Đề cương NCKH đáp ỨNG của tế bào đa NĂNG dây CHẰNG NHA CHU đối với vật LIỆU CALCIUM SILICATE CEMENT (BIODENTINETM) SO với AMALGAM NGHIÊN cứu IN VITRO

Bên cạnh những ưu điểm như khả năng bám dính vào mô răng cao, tínhtương hợp sinh học cao, độc tính thấp và đặc biệt là có thể kích thích tái tạo mô, chophép mô tiếp xúc trực tiếp với vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

*********

ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

ĐÁP ỨNG CỦA TẾ BÀO ĐA NĂNG DÂY CHẰNG NHA CHU ĐỐI VỚI VẬT LIỆU CALCIUM SILICATE CEMENT

MỤC LỤC

Danh mục bảng

Danh mục hình

Danh mục từ viết tắt

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CƠ SỞ CỦA SỰ LÀNH THƯƠNG MÔ NHA CHU 4

1.1.1 Cấu tạo mô nha chu 4

1.1.2 Cấu tạo và chức năng của dây chằng nha chu 5

1.1.2.1 Cấu tạo của dây chằng nha chu 5

1.1.2.2 Chức năng của dây chằng nha chu 6

1.1.3 Những nghiên cứu về vai trò của tế bào dây chằng nha chu trong lành thương mô nha chu 6

1.2 TẾ BÀO GỐC 8

1.2.1 Khái niệm tế bào gốc 8

1.2.2 Đặc tính tế bào gốc 8

1.2.3 Phân loại tế bào gốc 8

1.2.4 Tế bào gốc trung mô 9

1.2.4.1 Khái niệm tế bào gốc trung mô 9

1.2.4.2 Hình thái tế bào gốc trung mô 9

1.2.4.3 Một số tế bào gốc trung mô 9

1.2.4.4 Tế bào đa tiềm năng dây chằng nha chu người 10

1.3 QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ VẬT LIỆU SINH HỌC 11

1.3.1 Tính tương hợp sinh học 11

1.3.2 Sự gây độc tế bào 12

1.3.3 Các phương pháp thử nghiệm 12

1.3.3.1 Thử nghiệm tiếp xúc trực tiếp 12

1.3.3.2 Thử nghiệm sự khuếch tán qua agar 12

1.3.3.3 Thử nghiệm dịch chiết 13

1.4 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 14

1.4.1 Biodentine (Calcium silicate cement) 14

1.4.1.1 Thành phần cấu tạo 14

1.4.1.2 Tính chất vật liệu 15

1.4.1.3 Những nghiên cứu về độc tính của Biodentine trong nha khoa 16

1.4.2 Amalgam 18

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 20

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 21

2.2.2 Phương tiện nghiên cứu 21

2.2.2.1 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 21

2.2.2.2 Hoá chất 21

2.2.3 Các bước tiến hành nghiên cứu 22

2.2.3.1 Cấy chuyển và xác định mật độ tế bào 22

2.2.3.2 Chuẩn bị vật liệu tạo giá thể 25

2.2.3.3 Phương pháp đánh giá độc tính in vitro của vật liệu đối với tế bào dây chằng nha chu 25

2.2.3.4 Phương pháp đánh giá sự tăng sinh tế bào trên bề mặt vật liệu 27 2.2.3.5 Phương pháp đánh giá hình thái tế bào trên khối vật liệu bằng cách chụp ảnh SEM 28

2.2.4 Biến số nghiên cứu 29

2.2.4.1 Biến số độc lập 29

2.2.4.2 Biến số phụ thuộc 29

2.2.5 Thu thập, xử lý và phân tích số liệu 30

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KẾT QUẢ DỰ KIẾN 32

LỢI ÍCH CỦA ĐỀ TÀI 34

ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các mức độ phản ứng trong thử nghiệm tiếp xúc trực tiếp và khuếch tán qua agar 13

Bảng 1.2 Các mức độ phản ứng trong thử nghiệm dịch chiết 14

Bảng 1.3 Thành phần cấu tạo của Biodentine 15

Bảng 2.4 Một số dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 21

Bảng 3.5 Mức độ độc tính sau 24 giờ theo tiêu chuẩn ISO 10993 32

Bảng 3.6 Giá trị trung bình mật độ quang ở bước sóng 450 nm 32

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ cấu tạo mô nha chu 4

Hình 2.2 Buồng đếm tế bào 24

Hình 2.3 Nguyên tắc phương pháp MTT 27

Hình 2.4 Sơ đồ minh hoạ tế bào bám trải trên bề mặt vật liệu 29

Hình 3.5 Tế bào bám trải trên bề mặt vật liệu 33

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

PDLSCs Periodontal ligament stem cells

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium

FBS Fetal bovine serum

DMSO Dimethyl sulfoxide

PBS Phosphate Buffered Saline

EDTA Ethylene Diaminetetraacetid Acid

MTT 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-YL)-2, 5-diphenyl tetrazolium

