Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào phôi hợp tử chưa trưởng thành của cây ngô thông qua vi khuẩn agrobacterium

Ngô chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ luôn là giống cây trồng ưu thế, chiếm 7,8 triệu ha tương đương với 5% diện tích cây trồng chuyển gen toàn cầu và được trồng tại 9 nước [37] Ở Việt Nam,

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này trước tiên tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành

và sâu sắc nhất tới TS Phạm Thị Lý Thu đã tận tâm, nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn thạc sĩ này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo phòng Sau Đại học, thầy cô giáo khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội quan tâm và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian hoàn thành khóa học cũng như khi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn các cô chú, anh chị em đồng nghiệp Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp đã quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình trong suốt thời gian tôi thực hiện luận văn

Cuối cùng cho phép tôi được gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và tất cả những người thân yêu đã luôn động viên, khích lệ, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với những giúp đỡ quý báu đó

Hà Nội, tháng 9 năm 2014

Học viên

Phạm Thị Hương

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Danh mục bảng iv

Danh mục hình v

Ký hiệu viết tắt vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Nguồn gốc, phân loại và vai trò của cây ngô 3

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây ngô 3

1.1.2 Vai trò của cây ngô 4

1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen vào cây một lá mầm nhờ vi khuẩn Agrobacterium 6

1.2.1 Ảnh hưởng của kiểu gen 6

1.2.2 Dạng mẫu mô đích 7

1.2.3 Chủng Agrobacterium và plasmid 8

1.2.4 Các điều kiện xử lý mẫu mô đích, lây nhiễm và đồng nuôi cấy 8

1.3.Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô 10

1.4 Nghiên cứu tạo cây trồng biến đổi gen kháng thuốc trừ cỏ 13

1.4.1 Thuốc trừ cỏ Glyphosate 13

1.4.2 Thuốc diệt cỏ gluphosinate 15

1.4.3 Các gen sử dụng trong tạo giống cây trồng biến đổi gen chống chịu thuốc trừ cỏ 16

1.4.4 Giống cây trồng biến đổi gen kháng thuốc trừ cỏ - Thành tựu và triển vọng 18

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 20

2.1.1 Vật liệu 20

2.1.2 Hoá chất và thiết bị máy móc 21

2.1.3 Địa điểm thực hiện 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens 21

2.2.2 Chọn lọc nồng độ glyphosate để chọn lọc cây ngô chuyển gen trong điều kiện nhà lưới 23

2.2.3 Thử khả năng kháng thuốc trừ cỏ của các cây chuyển gen trong điều kiện nhà lưới 24

2.2.4 Thí nghiệm nảy mầm của hạt ngô thế hệ T0 24

2.2.5 Phương pháp phân tích sinh học phân tử cây chuyển gen 24

2.2.6 Phương pháp thu thập số liệu thống kê 27

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Nghiên cứu đánh giá khả năng tiếp nhận gen CP4 EPSPS của các dòng ngô 28

3.2 Chọn lọc nồng độ glyphosate để chọn lọc cây ngô chuyển gen trong điều kiện nhà lưới 33 3.3 Kết quả phân tích PCR sự có mặt của gen kháng thuốc trừ cỏ EPSPS của các dòng ngô chuyển gen thế hệ T0 34

3.4 Kết quả phân tích Southern blot các dòng ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ 39

3.5 Đánh giá sự có mặt của protein EPSPS trong các dòng ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ 41

3.6 Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc trừ cỏ glyphosate của các dòng ngô chuyển gen EPSPS trong điều kiện nhà lưới 43

3.7 Đánh giá sự phân ly của gen EPSPS trong các dòng ngô chuyển gen kháng cỏ thế hệ T1 45 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

