Nghiên cứu đột biến trên gen FLT3 ở một số bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘITRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---HOÀNG NHẬT LỆ NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN TRÊN GEN FLT3 Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN LƠ XEMI CẤP DÒNG TỦY Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm M

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-HOÀNG NHẬT LỆ

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN TRÊN GEN FLT3

Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN LƠ XEMI CẤP

DÒNG TỦY

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 TS LÊ XUÂN HẢI

2 GS.TS PHAN TUẤN NGHĨA

Hà Nội - Năm 2014

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Phan Tuấn Nghĩa, TS Lê XuânHải những người thầy tận tâm đã hướng dẫn, dìu dắt, dành nhiều thời gian quí báu,tạo mọi điều kiện tốt nhất và tâm huyết giúp đỡ cho em hoàn thành luận văn này.Tôi cũng bày tỏ lòng cảm ơn chân thành nhất đến TS Phạm Bảo Yên, ThS.Trịnh Lê Phương, ThS Ngô Kim Toán và cùng toàn thể các bạn sinh viên thực tậptại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và protein đã giúp đỡ và chia

sẻ kinh nghiệm thực tế trong quá trình thực hiện thí nghiệm phân tích đột biến gen.Tôi cũng xin được cảm ơn chân thành nhất tới GS.TS Nguyễn Anh Trí, Việntrưởng Viện Huyết học- Truyền máu TW, đã hết sức tạo điều kiện để tôi hoàn thànhchương trình học đào tạo của một học viên cao học

Tôi cũng chân thành cảm ơn Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học và Bộ môn Sinh

lý thực vật và Hóa sinh, các thầy cô trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên đã giúp đỡ tận tình trong thời gian tôi học và hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tập thể Khoa H7, Phòng Kếhoạch tổng hợp, Khoa Huyết thanh học nhóm máu, Khoa Lưu Trữ và Phân phốimáu, Phòng Tổ chức cán bộ và các Khoa phòng trong Viện đã luôn tạo điều kiện tốtnhất cho tôi trong suốt những năm tháng tôi học tập và thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình thân yêu của tôi đãđồng hành, động viên về mặt tinh thần cũng như vật chất để tôi có thể yên tâm hoctập, công tác và hoàn thành luận văn

Hoàng Nhật Lệ

FAB: French - American - British

FLT3: FMS related tyrosin kinase

SLTC: Số lượng tiểu cầu

WHO: Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization)TB: Tế bào

TBBT: Tế bào bất thường

TKD: Tyrosin kinase domain

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ .1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Giới thiệu chung về AML .3

1.1.1 Lịch sử phát hiện AML 3

1.1.2 Phân loại bệnh AML 4

1.1.3 Phân loại bệnh theo FAB .6

1.2 Tình trạng mắc bệnh AML .9

1.2.1 Tình trạng mắc bệnh AML trên thế giới 9

1.2.2 Tình trạng mắc bệnh AML ở Việt Nam 10

1.3 Một số nguyên nhân gây bệnh AML .11

1.3.1.Yếu tố di truyền .11

1.3.2 Yếu tố môi trường .11

1.3.3 Virus .12

1.3.4 Bất thường về nhiễm sắc thể 12

1.3.5 Các yếu tố khác .13

1.3.6 Cơ chế bệnh sinh của AML 13

1.4 Gen FLT3 và các loại đột biến trên gen FLT3 14

1.4.1 Cấu trúc và chức năng của gen FLT3 (hình 1.6 và hình 1.7) .14

1.4.2 Ý nghĩa của xét nghiệm phát hiện đột biến gen FLT3 trong tiên lượng điều trị AML 17

1.4.3 Các loại đột biến trên gen FLT3 .18

1.4.4 Phương pháp phát hiện đột biến trên gen FLT3 .20

Chương 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .22

2.1 Đối tượng nghiên cứu .22

2.2 Vật liệu nghiên cứu .22

2.3 Các thiết bị máy móc dùng trong nghiên cứu .23

2.4 Các phương pháp nghiên cứu .24

2.4.1 Đánh giá tình trạng bệnh nhân bằng các tiêu chí lâm sàng 24

2.4.2 Tách chiết và định lượng DNA tổng số .25

2.4.4 Điện di phân tách DNA trên gel agarose .27

2.4.5 Nhân bản gen bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu của gen FLT3 27 2.4.6 Nhân dòng gen FLT3 vào E coli 29

2.4.7 Xác định trình tự gen theo nguyên lý của Sanger và cộng sự 30

2.5 Phân tích, xử lý số liệu theo phương pháp nghiên cứu .31

Chương 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN .32

3.1 Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh nhân AML chọn nghiên cứu sự có mặt của đột biến gen FLT3 .32

3.1.1 Tỷ lệ % mắc bệnh AML theo tuổi .32

3.1.2 Tỷ lệ % mắc bệnh AML theo giới 34

3.1.3 Tỷ lệ % mắc bệnh AML theo phân loại FAB 35

3.1.4 So sánh hiệu quả điều trị lâm sàng giữa nhóm có đột biến và không có đột biến FLT3-ITD 36

3.2 Phân tích sự có mặt của đột biến gen FLT3 .37

3.2.1 Tách chiết DNA tổng số 37

3.2.2 Nhân bản đoạn gen mã hóa FLT3 bằng PCR .38

3.2.3 Nhân dòng FLT3 vào vector .40

3.2.4 Xác định trình tự gen FLT3 mang gen đột biến .42

3.2.5 Phân tích kết quả đột biến gen FLT3 - ITD với đột biến nhiễm sắc thể 43 3.3 Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh nhân có đột biến gen FLT3 44 3.3.1 Đặc điểm tế bào ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-ITD .44

3.3.2 Đặc điểm lâm sàng liên quan đến tình trạng xuất huyết của bệnh nhân AML 45 3.3.3 Đặc điểm lâm sàng liên quan đến tình trạng thiếu máu của bệnh nhân AML 46 KẾT LUẬN .47

KIẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại AML 2001 và 2008 của WHO 5

Bảng 1.2 Ý nghĩa tiên lượng của đột biến FLT3 ở bệnh nhân trưởng thành 17

Bảng 1.3 Nhóm tiên lượng theo NCCN 2013 18

Bảng 2.1 Thành phần của phản ứng PCR 28

Bảng 3.1 So sánh tỷ lệ mắc bệnh AML theo tuổi của các tác giả 32

Bảng 3.2 Tỷ lệ % mắc bệnh AML theo phân loại FAB 35

Bảng 3.3 Tỷ lệ xuất hiện đột biến gen FLT3-ITD với đột biến nhiễm sắc thể 43

Bảng 3.4 Đặc điểm tế bào ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-ITD 44

Bảng 3.5 So sánh tình trạng thiếu máu của BN giữa hai nhóm 46

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M2 7

Hình 1.2 Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M3 7

Hình 1.3 Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M4 8

Hình 1.4 Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M5 9

Hình 1.5 Hình ảnh nhiễm sắc thể bị mất đoạn và thêm đoạn 12

Hình 1.6 Vị trí của gene FLT3 trên nhiễm sắc thể số 13 16

Hình 1.7 Sơ đồ cấu trúc và hoạt động của FLT3 16

Hình 3.1 Phân bố của bệnh AML theo giới 34

Hình 3.2 So sánh kết quả điều trị giữa nhóm có đột biến và không đột biến 36

Hình 3.3 Hình ảnh một số mẫu bệnh nhân AML được tách DNA tổng số 38

Hình 3.4 Sàng lọc mẫu bệnh nhân AML bằng PCR 39

Hình 3.5 Hình ảnh tinh sạch băng đột biến FLT3 40

Hình 3.6 Điện di khuẩn lạc sau khi nhân dòng FLT3 41

Hình 3.7 Kết quả giải trình tự mẫu 146.5 có đột biến 45 bp 42

Hình 3.8 Tình trạng xuất huyết giữa nhóm có đột biến và không có đột biến

45

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lơ xê mi cấp dòng tủy (AML-Acute Myelogenic Leukemia) là một bệnh lýđơn dòng ác tính của tổ chức sinh máu, bệnh được đặc trưng bởi sự tăng sinh củacác tế bào non (blast) bất thường, chủ yếu ở trong tủy xương và ở máu ngoại vi cócác tế bào non ác tính Những tế bào này lấn át tế bào bình thường và ức chế quátrình trưởng thành và phát triển của các dòng tế bào bình thường trong tủy xương[2,14,21]