SEM Scanning electron microscopy

RT- PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

ARN Ribonucleic Acid

SHED Stem Cells from Exfoliated Deciduous teeth

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong thực hành nội nha hàng ngày, các bác sĩ răng hàm mặt thường xuyên phảiđối mặt với những ca khó dễ dẫn tới thất bại Khi đó, vi khuẩn và những sản phẩmphụ của nó còn tồn tại trong hệ thống ống tuỷ sẽ thoát ra ngoài và đến mô nha chu đểgây bệnh Phẫu thuật nội nha được chỉ định để loại bỏ những chất độc từ hệ thốngống tuỷ trong trường hợp phương pháp tiếp cận từ trên xuống không khả thi do sựhiện diện của chốt và vật liệu trám vĩnh viễn khác trong ống tuỷ

Quá trình sửa chữa diễn ra trong các mô quanh chóp sau khi phẫu thuật cắt chóp

đã được chứng minh [6, 18] Sự lành thương xương sau phẫu thuật liên quan đến việctái cấu trúc của bè xương, tái tạo màng xương chức năng và xương vỏ Sự thành côngcuối cùng của phẫu thuật phụ thuộc vào sự tái cấu trúc của một hệ thống bám dínhchức năng, bao gồm cement phủ lên bề mặt chân răng cắt bỏ, dây chằng nha chu(PDL), và xương ổ răng [5] Phẫu thuật cắt chóp kết hợp với trám ngược bằng mộtvật liệu không những ngăn chặn lối ra của bất kỳ vi khuẩn còn lại hoặc các sản phẩmphụ của nó, mà còn cho phép sự hình thành của một màng nha chu bình thường trên

bề mặt bên ngoài của nó [21]

Trước đây, vật liệu nha khoa truyền thống được sử dụng phổ biến để trám ngược

là Almalgam Tuy nó có thể bị bào mòn, gây ra đổi màu mô mềm bên trên hoặc giảiphóng kim loại vào trong mô nhưng cho đến nay vẫn được đánh giá cao về sự dungnhận sinh học, đặc tính cơ học chịu nén tốt, ít thay đổi thể tích, độ khít sát cũng nhưtính an toàn vật liệu Nhiều loại vật liệu nha khoa thích hợp khác được sử dụng như làpolycarboxylate cement, IRM (Intermediate Restorative Material), Super EBAcement (ethoxybenzoic acid), glass ionomer cement, Gần đây, MTA (Mineraltrioxide aggregate) ra đời và được chỉ định sử dụng rộng rãi trong nội nha như trám

ngược sau phẫu thuật cắt chóp, điều trị thủng sàn, che tuỷ hay trám bít ống tuỷ [12,

23, 28, 33] Bên cạnh những ưu điểm như khả năng bám dính vào mô răng cao, tínhtương hợp sinh học cao, độc tính thấp và đặc biệt là có thể kích thích tái tạo mô, chophép mô tiếp xúc trực tiếp với vật liệu, MTA cũng bộc lộ một số nhược điểm nhưthời gian đông lâu, đặc tính cơ học thấp, khó thao tác, khó lưu trữ và giá thành cao

Do đó, những vật liệu mới ra đời và phát triển với những tính năng tương tự

nhưng khắc phục được những nhược điểm của MTA đặc biệt là calcium silicate

cement (Biodentine) được báo cáo là một trong những vật liệu có tính tương hợp sinh

học trong nha khoa hiện nay tức là khả năng của vật liệu có thể tạo ra sự đáp ứng phù

hợp của vật chủ Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu đánh giá độc tính in vitro của

calcium silicate cement (Biodentine) như nghiên cứu của Patrick Laurent và cộng

sự (2008) được thực hiện trên gen đối với bốn dòng vi khuẩn Salmonella

typhimurium, nguyên bào sợi tuỷ răng người và hiệu quả của calcium silicate cementtrên chức năng tế bào đích chuyên biệt bởi hoá mô miễn dịch; hoặc trên tế bào tuỷ

răng chuột được làm bất tử (OD-21) của Marjorie Zanini và cộng sự (2012); hoặc nghiên cứu của Camila M Corral Nũnez và cộng sự (2014) đánh giá sự sống của tế

bào và biểu hiện ARN thông tin của IL-1α và IL-6 trong tế bào nguyên bào sợi 3T3(dòng tế bào nguyên bào sợi phôi chuột) khi tiếp xúc trực tiếp với Biodentine và