4.1 Kết luận 48

4.2 Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Công thức môi trường 23

Bảng 2.2 Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng PCR 26

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR gen EPSPS 26

Bảng 3.1 Kết quả biến nạp gen EPSPS vào các dòng ngô vụ Đông Xuân 29

Bảng 3.2 Kết quả biến nạp gen EPSPS vào các dòng ngô vụ Hè Thu 30

Bảng 3.3 Khảo sát nồng độ glyphosate đối với các cây chuyển gen 33

Bảng 3.4 Hàm lượng ADN của các cây chuyển gen 35

Bảng 3.5 Kết quả phân tích PCR gen kháng thuốc trừ cỏ EPSPS trong các dòng ngô chuyển gen 36

Bảng 3.6 Hiệu quả chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 39

Bảng 3.7 Kết quả xác định protein EPSPS trong các dòng ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ 42

Bảng 3.8 Đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của các dòng chuyển gen 44

Bảng 3.9 Kết quả nảy mầm của hạt chuyển gen thế hệ T0 45

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây ngô 3

Hình 2.1 Các dòng ngô trồng làm vật liệu chuyển gen trong nhà lưới cách ly côn trùng 20

Hình 2.2 Cấu trúc vector chuyển gen mang gen EPSPS 20

Hình 2.3 Tách phôi từ bắp ngô dòng CM8 (Vụ Hè Thu, 8 ngày sau thụ phấn) 22

Hình 3.1 Kết quả biến nạp gen EPSPS vào 3 dòng ngô vụ Đông Xuân 30

Hình 3.2 Kết quả biến nạp gen EPSPS vào 3 dòng ngô vụ Hè Thu 31

Hình 3.3 Các giai đoạn của quá trình chuyển gen EPSPS vào dòng ngô VH1, CM8, CH9 32

Hình 3.4 Khảo sát nồng độ glyphosate xử lí trên bề mặt lá ngô chuyển gen và mẫu đối chứng (lá cây ngô không chuyển gen) 34

Hình 3.5 Kết quả điện di kiểm tra mẫu DNA tổng số trên gel agarose 0,8% 35

Hình 3.6 Kết quả phân tích PCR gen EPSPS ở các cây T0 của dòng CM8 37

Hình 3.7 Kết quả phân tích PCR gen EPSPS ở các cây T0 của dòng CH9 37

Hình 3.8 Kết quả phân tích PCR gen EPSPS các cây T0 dòng VH1 39

Hình 3.9 DNA tổng số của các dòng ngô chuyển gen được cắt bằng enzyme BamHI 40

Hình 3.10 Kết quả phân tích Southern blot các dòng ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ EPSPS 41

Hình 3.11 Kết quả đánh giá sự hiện diện của protein EPSPS trong các dòng ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ 43

Hình 3.13 Kết quả đánh giá khả năng nảy mầm hạt của các dòng ngô chuyển gen thế hệ T1 trên môi trường chọn lọc 46

Hình 3.14 Cây chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ thế hệ T1 dòng CH9 sau 3 lần phun Vifosate 47

KÝ HIỆU VIẾT TẮT

2,4D Dichlorophenoxy acetic acid

CTAB Cetyltrimethylammonium Bromide

CIMMYT International maize and wheat improvement center

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit

FAO Food and Agriculture Organization

nptII neomycin phosphotransferase

PCR Polymerase Chain Reaction

MỞ ĐẦU

Ngô là một trong ba cây lương thực quan trọng nhất trên thế giới (cùng với lúa

mì và gạo) và là cây lương thực có vai trò kinh tế quan trọng bậc nhất Tính đến năm

2013 diện tích trồng ngô thế giới vào khoảng 177 triệu ha [65] Theo dự đoán vào năm

2020, nhu cầu ngô sẽ tăng lên 50% với hơn 852 triệu tấn một năm và có thể vượt qua

cả gạo và lúa mì [35]