Theo các nghiên cứu trên thế giới, hơn 80% các đột biến gen được tìm thấy ởbệnh nhân mắc AML xảy ra ở 3 gen nucleophosmin 1 (NPM1), Fms-like tyrosinekinase 3 (FLT3) và CCAAT- enhancer binding protein alpha (CEBPA) [29,30,32,40] Khoảng 30% tổng số bệnh nhân mắc AML với kiểu hình nhiễm sắc thể bìnhthường bị đột biến gen FLT3, hậu quả là enzyme tyrosine kinase này luôn luôn ởtrạng thái hoạt động mà không cần dimer hóa, dẫn đến rối loạn quá trình phát triển

và biệt hóa tế bào máu Nhiều nhóm nghiên cứu FLT3 đã phát hiện ra hai kiểu độtbiến thường gặp nhất trên gen này là lặp đoạn nội phân tử (ITD - internal tandemduplication) và đột biến điểm gây thay thế acid amin aspartic ở vị trí 835 thuộcvùng tyrosine kinase [38,42,49,55]

Tỷ lệ mắc bệnh LXM cấp ở Mỹ năm 2012 khoảng 3-5 trường hợp trong100.000 dân, chiếm khoảng 3% tổng số các bệnh ung thư Ở Việt Nam, theo nghiêncứu của Bạch Quốc Khánh và cộng sự năm 2012 lơ xê mi cấp chiếm tỷ lệ 41,5%trong các bệnh máu Bệnh gặp ở mọi lứa tuổi, ở cả hai giới Tuy nhiên bệnh có xuhướng gặp nhiều hơn ở trẻ em và người già [7] Nhóm AML thường gặp ở ngườilớn trong khi đó, nhóm LXM cấp dòng lympho chiếm 75-80% LXM cấp ở trẻ emTrước đây việc chẩn đoán AML chủ yếu dựa vào hình thái học tế bào, hóa học

tế bào kết hợp với triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân do đó việc phân loại AMLcòn gặp nhiều khó khăn đối với bệnh nhân có bộ nhiễm sắc thể bình thường thìkhông phát hiện được những tổn thương trên gen để có định hướng điều trị

Tuy vậy, hầu như chưa có các nghiên cứu đi sâu phân tích các dạng đột biến

cụ thể gây nên bệnh AML Chính vì vậy việc áp dụng các phương pháp phân tích

DNA để xác định và phát hiện các loại đột biến ở bệnh nhân AML là rất cần thiết và

có ý nghĩa giá trị thực tiễn thiết thực trong chẩn đoán bệnh Đề tài: ˝Nghiên cứu đột biến trên gen FLT3 ở một số bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy” của chúng tôi

được đặt ra nhằm mục tiêu:

1 Xác định tỷ lệ đột biến FLT3-ITD ở bệnh nhân bị bệnh lơ xê mi cấp

dòng tủy.

2 Bước đầu xác định các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của các bệnh

nhân có đột biến này.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về AML

Lơ xê mi cấp dòng tủy (AML) là một trong các loại ung thư máu ác tính nhất

và tiến triển rất nhanh Nguyên nhân phát sinh bệnh là do các thay đổi bất thường(đột biến) dẫn đến làm rối loạn quá trình sản sinh bạch cầu, loại tế bào chịu tráchnhiệm bảo vệ cơ thể thông qua các cơ chế miễn dịch, tạo ra những bạch cầu bấtthường với tốc độ nhanh chóng Bệnh nhân AML, nếu không được chẩn đoán, điềutrị kịp thời và phát hiện sớm sẽ tử vong [14,19]

1.1.1 Lịch sử phát hiện AML

Năm 1827, bác sỹ Velpeau người Pháp đã mô tả một người bán hoa 63 tuổimang một căn bệnh đặc trưng tiến triển bởi sốt, suy nhược, sỏi thận, gan to, lách to.Velpeau ghi nhận máu của bệnh nhân này giống “như cháo”, ông tiên đoán hiệntượng này là do số lượng bạch cầu rất nhiều ở trong máu bệnh nhân

Năm 1845, Bennett mô tả một loạt bệnh nhân tử vong có triệu chứng lách to,máu thay đổi về màu sắc và tăng độ quánh Ông cũng sử dụng thuật ngữ

‘leucocythemia’ chỉ đặc điểm ở những bệnh nhân này có dày đặc bạch cầu trongmáu ngoại vi

Năm 1856, thuật ngữ "bệnh bạch cầu" được đặt ra bởi Rudolf Virchow, nhàbệnh lý học nổi tiếng người Đức, ông cũng là người tiên phong trong việc sử dụngkính hiển vi quang học để đọc công thức máu của bệnh nhân, Virchow là người đầutiên mô tả các bất thường của các tế bào máu trắng ở bệnh nhân có hội chứng lâmsàng đã được mô tả bởi Velpeau và Bennett Virchow đã không tìm ra được nguyênnhân của việc sản sinh quá nhiều tế bào bạch cầu, ông đã sử dụng thuật ngữ mô tả

"bệnh bạch cầu" (tiếng Hy Lạp: "máu trắng") để chỉ tình trạng này

Năm 1877, Paul Ehricl đã tìm ra phương pháp nhuộm tiêu bản và đưaphương pháp này vào việc mô tả sự khác thường giữa bạch cầu bình thường và bấtthường ở bệnh nhân

Năm 1879, Mosler là người đầu tiên đã đưa kỹ thuật xét nghiệm tủy xương vàochẩn đoán đối với những bệnh nhân có triệu chứng xuất huyết và thiếu máu ở trên

Năm 1889, Wilhelm Ebstein đã dùng thuật ngữ (leukemia-lơ xê mi cấp) với triệuchứng bệnh tiến triển nhanh, tiên lượng xấu để chẩn đoán phân biệt với lơ xê mi mạn

Năm 1900, Naegeli gọi myeloblast là tế bào ác tính trong bệnh lơ xê mi cấp

và chia lơ xê mi cấp thành dòng tủy (AML) và dòng lympho (ALL)

Năm 1976, FAB đã đưa ra phân loại AML dựa vào hình thái học và hóa học

tế bào [31]

Năm 2001, WHO đã đưa ra phân loại lơ xê mi cấp để chẩn đoán xác định về

tế bào blast đã giảm xuống còn ≥ 20% tổng số tế bào có nhân trong tủy được chẩnđoán xác định so với tiểu chuẩn của FAB (1986) tế bào blast ≥ 30%

Năm 2008, WHO đã đưa ra phân loại mới dựa trên tổn thương gen để chẩnđoán và đánh giá tiện lượng của bệnh đề ra phương pháp điều trị thích hợp

1.1.2 Phân loại bệnh AML

AML có nhiều thể loại khác nhau, phân loại dựa vào các đặc điểm hình tháihọc, hóa học tế bào, các dấu ấn miễn dịch trên bề mặt tế bào, các đột biến về mặt ditruyền và gen Trong bảng phân loại của WHO năm 2001 có nhiều thể bệnh AMLvới các rối loạn về di truyền, bất thường trên gen từ đó giúp cho việc chẩn đoánđược tiên lượng về bệnh rõ ràng hơn [31]

Năm 2008 WHO đã đưa ra phân loại mới về AML mở rộng hơn so với phânloại của WHO năm 2001 với một số bệnh đáng chú ý, trong đó đặc biệt một số genđược đưa vào để xác định AML (bảng 1.1), gen FLT3 mặc dù chưa được đưa vàochính thức để áp dụng trong chẩn đoán, nhưng cũng được khuyến cáo nên tiến hànhxét nghiệm trong điều kiện cho phép [56]

Bảng 1.1 Phân loại AML 2001 và 2008 của WHO Phân loại WHO 2008 – AML Phân loại WHO 2001 – AML

1.Lơ xê mi cấp bất thường gen hay gặp 1.Lơ xê mi cấp bất thường gen hay

gặpAML có t(8;21)(q22;q21); RUNX1-

RARa)AML có t(9;11)(p22;q23); MLLT3- MLL AML 11q23(MLL)

AML t(6;9)(p23;q34) ; DEK- NUP 214

AML có inv(3)(q21;q26.2)hoặc t(3;3)

(q21;q26.2); RPN1- EV11

AML t(1;22)(p13;q13); RBM15- MKL1

AML có đột biến gen NPM1

AML có đột biến gen CEBPA

2 AML liên quan đến thay đổi rối loạn sinh

tủy 2.AML liên quan đến thay đổi rối loạnsinh tủy có đột biến đa dòng

3 AML thứ phát sau điều trị các bệnh ác tính 3 AML liên quan đến điều trị

4 AML không phân loại 4 AML không phân loại

AML với sự khác biệt tối thiểu M0 AML với sự khác biệt tối thiểu M0AML không có sự trưởng thành M1 AML không có sự trưởng thành M1AML dòng tủy mono M4 AML dòng tủy mono M4