MTA; hoặc Andriara De Rossi và cộng sự (2014) đánh giá tuỷ răng và mô quanh

chóp của 60 chân răng chó sau khi thực hiện lấy tuỷ buồng, che tuỷ với Biodentine và

so sánh với MTA bởi phim quanh chóp, phân tích mô học, vi sinh Tuy các nghiên

cứu đều cho rằngvật liệu này có tính tương hợp sinh học và có thể được dùng an

toàn trên lâm sàng đặc biệt là phục hồi trám các răng sau, che tuỷ trực tiếp, có tiềmnăng thay thế vật liệu truyền thống trong phẫu thuật nôi nha; nhưng cho đến nay,

chưa có nghiên cứu về đáp ứng sinh học đặc biệt là sự đáp ứng của tế bào đa năng

dây chằng nha chu người - quyết định sự lành thương lý tưởng của mô nha chu sau

phẫu thuật cắt chóp kết hợp với trám ngược của loại vật liệu này

Câu hỏi nghiên cứu:

Có hay không có sự đáp ứng của tế bào đa năng dây chằng nha chu đối với vật liệu Calcium silicate cement (Biodentine TM ) so với vật liệu truyền thống Amalgam?

Mục tiêu tổng quát:

Xác định sự đáp ứng của tế bào đa năng dây chằng nha chu đối với vật liệu

Mục tiêu chuyên biệt:

1 Xác định và so sánh mức độ phản ứng của tế bào đa năng dây chằng nha chu (thế hệ tế bào P4) khi tiếp xúc với dịch chiết của Biodentine và Amalgam nhằm đánh giá mức độ độc tính in vitro

2 Xác định và so sánh trung bình mật độ quang OD của tế bào đa năng dây chằng nha chu khi tiếp xúc với Biodentine và Amalgam nhằm đánh giá khả năng tăng sinh của tế bào bằng phương pháp MTT.

3 Đánh giá hình thái của tế bào đa năng dây chằng nha chu khi tiếp xúc với

Biodentine và Amalgam dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM).

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CƠ SỞ CỦA SỰ LÀNH THƯƠNG MÔ NHA CHU

1.1.1 Cấu tạo mô nha chu

Mô nha chu được cấu tạo do tập hợp của các mô duy trì và nâng đỡ răng Bốnthành phần của mô nha chu là nướu, dây chằng nha chu, xương ổ răng và xê măngchân răng

Hai thành phần mô khoáng hoá là xương ổ răng và xêmăng là những trụ cột, nhờ

đó các sợi dây chằng nha chu neo chặt răng vào xương ổ Sự phân phối của mô sợi vàkhoáng hoá của mô nha chu khác nhau do cấu tạo protein, các phần tử tế bào, sựkhoáng hoá, chuyển hoá và do chức năng của chúng

Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo mô nha chu

1.1.2 Cấu tạo và chức năng của dây chằng nha chu

1.1.2.1 Cấu tạo của dây chằng nha chu

Dây chằng nha chu (màng nha chu) là một mô liên kết chặt chẽ, có nhiều tế bào,nhiều sợi, nằm giữa bề mặt chân răng và xương ổ chính danh, nối xê măng chân răngvới xương ổ Ở đỉnh xương ổ, nó liên tục với mô liên kết của nướu dính

Về mặt mô học, các tế bào của dây chằng nha chu có thể được xếp thành ba nhómlớn theo nguồn gốc và vai trò của chúng:

 Tế bào mô liên kết: gồm có

- Nguyên bào sợi: Là những tế bào chủ yếu của mô liên kết, chiếm 65% tổng

số các loại tế bào, nằm giữa những sợi collagen có hướng song song với cácsợi Nguyên bào sợi cóliên quan trực tiếp đến việc tạo ra các protein ngoại tiết

có chức năng tạo ra nhiều dạng sợi collagen khác nhau và các proteoglycan.Nguyên bào sợi có hoạt tính phophatase kiềm tương tự hoạt tính của các tạocốt bào

- Nguyên bào xương, huỷ cốt bào

- Nguyên bào xê măng, huỷ ngà bào

- Tế bào tiền sinh xê măng và tiền sinh xương (tế bào trung mô không biệt hoá, đa năng): nằm kề các vùng xê măng và xương Về mặt hình thái, chúng

gần giống như các nguyên bào sợi không hoạt động Những tế bào này có khảnăng thay thế (bằng cách phân chia và biệt hoá) một trong những loại tế bào cótrong khoảng nha chu

 Tế bào biểu mô còn sót lại của bao Hertwig.

