Đánh giá một số chỉ tiêu của vacxin phòng bệnh xuất huyết ở cá rô phi do vi khuẩn Streptococcus Spp. gây ra

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ---***---BÙI THỊ HIỀN ðÁNH GIÁ MỘT SỐ CHỈ TIÊU CỦA VACXIN PHÒNG BỆNH XUẤT HUYẾT Ở CÁ RÔ PHI DO VI KHUẨN...

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-*** -BÙI THỊ HIỀN

ðÁNH GIÁ MỘT SỐ CHỈ TIÊU CỦA VACXIN

PHÒNG BỆNH XUẤT HUYẾT Ở CÁ RÔ PHI DO VI KHUẨN

Trang 2

Page i

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả ñược nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược công bố trong bất kỳ một công trình nào khác ðồng thời tất cả các thông tin tôi trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả

Bùi Thị Hiền

Trang 3

Page ii

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành các nội dung cơ bản trong luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự

nỗ lực và cố gắng của bản thân tôi còn nhận ñược sự giúp ñỡ tận tình của nhiều tổ chức, cơ quan và các cá nhân

Lời ñầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS Nguyễn Hữu Vũ – Giám ñốc Công ty Cổ phần Dược và Vật tư thú y (Hanvet), TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ - Học viện Nông nghiệp Việt Nam là những người ñịnh hướng và trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới ThS Hồ Thu Thủy cùng các anh chị Trung tâm nghiên cứu – Công ty Hanvet ñã tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài

Tôi xin ñược bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong trường Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm – Khoa Thú y ñã tạo mọi ñiều kiện tốt nhất ñể tôi thực hiện ñề tài

Tôi xin cảm ơn tới gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp những người ñã giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp

Tác giả

Bùi Thị Hiền

Trang 5

Page iv

Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

1.4.2 Một số thông tin về liên cầu khuẩn Streptococcus spp gây bệnh trên

1.5.2 đáp ứng miễn dịch thu ựược ở cá (miễn dịch ựặc hiệu) 20

Chương 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

2.1.1 Kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của vacxin phòng bệnh xuất huyết ở cá rô

2.1.2 Kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin phòng bệnh xuất huyết ở cá rô

2.1.3 đánh giá hiệu lực của vacxin phòng bệnh xuất huyết ở cá rô phi do

Trang 6

Page v

2.5.2 Phương pháp kiểm tra dấu hiệu bên ngoài và mổ khám bệnh tích 27

2.5.4 Phương pháp phân lập vi khuẩn Streptococcus spp có trong mẫu

2.5.9 Phương pháp ñánh giá ñộ dài miễn dịch của cá sau khi tiêm vacxin 32 2.5.10 Phương pháp ñánh giá hiệu quả của của vacxin sau bảo quản 33

3.2 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của vacxin 36

3.4 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vacxin 41 3.4.1 Kết quả kiểm tra bằng phương pháp ngưng kết trên phiến kính 41 3.4.2 Kết quả kiểm tra bằng phương pháp công cường ñộc 43

3.5.1 Kết quả kiểm tra bằng phương pháp ngưng kết trên phiến kính: 54 3.5.2 Kết quả kiểm tra bằng phương pháp công cường ñộc: 56 3.5.3 Theo dõi trọng lượng cá ở các thời ñiểm thí nghiệm: 58 3.6 Kết quả ñánh giá hiệu quả của vacxin sau bảo quản 59

Trang 7

Page vi

Trang 9

Page viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Vi khuẩn gây bệnh trên cá rô phi nuôi tại khu vực đông Nam Á

(Lauke Labrie, 2007) 14

Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của 3 lô vacxin vô hoạt phòng bệnh xuất huyết ở cá rô phido vi khuẩn Streptococcus spp gây ra 37

Bảng 3.2: Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin vô hoạt phòng bệnh xuất huyết ở cá rô phi do vi khuẩn Streptococcus spp gây ra 40

Bảng 3.3: Kết quả kiểm tra bằng phương pháp ngưng kết trên phiến kắnh 43

Bảng 3.4: Kết quả theo dõi triệu chứng của cá sau khi công cường ựộc 45

Bảng 3.5 Kết quả theo dõi cá chết 47

Bảng 3.6 Kết quả mổ khám bệnh tắch 49

Bảng 3.7: Kết quả phân lập vi khuẩn Streptococcus spp từ mẫu cá bệnh 51

Bảng 3.8: Tỷ lệ bảo hộ của vacxin 53

Bảng 3.9: Kết quả kiểm tra ựộ dài miễn dịch của cá bằng phương pháp ngưng kết trên phiến kắnh 55

Bảng 3.10: Kết quả kiểm tra ựộ dài miễn dịch của cá bằng phương pháp công cường ựộc 57

Bảng 3.11: Kết quả theo dõi trọng lượng cá 59

Bảng 3.12: Kết quả kiểm tra chỉ tiêu cảm quan, vô khuẩn và an toàn của vacxin sau thời gian bảo quản 60

Bảng 3.13: Kết quả kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vacxin sau thời gian bảo quản 63

Trang 10

Page ix

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus) 3

Hình 1.2 Cá rô phi (cá ñiêu hồng) 4

Hình 1.3: Hình thái của vi khuẩn Streptococcus spp dưới kính hiển vi x 1000 lần 15

Hình 2.1: ðường cắt giải phẫu xoang cơ thể cá 27

Hình 2.2: Giải phẫu não cá 28

Hình 2.3 Cá rô phi thí nghiệm 31

Hình 3.1 Tóm tắt quy trình sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh xuất huyết ở cá rô phi do vi khuẩn Streptococcus spp gây ra 35

Hình 3.2 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của vacxin 38

Hình 3.3: Tiêm cá thí nghiệm 39

Hình 3.4: Hình ảnh lấy máu cá 41

Hình 3.5 Hình ảnh thu huyết thanh cá 41

Hình 3.6 Kết quả phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính 42

Hình 3.7 Dấu hiệu bệnh lý của cá rô phi 46

Hình 3.8: Hình ảnh nội quan xuất huyết 48

Hình 3.9: Hình thái khuẩn lạc Streptococcus spp khi nuôi cấy trên môi trường BHIA 52

Hình 3.10: Tỷ lệ bảo hộ sau một thời gian tiêm vacxin cho cá rô phi 58

Hình 3.11: Trọng lượng cá tại các thời ñiểm kiểm tra 59

Hình 3.12 : Tỷ lệ bảo hộ của vacxin sau thời gian bảo quản 65

Trang 11

Ở nước ta, hàng năm có khoảng 5.000-7.000 tấn cá rô phi ñược tiêu thụ nội ñịa Cùng với sự phát triển của các hình thức nuôi mới như nuôi với mật ñộ cao và nuôi thâm canh thì vấn ñề dịch bệnh ñã trở thành một trong những trở ngại chính cho sự phát triển bền vững của ñối tượng này tại Việt Nam Bệnh ở cá

rô phi có thể do vi khuẩn, virus, nấm, hoặc ký sinh trùng gây nên Trong số ñó,

bệnh do vi khuẩn Streptococcus spp ñã gây thiệt hại lớn cho người nuôi cá rô

phi nói riêng và cá nước ngọt nói chung, làm ảnh hưởng ñến hiệu quả kinh tế của ngành nuôi trồng thủy sản Hiện nay, trên thế giới ñã có 36 loại vacxin phòng bệnh do vi khuẩn và 02 loại vacxin phòng bệnh do virus cho cá nhưng ở Việt Nam hiện chỉ có một loại vacxin phòng bệnh do vi khuẩn cho cá Do vậy việc phòng trị bệnh trên cá nước ngọt vẫn chủ yếu dựa vào việc sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất Việc sử dụng các hoá chất kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản

ñã khiến cho việc xuất khẩu thủy sản của Việt Nam gặp rất nhiều khó khăn, ñặc biệt là ở các thị trường khó tính như Mỹ, EU, Nhật Bản

Vì vậy tập trung các nguồn lực nhằm phát triển các loại vac xin phòng bệnh cho cá ở Việt Nam là một việc làm rất cần thiết Việc sử dụng vacxin phòng bệnh cho cá giúp giảm tỷ lệ chết, giảm việc sử dụng các loại kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản góp phần tạo ra các sản phẩm ñảm bảo an toàn thực phẩm cho con người Hiện tại Công ty Cổ phần Dược và Vật tư thú y (Công ty Hanvet) ñang tiến hành nghiên cứu xác ñịnh vi khuẩn gây bệnh xuất huyết ở cá rô phi và sản xuất vacxin phòng bệnh

Trang 12

Page 2

Chúng tôi tiến hành ựề tài: Ộđánh giá một số chỉ tiêu của vacxin phòng bệnh xuất huyết ở cá rô phi do vi khuẩn Streptococcus spp gây raỢ nhằm ựánh

giá hiệu quả của vac xin trước khi ựưa vào áp dụng trong thực tiễn

2 Mục ựắch của ựề tài

đánh giá các chỉ tiêu vô trùng, an toàn, hiệu lực, ựộ dài miễn dịch và ựộ dài

bảo quản của vacxin phòng bệnh xuất huyết ở cá rô phi do vi khuẩn Streptococcus

spp gây ra nhằm ựánh giá hiệu quả của vacxin trong phạm vi phòng thắ nghiệm

3 Ý nghĩa khoa học của ựề tài

- Là cơ sở ựề ra biện pháp phòng bệnh xuất huyết ở cá rô phi do vi khuẩn

Streptococcus spp gây ra có hiệu quả cao;