AML dòng hồng cầu M6 AML dòng hồng cầu M6

AML dòng mẫu tiểu cầu M7 AML dòng mẫu tiểu cầu M7

Phân loại WHO 2008 – AML Phân loại WHO 2001 – AML

AML dòng bạch cầu ưa baso AML dòng bạch cầu ưa baso

AML tăng sinh toàn bộ xơ AML tăng sinh toàn bộ xơ

Myeloid sarcoma (mô liên kết) Myeloid sarcoma (mô liên kết)

5 Tăng sinh tủy liên quan đến hội chứng

Down

6 Blastics plasmacytoid dendrictic cell

neoplasm

1.1.3 Phân loại bệnh theo FAB

Phân loại AML đã được sử dụng rộng rãi từ năm 1976 cho đến nay và dựa trênchủ yếu là phân loại bằng hình thái học tế bào và hóa học tế bào Người ta phân loạithành 8 thể sau:

* Thể M0: AML thể không biệt hóa trong đó có tế bào non bất thường ≥ 90%,

- Tế bào tiền tủy bào < 3%

* Thể M1: AML thể chưa trưởng thành (AML without maturation):

- ≥ 5% blast dương tính với MPO và/hoặc Sudan đen

- ≥ 90% tế bào có nhân không thuộc dòng hồng cầu tủy xương là blast

- ≤ 50% tế bào có nhân tủy xương thuộc dòng hồng cầu

- ≤ 10% tế bào có nhân tủy xương là tiền tuỷ bào

* Thể M2: AML thể trưởng thành (AML with maturation, hình 1.1):

- ≥ 5% blast dương tính với MPO và/hoặc Sudan đen

- ≤ 89% tế bào có nhân không thuộc dòng hồng cầu tủy xương là blast

- ≤ 50% tế bào có nhân tủy xương thuộc dòng hồng cầu

- ≤ 10% tế bào có nhân tủy xương là tiền tuỷ bào

Hình 1.1 Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M2

* Thể M3: AML thể tiền tuỷ bào (acute promyelocytic leukemia, hình 1.2):

- ≥ 5% blast dương tính với MPO và hoặc Sudan đen

- < 50% tế bào có nhân tủy xương thuộc dòng hồng cầu

Đại đa số tế bào có nhân tủy xương là tiền tuỷ bào, có nhiều hạt đặc hiệu trongbào tương

Hình 1.2 Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M3

* Thể M4: Lơ xê mi cấp tuỷ - mono (acute myelomonocytic leukemia, hình 1.3):

- Các phương pháp nhuộm MPO, Sudan đen, Esterase không đặc hiệu dươngtính với hai quần thể tế bào.

- < 50% tế bào có nhân tủy xương thuộc dòng hồng cầu

- ≥ 30% là blast, tế bào dòng tuỷ (kể cả blast) chiếm 30 - 80%

- 5% tế bào có nhân không thuộc dòng hồng cầu/lympho là bạch cầu ưa acidthì xếp vào thể M4eo

Hình 1.3 Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M4

* Thể M5: Lơ xê mi cấp dòng mono (acute monoblastic leukemia, hình 1.4):

- MPO và Sudan đen âm tính hoặc dương tính yếu Esterase MPO và Sudanđen âm tính hoặc dương tính yếu, esterase đặc hiệu dương tính mạnh và không bị ứcchế bởi NaF

- Trong thể M5 người ta chia thành 2 loại M5a và M5b

- Trong đó M5a: tế bào blast biệt hóa, trở thành monocyte non, nguyên sinhchất chiếm tỷ lệ cao

- M5b: tế bào monocyte chín chiếm tỷ lệ cao trong tủy Nguyên sinh chất không cóhạt đặc hiệu

Hình 1.4 Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M5

* Thể M6: Lơ xê mi cấp dòng hồng cầu (acute erythroblastic leukemia):

- PAS có thể dương tính, các phương pháp nhuộm khác ít có giá trị MPO,Sudan đen có thể dương tính

- ≥ 50% tế bào có nhân tủy xương thuộc dòng hồng cầu và thường bị loạn sản

- ≥ 30% tế bào không thuộc dòng hồng cầu là blast tuỷ

- Có thể gặp thể Auer

* Thể M7: Lơ xê mi cấp dòng mẫu tiểu cầu (acute megakaryoblastic leukemia):

- PAS, esterase không đặc hiệu và peroxydase tiểu cầu dương tính

- MPO và Sudan đen âm tính

1.2 Tình trạng mắc bệnh AML

1.2.1 Tình trạng mắc bệnh AML trên thế giới

Theo thống kê của Cộng đồng Châu Âu năm 2000-2002 tỷ lệ mắc bệnh AML

ở các nước trong khu vực như sau: Phía Bắc cộng đồng Châu Âu thì tỷ lệ mắc bệnhAML là 2,95 trong 100,000 dân, trong đó khu vực miền Trung và miền Nam thì tỷ

lệ mắc bệnh AML trong 100,000 dân lần lượt là 2,92 và 2,90 nhưng riêng nước Anh

và Ireland thì tỷ lệ mắc bệnh AML trong 100,000 dân là 3,24

Theo thống kê của Hiệp hội Ung thư Canada năm 2007 cho đến nay tỷ lệ mắcbệnh của người dân Canada cứ 1,130 người mắc AML được chẩn đoán mới thì có

587 là nam giới và 543 là nữ giới Tỷ lệ tử vong năm 2009 của AML là 897 trườnghợp trong đó nam giới là 479 người và nữ giới là 418 người [60] Năm 2008 ướctính trên toàn thế giới có khoảng 12,7 triệu ca bị ung thư trong đó có 7,6 triệu cachết vì ung thư

Năm 2012 ở Mỹ có 47,150 người được chẩn đoán là lơ xê mi cấp trong đóAML chiếm khoảng 3% so với các loại ung thư khác, độ tuổi chiếm 15-25% ở trẻnhỏ còn người lớn thì tăng theo tuổi cứ trên 67 tuổi thì tỷ lệ mắc bệnh AML ngàycàng tăng Năm 2013 ở Mỹ có khoảng 48,610 ca được chẩn đoán mới về ung thư,trong đó AML có khoảng 14,590 ca được chẩn đoán mới và 10,730 ca tử vong hầuhết là người trưởng thành [61]

Theo Hiệp hội Ung thư thế giới ở các nước khu vực Tây Âu thì tỷ lệ mắc cácbệnh này là 2,07 trong 100,000 dân

1.2.2 Tình trạng mắc bệnh AML ở Việt Nam

Bạch Quốc Tuyên, Nguyễn Thị Minh An cho thấy rằng giai đoạn 1974-1990cho thấy tỷ lệ bệnh nhân đến khám và điều trị lơ xê mi cấp ngày càng tăng [1].Trong thời gian này chẩn đoán chủ yếu dựa vào việc phân loại hình thái học tế bào

và triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân

Năm 1997, nghiên cứu của Đỗ Trung Phấn và cộng sự về tình hình bệnh máutại Viện Huyết học - Truyền máu - Bệnh viện Bạch Mai cho biết tỷ lệ bệnh nhânđược chẩn đoán là bệnh máu ác tính chiếm 32,03% trong đó là AML chiếm tỷ lệcao là 64,3% [13]

Theo thống kê của Trần Thị Minh Hương trong 3 năm (1997-1999) tại Viện Huyếthọc - Truyền máu - Bệnh viện Bạch Mai thì tình hình mắc bệnh lơ xê mi cấp ngày càngtăng, tỷ lệ mắc bệnh lơ xê mi cấp chiếm 38,5% trong các bệnh máu ác tính [5]

Năm 2000-2002, Đỗ Trung Phấn và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu nâng caochất lượng phân loại lơ xê mi cấp tại Viện Huyết học-Truyền máu-Bệnh viện BạchMai cho thấy tỷ lệ mắc bệnh lơ xê mi cấp là 32,1% trong số các bệnh máu tới khám

và điều trị tại Viện [15]

Năm 2006, Nguyễn Hữu Toàn và cộng sự đã có những báo cáo về tiên lượngtrong bệnh AML nhưng chưa đề cập tới tiên lượng của bệnh nhân có đột biến genFLT3 [17].