 Tế bào bảo vệ gồm các đại thực bào monocyte, lymphocyte, tương bào,

Ngoài ra, khung ngoại bào của dây chằng nha chu có bốn nhóm phân tử lớn

chính gồm collagen lưới và elastin có trong thành phần của khung ngoại bào

Proteoglycan và glycoprotein của cấu trúc tạo ra phần keo còn gọi là chất căn bản cùng với hệ thống mạch máu và thần kinh phong phú.

1.1.2.2 Chức năng của dây chằng nha chu

Các bó sợi collagen của dây chằng nha chu thực hiện chức năng giữ chặt răng.Mạng huyết quản và bạch mạch mang lại dưỡng chất và loại bỏ những chất chuyểnhoá của mô mềm trong màng nha chu và một phần nướu Những sợi thần kinh đi theo

hệ mạch máu và bạch mạch đem các kích thích đến những thành phần cơ của nhữngthành mạch và phần khác là cảm nhận các phản xạ của nha chu Ngoài ra, dây chằngnha chu còn giữ vai trò của màng xương cho xê măng và xương ổ răng Những tế bàocủa dây chằng nha chu liên hệ trực tiếp đến sự thành lập và tiêu huỷ các mô này

1.1.3 Những nghiên cứu về vai trò của tế bào dây chằng nha chu trong lành thương mô nha chu

Melcher và cộng sự (1970) đã đề xuất rằng các tế bào của dây chằng nha chu và tế bào "con cháu" của nó thể hiện khả năng ức chế tạo xương, một quan điểm được hỗ

trợ bởi Line, Polson và Zander (1974) và đã tiếp tục đề nghị (Melcher 1976) rằng các

tế bào dây chằng nha chu và các tế bào xương có thể ngăn chặn lẫn nhau xâm nhậpvào các khu vực tương ứng của chúng

Nghiên cứu của Andreasen và cộng sự (1972) đánh giá kiểu lành thương dựa trên môhọc của 70 ca phẫu thuật nội nha cho thấy thấy kết quả phẫu thuật chóp có thể đượcchia thành ba loại chính: (1) lành thương với sự hình thành các màng nha chu hoặcankylosis, và không có hoặc viêm quanh chóp nhẹ, (2) lành thương bằng sự hìnhthành các mô xơ (mô sẹo ), thỉnh thoảng có sự ankylosis, và các mức độ khác nhau

của hiện tượng viêm, và (3) viêm quanh chóp vừa hoặc nặng mà không có các vếtsẹo.

Gould và cộng sự (1980) đã nghiên cứu về sự di cư và phân chia của quần thể tếbào tổ tiên của dây chằng nha chu sau khi lành thương ở chuột cho thấy rằng 3 ngàysau khi dây chằng nha chu bị hoại tử, có sự hiện diện một lượng lớn nguyên bào sợi ởdây chằng kế cận tổn thương và ở trong tổn thương sau 5 ngày cùng với xê măng bào,

tế bào tạo xương di cư đến bề mặt mô nha chu và xương ổ răng tại mép tổn thương

Boyko và cộng sự (1981) đã nhổ các răng tiền hàm từ tám con chó, và lấy các tế bào

từ dây chằng nha chu và nướu dính nuôi trong ống nghiệm Các răng cửa bên được

nhổ sau và được trám bít ống tuỷ, sau đó chia thành ba nhóm Tế bào nướu nuôi cấy

đã được gắn liền với những chân răng trong nhóm đầu tiên, các tế bào dây chằng nhachu gắn với những chân răng trong nhóm thứ hai và nhóm thứ ba không được gắn tếbào đóng vai trò là nhóm chứng Các chân răng được cấy chuyển vào các lỗ xương ổrăng của răng cối nhỏ hàm dưới đã mất và được bao phủ hoàn toàn bởi một vạt nướu.Kết quả thu được là tất cả các chân răng đều bị ankylosis và tiêu trừnhững chân răng