- đánh giá ựược chỉ tiêu vô trùng, an toàn và hiệu lực của vacxin phòng bệnh

xuất huyết ở cá rô phi do vi khuẩn Streptococcus spp nhằm ựánh giá hiệu quả sử

dụng vacxin trong phòng thắ nghiệm trước khi thử nghiệm ngoài thực ựịa ựể quyết ựịnh ựưa vào sản xuất, áp dụng ựại trà trong thực tiễn;

- đánh giá ựược ựộ dài miễn dịch của cá sau khi tiêm vacxin, từ ựó xây dựng ựược quy trình sử dụng và bảo quản vacxin hợp lý giúp cho việc ựịnh hướng sản xuất, bảo quản, tiêm phòng phù hợp mang lại hiệu quả kinh tế cao

4 Ý nghĩa thực tiễn của ựề tài

Phục vụ cho chiến lược phòng trị bệnh trên cá rô phi nhằm tìm ra phương pháp sản xuất vacxin hiệu quả cao, chi phắ sử dụng vacxin thấp và dễ áp dụng ở ựiều kiện của Việt Nam

Trang 13

Page 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Một số ựặc ựiểm sinh học của cá rô phi

1.1.1 Nguồn gốc

Cá rô phi có nguồn gốc từ Châu Phi, cá ựược nuôi ựầu tiên ở Kenya và sau ựó

nuôi rộng rãi nhiều nước ở Châu Phi và trên thế giới Cá ựược nuôi nhiều nhất là ở

những nước nhiệt ựới và cận nhiệt ựới Rô phi ựen (Oreochromis mossambicus) là loài cá Rô phi ựầu tiên ựược nhập vào nước ta năm 1951 Rô phi vằn (O niloticus)

ựược nhập từ đài Loan năm 1973, sau ựó cá rô phi ựược cải thiện chất lượng di truyền (dòng GIFT) ựã ựược giới thiệu vào Việt Nam từ Thái Lan năm 1994

1.1.2 Phân loại

Cá rô phi thuộc lớp: Ostechthyes; Lớp phụ: Actynopterigii

Bộ: Perciformes; Bộ phụ: Perciidae

Họ: Cichlidae

Giống: Tilapia, Sarotherodon, Oreochromis

Loài: Tilapia sp, Sarotherodon sp, Oreochromis sp

Hiện nay có 2 loài chắnh ựược phổ biến tại Việt Nam là :

Cá rô phi vằn ( Rô phi đài Loan, Oreochromis niloticus ) ựược nhập vào Việt

Nam năm 1973 từ đài Loan

Hình 1.1: Cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus)

Trang 14

Page 4

Cá rô phi ñỏ (Oreochromis sp.), còn ñược gọi là cá ñiêu hồng, có màu hồng ñược

nhập vào Việt Nam năm 1985 từ Malaysia

Hình 1.2 Cá rô phi (cá ñiêu hồng)

1.1.3 ðặc ñiểm hình thái

Cá rô phi vằn có thân hình màu hơi tím, vảy sáng bóng, có 9-12 sọc ñậm song song nhau từ lưng xuống bụng Vi ñuôi có màu sọc ñen sậm song song từ phía trên xuống phía dưới và phân bổ khắp vi ñuôi Vi lưng có những sóc trắng chạy song song trên nền xám ñen Viền vi lưng và vi ñuôi có màu hồng nhạt

1.1.4 ðặc ñiểm môi trường sống

a Nhiệt ñộ:

Cá rô phi có nguồn gốc từ xứ nóng nên chúng là loài cá ưa nhiệt, có khả năng thích ứng tốt với ñiều kiện nhiệt ñộ cao hơn là ñối với nhiệt ñộ thấp Nhiệt ñộ thuận lợi cho sinh trưởng của cá rô phi là 20 - 35oC, tối ưu ở 28 - 30oC (Balarin và Haller, 1982) Trên 32oC tốc ñộ tăng trưởng và tiêu thụ thức ăn thay ñối tỉ lệ nghịch với quá trình tăng nhiệt ñộ Một số tác giả khác cũng có cùng quan ñiểm: Marcel Huet, 1994 cũng khẳng ñịnh, ngưỡng nhiệt ñộ thích hợp cho sinh trưởng phát triển của cá là 20

- 30oC, cũng theo Zhong Lin (1991) là 25 – 35oC Khi nhiệt ñộ xuống thấp hơn

20oC cá tăng trưởng chậm và ngừng ăn ở nhiệt ñộ dưới 15oC Khi nhiệt ñộ xuống dưới 10oC, tỷ lệ cá chết là rất lớn

b ðộ pH

Trang 15

Page 5

Cá rô phi có khả năng sống trong môi trường nước có biên ñộ pH rất rộng 5 -

11, nhưng thích hợp nhất là 6,5 - 8,5 ðộ pH nhỏ hơn 4 hay cao hơn 11 có thể gây chết cho cá

c Hàm lượng oxy hòa tan

So với các loài cá khác thì cá rô phi có thể sống ở môi trường nước bẩn tù ñọng, mà ở ñó hàm lượng O2 thấp khoảng 1mg/l Khi nồng ñộ O2 giảm xuống dưới 1mg/l, chúng có khả năng sử dụng O2 trong không khí Tuy nhiên nếu thiếu O2trong thời gian kéo dài có thể làm giảm tốc ñộ tăng trưởng của cá rô phi

1.1.5 ðặc ñiểm dinh dưỡng

Trứng cá rô phi thụ tinh ñược ấp trong miệng cá mẹ (ở giống Oreochromis) ở

28oC sẽ nở sau 4 ngày Cá bột sau khi nở 3 - 5 ngày tuổi thì có thể bơi lội tự do ở bên ngoài Giai ñoạn này cá ăn sinh vật phù du thủy sinh là chủ yếu, 20 ngày tuổi (17 - 18 mm) cá chuyển dần sang thức ăn như cá trưởng thành Cá trưởng thành ăn mùn bã hữu cơ, tảo các loại, ấu trùng, côn trùng, sinh vật ñáy, phù du sinh vật, thực vật thượng ñẳng loại mềm, phân hữu cơ… Ngoài ra, trong ao nuôi có thể cho thêm thức ăn bổ sung như cám gạo, bột ngô và các phụ phẩm nông nghiệp khác ðặc biệt

cá rô phi có thể sử dụng rất hiệu quả thức ăn công nghiệp và thức ăn tự chế biến (Balarin và Haller, 1982) ðây là một ñặc ñiểm giúp cho việc nuôi cá rô phi thâm canh ñạt năng suất cao Với những ñặc ñiểm ưu việt ñó cá rô phi ñược phân bố và ương nuôi khá rộng rãi trong các vùng miền của nước ta

1.1.6 ðặc ñiểm sinh sản

- Mùa vụ sinh sản: Rô phi ñẻ quanh năm (trừ những ngày quá lạnh hoặc quá nóng), ñẻ nhiều nhất từ tháng 5 ñến tháng 10 Mỗi năm ñẻ từ 5 - 11 lứa, mỗi lứa ñẻ

Trang 16

Page 6

100 - 3400 trứng Trong một buồng trứng thường có 5 lứa trứng

- Tuổi thành thục: cá rô phi thành thục sinh dục rất sớm, bắt ñầu sinh sản sau khi nở 3 - 4 tháng Cỡ cá thành thục nhỏ nhất khoảng 40g Thời gian tái thành thục khoảng 1 - 2 tháng

- Phân biệt cá rô phi ñực và cá rô phi cái:

Khi ñến tuổi phát dục thì ở mép các vây ñuôi, vây lưng và vây bụng ở cá ñực

có màu sắc rực rỡ từ hồng ñến xanh ñen, trong khi ñó thì cá cái không có sự thay ñổi về màu sắc mà bụng của nó phát triển rất nhanh Ngoài ra ta có thể phân biệt ñược cá rô phi ñực cái ngay khi chúng còn nhỏ, cỡ 6 – 7 cm, bằng cách nhìn vào vùng lỗ huyệt Cách phân biệt này càng chính xác khi cá gần thành thục sinh dục + Cá ñực có 2 lỗ: phía trước là lỗ hậu môn, phía sau là rãnh huyệt (còn gọi là huyệt niệu sinh dục)

+ Cá cái có 3 lỗ: lỗ hậu môn, lỗ niệu và lỗ sinh dục

- Tập tính sinh sản: Tùy theo loài mà cá rô phi có tập tính sinh sản khác nhau

nuôitrồng thuỷ sản

Tilapia

Khi ñẻ cần có giá thể ñể trứng bám Cá làm tổ ñẻ bằng cỏ rác Sau khi-ñẻ, cả cá cái và cá ñực cùng tham gia bảo vệ tổ