Năm 2008, Trần Thị Phương Túy và cộng sự khi nghiên cứu giá trị dấu ấnmiễn dịch trong chẩn đoán phân loại lơ xê mi cấp tại Bệnh viện trung ương Huế chothấy tỷ lệ mắc bệnh là 38,7% [22]

Năm 2010, Nguyễn Triệu Vân và cộng sự cho thấy tỷ lệ mắc bệnh lơ xê mi cấpcũng tăng theo từng năm trong đó AML chiếm là 63,7% trong lơ xê mi cấp [23]

Bạch Quốc Khánh và cộng sự khi nghiên cứu tình hình bệnh máu đến khám và điềutrị tại Viện Huyết học -Truyền máu TW giai đoạn 2010-2012 cho thấy tỷ lệ lơ xê mi cấpchiếm 41,5% trong tổng số bệnh nhân đến khám mới tại Viện [7]

Các kết quả thống kê trên đây cho thấy có sự gia tăng của tỷ lệ bệnh nhân lơ xê micấp trong những năm gần đây Một trong các nguyên nhân của sự gia tăng này có thể liênquan đến việc áp dụng các kỹ thuật cao trong việc chẩn đoán phân loại bệnh AML

1.3 Một số nguyên nhân gây bệnh AML

Cho đến nay nguyên nhân gây bệnh AML chưa được xác định một cách rõ ràng,nhưng người ta vẫn đề cập đến một số yếu tố bệnh cảnh có liên quan đến bệnh AML

1.3.1.Yếu tố di truyền

Yếu tố gia đình: Có rất nhiều thông báo về tình trạng mắc bệnh lơ xê mi cấptrong một gia đình Khả năng mắc bệnh ở những gia đình có người bị bệnh ung thưtăng gấp 3 lần so với gia đình không có người bị bệnh Nghiên cứu của PhạmQuang Vinh cũng cho thấy bệnh nhân và con của bệnh nhân cùng mang một loạiđột biến nhiễm sắc thể [25,26]

Yếu tố di truyền: một số thể bệnh bẩm sinh di truyền như hội chứng Down,Fanconi, Klinefelter… là những nguyên nhân để bệnh nhân mắc tỷ lệ ung thư máurất cao Nguyên nhân có thể là do cấu trúc nhiễm sắc thể không bền vững rất dễ tổnthương làm cho nhóm đối tượng này dễ phát sinh bệnh AML

1.3.2 Yếu tố môi trường

- Tiếp xúc với môi trường độc hại như thuốc trừ sâu, dioxin, benzen, hóa chất đột

biến gen như ethidium bromide…làm cho nguy cơ xuất hiện lơ xê mi cấp ngày càng tăng.

- Các tia bức xạ ion hóa làm cho đột biến nhiễm sắc thể dẫn đến ung thư máu Ví

dụ những cư dân Nhật Bản sống sót tại vụ nổ bom Hiroshima và Nagazaki mắc ung thưcao gấp nhiều lần so với người khác Tương tự như vậy vụ nổ nhà máy điện tử hạt nhânChernobyl tại Nga cũng là nguyên nhân làm gia tăng tỷ lệ mắc các bệnh về ung thư

1.3.3 Virus

Cho tới nay các nhà khoa học chưa tìm thấy được mối liên quan nào giữa virus

và bệnh lơ xê mi cấp Tuy vậy một số công trình nghiên cứu thực nghiệm cho thấy

có mối liên quan một số virus như Epstein Barr virus (EBV) gây ung thư vòm họng,Human Papilloma virus (HPV) gây ung thư tử cung và Human T-CellLymphotrophic virus1, 2 (HTLV-1, 2) gây ung thư lơ xê mi dòng T lympho

1.3.4 Bất thường về nhiễm sắc thể

Trong lơ xê mi thường gặp hiện tượng chuyển đoạn từ một nhiễm sắc thể nàytới một nhiễm sắc thể khác tạo nên một sự sắp xếp mới, chuyển phần promoter củagen này nối với phần cấu trúc của gen khác làm cho gen được phiên mã, đảo đoạn

có thể trong cùng một nhiễm sắc thể hoặc nhiễm sắc thể khác, mất đoạn, lặp đoạnđấy là những nguyên nhân thường gặp (hình 1.5)

Hình 1.5 Hình ảnh nhiễm sắc thể bị mất đoạn và thêm đoạn

1.3.5 Các yếu tố khác

Như chúng ta đã biết mỗi một chủng tộc khác nhau cũng có gen và yếu tố đặctrưng về di truyền khác nhau ví dụ như tỷ lệ mắc bệnh AML ở phía Tây Âu khác với tỷ

lệ mắc bệnh ở Bắc Âu là do các yếu tố chủng tộc cũng là nguyên nhân gây bệnh AML

1.3.6 Cơ chế bệnh sinh của AML

Cơ chế bệnh sinh của AML còn nhiều vấn đề chưa được rõ ràng Đa số cácnhà khoa học cho rằng AML là do đột biến nhiễm sắc thể và đột biến gen: gen tiềnung thư mất khả năng kiểm soát tạo ra gen ung thư Cơ chế thứ hai gen làm nhiệm

vụ ức chế ung thư, chức năng chính của chúng tác động đến quá tŕnh của tế bào như

sự phát triển, biệt hóa, tự tái sinh, khả năng chống chịu, kiểm soát chu trình tế bào,

cơ chế tự sửa chữa DNA và vai trò giữ ổn định vật chất di truyền

Cơ chế xuất hiện gen ung thư thường gặp trong AML là do sự đột biến genbình thường Các gen bình thường mất kiểm soát hoặc không hoạt động dẫn đến tếbào tăng sinh mạnh, không bị chết bởi chương trình và lấn át những tế bào bìnhthường khác Điều này làm cho tế bào ung thư càng phát triển mạnh

Có rất nhiều bất thường di truyền được phát hiện trong AML như t(15;17) haygặp trong bệnh M3, t(8;21) và inv(16)…Trong AML, thường gặp khoảng 50% bấtthường về di truyền và những bất thường này được chia nhóm như sau:

- Nhóm một bao gồm gen hoạt động liên quan truyền tín hiệu kích thích pháttriển tế bào Thông qua các receptor tyrosin kinase làm kích hoạt quá trìnhphosphoryl hóa dẫn đến sự tăng sinh tế bào vượt qua khả năng kiểm soát Các genđóng vai trò trong hoạt động này là BCR-ABL, FLT3, c-Kit…

- Nhóm hai gồm những gen ảnh hưởng đến quá trình phiên mã Các gen thayđổi do sự đảo đoạn, mất đoạn của nhiễm sắc thể [10, 21]

- Nhóm ba bao gồm các gen liên quan đến sự chết theo chương trình của tếbào Bình thường các tế bào có thời gian sống nhất định, sau quá trình phân chiabiệt hóa tế bào sẽ chết dù không có tác động gì, như vậy gọi là chết theo chu trình tế

bào Bình thường các tế bào bạch cầu tồn tại một thời gian nhất định ở máu ngoại vi

và phân chia dưới sự kiểm soát của quá trình theo cơ chế nhất định, nhưng tế bàoung thư lại có tính chất tăng sinh mạnh và không chết theo chương trình

- Nhóm bốn bao gồm các gen tác động vào quá trình tái tạo của tế bào, bìnhthường tế bào biệt hóa và phát triển theo một dòng của tế bào, nhưng trong lơ xê micấp các tế bào đều có khả năng tự tái tạo

- Nhóm năm bao gồm gen chống ung thư, các gen này bình thường có khảnăng ngăn chặn sự phát triển khối u nhưng ở đây chúng mất chức năng này

1.4 Gen FLT3 và các loại đột biến trên gen FLT3

1.4.1 Cấu trúc và chức năng của gen FLT3 (hình 1.6 và hình 1.7)

- FLT3 (FMS-like Tyrosine kinase-3) hoặc CD135 là một thụ thể của cytokine

do gen FLT3 mã hóa, thuộc phân lớp thứ 3 của họ tyrosin kinase Gen FLT3 được

biết đến đóng một vai trò quan trọng trong việc tế bào gốc tạo máu và điều hòa việctăng sinh và biệt hóa của tế bào gốc đa tiềm năng, các tế bào đầu dòng và cáclympho trưởng thành thông qua truyền dẫn các tín hiệu bằng việc gắn với FLT3

- Gen FLT3 nằm trên nhiễm sắc thể 13q12 và có 24 exon Nó mã hóa tổng hợp

protein màng tế bào gồm 993 acid amin gồm 2 phần: phần glycogyl hóa có khốilượng phân tử 158-160 kda, phần bị glycogyl hóa với khối lượng phân tử 130-143kda Phân tử protein FLT3 gồm có 5 phần cấu trúc như globulin miễn dịch: phầnngoài màng, phần xuyên màng, phần cận màng và 2 cấu trúc TK1 và TK2 FLT3được tìm thấy ở hầu hết các mô trong cơ thể: ở cơ quan tạo máu (lách, tuyến ức, tủyxương, tế bào máu ngoại vi), tuyến tiền liệt, tinh hoàn, thận, buồng trứng, phổi, ruột,tim, nhau thai, nồng độ cao nhất ở tế bào đơn nhân máu ngoại vi [48]

- Nakao và cộng sự phát hiện đột biến FLT3 vào năm 1996 Đột biến là doxuất hiện quá trình tự sao chép, một đoạn DNA tự nhân lên chèn vào đoạn giữa củagen tạo thành hai đoạn giống nhau vì vậy gọi là lặp đoạn nội phân tử (ITD) Sau đónhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng ngoài vùng đột biến này người ta còn bắt gặp đột

biến vùng tyrosin kinase (TKD) và những vùng đột biến khác, nhưng tỷ lệ cao gặpchủ yếu FLT3-ITD và FLT3-TKD [41].