mang tế bào dây chằng nha chu được nuôi cấy đã liên kết với những mảnh mô sợi

mới được xác định là dây chằng nha chu trên cơ sở định hướng các sợi của nó, đồngthời có sự hiện diện của các sợi Sharpey trong xương và răng, và nguyên bào xương

và nguyên bào cement ở vị trí bình thường

Nghiên cứu của Nymanvà cộng sự (1982) cũng cho rằng có thể hình thành bám dínhmới trên bề mặt chân răng trên bệnh nhân bị nha chu viêm dẫn đến mất bám dính từcác tế bào có nguồn gốc từ dây chằng nha chu Isidor và cộng sự (1986) cũng đã đưa

ra kết luận rằng sự hiện diện của các tế bào có nguồn gốc từ dây chằng nha chu làmột điều kiện tiên quyết cho sự hình thành bám dính mới nhằm tái lập quần thể nhachu của bề mặt chân răng bị cắt rời

Để hiểu rõ vai trò của các tế bào trong quá trình tái tạo mô nha chu, Somermanvàcộng sự (1988) đã tiến hành nghiên cứu so sánh các tế bào dây chằng nha chu và cácnguyên bào sợi nướu người trong ống nghiệm Kết quả là sự sản xuất protein vàcollagen trong các tế bào dây chằng nha chu lớn hơn đáng kể so với các nguyên bàosợi nướu Ngoài ra, các tế bào dây chằng nha chu có nồng độ phosphatase kiềm caohơn khi so sánh với các nguyên bào sợi nướu.

1.2 TẾ BÀO GỐC

1.2.1 Khái niệm tế bào gốc

Tế bào gốc là những tế bào không (hoặc chưa) chuyên hóa trong mô sống, có khảnăng trở thành các tế bào chuyên hóa với các chức phận sinh lý

1.2.2 Đặc tính tế bào gốc

bào nguyên nhiễm, mà vẫn duy trì trạng thái không biệt hóa

kiểu tế bào trưởng thành nào Trên thực tế, đặc tính này chỉ đúng với các tế bàogốc toàn năng, hoặc vạn năng Tuy nhiên, một tế bào gốc đa năng (hay tế bàotiền thân) cũng nhiều khi được gọi là tế bào gốc

1.2.3 Phân loại tế bào gốc

Với các tác giả khác nhau, có thể có những cách phân loại khác nhau Hiện nay, tácgiả Shinyya Yamanaka và James Thompson (2008) đề nghị phân loại, chia tế bào gốcthành năm nhóm chính (3):

 Tế bào gốc phôi: thu nhận từ phôi giai đoạn tiền làm tổ

 Tế bào gốc nhũ nhi: thu nhận từ thai, mô máu cuống rốn, nhau thai, dịch ối,

 Tế bào gốc trưởng thành: thu nhận từ cơ thể trưởng thành

 Tế bào gốc vạn năng cảm ứng: có thể tạm hiểu là tế bào gốc phôi nhân tạo, cótiềm năng như các tế bào gốc phôi (được tạo ra do có sự thao tác in vitro trênchính bộ gene đã biệt hoá chức năng của chúng).

 Tế bào gốc ung thư: được coi là nguồn gốc của khối u và chỉ có trong các khốiu

1.2.4 Tế bào gốc trung mô

1.2.4.1 Khái niệm tế bào gốc trung mô

Tế bào gốc trung mô là các tế bào gốc đa tiềm năng có thể biệt hóa thành nhiều loại

tế bào khác nhau Dưới điều kiện thích hợp chúng có thể biệt hóa thành nhiều loại tếbào chuyên hóa như như tế bào mỡ, sụn, xương, cơ, thần kinh và beta của tụy đảo…

1.2.4.2 Hình thái tế bào gốc trung mô

Khi chưa biệt hóa, tế bào gốc trung mô có hình dạng giống tế bào fibroblast (hìnhthoi dài)

1.2.4.3 Một số tế bào gốc trung mô

Tế bào gốc trung mô có mặt ở nhiều mô khác nhau trong cơ thể người trưởng thành

và chúng có khả năng tạo ra các tế bào đảm nhận các chức năng chuyên biệt tại mô

đó Hiện nay, tế bào gốc trung mô chủ yếu được thu nhận từ tủy xương, máu cuốngrốn, mô mỡ, răng Ngoài ra, trong màng xương, màng hoạt dịch, cơ, lớp da nằm dướibiểu bì, máu,…cũng có tế bào gốc trung mô