T zillii, T rendalli

Sarotherodon

Cá ñào tổ ñẻ Cá ñực hoặc cá cái, hoặc cả

cá ñực và cá cái cùng ấp trứng trong miệng

Trang 17

Page 7

O.andersoni

1.2 Tình hình nuôi cá rô phi

1.2.1 Tình hình nuôi cá rô phi trên thế giới

Hiện nay, cá rô phi là ựối tượng ựược nuôi phổ biến ở nhiều nước trên thế giới, chiếm một vi trắ quan trọng chỉ ựứng sau nhóm cá chép trong các thủy vực nước ngọt Nhờ có những ựặc tắnh tốt như phổ thức ăn ựa dạng, ắt bệnh tật, chất lượng thịt thơm ngon, ựầu tư chi phắ thấpẦvì thế mà trong những năm gần ựây loài này ựược nuôi phổ biến, diện tắch và sản lượng cũng như chất lượng sản phẩm không ngừng tăng lên Trong tương lai, cá rô phi sẽ là sản phẩm thay thế cho các loại thịt cá trắng ựang ngày càng cạn kiệt đối tượng chiếm ưu thế và ựược nuôi phổ

biến là giống cá rô phi vằn O niloticus, với tổng sản lượng là 1,001,302 tấn năm

2002, chiếm 84% của tổng sản lượng cá rô phi (FAO, 2004)

Tại Hội nghị của INFOFISH TILAPIA 2010 về cá rô phi tổ chức tại Kuala Lumper, Malaysia cuối tháng 10/2010, thống kê tổng sản lượng cá rô phi toàn cầu năm 2010 ựạt 3,7 triệu tấn Mặc dù cá rô phi có nguồn gốc không phải từ châu Á nhưng ựây lại là khu vực sản xuất cá rô phi quan trọng nhất thế giới Sản lượng cá

rô phi ở châu Á trong thời gian qua ựược coi là tăng nhanh nhất thế giới Các nước châu Á ựại diện có nghề nuôi cá rô phi phát triển mạnh ựó là Trung Quốc, Indonesia, Thái Lan, đài LoanẦ Tổng sản lượng cả năm nước này chiếm 94% tổng sản lượng cá rô phi của châu Á Trong ựó Trung Quốc là quốc gia sản xuất cá rô phi lớn nhất Tắnh ựến năm 2011, sản lượng cá rô phi của nước này giữ ổn ựịnh ở mức

1,1 Ờ 1,2 triệu tấn và dự kiến vẫn tiếp tục tăng vào các năm tới

Tại Trung Quốc, rô phi ựược nuôi tập trung nuôi ở 4 tỉnh đông Nam Quảng

đông Con giống ựược sử dụng chủ yếu là con lai giữa loài O niloticus và O

aureus Rô phi ựược nuôi cả trong hệ thống nuôi thâm canh và bán thâm canh,

chúng có thể ựược nuôi ựơn hoặc nuôi ghép với các loài cá khác trong ao nước ngọt, trong lồngẦ cá ựược thả với mật ựộ 2,5 con/m2, con giống có khối lượng trung bình là 4g

Philippin là một nước nuôi khá nhiều cá rô phi, năm 2003 sản lượng cá rô phi

Trang 18

Page 8

ựạt 135.996 tấn/230.000 ha Nuôi cá rô phi trong ao, lồng, các vùng nước ngọt và lợ: Sản lượng ở nước ngọt chiếm 56%, nuôi lồng nước ngọt chiếm 37% và nuôi nước lợ chiếm 7% tổng sản lượng Philippin là nước tiên phong ở Châu Á về việc nuôi cá rô phi trong lồng trên hồ và sông, suối Việc thử nghiệm nuôi bắt ựầu từ năm 1973, cả nước có khoảng 2000 ha lồng vào năm 2000, sản xuất ra 33.967 tấn rô phi thương phẩm đây cũng là quốc gia ựầu tiên trong khu vực sử dụng hormon giới tắnh chuyển ựổi giới tắnh sản xuất ra con giống với tỉ lệ giới ựực cao (từ 98 Ờ 100%) góp phần nâng cao năng suất sản lượng cá nuôi

Thái Lan nuôi cá rô phi trong lồng rộng khắp miền Bắc và miền Trung Sau thời gian nuôi 90 ọ 120 ngày, cá ựạt kắch cỡ 600 ọ 700g và 120 ọ 150 ngày, cá ựạt kắch cỡ 800 ọ 900g với tỷ lệ sống 80 ọ 90%, hệ số thức ăn là 1,0 ọ 1,8 (Phạm Anh Tuấn và ctv, 2006)

Các nước Châu Mỹ bắt ựầu quan tâm ựến nuôi cá rô phi trong vòng 10 năm gần ựây ựặc biệt là sau rủi ro của nghề nuôi tôm do dịch bệnh gây ra Các nước vùng Trung Nam Mỹ như Mehico, Brazil, Ecuador là những nước sản xuất cá rô phi chủ yếu ở khu vực này

Cá rô phi có nguồn gốc từ Châu Phi nhưng nghề nuôi cá rô phi ở khi vực này chỉ mới phát triển trong 10 năm qua Ai Cập là nhà sản xuất lớn nhất, năm 2003 ựạt sản lượng 200.000 tấn, chiếm 90% sản lượng cá rô phi ở châu lục này Các quốc gia khác như Ghana, Nigieria, Kenya, ZimbabiweẦ sản lượng cá rô phi không ựáng kể, chủ yếu phục vụ tiêu thụ nội ựịa

Ở Châu Âu Sản do nhiệt ựộ thấp không thuận lợi cho việc nuôi cá rô phi nên sản lượng cá rô phi không ựáng kể Theo thống kê của FAO, sản lượng cá rô phi nuôi ở Châu Âu là 270 tấn (năm 1999) Hiện nay, Bỉ là nơi nuôi nhiều cá rô phi nhất với sản lượng ựạt khoảng 300 tấn/năm

Nuôi cá rô phi trong lồng bè rất phổ biến tại một số nước như: đài Loan, Indonesia, Phillipin, Malaysia, Thái Lan đài Loan ựã mở ựầu phương thức nuôi rô phi trong lồng nổi, năng suất ựạt 4,3-5,4 tấn/lồng/2 vụ/năm Lồng nổi cỡ mắt lưới 1cm ựược thả cá giống cỡ 20 - 30g/con, mật ựộ 4.000-5.000 con/lồng, cho ăn tự

Trang 19

Page 9

ñộng với thức ăn viên 3 lần/ngày, sau 4 - 5 tháng cá ñạt cỡ thương phẩm 600g/con

Mô hình nuôi lồng phát triển ở Indonexia trong hồ nước ngọt lớn ở Java Tại ñây Công ty Aquafarm Nusantara sản xuất gần 5.000 tấn/năm Philippin nuôi cá rô phi vằn trong lồng trên các hồ chứa Năm 1999 có 2.000 lồng, sản xuất 31.114 tấn cá Mật ñộ cá thả là 15 - 45 con/m2 trong lồng cố ñịnh, và 55 - 80 con/m2 trong lồng nổi, cỡ cá thả 0,5 - 2,0g/con, sau 3 - 5 tháng nuôi ñạt năng suất 4 - 25kg/m2, cỡ cá

150 - 250g/con, tỷ lệ sống ñạt 80 - 90% (Phạm Anh Tuấn và ctv, 2006)

1.2.2 Tình hình nuôi cá rô phi tại Việt Nam

Nghề nuôi cá rô phi ở nước ta có lịch sử hơn 50 năm, khởi ñầu khi nhập nội

cá rô phi ñen (O mosambicus) vào nước ta ñầu những năm 1950 Những thập niên

50 và 60 của thế kỷ trước, cá rô phi ñược nuôi chủ yếu ở hình thức quảng canh và quảng canh cải tiến, nuôi chung cá ñực và cá cái Phong trào nuôi cá rô phi ñặc biệt phát triển từ những năm ñầu của thập kỷ 90 sau khi chúng ta nhập lại những dòng

cá rô phi vằn có chất lượng tốt, ñặc biệt là cá chọn giống dòng Thái Lan và Israel

Cá ñược nuôi ở nhiều ñịa phương với các hình thức khác nhau: nuôi ñơn, nuôi ghép, với mức ñộ canh tác từ quảng canh, bán thâm canh ñến thâm canh

Theo Tổng Cục Thống kê năm 2005, diện tích nuôi cá rô phi của cả nước ta

là 22,340 ha chiếm 3% tổng diện tích nuôi trồng thủy sản, trong ñó nuôi nước lợ, mặn là 2,068 ha và nuôi nước ngọt là 20,272 ha Tổng sản lượng cá rô phi ước tính ñạt 54,486,8 tấn; chiếm 9,08% tổng sản lượng cá nuôi ðồng bằng Sông Hồng và ðồng bằng sông Cửu Long là hai vùng nuôi chủ yếu, lần lượt chiếm 17,6% và 58,4% tổng sản lượng cá rô phi của cả nước Sản lượng cá rô phi trong cả nước bao gồm: nuôi trong ao và trong ñầm 37,931,8 tấn; nuôi lồng 10,182 tấn Mục tiêu ñưa

ra ñến năm 2015 sản lượng cá cả nước ñạt 200,000 tấn/năm; trong ñó dành 40% cho xuất khẩu (Phạm Anh Tuấn, 2006)