- Tỷ lệ đột biến FLT3 khoảng 30% AML, đây là gen có tỷ lệ đột biến cao trongcác loại đột biến ở bệnh AML Mặc dầu phân loại của WHO 2008 chưa đưa genFLT3 vào tiêu chuẩn chẩn đoán, nhưng gen này được khuyến cáo nên làm cho bệnhnhân AML vì có giá trị trong việc tiên lượng, chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân

- Trong tủy xương bình thường FLT3 ít có biểu hiện ở tế bào gốc nhưng lạibiểu hiện cao ở tế bào máu ác tính FLT3 có vai trò quan trọng trong việc kích thích

sự phát triển của tế bào gốc tạo máu cả hai dòng tủy và lympho Để nghiên cứu vaitrò của FLT3 các nhà khoa học đã tổng hợp chất gắn với FLT3 (FLT3 ligand-FL) đểkích hoạt tyrosine kinase làm tăng sinh tế bào gốc tạo máu ở tủy và máu ngoại vi.Chất gắn có vai trò trong các phản ứng miễn dịch thông qua tế bào tua gai (tế bàotrình diện kháng nguyên) và vai trò ức chế khối u thông qua tế bào giết tự nhiên(NK) Nhưng ở bệnh nhân AML-chất gắn phối hợp cùng các yếu tố tăng trưởngkhác kích thích sự tăng sinh của tế bào ung thư Khi có sự kết hợp giữa chất gắn vàthụ thể của FLT3, thụ thể sẽ trải qua sự biến đổi hình thái, làm cho thụ thể mở ra đểbộc lộ khu vực dimer hóa, tạo điều kiện cho việc dimer hóa giữa 2 thụ thể với nhau

Sự dimer hóa này là khởi đầu cho việc hoạt hóa enzyme tyrosine kinase, dẫn đến sựphosphoryl hóa nhiều vị trí khác nhau của vùng nội bào Thụ thể đã hoạt hóa sẽ lôikéo một số protein ở bào tương đến để tạo nên một phức hợp protein ở vùng nộibào SHC, growth factor receptor 2 (GRB2), GAB2-GRB2- associated bindingprotein, SH2-containing Inosito (SHIP), Casitas B-Lineage Lymphoma và CBLproto-oncogen B là một số ít trong rất nhiều các protein có tương tác với receptorcủa FLT3 Mỗi protein gắn với phức hợp sẽ tiếp tục được hoạt hóa tạo nên dãy phảnứng phosphoryl hóa, dẫn đến sự hoạt hóa một số chất trung gian truyền tin thứ cấpnhư MAP kinase, STAT và AKT/PI3 kinase Một khi được hoạt hóa, các chất trunggian này sẽ được đi kèm bởi HSP90 đến kỳ giữa của nhân để truyền tin đến nhân Ởnhân, các chất trung gian này sẽ kích hoạt một loạt các phản ứng để điều hòa sự biệthóa, tăng sinh, chết theo chương trình và sự tồn tại của tế bào [52]

Hình 1.6 Vị trí của gene FLT3 trên nhiễm sắc thể số 13

Hình 1.7 Sơ đồ cấu trúc và hoạt động của FLT3

Sự kết hợp giữa chất gắn của FLT3 với các yếu tố tăng trưởng khác sẽ kích thíchtăng sinh các tế bào tiền thân tạo máu cũng như các tế bào đầu dòng tủy và lympho

1.4.2 Ý nghĩa của xét nghiệm phát hiện đột biến gen FLT3 trong tiên lượng điều

trị AML

Mặc dù xếp loại WHO năm 2008 không đưa xét nghiệm phát hiện đột biếnFLT3 vào bảng phân loại, nhưng thực tế cho thấy việc triển khai xét nghiệm sànglọc FLT3 đối với bệnh nhân được chẩn đoán AML là cần thiết và có giá trị trongviệc định hướng điều trị và tiên lượng của bệnh Theo tổng kết của Gilliland D.G vàGriffin.J.D dựa trên kết quả nghiên cứu của một số tác giả cho thấy bệnh nhân AML

có đột biến FLT3-ITD đấy là một tiên lượng xấu trong điều trị (bảng 1.2) [35]

Bảng 1.2 Ý nghĩa tiên lượng của đột biến FLT3 ở bệnh nhân trưởng thành

FLT3 Không phát hiện tiênlượng xấu ở bệnh nhân

>60 tuổi

Stirewalt vàcộng sự2001[52]

3 AML 160 14/103 trường hợp

có đột biến ITD tỷ lệ (13.2%)

FLT3 Thời gian sống toàn bộthấp (p=0.0002)

FLT3 Không có sự khác biệtgiữa thời gian sốngkhông bệnh và thời giansống toàn bộ

Frohling vàcộng sự

2001 [33]

6 AML 713 202/713 trường hợp

có đột biến ITD tỷ lệ (25.3%)

FLT3 Thời gian sống khôngbệnh thấp

-Thời gian sống toàn bộthấp

Thiede vàcộng sự

2001[53]

Tương tự như vậy theo nghiên cứu của National Comprehensive CancerNetwork (NCCN) năm 2013 yếu tố để tiên lượng bệnh nhân AML cũng dựa vàoviệc tổn thương gen để phân loại bệnh nhân trong việc chẩn đoán và dùng phác đồđiều trị thích hợp (bảng 1.3).

Bảng 1.3 Nhóm tiên lượng theo NCCN 2013 [44]

Tiên

lượng Bất thường nhiễm sắc thể và gen

Tốt t(15;17)(q22;q12-21) – PML/RARA

t(8;21)(q22;q22) - AML1/ETO inv(16)(p13q22)/t(16;16)(p13;q22) – CBFB/MYH11 Đột biến gen NPM1 không kèm đột biến FLT3-ITD Đột biến gen CEBPA không kèm đột biến FLT3-ITD

Trung bình Không phát hiện nhiễm sắc thể bất thường

t(9;11)(p22;q23) – MLL/AF9, del(7q), del(9q), del(11q), del(20q),

-Y, +8, +11, +13, +21, +22Xấu Bất thường nhiễm sắc thể phức tạp ( ≥ 3 bất thường không liên

quan nhau); bất thường 3q, ngoại trừ t(3;5)(q21-25;q31-35);

inv(3)(q21q26)/t(3;3)(q21;q26);

t(6;9)(p23;q34); t(6;11)(q27;q23); t(11;19)(q23;p13.1); del(5q); -5;-7 ; -17; bất thường17p kết hợp với những đột biến FLT3

1.4.3 Các loại đột biến trên gen FLT3

Các công trình nghiên cứu về đột biến gen FLT3 ở thế kỷ 20 đã chỉ ra có hailoại đột biến chính: lặp đoạn nội phân tử (FLT3-ITD) và đột biến điểm (FLT3-TKD) [12,24,32,33]