Loại tế bào gốc của răng người được phân lập đầu tiên là tế bào từ mô tủy răng(dental pulp stem cells - DPSCs) của răng khôn (Gronthos và cs., 2000) Các tế bàonày cho thấy có khả năng biệt hóa thành tế bào dạng nguyên bào ngà và tạo mô dạngphức hợp ngà-tủy khi cấy dưới da chuột đã bị suy giảm miễn dịch Tiếp theo, nhiềuloại tế bào gốc trung mô của răng đã được phân lập như tế bào gốc từ răng sữa rụng

(stem cells from exfoliated deciduous teeth - SHED) (Miura và cs.,2003), tế bào gốc

từ dây chằng nha chu (periodontal ligament stem cells - PDLSCs) (Seo và cs., 2004),

tế bào gốc bao răng (dental follicle precursor cells - DFPCs) (Morsczeck và cs.,2005) và tế bào gốc nhú chóp răng (stem cells from apical papilla - SCAP)(Sonoyama và cs., 2006, 2008)

1.2.4.4 Tế bào đa tiềm năng dây chằng nha chu người (tế bào gốc trung mô)

Gần đây, việc phân lập tế bào gốc ở người từ mô dây chằng nha chu người(PDLSCs) đã mở ra những cơ hội mới cho ngành kỹ thuật mô nha khoa PDLSCs cónhững đặc tính điển hình của tế bào gốc trung mô có nguồn gốc tuỷ xương như khảnăng tự làm mới, biểu hiện những marker bề mặt tương tự như tế bào gốc trung mô

có nguồn gốc tuỷ xương như là CD10, CD13, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90 vàCD105 PDLSCs cũng sở hữu đặc tính đa tiềm năng để biệt hoá thành những loại tếbào khác như nguyên bào xương, tế bào tạo mỡ, tế bào tạo sụn, tế bào tạo thần kinh

in vitro Thêm vào đó, PDLSCs có khả năng đặc biệt hình thành xê măng và môtương tự dây chằng nha chu in vivo Các dữ liệu cho thấy rằng PDLSCs có đủ haiđặc tính của tế bào gốc sinh dưỡng (tế bào gốc trưởng thành có thể tự làm mới và biệthóa thành các tế bào chuyên hóa về chức năng) (Seo và cộng sự (2004), Bartold vàcộng sự (2006), Huang và cộng sự (2009), Wada (2009), Feng và cộng sự (2010))

Ha Le Bao Tran và cộng sự (2014) - Bộ môn sinh lý học và công nghệ sinh học độngvật thuộc trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia Thành phố HồChí Minhđã nuôi cấy thành công tế bào từ mô dây chằng nha chu ở người Tế bàodây chằng nha chu biểu hiện những marker của tế bào gốc trung mô như CD44,CD73 và CD90 và cũng sở hữu đặc tính đa tiềm năngcó thể biệt hoá thành những loại

tế bào khác nhau như nguyên bào xương và tế bào tạo mỡ in vitro

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng tế bào dây chằng nha chu đa tiềm năng

ở người có nguồn gốc từ phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn sinh lý học và công nghệ

sinh học động vật thuộc trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc GiaThành phố Hồ Chí Minh

1.3 QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ VẬT LIỆU SINH HỌC

Chúng ta cần đánh giá để xác định được vật liệu sinh học có khả năng tương hợpsinh học hay không và liệu chúng có thể thực hiện chức năng phù hợp trong môi

trường in vivo hay không? Các kết quả đánh giá trong điều kiện in vitro có thể cung cấp các dữ liệu về sự tương tác sinh học nhanh và ít tốn kém Khi được áp dụng hợp

lý, các thử nghiệm in vitro sẽ cung cấp những kiến thức hữu ích để đưa ra quyết định

có nên tiếp tục đánh giá vật liệu này trong những mô hình thí nghiệm in vivo tốn kémhay không

1.3.1 Tính tương hợp sinh học

Tính tương hợp sinh học là khả năng thực hiện chức năng cùng với một đáp ứngthích hợp của cơ thể chủ trong một tình huống đặc trưng Thuật ngữ "tính tương hợpsinh học" ngụ ý đến tính tương hợp hoặc hoà hợp với hệ thống sống