1.3 Tình hình dịch bệnh ở cá rô phi

1.3.1 Trên thế giới

Cá rô phi là một trong những ñối tượng nuôi thủy sản nước ngọt chủ yếu trên thế giới Ban ñầu, cá rô phi ñã ñược xem là có khả năng ñề kháng tốt với vi khuẩn,

Trang 20

Page 10

ký sinh trùng, nấm và virus so với các loài cá khác trong cùng môi trường nuôi Tuy nhiên trong thời gian gần ựây, cá rô phi ựã ựược tìm thấy là mẫn cảm với cả vi khuẩn và ký sinh trùng Các tác nhân gây bệnh phổ biến cho cá rô phi bao gồm

Streptococcus spp., Flavobacterium columnare, Aeromonas hydrophyla, Edwarsiella tarda, Ichthyophitirius multifillis, Tricodhina sp., Gyrodactylus niloticus (Klesius và ctv, 2000) Bệnh trên cá rô phi xảy ra khắp nơi, trong ựó một

số ựã phát triển thành những trận dịch đài Loan là nước từng ựã hứng chịu rất nhiều trận dịch trên cá rô phi Trận dịch năm 1992 ựã làm chết rất nhiều cá rô phi trong những ao nuôi nước ngọt ở miền đông Nam đài Loan sau ựó lan rộng ra các ựảo trong khu vực ở cả nước lợ và nước mặn Tại Israel, một tác nhân gây bệnh rất

giống nấm Branchiomyces ựã làm chết 85% cá rô phi ựỏ và cá rô phi lai

1.3.2 Ở Việt Nam

Hiện nay ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về bệnh cá rô phi chưa nhiều Những công trình nghiên cứu ở Việt Nam như: nghiên cứu về ký sinh trùng trên một số dòng cá rô phi vằn ở Bắc Ninh và Quảng Ninh (Bùi Quang Tề và ctv, 1999); hay nghiên cứu về ký sinh trùng ở những giai ựoạn khác nhau trên 3 dòng cá

rô phi nuôi như dòng Thái, dòng Việt và dòng GIFT tại miền Bắc Việt Nam (Bùi Quang Tề và Vũ Thị Lụa, 1999; trắch dẫn từ Nguyễn Tri Cơ, 2004)

1.4 Một số thông tin về bệnh do liên cầu khuẩn Streptococcus spp gây ra

1.4.1 Tình hình dịch bệnh

a Trên thế giới:

Một số loài vi khuẩn Streptococcus spp gây bệnh trên cá ựã ựược xác ựịnh bao gồm: Streptococcus difficile phát hiện ở Isael, S Milerri, S Parauberis phân lập từ loài cá bơn nuôi ở miền Bắc Tây Ban Nha, S Iniae ựược phát hiện trên nhiều

loài và cả ở ựộng vật có vú Các vi khuẩn này gây ra hội chứng bệnh có tên là bệnh

do liên cầu khuẩn (Streptococcosis) Bệnh Streptococcosis ựược Hoshina và ctv báo

cáo ựầu tiên vào năm 1958 ở Nhật Bản trên các loài cá hồi nuôi điều quan trọng cần lưu ý rằng nhiễm liên cầu khuẩn ựã trở thành một vấn ựề lớn trong nuôi cá rô

phi và gây thiệt hại kinh tế nặng nề Streptococcus iniae và Streptococcus

Trang 21

Page 11

agalactiae là những loài vi khuẩn chắnh ảnh hưởng ựến việc sản xuất cá rô phi trên

thế giới (Evan và ctv, 2006)

Dịch bệnh ở cá rô phi nuôi ở Thái Lan ựã ựược quan sát thấy trong lồng nuôi trên sông Mekong tại thành phố Mukudahan, phắa đông Bắc Thái Lan vào tháng 5 năm 2001 Tỷ lệ cá bị chết do dịch bệnh vào khoảng 40-60% sau hai tuần bị nhiễm bệnh Dấu hiệu ựiển hình của cá bị bệnh là chướng bụng, trong xoang bụng chứa dịch và hậu môn bị sưng Trong năm 2002 và 2003, tại thành phố Lubuk Linggau, miền Nam Sumatra, Indonesia cá rô phi nuôi lồng cũng ựã xuất hiện hiện tượng cá

bị chết với dấu hiệu bệnh lý hai mắt ựục và ựổi màu Vi khuẩn phân lập từ bộ não

và các cơ quan khác của cá rô phi bị ảnh hưởng từ Thái Lan và Indonesia ựã ựược

xác ựịnh là Streptococcus agalactiae và Streptococcus iniae (Yuasa, 2005)

Năm 2005 tại một số hồ chứa của Malaysia ựã ghi nhận ựược hiện tượng cá

rô phi nuôi lồng bị chết, kết quả thu mẫu ựã phân lập ựược vi khuẩn từ các cơ quan

đặc biệt là mẫu thu ở mắt, thận, não Trong ựó vi khuẩn S agalactiae chiếm 70% tổng số loài vi khuẩn Streptococcus ựược xác ựịnh, 30% còn lại là Leuconostoc spp

và S.constellatus Dấu hiệu ựiển hình quan sát bao gồm cá bơi lội không bình

thường và bỏ ăn Hầu như tất cả các cá rô phi bị bệnh mắt như ựục giác mạc hoặc tối màu, mắt bị lồi hoặc xẹp (Yuasa, 2005) Những năm gần ựây rất nhiều ựợt dịch

bệnh do nhiễm Streptococcus agalactiae ựã ựược ghi nhận ở nhiều trang trại nuôi cá

rô phi ựặc biệt là cá trang trại ở châu Á (Musa và ctv, 2009; Suanyuk và ctv, 2005)

Từ tháng 7 ựến tháng 12 năm 2009 bệnh Streptococcosis trên cá rô phi ựã

bùng phát tại bốn tỉnh Guangdong, Guangxi, Hainan and Fujian nơi chiếm tới 90%

sản lượng nuôi ựối tượng này tại Trung Quốc Bệnh Streptococcosis không chỉ xảy

ra tại nơi có sản lượng nuôi cá rô phi lớn nhất thế giới (1.1 triệu tấn năm 2009) Tại

Thái Lan theo (Wongtavatchai & Maisak, 2008) tỷ lệ Streptococcus agalactiae trên

Streptococcus iniae là 112/8 ở cá rô phi vằn (Oreochromis nilotica), nghiên cứu về

dịch tễ học của Intervet/Scheing Ờ Plough Animal Health cho kết quả Streptococcus

agalactiae chiếm 82% và Streptococcus iniae 18% trong tổng số 500 mẫu phân lập

từ 13 nước Châu Á và Châu Mỹ La Tinh trong 8 năm (Sheehan và ctv, 2009)

Trang 22

Page 12

b Ở Việt Nam

Năm 2009, dịch bệnh gây chết hàng loạt cá rô phi nuôi thương phẩm tại một

số tỉnh miền Bắc ðây ñược coi là ñợt dịch bệnh lớn nhất kể từ trước ñến nay ñối với nghề nuôi cá rô phi ở nước ta Bước ñầu, nguyên nhân gây chết ñã ñược xác

ñịnh ñó chính là bệnh Streptococcosis do vi khuẩn Gram (+), Streptococus spp gây

ra Cá bị bệnh thường có các triệu chứng, bệnh tích như cá bơi lờ ñờ, mất ñịnh hướng, trướng bụng, xuất huyết, lồi mắt, sưng ruột, các cơ quan nội tạng như gan, thận, lá lách bạc màu hoặc xuất huyết, sưng to ðặc biệt vi khuẩn tấn công niêm mạc mắt và não cá làm cho cá bơi không ñịnh hướng và có dấu hiệu tổn thương thần kinh Bệnh thường xảy ra vào mùa hè ñặc biệt khi khi nhiệt ñộ nước cao ðối với mùa ñông và mùa xuân, mật ñộ vi khuẩn thường thấp và không ñủ ngưỡng gây bệnh Tác nhân gây bệnh quan trọng trên cá rô phi thường là vi khuẩn, virus hoặc

protozoa trong ñó ñáng chú ý nhất là bệnh do vi khuẩn mà ñặc biệt là

Streptococcus agalactiae ñã gây chết hàng loạt cá nuôi trong thời gian qua (ðồng

Thanh Hà và ctv, 2010) Kết quả nghiên cứu của ðinh Thị Thủy (2007) về các bệnh

nguy hiểm thường gặp ở cá rô phi Oreochromis spp nuôi thâm canh cho thấy bệnh

Streptococcosis thường xuất hiện vào mùa hè ñặc biệt khi nhiệt ñộ nước cao, tỷ lệ

thiệt hại từ 7 – 10% và cá ở giai ñoạn 1 – 4 tháng tuổi Tại An Giang và Vĩnh Long

vi khuẩn Streptococus spp có tần suất xuất hiện từ 95 – 100% vào tháng 1, tháng 5,

tháng 9 và tháng 11 (ðinh Thị Thủy, 2007) Từ tháng 4 ñến tháng 9 năm 2009, hiện tượng cá rô phi bị chết ñã xuất hiện ở tất cả các vùng nuôi tập trung ở miền Bắc như