Đột biến FLT3-ITD thường là đột biến xảy ra do có sự chèn thêm một đoạnhoặc lặp một đoạn ngay trên gen, đột biến có kích thước đoạn chèn vào khoảng từ3-400 bp Người ta phát hiện các đột biến này bằng cách điện di sản phẩm PCR vớicặp mồi đặc hiệu trên gen agarose 2% để phát hiện Theo nghiên cứu của Sohei vàcộng sự khi nghiên cứu trên 647 bệnh nhân có độ tuổi từ 0 đến 21 tuổi cho thấy độtbiến FLT3-ITD phụ thuộc vào vị trí đột biến, số lượng đột biến và độ dài của độtbiến FLT3 sẽ có ảnh hưởng tiên lượng điều trị và lui bệnh của bệnh nhân bị đột biếnđột biến FLT3- ITD [51] Trước đây gen FLT3 được cho là có 21 exon cho nên việcnghiên cứu FLT3 xảy ra ở exon 11, exon 12 nhưng sau đó nhiều tác giả nghiên cứu

và đánh lại số thứ tự trên gen FLT3 và gen FLT3 có 24 exon và đã chỉ ra rằng độtbiến xảy ra trên exon 14 và exon 15 [33, 41]

Đột biến FLT3-ITD là kết quả của việc nhân đôi exon 14 và 15 của FLT3, xảy

ra trong CML (5-10%), MDS (5-10%), AML (15-35%) Tỷ lệ đột biến FLT3-ITD làloại đột biến cao và phụ thuộc vào tuổi, đột biến FLT3-ITD hiếm gặp ở trẻ sơ sinhmắc bệnh AML, tỷ lệ đột biến tăng 5-10% trong độ tuổi từ 5-10 tuổi, 20% ở ngườitrẻ tuổi và >35% ở những bệnh nhân được chẩn đoán AML trên >55 tuổi Mặt khácđột biến vùng juxtamembrane domain (JM) cũng làm kích hoạt quá trìnhphosphoryl hóa sau dễ dàng hơn

Đột biến FLT3-TKD là một đột biến điểm thay thế acid amin aspartic ở codon

835 bằng tyrosine D835Y và D835E Yamamoto và cộng sự năm 2001[57] khi phântích trình tự ở một số bệnh nhân có đột biến FLT3 thấy xuất hiện một vài loại độtbiến D835 Ông thấy rằng nucleotide G đầu tiên của D835 được thay thế bằngnucleotide T dẫn đến Asp thay thế axit amin Tyr (D835Y) Việc thay thế nucleotide

T cho các nucleotide A ở vị trí thứ hai của D835, dẫn đến Asp thay thế axit aminVal (D835V) Hơn nữa, ông cũng đã phát hiện đột biến D835H, D835E, và D835Ntrên cùng một bệnh nhân Điều thú vị là đột biến D835Y và D835E đã được tìmthấy trong một bệnh nhân AML (M3) khi phân tích nhân dòng cho thấy các đột biếntrên xảy ra ở alen khác nhau Trong bệnh nhân rối loạn sinh tủy Yamamoto cũng

phát hiện đột biến tìm thấy tại I836 Đột biến này bao gồm việc đột biến chèn thêm

3 nucleotide (TTG) giữa D835 và I836, thay thế nucleotide AT thành nucleotide

GA tại các nucleotide vị trí đầu tiên và thứ hai của I836, dẫn đến chèn thêm Leu vàthay đổi Isoleucine thành Asparagine Khác với FLT3-ITD đột biến này không phụthuộc vào tuổi, nó xuất hiện ở các độ tuổi như nhau Tuy cơ chế tác dụng giốngnhau, nhưng FLT3-TKD không gây tăng sinh tế bào dòng tủy và không có tiênlượng xấu như FLT3-ITD Khi bệnh nhân có đột biến FLT3-TKD thì không có độtbiến FLT3-ITD đi kèm

1.4.4 Phương pháp phát hiện đột biến trên gen FLT3

Năm 1999 Kyo và cộng sự nghiên cứu 201 bệnh nhân được chẩn đoán là

AML về đột biến gen FLT3 trên exon 11, exon 12 và đột biến gen N-RAS ông sử

dụng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho đột biến gen FLT3 là:

11F: 5′-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC

12R: 5′-CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC

Với chu kỳ nhiệt như sau 94oC-3 phút, 35 chu kỳ [94oC (30 giây), 56oC (1phút), 72oC (2 phút)] và giai đoạn kéo dài là 72oC-10 phút Sau đó ông cũng sửdụng phương pháp thôi gel, nuôi cấy khuẩn lạc và tách chiết plasmid, nghiên cứucủa ông đã phát hiện đoạn đột biến liên quan đến đoạn lặp lại vùng giầu Y trải dài

từ codon 589 đến codon 599, vị trí đột biến này đã được nhiều nghiên cứu trước đâycông bố Tỷ lệ đột biến gen FLT3-ITD trong nghiên cứu của ông là 21,4%, đột biếngen N-RAS là 12,4% và đột biến cả 2 gen trên là 1,5% [36].

Năm 2008, Gari và cộng sự khi tiến hành sàng lọc 129 bệnh nhân AML, bằngphản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu:

F5′-TCTGTTTCATCGCTGAGTGAC-3′

R5′-AGCCTTGAAACATGGCAAAC-3′

Với chu kỳ nhiệt 94oC - 5 phút, 35 chu kỳ [94oC (1 phút), 55oC (30 giây)] vàgiai đoạn kéo dài là 72oC- 30 giây đoạn gen được khuếch đại có kích thước 396 bp

trên exon 14, 15 để sàng lọc FLT3 và exon 20 để sàng lọc đột biến điểm D835Y,nghiên cứu đã cho biết tỷ lệ đột biến gen FLT3-ITD là 15/129 (11,63%), đột biếnđiểm D835Y là 11/129 (8,5%) sau đó các mẫu được gửi đi giải trình tự và độ dàiđoạn các loại đột biến FLT3-ITD nằm trong khoảng 24-60 bp Điều này chứng tỏmồi sử dụng trong nghiên cứu của ông là đặc hiệu [34].

Năm 2013, nghiên cứu của Kiều Thị Vân Oanh và cộng sự khi tiến hành phântích và sàng lọc đột biến FLT3-ITD tác giả đã sử dụng 2 kỹ thuật PCR là (RT-PCR

và nested-PCR) để phát hiện đột biến FLT3-ITD ở exon 14 và 15 của đoạn gen cókích thước là khoảng 400 bp với cặp mồi đặc hiệu là:

F5′-CAATTTAGGTATGAAAGCC-3′

R 5′-CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3

Qua 35 chu kỳ với 2 giai đoạn chu kỳ nhiệt như sau: RT-PCR: 45oC (45phút), 95oC (2 phút), 94oC (30 giây), 65oC (1 phút), 72oC (1 phút) Sau đó sản phẩmPCR tiếp tục chạy phản ứng Nested-PCR với chu kỳ nhiệt là 95oC (5 phút), 95oC (5giây), 60oC (5 giây), 68oC (30 giây), 72oC (1 phút) Sau đó sản phẩm PCR đượcđiện di để phát hiện băng đột biến trên gel agarose 2%, nhóm nghiên cứu phát hiện

tỷ lệ đột biến trong 100 bệnh nhân nghiên cứu có FLT3-ITD dương tính là 27%, kếtquả của nhóm nghiên cứu phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả nướcngoài đã được công bố, nhưng nhóm nghiên cứu chỉ dừng lại kết quả bệnh nhân cóbăng đột biến chưa đưa ra được đột biến là bao nhiêu nucleotid [12]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- 137 mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân (tuổi từ 16 đến 82 tuổi) được chẩnđoán AML tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương thời gian từ tháng 8/2012

- đến tháng 7/2013 có các tiêu chuẩn sau:

- Bệnh nhân được chẩn đoán xác định AML theo tiêu chuẩn của WHO 2001

và phân loại FAB

- Ưu tiên những bệnh nhân có kết quả chẩn đoán nhiễm sắc thể bình thườngđược lấy vào nghiên cứu

- Được tiến hành làm các xét nghiệm lâm sàng và cận lâm sàng

- Mẫu đối chứng: 5 mẫu máu của người khỏe mạnh, đủ tiêu chuẩn hiến máu(theo tiêu chuẩn của Qui chế truyền máu 2007) được chọn làm đối chứng âm trongcác phản ứng PCR

- Bệnh nhân đồng ý lấy máu và được tiến hành sàng lọc để phát hiện băng độtbiến FLT3-ITD

- Bệnh phẩm: 1-2 ml máu ngoại vi của bệnh nhân

2.2 Vật liệu nghiên cứu

- Nước cất vô trùng (ddH2O)

* Hóa chất dùng cho điện di trên gel agarose

- Agarose

- Ethidium Bromide 10 mg/ml.