Hiện nay ngành sản xuất ngô thế giới nói chung và nước ta nói riêng đang phải đối mặt với rất nhiều vấn đề như: khí hậu biến đổi phức tạp, hạn hán, lũ lụt ngày càng nặng nề hơn, đặc biệt cỏ dại cũng là một vấn đề lớn trong nông nghiệp đã làm giảm năng suất cây trồng từ 10 – 15% Do đó, hàng loạt các biện pháp phòng trừ cỏ dại đã được áp dụng như: sử dụng các loại thuốc diệt cỏ chọn lọc hoặc không chọn lọc Đặc biệt ở những vùng có hiện tượng xói mòn đất, thuốc diệt cỏ được sử dụng như một giải pháp duy nhất để loại trừ cỏ dại Tuy nhiên, việc lạm dụng một số thuốc diệt cỏ có độc tính cao đã và đang gây ra các hậu quả nghiêm trọng đối với môi trường, hệ sinh thái

và sức khỏe con người Điều này đặt ra nhiệm vụ to lớn cho các nhà chọn giống, các nhà nghiên cứu công nghệ sinh học chọn tạo ra các giống ngô mới có năng suất cao, chống chịu thuốc diệt cỏ

Các giống cây trồng biến đổi gen mang các đặc tính khác nhau đã được nghiên cứu và áp dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao năng suất cây trồng, tăng thu nhập cho người lao động Hàng năm, số lượng nông dân và các quốc gia trồng cây trồng biến đổi gen liên tục gia tăng Cây ngô chuyển gen đầu tiên được thương mại hóa vào năm

1996, đến năm 2013 diện tích trồng ngô biến đổi gen đạt 57,4 triệu ha tại 17 nước, trong đó có 5 nước trồng hơn 1 triệu ha bao gồm: Hoa Kỳ (35,6 triệu ha), Brazil (12,9 triệu ha), Argentina (3,2 triệu ha), Nam Phi (2,4 triệu ha) và Canada (1,7 triệu ha) Ngô chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ luôn là giống cây trồng ưu thế, chiếm 7,8 triệu ha tương đương với 5% diện tích cây trồng chuyển gen toàn cầu và được trồng tại 9 nước [37]

Ở Việt Nam, trong thời gian gần đây, các nghiên cứu chuyển gen vào các loài cây trồng đã được quan tâm, chú ý nhiều hơn, tuy nhiên với đối tượng cây ngô, có

thể nói đây là loài cây trồng tương đối khó tính trong quá trình nuôi cấy invitro cũng như chuyển nạp gen, hiệu quả biến nạp gen còn rất thấp Mặt khác, việc tạo ra cây trồng chuyển gen có khả năng áp dụng vào sản xuất từ những nghiên cứu trong nước đang là đòi hỏi cấp thiết đối với lĩnh vực nghiên cứu công nghệ sinh học và ngành nông nghiệp của Việt Nam Các giống cây trồng biến đổi gen kháng thuốc trừ cỏ đã mang lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường và chi phí lao động của nông dân

Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn và dựa trên các cơ sở lý luận khoa học nêu trên

chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào phôi hợp tử chưa trưởng thành của cây ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium” Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá khả năng tiếp nhận gen kháng thuốc trừ cỏ của một số dòng ngô Việt Nam

Nôi dung nghiên cứu

1 Nghiên cứu đánh giá khả năng tiếp nhận gen EPSPS vào các dòng ngô Việt Nam

2 Phân tích sinh học phân tử PCR sự có mặt của gen kháng thuốc trừ cỏ EPSPS của các dòng ngô chuyển gen thế hệ T0 và thế hệ T1

3 Phân tích Southern blot sự có mặt của gen kháng thuốc trừ cỏ

4 Đánh giá sự có mặt của protein EPSPS trong các dòng ngô chuyển gen kháng cỏ

5 Đánh giá khả năng kháng thuốc trừ cỏ glyphosate của các dòng ngô chuyển

gen EPSPS trong điều kiện nhà lưới

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc, phân loại và vai trò của cây ngô

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây ngô

Phân loại khoa học

Ngô (Zea mays L) thuộc:

Chi : Maydeae

Họ: Poaceae (hòa thảo)

Bộ: Poales (Hòa thảo)

từ trước đây dùng để gọi cho một loại cây lương thực, hiện nay thuật ngữ này dùng