Hà Nội, Hải Dương, Hải Phòng, Quảng Ninh, Bắc Ninh, Bắc Giang và Hà Giang

Tỷ lệ chết cao nhất là 100% và trung bình là 42,56% ðây ñược coi là ñợt dịch bệnh lớn nhất trên cá rô phi nuôi tại miền Bắc Việt Nam Kết quả nuôi cấy phân lập tác

nhân gây bệnh trên cá rô phi cho thấy vi khuẩn gram dương Streptococus spp có

xuất hiện trên mẫu bệnh (Công ty Hanvet, 2009); Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1 thấy trên hầu hết các mẫu bệnh (Nguyễn Viết Khuê và ctv, 2009)

Theo ðồng Thanh Hà và ctv (2010) dịch bệnh xảy ra lần ñầu vào mùa hè năm 2009 ở các tỉnh như: Hà Nội, Hải Phòng, Hải Dương, Quảng Ninh, Bắc Ninh,

Trang 23

Page 13

Hà Giang; gây chết với tỷ lệ 90 – 100% cá nuôi (cả cá giống và thương phẩm) Tác giả chỉ ra rằng tác nhân gây bệnh trên cá rô phi ở miền Bắc Việt Nam là

Streptococus agalactiae và về khả năng phát triển của vi khuẩn ở 37oC và ñộ mặn

37o/oo ñược xem là yếu tố nguy cơ lây nhiễm bệnh cho ñộng vật có vú và con người

Cũng theo ðồng Thanh Hà và ctv (2010) vi khuẩn Streptococus agalactiae có khả

năng sống sót tốt trong nước ao và bùn ñáy từ 3 - 5 ngày ở hai mức nhiệt ñộ 25oC

và 30oC Từ những mẫu cá ñiêu hồng bị bệnh phù mắt và xuất huyết ñược thu từ những bè nuôi cá ñiêu hồng thâm canh ở Tiền Giang tiến hành kiểm tra vi khuẩn

học xác ñịnh do vi khuẩn Streptococus agalactiae gây ra (ðặng Thị Hoàng Oanh và

nhóm liên cầu khuẩn gram dương là tác nhân gây bệnh chính trên các hệ thống nuôi

cá rô phi thâm canh và gây thiệt hại lớn cho nghề này trên toàn thế giới (Perera R.P., 1994) Vi khuẩn có khả năng phát triển trên các môi trường nuôi cấy khác nhau như Tryptic Soy Agar, Brain Heart Infussion, Muller-Hinton và Blood Agar Khuẩn lạc của vi khuẩn có kích thước dao ñộng từ 0,5 ñến 0,7mm sau 24 giờ nuôi cấy Vi khuẩn có thể tạo vòng dung huyết trên môi trường thạch máu (Nguyen và

Kanai, 1999) S iniae thủy phân esculin và tinh bột, không thủy phân gelatin và có

khả năng lên men glucose, maltose, mannitol, sucrose, không lên men arabinose, lactose, raffinose và xylose (Nguyen và Kanai, 1999)

Kết quả nghiên cứu tác nhân gây bệnh Streptococcosis trên cá rô phi cho thấy vi khuẩn Streptococus iniae và Streptococus agalactiae có thể tồn tại ngoài

môi trường quanh năm Ngoài ra vi khuẩn gây bệnh có thể phân lập ñược từ nguồn ñất, chất hữu cơ lắng tụ, chất nhầy của cá Theo Bromage và ctv, 1999 vi khuẩn gây

bệnh Streptococus iniae có thể do cá bị bệnh qua khỏi ñợt dịch thải ra ngoài môi

Trang 24

Page 14

trường Do vi khuẩn gây bệnh Streptococcosis thắch hợp với ựiều kiện nhiệt ựộ cao

nên vào mùa ựông rất ắt khi phân lập ựược các loài vi khuẩn này

Tác nhân gây bệnh Streptococcosis là nhóm vi khuẩn thuộc giống

Streptococcus spp Vi khuẩn Streptococcus spp gây bệnh ở cá rô phi lần ựầu tiên

phân lập ựược ở cá rô phi nuôi tại Nhật Bản gồm hai loài là Streptococcus shiloi và

Streptococcus difficile Sau ựó các loài vi khuẩn gây bệnh trên cá rô phi ựược phân

loại lại như Streptococcus shiloi ựược là Streptococcus iniae, còn Streptococcus

difficile ựược xác nhận là Streptococcus agalactiae

Năm 2005 tại một số hồ chứa của Malaysia ựã ghi nhận ựược hiện tượng cá

rô phi nuôi lồng bị chết, kết quả thu mẫu ựã phân lập ựược vi khuẩn từ các cơ quan

đặc biệt là mẫu thu ở mắt, thận, não Trong ựó vi khuẩn S agalactiae chiếm 70% tổng số loài vi khuẩn Streptococcus ựược xác ựịnh, 30% còn lại là Leuconostoc spp

và S.constellatus Dấu hiệu ựiển hình quan sát bao gồm cá bơi lội không bình

thường và bỏ ăn Hầu như tất cả các cá rô phi bị bệnh mắt như ựục giác mạc hoặc tối màu, mắt bị lồi hoặc xẹp (Yuasa, 2005)

Streptococcus agalactiae ngày càng ựược phát hiện và khẳng ựịnh là nguyên

nhân gây bệnh cho cá, ựặc biệt là cá nước ngọt (Plumb, 1999; Pretto-Giordano và

ctv, 2010) Những năm gần ựây rất nhiều ựợt dịch bệnh do nhiễm Streptococcus

agalactiae ựã ựược ghi nhận ở nhiều trang trại nuôi cá rô phi ựặc biệt là cá trang trại

ở châu Á (Musa và ctv, 2009; Suanyuk và ctv, 2005)

Từ các kết quả nghiên cứu cho thấy bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae và

S agalactiae là rất phổ biến và ảnh hưởng ựến cá rô phi nuôi tại khu vực đông nam

Á Kết quả nghiên cứu ựược tổng hợp theo bảng 1.1

Bảng 1.1: Vi khuẩn gây bệnh trên cá rô phi nuôi tại khu vực đông Nam Á

Trang 25

Page 15

Philippin, Thái Lan, Trung Quốc và Việt nam

Flavobacteriu

1.4.2.1 ðặc ñiểm hình thái

Vi khuẩn Streptococcus spp là những vi khuẩn hình cầu hoặc hình bầu dục,

ñường kính khoảng 0,6-0,8 µm, bắt màu gram dương Vi khuẩn xếp thành chuỗi vì phân chia trong mặt phẳng thẳng góc với trục của chuỗi Liên cầu không có lông, không di ñộng, không sinh nha bảo và một số loài có vỏ

Hình 1.3: Hình thái của vi khuẩn Streptococcus spp

dưới kính hiển vi x 1000 lần

1.4.2.2 Tính chất nuôi cấy:

Liên cầu hiếu khí kỵ khí tùy tiện và thường ñòi hỏi môi trường nuôi cấy có nhiều chất dinh dưỡng như máu, huyết thanh, ñường Vi khuẩn phát triển tốt hơn ở ñiều kiện khí trường có thêm 5 - 10% CO2 Nhiệt ñộ nuôi cấy thích hợp là 37oC, một số phát triển ñược ở 10 - 40oC như liên cầu ñường ruột

Trang 26

Page 16

Trong môi trường lỏng (canh thang): Liên cầu dễ tạo thành những chuỗi dài không bị gẫy, sau ñó tạo thành những hạt nhỏ hoặc những hạt như bông rồi lắng xuống ñáy môi trường nuôi cấy Do ñó sau 24 giờ, môi trường trở nên trong và có lắng cặn

- Trên môi trường ñặc: Liên cầu có khuẩn lạc tròn, lồi, bóng khô, màu hơi xám trong

- Trên môi trường thạch máu: Liên cầu phát triển tốt, có thể làm tan máu dưới 3 hình thức α, β, γ tuỳ thuộc từng nhóm liên cầu:

+ Tan máu (α): ñây là tan máu không hoàn toàn, vòng tan máu có xuất hiện màu

xanh Liên cầu tan máu α, loài Streptococcus viridans thường là loại không gây bệnh

+ Tan máu (β): Tan máu β, ñây là tan máu hoàn toàn, vòng tan máu trong

suốt và có ñường kính gấp 2 - 4 lần ñường kính của khuẩn lạc Những Streptococci

có khả năng gây tan máu β phần lớn có khả năng gây bệnh Tan máu β chủ yếu ở liên cầu nhóm A, ngoài ra có thể gặp ở nhóm B, C, D