- Dung dịch điện di TAE

- Dung dịch hòa loãng mẫu 6X

- Marker 100 bp và 1kb

* Hóa chất dùng để biểu hiện cảm ứng của gen

- Môi trường TSA, LB

- Xgal, IPTG 100 mM

- Kháng sinh Ampicillin

* Hóa chất dùng để tách chiết plasmid

- Dung dịch Sol I: Tris-HCl 25 mM pH 8; EDTA10mM pH 8,0; Glucose 50mM; RNase A 10 mg/ml

- Dung dịch Soll II: SDS 1%, NaOH 0, 2 N

- Dung dịch Soll III: Potassium acetate 3 M; acetic acid 11, 5% (pH 5.2)

Các hóa chất còn lại đều được mua từ các hãng quốc tế có uy tín và đều đạtđược độ tinh khiết để dùng phân tích

2.3 Các thiết bị máy móc dùng trong nghiên cứu

Các thiết bị chính dùng cho nghiên cứu bao gồm:

- Máy nhân gen (PCR)

- Bể điện di đứng loại nhỏ.

- Nguồn điện di

- Máy soi gel

- Bể ổn nhiệt.

- Tủ lạnh

2.4 Các phương pháp nghiên cứu

- Các phương pháp nghiên cứu chính bao gồm hồi cứu bệnh án thu thập các dữliệu về lâm sàng kết hợp thực nghiệm để phát hiện chính xác bệnh nhân có mangđột biến gen FLT3-ITD hay không

2.4.1 Đánh giá tình trạng bệnh nhân bằng các tiêu chí lâm sàng

- Tiêu chuẩn chẩn đoán lơ xê mi:

+ Lâm sàng: Bệnh nhân (BN) có hội chứng thiếu máu, xuất huyết, nhiễm trùng

và thâm nhiễm

+ Xét nghiệm: Bệnh nhân có số lượng blast ≥ 20% tế bào tủy xương hoặcmáu

- Theo tiêu chuẩn của NCCN năm 2011

Tiêu chuẩn lui bệnh hoàn toàn [44]:

- Lâm sàng: Không có biểu hiện triệu chứng của bệnh

- Xét nghiệm:

+ Mật độ tế bào tủy bình thường, tỷ lệ tế bào non ác tính trong tủy < 5%.+ Máu ngoại vi không có tế bào non, số lượng tiểu cầu > 100G/l, số lượng bạch cầu hạttrung tính > 1G/l

+ BN không phụ thuộc vào truyền máu

+ Không có dấu hiệu xâm lấn ngoài tủy

Tiêu chuẩn lui bệnh không hoàn toàn [44]:

+ Tỷ lệ tế bào non trong tủy từ 5- 25%

+ Máu ngoại vi không có tế bào non, số lượng tiểu cầu > 100G/l, bạch cầu hạttrung tính > 1G/l

Tiêu chuẩn không lui bệnh [44]:

+ Tỷ lệ tế bào non trong tủy > 25%

Tiêu chuẩn thiếu máu:

Hội chứng thiếu máu: Bệnh nhân thường xanh xao, mệt mỏi

Tiêu chuẩn xuất huyết:

Hội chứng xuất huyết: rất hay gặp, chiếm khoảng 50%, có thể lên tới 72%,trong đó chủ yếu là xuất huyết dưới da, niêm mạc, nặng hơn có thể xuất huyết nộitạng, đặc biệt thể M3 rất hay gặp xuất huyết do rối loạn đông máu rải rác lòng mạch

2.4.2 Tách chiết và định lượng DNA tổng số

56oC trong 10 phút Sau đó hỗn hợp được ly tâm nhẹ với tốc độ 3000 vòng/ 1 phút

để dung dịch lắng xuống đáy ống Tiếp theo hỗn hợp được bổ sung 200 μll dungdịch cồn (ethanol) tuyệt đối và trộn đều bằng máy vortex Hỗn hợp được đưa vàocột và ly tâm ở 8000 vòng trong 1 phút và dịch đi qua cột được loại bỏ

Cột được bổ sung 500 μll dung dịch đệm AW1 và ly tâm 14000 vòng trong 1phút và dịch đi qua cột được loại bỏ Tiếp tục bổ sung vào cột 500 μll dung dịch đệmAW2, hỗn hợp được ly tâm 14000 vòng trong 1 phút và dịch đi qua cột được loại bỏ.Cột được chuyển sang ống eppendorf thể tích 1,5ml mới, 200 μll nước vô trùngđược bổ sung, hỗn hợp được giữ 1 phút ở nhiệt độ phòng và ly tâm 8000 vòng trong

1 phút Dịch cuối cùng đi qua cột là DNA tổng số Mẫu được bảo quản - 20oC đểlàm các thí nghiệm tiếp theo

2.4.2.2 Định lượng DNA bằng phương pháp đo hấp thụ ở bước sóng 260nm

Nồng độ DNA tổng số tách chiết từ mẫu máu của BN chẩn đoán là AML được

định lượng bằng cách đo mật độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại của các acid nucleic ởbước sóng 260 nm (A260) trên máy nanodrop và đợi khoảng 5 giây là kết quả xuấthiện Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng tửngoại ở bước sóng 260 nm của các baso nito Từ giá trị mật độ quang ở bước sóng

A260, với hệ số A260 = 1 tương đương với hàm lượng DNA của sợi đôi là 50 μlg/ml,

sử dụng công thức C = A260 x 50 x n (trong đó n là số lần để pha loãng) để địnhlượng DNA trong mẫu được tách chiết

Để kiểm tra độ tinh sạch của DNA tách chiết, người ta đo thêm ở bước sóng

ở 280 nm (A280) Ở bước sóng này, các protein có mức hấp thụ cao nhất Ngoài ra,các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các nucleic acid và do

đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid Một dung dịch nucleic acidđược xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỷ số:A260 /A280 nằm trong khoảng1.8 – 2 Nếu dưới 1,8 dung dịch tách chiết còn lẫn nhiều RNA, còn dung dịch saukhi đo có kết quả >2 chứng tỏ dung dịch còn lẫn nhiều protein, phải tiến hành táchlại mẫu để bảo đảm chất lượng mẫu cho phản ứng PCR

2.4.3 Tách chiết DNA plasmid bằng phương pháp Bibdo

Sau khi nuôi cấy trên đĩa thạch, 1 khuẩn lạc trắng được đưa vào ống nghiệm

vô khuẩn có chứa dung dịch LB lỏng có thể tích 2ml + 2 μll ampicilin nồng độ 100ng/ml và được lắc 200 vòng/1 phút ở nhiệt độ 37oC trong thời gian khoảng 14-16giờ Dịch nuôi cấy được chuyển sang ống eppendorf ly tâm tốc độ 4000 vòng/1phút

x 10 phút để thu tủa tế bào

Tế bào được hòa trở lại trong 200 μll dung dịch Sol I + 0,5% RNase 1mg/ml(khoảng 20 μll), trộn đều bằng máy vortex ủ nhiệt độ phòng 10 phút Tiếp theo bổsung 400 μll dung dịch Sol II vào, đảo ngược ống 5 lần (không sử dụng máy vortex)

và ủ ở 4oC/1 phút x 5 phút để phá vỡ tế bào và giải phóng plasmid

Hỗn hợp trên được trung hòa bằng 300 μll dung dịch Sol III, đảo ngược ốngnhẹ nhàng (không sử dụng máy vortex) Ủ - 20oC/1 phút x 20 phút Dịch nổi được thulại sau khi ly tâm 13000 vòng/1 phút x 15 phút ở 4oC và khoảng 800 – 900 μll dịch nổi

được chuyển sang ống eppendorf mới (giai đoạn hút này chú ý tránh hút vào tủa) Cuối cùng 600 μll dung dịch Isopropanol được bổ sung vào và ủ - 20oC thời gian

từ 2 giờ đến qua đêm Tiến hành tách plasmid ở tốc độ 13000 vòng/1 phút x 20 phút

ở 4oC, loại bỏ dung dịch và thêm 400 μll ethanol và ly tâm 13000 vòng/1 phút x 5phút x 4oC Ly tâm thêm một lần ở tốc độ 13000 vòng/1 phút x 5 phút ở 4oC, sau đóloại bỏ hoàn toàn cồn, mở lắp ống eppendorf và cho vào tủ ấm 37oC để khoảng 30 -

45 phút Kiểm tra không còn cồn, bổ sung 50 μll nước free nucleasa Lắc trộn đều vàtiến hành đo nanodrop và điện di Bảo quản mẫu ở - 20oC