để chỉ cây ngô, là dạng rút gọn của "Indian corn" là “cây lương thực của người Anh điêng” Lịch sử nghiên cứu thuộc các lĩnh vực khảo cổ, di truyền học, thực vật học, dân tộc học và địa lý học…quan tâm và đưa ra nhiều giả thuyết Có giả thuyết cho

là nguồn gốc cây ngô khoảng năm 5.500 tới 10.000 trước công nguyên (TCN) Những nghiên cứu về di truyền học gần đây cho rằng quá trình thuần hóa ngô diễn

ra vào khoảng năm 7000 TCN tại miền trung Mexico và tổ tiên của nó là loại cỏ teosinte hoang dại gần giống nhất với ngô ngày nay vẫn còn mọc trong lưu vực sông Balsas Liên quan đến khảo cổ học, người ta cũng đã phát hiện các bắp ngô có sớm nhất tại hang Guila Naquitz trong thung lũng Oaxaca, có niên đại vào khoảng năm 4.250 TCN, các bắp ngô cổ nhất trong các hang động gần Tehuacan, Puebla, có niên đại vào khoảng 2750 TCN Một số giả thuyết cho rằng, có lẽ sớm nhất khoảng năm 1500 TCN, ngô bắt đầu phổ biến rộng và nhanh, ngô là lương thực chính của phần lớn các nền văn hóa tiền Columbus tại Bắc Mỹ, Trung Mỹ, Nam Mỹ và khu

vực Caribe Với người dân bản xứ tại đây, ngô được suy tôn như bậc thần thánh và

có tầm quan trọng về mặt tôn giáo do ảnh hưởng lớn của nó đối với đời sống của họ

Hiện trên thế giới đang tồn tại hai hệ thống phân loại đối với Zea: Wilkes (1967) [63] và Doebly (1980) [23] Theo hệ thống phân loại của Wilkes ngô là

Zea mays, còn theo hệ thống phân loại mới là Zea mays mays Từ loài Zea mays

L dựa vào cấu trúc nội nhũ của hạt được phân thành các loại phụ Những loài

phụ chính bao gồm:

Zea mays subsp Indurata Sturt – Ngô đá

Zea mays subsp Indentata Sturt – Ngô răng ngựa

Zea mays subsp Ceratina Kulesh – Ngô nếp

Zea mays subsp Saccharata Sturt – Ngô đường

Zea mays subsp Everta Sturt – Ngô nổ

Zea mays subsp Amylacea Sturt – Ngô bột

Zea mays subsp Tunecata Sturt – Ngô bọc

1.1.2 Vai trò của cây ngô

Cây ngô là cây lương thực quan trọng đứng thứ ba trên thế giới (sau lúa mỳ và lúa gạo) và đứng thứ hai ở Việt Nam (sau lúa) Ngô được trồng rộng rãi trên toàn thế giới, với tổng sản lượng hàng năm lớn hơn bất kỳ loại ngũ cốc nào khác Hoa Kỳ sản xuất khoảng 40% tổng sản lượng ngô trên thế giới, sau Hoa Kỳ là các nước Trung Quốc, Brazil, Mexico, Indonesia, Ấn Độ, Pháp và Argentina Chỉ tính riêng trong năm 2013, tổng diện tích trồng ngô toàn cầu là hơn 177 triệu ha, đạt sản lượng 963 triệu tấn, nhiều hơn gạo (745 triệu tấn) hoặc lúa mì (708,5 triệu tấn) [65] Ngô là loại cây lương thực nuôi sống gần 1/3 số dân trên toàn thế giới Bên cạnh giá trị lương thực, cây ngô còn là cây thức ăn gia súc quan trọng, 70% chất tinh trong thức ăn hỗn hợp là từ ngô Cây ngô còn là thức ăn xanh và ủ chua rất tốt cho chăn nuôi gia súc lớn, đặc biệt là bò sữa Những năm gần đây, cây ngô còn là loại cây thực phẩm được ưa chuộng Người ta dùng bắp ngô bao tử để làm rau cao cấp Đây là loại rau có hàm lượng chất dinh dưỡng cao và không

có dư lượng các chất bảo vệ thực vật Các loại ngô nếp, ngô đường được dùng để luộc, nướng hoặc đóng hộp làm đồ hộp Ngô có một số vai trò chính:

- Là nguồn có giá trị dinh dưỡng: Ngô có chứa các chất như protein (10,6%), lipid (4-5%), glucid (69%), ngoài ra hàm lượng vitamin trong ngô cũng khá cao, tập chung chủ yếu ở lớp ngoài hạt ngô và ở mầm

- Làm lương thực, thực phẩm cho con người

Cây ngô là một trong ba cây trồng quan trọng nhất được sử dụng làm thức ăn cho người và gia súc Toàn thế giới sử dụng 17% sản lượng ngô làm lương thực cho người trong đó ở các nước đang phát triển là 30%, các nước phát triển khoảng 40% Các nước ở Trung Mỹ, Nam Á và Châu Phi sử dụng ngô làm lương thực chính Khẩu phần ăn ở các nước châu Mỹ La Tinh là bánh ngô, đậu đỗ và ớt giống như các nước châu Á sử dụng cơm (gạo), cá, rau xanh và các nước châu Âu sử dụng bánh mỳ, khoai tây, sữa

Tại Mỹ, hơn 90% sản lượng ngô được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi và 10% làm thức ăn cho người thông qua các sản phẩm chế biến công nghiệp Ở châu Phi và một số nước châu á, hơn 90% sản lượng ngô được sử dụng làm lương thực cho con người, cung cấp 80-90% năng lượng [16]

- Ngô làm thức ăn chăn nuôi

Theo số liệu thống kê của CIMMYT, giai đoạn 1997 – 1999, thế giới dùng ngô làm thức ăn chăn nuôi là 66% - khoảng 400 triệu tấn/năm Các nước phát triển

có tỷ lệ dùng ngô làm thức ăn chăn nuôi cao, thường trên 70%

Hiện nay, Việt Nam cũng dùng ngô làm thức ăn chăn nuôi là chính (khoảng 90%) song tỷ lệ ngô trong tổng số chất tinh chỉ khoảng 50%, vì ta còn dùng thêm gạo gẫy, cám, bột sắn

Từ ngô hạt có thể xay vỡ nuôi gia cầm (gà, vịt, ngan, ngỗng…), nghiền thành bột và chế biến làm thức ăn cho trâu bò, lợn và gia cầm, chế biến thức ăn cho cá Thân

lá ngô có thể cho trâu bò ăn tươi, sau khi thu hoạch (nhất là ngô thu bắp non) băm nhỏ

ủ chua làm thức ăn cho gia súc Chế biến thức ăn chăn nuôi từ ngô: Ngô nghiền thành bột và có thể trộn theo thành phần và tỷ lệ khác nhau với bột sắn (khoai mỳ), cám gạo, khô dầu lạc, khô dầu đậu tương, bột cá, vỏ tôm, vỏ sò …để chế biến làm các loại thức

ăn cho gia súc, gia cầm và thủy sản

Giá trị dinh dưỡng của thân, lá ngô khá lớn, phụ thuộc vào giống ngô và thời

vụ thu hoạch Trong 1 kg thân cây ngô có 600 - 700 g chất khô, 60-70 g protein, 280-300 g xơ Do vậy, thân, lá ngô là nguồn thức ăn thô quan trọng cho trâu bò ở nhiều vùng Giá trị dinh dưỡng thân, lá ngô còn tăng lên nếu được chế biến theo cách lên men ủ chua