+ Tan máu (γ): Tan máu γ là loại tan máu không có vòng tan máu xung quanh

của khuẩn lạc Hầu hết các Streptococci gây tan máu γ không mang tính ñộc lực

1.4.2.3 Tính chất sinh vật hóa học:

- Liên cầu không có enzym catalase

- Liên cầu không bị ly giải bởi muối mật, tức là:

+ Thử nghiệm optochin âm tính;

+ Thử nghiệm ly giải bởi muối mật âm tính

Trang 27

Page 17

thành 80 typ huyết thanh khác nhau Protein M nằm trên bề mặt tế bào nên dễ dàng kết hợp với kháng thể kháng protein M Kháng nguyên M có khả năng chống lại thực bào vì vậy nó liên quan trực tiếp tới ñộc lực của liên cầu

- Những kháng nguyên khác của liên cầu:

+ Kháng nguyên T: Là protein của vách tế bào vi khuẩn, bị phá huỷ bởi nhiệt

ñộ ở pH acid

+ Kháng nguyên P: Bản chất là nucleoprotein, kháng nguyên này có phản ứng chéo với nucleoprotein của tụ cầu

+ Kháng nguyên R: Bản chất là protein, nằm ở vách tế bào vi khuẩn, có một

số typ M của liên cầu nhóm A

+ Kháng nguyên vỏ acid hyaluronic: Có ở những liên cầu có vỏ của nhóm A

1.4.2.5 Các enzym và ñộc tố

a Các enzym (men):

- Men Streptokinase: Thường có ở liên cầu nhóm A,C,G Men này là một kháng nguyên có khả năng kích thích cơ thể hình thành kháng thể Anti Streptokinase (ASK) Streptokinase có khả năng làm tan tơ huyết, hoạt hoá xung quanh vùng tổn thương tạo ñiều kiện cho vi khuẩn lan tràn

- Streptodornase (Desoxyribonuclease): Streptodornase có khả năng thuỷ phân ADN, do ñó làm lỏng mủ nhưng chỉ có tác dụng khi có mặt của ion Mg Men streptodornase có 4 loại A, B, C, D và ñều là những kháng nguyên kích thích cơ thể hình thành những kháng thể ñặc hiệu

- Hyaluronidase: Men có tác dụng phân huỷ acid hyaluronic của tổ chức, tạo ñiều kiện cho vi khuẩn lan truyền sâu rộng vào các mô Men này cũng có tính kháng nguyên kích thích cơ thể sinh kháng thể anti streptohyaluronidase

- Diphospho Pyridine Nucleotidase (DPNase): Men này có ở liên cầu nhóm

A, C, G Có ñộc tính với tế bào bạch cầu và gây chết bạch cầu ðây cũng là men có tính kháng nguyên và kích thích cơ thể hình thành kháng thể

- Proteinase: Có tác dụng phân huỷ protein và kích thích cơ thể hình thành

Trang 28

- Streptolysin S: Nhiều liên cầu tiết ra loại men này, men gây tan máu ở bề mặt môi trường nuôi cấy, tính kháng nguyên yếu nên không kích thích cơ thể hình thành kháng thể

- ðộc tố hồng cầu: Còn ñược gọi là ñộc tố sinh ñỏ

1.4.3 Triệu chứng và bệnh tích

a Triệu chứng:

- Cá kém ăn hoặc bỏ ăn, bơi lờ ñờ hay mất ñịnh hướng gần mặt nước

- Cá bị trướng bụng, xuất huyết ñiểm, có ñốm ñỏ ở vùng da quanh miệng và hậu môn, xuất huyết nặng ở vây lưng và ngực, xuất huyết, viêm có mủ, lồi một hoặc

cả 2 mắt

b Bệnh tích:

- Các cơ quan nội tạng gan, thận xuất huyết, lách tụ huyết sưng to;

- Trong xoang bụng tích tụ dịch viêm;

- Tim, ruột bị viêm, xuất huyết;

- Túi mật, tụy sưng to

1.4.4 Sự phân bố và lan truyền của bệnh

Dịch bệnh thường xảy ra khi cá nuôi tiếp xúc với sự căng thẳng (stress) khi nhiệt ñộ nước tăng, lượng oxy trong nước thấp dưới mức cho phép hoặc cá

bị nuôi ở mật ñộ cao trong thời gian dài

Bệnh lây lan theo chiều ngang từ cá với cá (cá khoẻ ăn cá bị bệnh, ăn thịt lẫn

Trang 29

Page 19

nhau, do vết thương trên da ) và cũng có thể lây truyền từ môi trường ựến cá

1.5 Khái quát về hệ thống miễn dịch của cá

Lớp cá là lớp ựộng vật có xương sống nguyên thủy nhất, ựược coi là gạch nối quan trọng giữa các loài ựộng vật không xương sống và các loài ựộng vật có xương sống bậc cao hơn (Stoskopf S.K., 1993) Ở cá tồn tại cơ chế thực bào với các tế bào thực bào ựơn nhân và tế bào hạt của ựộng vật không xương sống Chúng cũng là sinh vật ựầu tiên thể hiện ựược hai cơ chế miễn dịch thể dịch và miễn dịch qua trung gian

tế bào như ở các loài ựộng vật có vú (Stoskopf S.K., 1993) Ngoại trừ một số loài cá sống ở nhiệt ựộ thấp không phát triển hệ thống ựáp ứng miễn dịch (Fox, 2005) Cũng như tất cả các cơ thể sống khác, cá có ựặc tắnh quan trọng là nhận biết

và dung nạp những cái của bản thân, ựồng thời nhận biết và thải bỏ những cái không phải của bản thân, xa lạ với cơ thể (đỗ Ngọc Liên, 1999) Dưới một phức hệ phức tạp tương tác giữa các tế bào ựược biết là hệ thống miễn dịch, chúng nhận biết tác nhân gây bệnh và các chất lạ rồi khởi ựộng một loạt các phản ứng khác nhau nhằm loại bỏ chúng ra khỏi cơ thế đó còn ựược gọi là sự ựáp ứng miễn dịch Những ựáp ứng miễn dịch nói chung ựược chia thành 2 lớp lớn: các ựáp ứng miễn dịch tự nhiên (không ựặc hiệu) và các ựáp ứng miễn dịch thu ựược (ựáp ứng miễn dịch ựặc hiệu)

Da: da cá khác so với các ựộng vật trên cạn là không hóa sừng và khả năng phục hồi của da rất nhanh khi bị tổn thương do sự hình thành lớp tế bào Malpighi

Trang 30

Page 20

huy ựộng từ các vùng lân cận Phản ứng phì ựại các tế bào Malpighi và lớp biểu bì cũng rất nhanh, giúp cho da trở thành một hàng rào vật lý tương ựối vững chắc ựể bảo vệ cơ thể (đặng Thị Hoàng Oanh, 2007) Ngoài ra, ở loài cá có vẩy thì hệ thống này sẽ bảo vệ da và cơ thể cá vững chắc hơn

Mang: là cơ quan ựặc biệt khác với các ựộng vật trên cạn Mang là nơi thực hiện quá trình hô hấp căn bản của cá, cũng là nơi tiếp xúc thường xuyên với các vi sinh vật bên ngoài môi trường Tuy nhiên, ở mang có sự tập trung của ựại thực bào rất cao Mang cũng ựược bao phủ bởi dịch nhờn và sự xuất hiện của các tế bào Malpighi giúp cho mang có khả năng thực hiện ựược chức năng chống lại các sinh vật từ bên ngoài môi trường

b Yếu tố miễn dịch không ựặc hiệu:

Theo đặng Thị Hoàng Oanh (2007), hệ thống miễn dịch không ựặc hiệu của

cá cũng bao gồm các nhân tố ức chế sinh trưởng như transferin, interferon, lysin trong bổ thể, protein phản ứng C và lectin Hàng rào tế bào như ựại thực bào, bạch cầu trung tắnh, bạch cầu ái toan và ái kiềm cũng ựóng vai trò quan trọng trong ựáp ứng miễn dịch ở cá, tuy nhiên sự hiểu biết về các tế bào này ở cá còn hạn chế

1.5.2 đáp ứng miễn dịch thu ựược ở cá (miễn dịch ựặc hiệu)

đáp ứng miễn dịch ựặc hiệu có tắnh ựặc hiệu cao ựối với tác nhân gây bệnh

Sự ựáp ứng này càng hoàn thiện sau mỗi lần tiếp xúc với tác nhân gây bệnh Hệ thống miễn dịch ựặc hiệu có thể ghi nhớ lại tác nhân gây bệnh và ngăn cản tác ựộng gây bệnh của chúng ở lần tiếp xúc lặp lại tiếp theo (đỗ Ngọc Liên, 1999)

a Cơ quan lympho:

Thận ựược xem là cơ quan lympho ngoại vi ở cá, nơi xảy ra quá trình bắt giữ,

xử lý và trình diện kháng nguyên cho hệ thống ựáp ứng miễn dịch Các tế bào lympho tham gia vào quá trình ựáp ứng miễn dịch cũng có nguồn gốc và chức năng gần giống như ựộng vật trên cạn (đặng Thị Hoàng Oanh, 2007)

b đáp ứng miễn dịch dịch thể:

Với vai trò tham gia quan trọng của các tế bào lympho B Ở cá, do thiếu tủy sống, sự trưởng thành và tăng sinh của các tế bào lympho B diễn ra ở lách và phần

Trang 31

Page 21

trước của thận (đỗ Ngọc Liên, 1999)

Cá chỉ tổng hợp ựược một lớp Ig (Immunoglobulin) tương ựương với IgM ở thú IgM ở cá xương có dạng tetreametric, ở cá sụn có dạng pentametric, trong khi ở

cá mập và cá ựuối có dạng monometric (Ambrosius và ctv, 1982; trắch dẫn từ Stoskopf S K, 1993) IgM là dạng Ig chủ yếu ựược tạo ra trong các ựáp ứng miễn dịch thì ựầu ở thú Ở cá không có kháng thể IgG IgM có vai trò hoạt hóa bổ thể, có vai trò trong sự opsonin hóa, trung hòa virus và sự ngưng kết (Tizard, 1987; trắch dẫn từ Stoskopf S.K, 1993)

Khi kháng nguyên xâm nhập vào trong cơ thể cá sẽ bị các tế bào trình diện kháng nguyên bắt giữ, xử lý và trình diện yếu tố quyết ựịnh kháng nguyên lên bề mặt làm kắch hoạt các tế bào lympho T Sau ựó, tế bào lympho T sẽ tác ựộng lên tế bào lympho B, chuyển tế bào này thành tương bào ựể sản sinh ra kháng thể Tương bào bắt ựầu xuất hiện và số lượng tăng lên nhanh chóng trong lách và thận khoảng 1 tuần sau khi có kắch thắch của kháng nguyên Kháng thể huyết thanh thường xuất hiện ngay trước thời ựiểm số lượng tương bào ựạt cực ựại khoảng ngày thứ 10-15 Hàm lượng Ig tăng lên mãnh liệt ựể ựạt cực ựại khoảng ngày thứ 20-30 sau khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể Như vậy so với ở ựộng vật có vú, pha mẫn cảm

ở cá kéo dài hơn nhưng thời gian duy trì hàm lượng kháng thể lâu hơn (đặng Thị Hoàng Oanh, 2007)

c Miễn dịch qua trung gian tế bào:

Các lympho bào T sinh ra từ tuyến ức của cá giúp cho sự ựáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào Sau các ựáp ứng của ựại thực bào, các lympho bào T Ờ helper

sẽ ựược kắch hoạt, trưởng thành thành các tế bào effector Nó nhận diện ựược kháng nguyên và gắn bám vào kháng nguyên thông qua các thể nhận trên bề mặt của các ựại thực bào, từ ựó kắch thắch ựại thực bào sản sinh các loại cytokine Cytokine tác ựộng gián tiếp gây ra một loạt các phản ứng nhờ các quần thể tế bào khác

d đáp ứng miễn dịch cục bộ ở mang:

Mang ựóng vai trò quan trọng trong việc tiếp thụ kháng nguyên, ựặc biệt là các kháng nguyên không hòa tan Ở mang có rất nhiều tế bào lympho, ựại thực bào và

Trang 32

Page 22

tương bào cư trú Mang có khả năng sản xuất kháng thể tại chỗ ựóng vai trò ựề kháng quan trọng ựối với các bệnh ở mang do vi khuẩn (đặng Thị Hoàng Oanh, 2007)

1.6 Một số thông tin về vacxin phòng bệnh cho cá

1.6.1 Nguyên tắc ứng dụng vacxin

Nguyên tắc của việc ứng dụng vacxin là dựa vào hai ựặc tắnh cơ bản của ựáp ứng miễn dịch ựặc hiệu đó là tắnh ựặc hiệu và sự ghi nhớ miễn dịch Các tế bào ghi nhớ cho phép hệ thống miễn dịch phát triển sự ựáp ứng mạnh hơn khi có lần tiếp xúc lặp lại với kháng nguyên Sự ựáp ứng thứ cấp này ựồng thời nhanh hơn và có hiệu quả hơn sự ựáp ứng ban ựầu Nguyên tắc của vacxin là sử dụng các vi sinh vật (vi khuẩn, virus) hoặc ựộc tố của chúng ựã ựược cải biến (làm yếu, gây chết) làm cho chúng trở nên một tác nhân không gây bệnh nhưng không làm mất tắnh kháng nguyên của chúng (Nguyễn đình Bảng và Nguyễn Thị Kim Hương, 2003)

Miễn dịch học cá có lịch sử ngắn hơn nhiều so với miễn dịch học người và thú đặc biệt từ khi nhiều nhược ựiểm của các biện pháp phòng trị bệnh theo con ựường hoá trị liệu bộc lộ nhiều nhược ựiểm, gây tác hại ựến người tiêu dùng và môi trường, việc nghiên cứu và sử dụng vacxin phòng bệnh cho cá càng trở nên cần thiết

1.6.2 Các dạng vacxin dùng cho cá

Vacxin chết (killed vaccine) là dạng vi sinh vật ựã ựược bất hoạt thông qua các phương pháp xử lắ hoá - lắ Hầu hết các vacxin ựược thương mại hiện nay ựể phòng

Trang 33

Page 23

các bệnh trên ñộng vật thuỷ sản ñều dựa vào phương pháp xử lí bằng formalin (Austin, 1984; trích dẫn từ Stoskopf S K, 1993) Ngoài ra còn sử dụng một số hoá chất như: chloroform và phenol, hoặc các tác nhân vật lí như: sodium hydroxide, sodiumdodecyl sulfate, nhiệt ñộ ñể giết chết vi sinh vật (Stoskopf S K, 1993) Vacxin nhược ñộc (attenuated vaccine): dùng các vi sinh vật ñã ñược làm yếu, bằng cách: xử lí vi sinh vật với hoá chất ở nồng ñộ cận ngưỡng chết, xử lí nhiệt ñộ thấp Phương pháp thông thường là nuôi cấy chúng ở môi trường không thích hợp hoặc với nhiệt ñộ không thuận lợi cho sự sinh trưởng Tuy nhiên vacxin dạng này vẫn chưa ñược thương mại hóa vì những e ngại là vi sinh vật dùng chế vacxin có thể trở nên có ñộc lực mạnh hơn

Hiện nay ngoài hai dạng vacxin phổ biến trên, các nhà nghiên cứu ñang khám phá khả năng làm tinh khiết các kháng thể từ các mầm bệnh hoặc tạo kháng thể qua các thao tác gen (còn gọi là vacxin tái tổ hợp) và vacxin ADN Vacxin ADN

có rất nhiều ưu ñiểm như chuẩn bị rất ñơn giản và có thể ñược sản xuất ở số lượng lớn Hơn nữa, vacxin ADN rất bền và có thể tồn tại ở những ñiều kiện nhiệt ñộ bất lợi tạo ñiều kiện dễ dàng trong vận chuyển, lưu giữ và phân phối Vacxin ADN còn có ưu ñiểm về khía cạnh miễn nhiễm do hệ miễn dịch nhận biết kháng nguyên ADN tương tự như nhận biết virus và vi khuẩn nội bào nên rất có hiệu lực trong việc bảo hộ cá với các trường hợp nhiễm virus và vi khuẩn Tuy nhiên, việc ứng dụng vacxin ADN vào sản xuất ñòi hỏi sự kiểm ñịnh về tính an toàn và khả năng bảo hộ của vacxin

1.6.3 Các phương pháp sử dụng vacxin cho cá

a Tiêm:

Hiện nay hầu hết các loại vacxin sử dụng cho ñộng vật có xương sống là ở dạng tiêm (injection), có thể tiêm dưới da, tiêm cơ hay tiêm xoang bụng (Souter, 1983; Stoskopf S K, 1993) Ở cá, tiêm xoang bụng (intraperitoneal = i.p.) cho hiệu giá kháng thể cao hơn (Austin, 1984; Wolf, 1988), nhưng nếu tiêm chủng với số lượng cá lớn sẽ không khả thi

b Ngâm:

Trang 34

Page 24

Phương pháp này thích hợp với cá nhỏ, nhưng cũng không nên chọn cá quá nhỏ vì sẽ tạo ñáp ứng miễn dịch kém do hệ thống miễn dịch chưa trưởng thành (Tatner và Horne, 1984; Manning và Mugal, 1985, trích dẫn từ Aasjord và Slinde, 1994) Các yếu tố ảnh hưởng tới việc hấp thụ kháng nguyên khi ngâm vacxin gồm có: nồng ñộ vacxin, thời gian ngâm, cỡ cá, Stress, ñộ pH, nồng ñộ muối trong dung dịch vacxin, nhiệt ñộ nước, chất gây mê, chất bổ trợ ñược sử dụng và dạng vacxin (dạng hạt hoặc dạng hoà tan)

c Cho ăn:

Phương pháp này ñơn giản là cho vacxin trộn với thức ăn, thực hiện dễ dàng trên số lượng lớn cá ở tất cả các kích cỡ, tiết kiệm thời gian, công sức và tránh tạo stress cho cá Tuy nhiên không phải loại vacxin nào cũng có thể sử dụng bằng phương pháp này