1.3.2 Sự gây độc tế bào

Sự gây độc tế bào là sự gây ra các tác động độc ở mức tế bào như giết chết, thayđổi tính thấm màng tế bào, ức chế hoạt động của enzyme Một vật liệu được gọi làđộc khi nó giải phóng một lượng hoá chất đủ để giết chết tế bào theo cách trực tiếphoặc gián tiếp thông ức chế các con đường trao đổi chất chính Số lượng tế bào bị ảnhhưởng sẽ cho biết liều lượng và độc lực của hoá chất

1.3.3 Các phương pháp thử nghiệm

1.3.3.1 Thử nghiệm tiếp xúc trực tiếp

Thử nghiệm này được thiết kế cho các vật liệu có nhiều hình dạng khác nhau Thửnghiệm này không thích hợp cho các vật liệu có tỉ trọng rất thấp hoặc rất cao vì có thểgây hư hỏng tế bào do cơ học Độc tính được đánh giá thông qua sự vắng mặt của các

tế bào được nhuộm bên dưới và xung quanh mẫu thử nghiệm Các mẫu thử đượcđánh giá là đạt yêu cầu nếu mức phản ứng từ 2 trở xuống (phản ứng nhẹ) theo bảng1.1

1.3.3.2 Thử nghiệm sự khuếch tán qua agar

Agar phải có chất lượng tốt để hỗ trợ sự tăng trưởng của tế bào và lớp agar phải đủmỏng để cho phép khuếch tán các chất rò rỉ Trong thử nghiệm này, thuốc nhuộmsống (đỏ trung tính) thường trộn trong agar để dễ quan sát các tế bào sống (các tế bàosống khoẻ mạnh hấp thụ và giữ lại nên có màu).Do đó, độc tính được đánh giá thôngqua sự mất màu thuốc nhuộm bên dưới và xung quanh mẫu thử nghiệm Các mẫu thửđược đánh giá là đạt yêu cầu nếu mức phản ứng từ 2 trở xuống (phản ứng nhẹ)

Bảng 1.1: Các mức độ phản ứng trong thử nghiệm tiếp xúc trực tiếp và khuếch tán

qua agar

Mức độ Phản ứng Mô tả vùng phản ứng

0 Không Không thể phát hiện được vùng phản ứng xung

quanh và bên dưới mẫu

1 Rất nhẹ Một ít tế bào bị chuyển dạng hoặc bị thoái hoá

bên dưới mẫu

2 Nhẹ Có xuất hiện vùng phản ứng giới hạn bên dưới

mẫu

3 Vừa Vùng phản ứng lan xa mẫu 0,5 - 1,0 cm

4 Nghiêm trọng Vùng phản ứng lan xa mẫu hơn1,0 cm

1.3.3.3 Thử nghiệm dịch chiết

Thử nghiệm này phù hợp cho những vật liệu tỉ trọng cao và cho các đánh giá đápứng liều Quy trình chiết mẫu được thực hiện ở điều kiện nhiệt độ sinh lý hoặc khôngsinh lý trong những khoảng thời gian gián đoạn Chuẩn bị dịch chiết vật liệu: sử dụngmôi trường nuôi không chứa hoặc có chứa huyết thanh, diện tích bề mặt mẫu thử trên

1 ml chất chiết (0,1-0,2 g vật liệu) Môi trường nuôi cấy có huyết thanh làm chất chiết

có thể mô phỏng theo điều kiện sinh lý hơn Độc tính đối với tế bàođược đánh giá sau

24 giờ ủ ở nhiệt độ chiết là 37 ± 1oC trong tủ CO2 Các tế bào sống hay chết có thểđược phân biệt bằng cách nhuộm sống hoặc hoá mô.Các dịch chiết của mẫu thử đượcđánh giá là đạt yêu cầu nếu mức phản ứng từ 2 trở xuống (phản ứng nhẹ) theo bảng1.2

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng thử nghiệm dịch chiết vì Biodentine vàAmalgam có tỉ trọng cao và môi trường sử dụng để chuẩn bị dịch chiết làDMEM/F12 thương mại (Sigma)

Bảng 1.2: Các mức độ phản ứng trong thử nghiệm dịch chiết

Mức độ Phản ứng Tình trạng của đĩa nuôi

0 Không Các hạt trong bào tương riêng rẽ, không có sự

ly giải tế bào

Không quá 20% tế bào ở dạng tròn, bám dính lỏng lẻo và không có hạt trong bào tương, thỉnhthoảng xuất hiện các tế bào ly giải

Không quá 50% tế bào ở dạng tròn và không cóhạt trong bào tương, không có sự ly giải tế bào lan rộng và vùng trống giữa các tế bào