- Làm nguyên liệu cho một số ngành công nghiệp

Ngô được sử dụng làm nguyên liệu cho một số ngành công nghiệp: sản xuất thức ăn gia súc, sản xuất rượu cồn, tinh bột dầu, glucose, bánh kẹo trong thành phần khối lượng của hạt ngô, tinh bột chiếm tỷ lệ 65-83% là nguồn nguyên liệu quan trọng trong công nghiệp gia công tinh bột Nguồn tinh bột này được sử dụng phổ biến trong công nghiệp chế biến các loại đường: sản xuất glucose dùng trong sản xuất bánh kẹo, công nghiệp keo dán, sản xuất xăng sinh học, chế biến

đồ giải khát, bia, rượu

1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen vào cây một lá mầm nhờ vi

khuẩn Agrobacterium

Sự thành công trong việc tạo ra thực vật chuyển gen phụ thuộc vào một loạt các yếu tố như tần số biến nạp, tác nhân chọn lọc hoặc sàng lọc và khả năng tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh từ các tế bào và mô mang gen chuyển nạp Đối với

phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium thì tần số biến nạp phụ thuộc

vào các yếu tố liên quan đến vi khuẩn và các yếu tố liên quan đến thực vật Các yếu

tố liên quan đến vi khuẩn bao gồm: chủng vi khuẩn, mật độ vi khuẩn, thời gian lây

nhiễm, hoạt tính của gen vir, khả năng xâm nhập vào các cây chủ và loại vectơ Các

yếu tố liên quan đến thực vật gồm loại cây, kiểu gen, dạng mẫu mô, khả năng phân bào của các tế bào đích, thành phần môi trường [20] Sau đây là một số yếu tố chính

1.2.1 Ảnh hưởng của kiểu gen

Nhìn chung, hiệu quả chuyển gen rất khác nhau giữa các kiểu gen của cùng một loài Đa số các báo cáo về chuyển gen chỉ đề cập ảnh hưởng của kiểu gen đến tần số chuyển gen bền vững, vì thế người ta không biết được kiểu gen có ảnh hưởng

đến khả năng chuyển T-ADN hay phản ứng nuôi cấy in vitro Trong số các loài cây

một lá mầm đã được chuyển gen, cây lúa là đối tượng chuyển gen ít phụ thuộc vào kiểu gen nhất Hơn 40 kiểu gen của các giống lúa indica, japonica và javanica đã được chuyển gen Đối với ngô, lúa mỳ, lúa mạch và mía, các dòng mô hình được sử dụng cho chuyển gen bằng súng bắn gen đều có phản ứng tốt trong chuyển gen

thông qua Agrobacterium Các dòng mô hình đó là ngô: A188 và các dòng lai với

A188; lúa mỳ: Bobwhite và Fielder; Lúa mạch: Golden Promise và Igri; Mía: Ja

60-5 [20]

Xây dựng được quy trình biến nạp không phụ thuộc vào kiểu gen của một loài cây trồng nhất định là một yêu cầu đối với các nhà nghiên cứu Gần đây, các cây chuyển gen đã được tạo ra từ các dòng/giống chọn lọc của nhiều loài cây ngũ cốc như: giống lúa miến PHI391; giống ngô PHP38 và PHN46; giống lúa mạch Schooner Tuy nhiên, tần số chuyển gen của các dòng chọn lọc này thấp hơn so với các dòng mô hình tương ứng [59], [60], [20]

1.2.2 Dạng mẫu mô đích

Mô sẹo phôi hoá

Mô sẹo phôi hoá tạo thành từ phôi trưởng thành của các giống lúa japonica

được cho là dạng mô thích hợp nhất cho biến nạp gen thông qua Agrobacterium

[31] Tiếp đó, dạng tế bào này đã được sử dụng để chuyển gen vào các giống lúa và lúa mỳ có kiểu gen khác nhau [19] Các nghiên cứu chuyển gen vào cây măng tây

A officinalis [39]; cây hẹ tây [24], tỏi [38], và các loài hoa Lily [51] cũng sử dụng

hệ thống tế bào đích này Mô sẹo phôi hoá tạo thành từ mô phân sinh hoặc từ

cây mía in vitro [25]; từ lá của hai loài cây cảnh Agapanthus praecox ssp Orientalis L và Muscari armeniacum Leichtl Ex Bak., cũng đã được chuyển

gen thành công [51]