Trang 35

Page 25

Chương 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

2.1.1 Kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của vacxin phòng bệnh xuất huyết ở cá rô phi do

- Phương pháp ngưng kết trên phiến kắnh

- Phương pháp công cường ựộc

2.1.4 đánh giá ựộ dài miễn dịch của vacxin ở các thời ựiểm 21 ngày, 2 tháng, 3 tháng, 4 tháng, 5 tháng và 6 tháng

2.1.5 đánh giá hiệu quả của vacxin sau bảo quản 3 tháng, 6 tháng, 9 tháng, 12 tháng, 15 tháng

2.2 đối tượng nghiên cứu

Vacxin vô hoạt phòng bệnh xuất huyết ở cá rô phi do vi khuẩn

Streptococcus spp gây ra

2.3 Thời gian và ựịa ựiểm nghiên cứu

2.3.1 Thời gian nghiên cứu

đề tài ựược thực hiện từ tháng 6/2013 ựến tháng 9/2014

2.3.2 địa ựiểm nghiên cứu

Thắ nghiệm ựược thực hiện tại Khu thắ nghiệm ướt Công ty Cổ phần Dược

và Vật tư thú y (Hanvet) - 88 Trường Chinh, đống đa, Hà Nội

2.4 Nguyên liệu

- Mẫu vacxin vô hoạt phòng bệnh xuất huyết ở cá rô phi do vi khuẩn

Trang 36

Page 26

Streptococcus spp dạng nước

- Chủng vi khuẩn cường ñộc Streptococcus agalactiae và Streptococcus

iniae do Công ty Hanvet phân lập ñược

- Cá rô phi có trọng lượng 10 g ± 0,5 g, khoẻ mạnh, màu sắc cá tươi sáng, ñầy ñủ các bộ phận và bơi lội bình thường, không nằm trong ổ dịch và chưa ñược

tiêm vacxin phòng bệnh Streptococcosis Cá ñược nuôi thuần trong bể nuôi phòng

thí nghiệm (khoảng 3 tuần trước khi tiến hành thí nghiệm) ñể tạo sự ổn ñịnh hơn về ñiều kiện sống, các yếu tố môi trường, ngoại cảnh tác ñộng ñến quá trình sống của

cá so với cá sống bên ngoài tự nhiên

- Bể nuôi phòng thí nghiệm: bể nhựa, có thể tích 1 m3, ñặt trong nhà có mái che, sục khí liên tục và thay nước hàng ngày

- Môi trường nuôi cấy: môi trường NA (Nutrient Agar), BA (Blood Agar), BHIA (Brain heart infusion agar), Nutrient broth, Sabouraud dextrose agar, Thioglycolate

- Dụng cụ và hóa chất phòng thí nghiệm

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp thu mẫu cá bệnh

- Dụng cụ: túi nilon và găng tay

- Nguyên tắc thu mẫu cá bệnh:

Phải kiểm tra ngay khi cá ñược vớt lên khỏi mặt nước, các biểu hiện bệnh tích bên ngoài Ghi các triệu chứng cá bệnh trước khi thu mẫu

Cơ quan sử dụng ñể nuôi cấy phân lập vi khuẩn bao gồm gan, thận, lách, não

và mắt của cá rô phi có dấu hiệu bệnh ñiển hình, cá còn ñang sống hoặc mới chết Triệu chứng ñặc trưng của cá: dấu hiệu bên ngoài (cá có biểu hiện bất thường, lồi mắt hoặc nổ mắt, có các ổ áp-xe, xuất huyết ở da, dịch cổ trướng), dấu hiệu bên trong (viêm màng bụng, túi mật rất to, nhiễm trùng máu)

Dùng găng tay cho mẫu cá bệnh vào túi nilon

Thu mẫu cá bệnh vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm trong thời gian

Trang 37

Page 27

ngắn nhất

2.5.2 Phương pháp kiểm tra dấu hiệu bên ngoài và mổ khám bệnh tích

- Kiểm tra các dấu hiệu bên ngoài: quan sát cách cá bơi, mắt, vảy, da, vây bụng, hậu môn và mang của cá bệnh, nhận ñịnh sự khác biệt so với cá khỏe

- Mổ khám bệnh tích bên trong:

+ Mổ xoang bụng cá: trước khi tiến hành mổ cá, cá cần ñược ñánh vẩy sạch tại vị trí cần mổ, sau ñó dùng bông tẩm cồn 70o C sát trùng thật kĩ tại khu vực mổ ñể tránh sự nhiễm tạp của các vi khuẩn từ bên ngoài

• ðặt cá với phần bụng quay về phía người mổ

• Cắt bỏ vây lưng và vây ngực

ðường thứ ba: nối hai ñường cắt trên

Hình 2.1: ðường cắt giải phẫu xoang cơ thể cá

Dùng kẹp ñã khử trùng gắp bỏ phần cơ bụng cá ñã cắt

- Quan sát các mô và cơ quan sau: Quan sát dịch nhầy xoang bụng và màu của dịch nhầy, chất dịch có nhiều hay ít

Trang 38

Page 28

Gan: kiểm tra màu sắc, bề mặt, rìa của gan

Lách: như trên

Thận: kiểm tra màu sắc, kích cỡ

+ Mổ sọ não cá: Sát trùng mặt ngoài của vùng da phần sọ não cá bằng cồn

70º Sau ñó dùng kéo cắt một ñường ngay phía sau mắt cá, một ñường ngay trên ñỉnh nắp mang sao cho ñối xứng qua sống lưng cá Chiều dài ñường cắt khoảng 0,5

- 1 cm Cắt bỏ phần cơ và sụn giữa hai ñường cắt, sẽ bộc lộ phần não của cá .

Hình 2.2: Giải phẫu não cá

2.5.3 Phương pháp ñếm mật ñộ vi khuẩn

Phương pháp xác ñịnh gián tiếp số lượng tế bào bằng cách ñếm số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch

Xếp một dãy ống nghiệm vào giá ống nghiệm Dùng bút cồn ñánh số thứ tự

từ 1-n (n: số thứ tự của ống nghiệm cuối cùng, 10-n : nồng ñộ pha loãng nhỏ nhất ñể ñếm số) Dùng pipet loại 10ml hút 4,5ml nước muối sinh lý 0,9% vào từng ống nghiệm trên

Tiếp tục dùng pipet loại 1ml hút 0,5ml canh trùng nuôi cấy cho vào ống nghiệm thứ nhất, trộn ñều, dùng pipet thứ 2 hút 0,5ml canh khuẩn từ ống nghiệm 1 sang ống nghiệm 2, trộn ñều Hút 0,5ml canh trùng từ ống nghiệm thứ 2 sang ống nghiệm thứ 3 và cứ làm như thế cho ñến ống nghiệm cuối cùng Ta ñược dãy ống nghiệm có ñộ pha loãng canh khuẩn theo thứ tự 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-(n-1), 10-n

Hút 0,1ml canh khuẩn ở ống nghiệm thứ n, láng ñều trên môi trường thạch

Trang 39

Page 29

ñĩa (mỗi ñộ pha loãng cấy vào 3 ñĩa) ðem toàn bộ các ñĩa thạch ñược cấy canh khuẩn ñặt vào tủ ấm ở nhiệt ñộ 37oC trong 24 giờ Sau ñó, lấy ra ñếm số lượng khuẩn lạc mọc trên bề mặt thạch

Kết thúc thời gian ủ, lấy các ñĩa thạch ra, tiến hành ñếm khuẩn lạc và tính

số lượng tế bào trong 1 ml mẫu theo công thức:

Mi(CFU/ml) = Ai x Di/V Trong ñó :Ai: là số khuẩn lạc trung bình/ ñĩa

Di: là ñộ pha loãng

V: là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi ñĩa (ml)

Mật ñộ tế bào trung bình MI trong mẫu ban ñầu là trung bình cộng của Mi ở các nồng ñộ pha loãng khác nhau

2.5.4 Phương pháp phân lập vi khuẩn Streptococcus spp có trong mẫu bệnh phẩm

Mẫu vi khuẩn thường ñược lấy ở gan, thận và não Dùng mũi kéo ñã khử trùng cắt một vết nhỏ trên gan, thận, não ðưa que cấy vòng nhúng vào chỗ cắt, sau

ñó cấy ria trên môi trường thạch BHIA Ủ ở nhiệt ñộ phòng trong 18 - 24 h Sau 24h nuôi cấy mẫu, ta tiến hành quan sát màu sắc, hình thái và mật ñộ của khuẩn lạc ñã mọc

Khuẩn lạc Streptococcus spp trên môi trường BHIA có màu trắng ñục, hình tròn, rìa

ñều, bóng, lồi thấp, tâm hơi ñậm, ñường kính từ 0,5 - 0,7 mm

2.5.5 Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu vô trùng

Phương pháp kiểm tra dựa theo quy ñịnh về kiểm tra chỉ tiêu vô trùng vacxin dùng trong thú y theo TCN.161.92

Mỗi mẫu vacxin ñược kiểm tra trên các môi trường với số lượng như sau:

Định dạng
Số trang	79
Dung lượng	2,79 MB