2.4.4 Điện di phân tách DNA trên gel agarose

Sau khi kiểm tra nồng độ DNA bằng phương pháp đo hấp thụ ánh sáng tia tửngoại ở bước sóng A260 /A280, chúng tôi tiến hành điện di DNA tổng số trên gel

agarose 1% trong đệm TBE 1 X, với hiệu điện thế 90V trong khoảng thời gian 1 giờ

Đệm TBE đậm đặc gấp 10 lần (Tris-axit boric-EDTA 10X): Hòa tan 108 gTris và 55 g axit boric trong 600 ml nước Thêm 40 ml EDTA 0,5 M và thêm nướccất khử ion là 1 lít Hấp vô trùng ở 121oC trong 15 phút, bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Khi sử dụng, thêm 900 ml nước vào 100 ml dung dịch TBE gốc (10X) thànhdung dịch TBE 1X

Sau khi điện di xong, bản gel được nhuộm với dung dịch ethidium bromide1% trong 10 phút và soi bản gel trên hệ thống máy đọc geldot

2.4.5 Nhân bản gen bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu của gen FLT3

- Các mồi nhân đoạn gen đặc biệt FLT3 được thực hiện trên cơ sở kết quảnghiên cứu trước đây của Kyo và cộng sự (1999) và được triển khai có kết quả tạiPhòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ enzyme Trình tự cặp mồi nhân đoạn gen

có trình như sau:

FLT 11F: 5’-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC- 3’

FLT 12 R: 5’- CTT TCAGCATTTTGACGGCAACC- 3’

Thành phần của phản ứng PCR được trình bày ở bảng 2.

Chu trình nhiệt của phản ứng như sau:

Sản phẩm của PCR sau đó được phân tích bằng điện di trên gel agarose 2%.

2.4.6 Nhân dòng gen FLT3 vào E coli

Tinh sạch đoạn gen mang đột biến FLT3 bằng kít thôi gel của hãng Promega

Sau khi điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% để xác định sự chênh lệchkích thước của băng DNA và băng DNA được cắt và cho vào ống eppendorf Bổsung dung dịch gắn màng (membrance binding) với tỷ lệ 10 μll /10 mg gel, đun hỗnhợp trên ở nhiệt độ 60oC - 65oC cho đến khi gel tan chảy hoàn toàn Dung dịch đồngnhất được chuyển qua cột SV milicolumn (hãng Promega) và ủ nhiệt độ phòngtrong 1 phút Ly tâm cột SV 16000 g x 1 phút để loại bỏ dung dịch qua cột, rửa 2lần bằng dung dịch rửa (membrance washing solution)

Tiếp theo, dung dịch rửa được loại bỏ hoàn toàn và chuyển cột sang ốngeppendorf sạch, vô trùng và bổ sung 30 μll nước được khử ion Dịch qua cột chứamẫu được thu lại và bảo quản – 20oC để tiếp tục làm những nghiên cứu tiếp theo

Giai đoạn gen FLT3 được gắn vào vector pGEM-T

Các sản phẩm trên sau đó được gắn trực tiếp vào vector nhân dòng pGEM-T.Vector nhân dòng này có đầu T (pGEM-T) được thiết kế có chứa một gốcthymydine monophosphate ở đầu 3’ để bổ sung với gốc adenosine monophosphateđược gắn vào ở đầu 3’ của sản phẩm PCR khi dùng Taq DNA polymearse

Thành phần của phản ứng gắn đoạn gen FLT3 mã hóa vào vector pGEM-T vớitổng thể tích là 10 μll như sau: 2,5 μll ddH2O, 5 μll dung dịch đệm 2 X, 1 μll T4 DNAligase, 0,5 μll vector pGEM-T, sản phẩm thôi gel là 1 μll

Hỗn hợp phản ứng được ủ 22oC trong khoảng 2-3 giờ hoặc để nhiệt độ 4oC

qua đêm, sau đó sản phẩm được biến nạp vào tế bào E coli.

Biến nạp sản phẩm bằng phương pháp sốc nhiệt vào tế bào E coli DH5α khả biến

Tế bào khả biến E.coli chủng DH5α (do phòng Thí nghiệm trọng điểm côngnghệ enzyme và protein sản xuất, lưu giữ ở nhiệt độ - 80oC) được lấy ra và bảo quảntrong hộp lạnh để tan từ 15- 20 phút trong khi đợi sản phẩm gắn được bất hoạtenzyme ở nhiệt ở 65oC trong 10 phút, sau đó hút 8-10 μll hỗn hợp được gắn ở trên

bố sung vào dung dịch tế bào, trộn nhẹ nhàng và để hỗn hợp trên đá 15 phút có tácdụng là cho vector bám vào thành tế bào.

Sau đó được tiến hành sốc nhiệt ở 42oC trong 40 giây, mẫu được chuyển lạitrên tủ đá 5 phút và bổ sung 800 μll dung dịch LB lỏng, nuôi ở tủ với nhiệt độ 37oCtrong 1 giờ và lắc với tốc độ là 200 vòng/1 phút

Tiến hành ly tâm, để lại khoảng 50-100 μll dung dịch biến nạp để cấy trải trênđĩa petri có chứa môi trường TSA có bổ sung ampicilin, 15 μll Xgal, 15 μll IPTG vànuôi cấy qua đêm ở tủ ấm 37oC

Phương pháp chọn lọc khuẩn lạc trắng – xanh

Vector nhân dòng pGEM -T có gen lacz có tác dụng chuyển hóa đường lactose

Vì vậy đối với plasmid không mang đoạn gen chèn vào, khi đó gen lacz hoạt động bìnhthường trong việc tổng hợp β-galactosidase khi có mặt X-gal và IPTG trong môitrường thì enzyme sẽ chuyển hóa cơ chất thành màu xanh khi có mặt của oxy

Còn đối với plasmid tái tổ hợp có màu trắng do gen lacz bị bất hoạt là vì đoạn

gen lạ chèn vào và làm mất hoạt tính β – galactosidase của các thể tái tổ hợp, quátrình chuyển hóa cơ chất không xảy ra khi có mặt cả X-gal và IPTG

Do đó theo lý thuyết khuẩn lạc trắng là những khuẩn lạc có thể mang đoạn genđột biến, khuẩn lạc xanh là những khuẩn lạc không mang đoạn gen đột biến

Kiểm tra khuẩn lạc trắng thu được bằng PCR và điện di sản phẩm PCR đểkiểm tra đúng đoạn gen được chèn vào hay không, bằng cách tiến hành nuôi cấy

và tách chiết plasmid theo phương pháp Bibdo và gửi mẫu đã tách chiết plasmid

để giải trình tự

2.4.7 Xác định trình tự gen theo nguyên lý của Sanger và cộng sự

Nguyên tắc của phương pháp dideoxy là dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sungcho trình tự cần xác định nhờ hoạt động của enzyme DNA-polymerase Với việc sửdụng thêm các dideoxynucleoside (ddNTP) với các deoxynucleoside (dNTP) thôngthường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA cókích thước khác nhau Trong phản ứng sử dụng đoạn DNA mồi mạch đơn khoảng

20 nucleotide, bốn loại dNTP và bổ xung thêm 1% ddATP (hoặc ddCTP, ddGTP,ddTTP) có gắn phức chất huỳnh quang cho mỗi loại phản ứng Các ddNTP mất hainguyên tử oxy ở C3 và C2 khi mạch đơn DNA đang tổng hợp được gắn 1 ddNTPphản ứng ngừng tổng hợp Mỗi loại phản ứng được thực hiện riêng rẽ, có DNAkhuôn, DNA mồi, đầy đủ các loại dNTP, enzyme Taq DNA - polymerase, dungdịch đệm và có thêm khoảng 1% một loại ddNTP Kết quả phản ứng tổng hợp nêncác đoạn oligonucleotide dài ngắn khác nhau một nucleotide và được nhận biết nhờphương pháp điện di Tổng hợp kết quả phản ứng ở 4 ống, thu được trình tự cácnucleotide của mạch đơn, có thể biết được trình tự sắp xếp các nucleotide trong gen.

2.5 Phân tích, xử lý số liệu theo phương pháp nghiên cứu

- Số liệu trung bình, độ lệch chuẩn, so sánh sự chênh lệch giữa 2 biến (giá trịp) được phân tích bằng Excel 2010

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1 Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh nhân AML chọn nghiên cứu

sự có mặt của đột biến gen FLT3

3.1.1 Tỷ lệ % mắc bệnh AML theo tuổi

Bảng 3.1 So sánh tỷ lệ mắc bệnh AML theo tuổi của các tác giả