3 Vừa Không quá 70% lớp đơn tế bào chứa tế bào

dạng tròn hoặc bị ly giải

4 Nghiêm trọng Lớp đơn tế bào gần như bị phá huỷ hoàn toàn

1.4 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

1.4.1 Biodentine (calcium silicate cement)

1.4.1.1 Thành phần cấu tạo

Bảng 1.3:Thành phần cấu tạo của Biodentine

Bột

Tri-calcium Silicate (C3S) Thành phần vật liệu chính Di-calcium Silicate (C2S) Thành phần vật liệu phụCalcium Carbonate và Oxide Chất độn

 Thời gian làm việc trong 6 phút và đông cứng hoàn toàn là 12 phút CaCl2 làmột trong những chất xúc tác hiệu quả nhất của quá trình hydrat hoá và đôngcứng Việc thêm CaCl2 vào pha chất lỏng có tác dụng làm giảm thời gian đôngcứng của vật liệu

 Vật liệu có tính cản quang nhờ oxide zirconium

 Vật liệu chịu lực nén tốt do không có thành phần aluminate và tạp chất khác

Ứng dụng lâm sàng: phục hồi sang thương sâu răng sâu và lớn bên cạnh những chỉ

định trong nội nha như sửa chữa thủng sàn, tiêu chân răng, kích thích đóng chóp vàtrám ngược

1.4.1.3 Những nghiên cứu về độc tính của Biodentine trong nha khoa

Patrick Laurent và cộng sự (2008) đánh giá độc tính in vitro trên gen đối với bốn

dòng vi khuẩn Salmonella typhimurium, nguyên bào sợi tuỷ răng người và hiệu quảcủa calcium silicate cement trên chức năng tế bào đích chuyên biệt bởi hoá mô miễndịch đã đưa ra kết luận vật liệu mới không ảnh hưởng chức năng của tế bào đích nhưnhư sự khoáng hoá, biểu hiện collagen loại 1, biểu hiện gen tiền ngà Như vậy,

cement mới có tính tương hợp sinh học và có thể được dùng an toàn trên lâm sàng

đặc biệt là phục hồi trám các răng sau, có tiềm năng thay thế vật liệu truyền thốngtrong phẫu thuật nội nha

Marjorie Zanini và cộng sự (2012) thực hiện nghiên cứu đánh giá hiệu quả sinh

học của Biodentine trên tế bào tuỷ răng chuột được làm bất tử (21) Tế bào

OD-21 được nuôi cấy trong môi trường có hoặc không có Biodentine Tác giả đánh giávật liệu trên sự tăng sinh tế bào sau 2, 3, 5 ngày kích thích, trên mức độ gen với kỹthuật RT-PCR, trên mức protein bằng cách đo hoạt động photphatase kiềm và nhuộm

tế bào để định lượng sự khoáng hoá sinh học Tác giả đã đưa ra kết luận Biodentine

có hoạt tính sinh học vì có sự tăng sinh tế bào OD-21 và khoáng hoá sinh học khi sosánh với nhóm chứng Vì vậy, Biodentine có thể được xem như là vật liệu thích hợptrên lâm sàng đối với chỉ định tái tạo phức hợp ngà-tuỷ cụ thể là che tuỷ trực tiếp

Nghiên cứu của Camila M Corral Nũnez và cộng sự (2014) đánh giá sự sống của

tế bào và biểu hiện ARN thông tin của IL-1α và IL-6 trong tế bào nguyên bào sợi 3T3(dòng tế bào nguyên bào sợi phôi chuột) khi tiếp xúc trực tiếp với Biodentine vàMTA Nhóm thử nghiệm bao gồm Biodentine và MTA được phủ lên một nắp trượt,nhóm chứng bao gồm mẫu không được phủ vật liệu và mẫu còn lại được phủ bởi vậtliệu GIC Fuji IX Nắp trượt này được thực hiện nuôi cấy với tế bàonguyên bào sợi3T3 Đánh giá sự sống tế bào bằng cách sử dụng chất nhuộm Alamar Blue sau 3, 6,

24, 72 giờ Đánh giá sự thay đổi hình thái tế bào khi tiếp xúc với Biodentine và MTAbằng cách quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét và biểu hiện cytokine ở mức ARNthông tin bởi RT-PCR sau 3, 24 giờ tiếp xúc trực tiếp với vật liệu.Kết quả nghiên cứu