Phôi non mới tách

Phôi non mới tách đã được tìm thấy là dạng mẫu mô đích tốt nhất, có

khả năng tái sinh cao, thích hợp cho lây nhiễm với Agrobacterium của các

kiểu gen của giống lúa indica [12], ngô [34], [42], [61], [27], [29], [58] và lúa

mạch [52] Quy trình chuyển gen đối với các loài Allium sử dụng phôi non đã

Các nghiên cứu chuyển gen thành công thông qua A tumefaciens cho

thấy hiện tại chỉ có 3 chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng hiệu quả ở các loài cây một lá mầm đó là LBA4404, C58 và EHA 101; và các chủng cải biên (EHA105 từ EHA101, AGL0 & AGL1 từ EHA101) [20] Dạng Ti-plasmid

của Agrobacterium cũng có vai trò trong quá trình chuyển T-ADN vào tế bào

thực vật Các nghiên cứu cho thấy, Ti-plasmid dạng nopalin có hiệu quả hơn

trong việc lây nhiễm Agrobacterium vào ngô so với Ti-plasmid dạng octopin

1.2.4 Các điều kiện xử lý mẫu mô đích, lây nhiễm và đồng nuôi cấy

Tiền xử lý mẫu mô biến nạp

Hệ thống chuyển gen có hiệu quả đã đƣợc xây dựng đối với phôi non tiền nuôi cấy đƣợc xử lý co nguyên sinh [40] Thổi khô phôi non lúa mỳ tiền

nuôi cấy sau khi lây nhiễm với Agrobacterium đã làm tăng rõ rệt hiệu quả

chuyển gen [19]

Xử lý chống thối hoại mô biến nạp

Các thao tác in vitro đối với mẫu mô thực vật sau khi lây nhiễm với Agrobacterium là rất cần thiết để kích thích khả năng chuyển T-ADN vào tế

bào thực vật và để phục hồi tế bào sau khi biến nạp

Xử lý áp suất thẩm thấu

Xử lý này có hiệu quả trong chuyển gen thông qua Agrobacterium ở

một số loài cây một lá mầm Nghiên cứu của Uze và cộng sự (1997) [53] cho

thấy xử lý phôi lúa non tiền nuôi cấy trên môi trường áp suất thẩm thấu 10% sucrose đã cải thiện khả năng chuyển T-ADN Tuy nhiên, ảnh hưởng của môi trường xử lý áp suất thẩm thấu đến hiệu quả chuyển T-ADN và chuyển gen bền vững không rõ rệt trong các nghiên cứu chuyển gen ở ngô [61], [27] Điều này cho thấy tác động của xử lý áp suất thẩm thấu đến chuyển gen thông qua

Agrobacterium phụ thuộc nhiều vào loài

Thổi khô mẫu

Một yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả chuyển gen ở các loài cây một lá mầm đó là thổi khô mẫu trước hoặc sau khi lây nhiễm Thổi khô huyền phù tế bào mía với thời gian từ 10-15 phút đã kích thích khả năng chuyển T-ADN và tần số chuyển gen bền vững [14], [54]

Nhiệt độ đồng nuôi cấy mô thực vật với vi khuẩn Agrobacterium

Nhiệt độ thích hợp cho chuyển gen bền vững cũng cần phải được đánh

giá với mỗi dạng mẫu mô đích và với mỗi chủng Agrobacterium biến nạp [48] Nghiên cứu của Kondo và cộng sự (2000) [38] cho thấy biểu hiện gus tạm

thời trong chuyển gen vào mô sẹo cây tỏi đạt được cao nhất ở 22oC, trong khi

đó tần số chuyển gen cao hơn đã nhận được ở phôi ngô non sau khi biến nạp đồng nuôi cấy ở 20oC [27], [29]

Thành phần môi trường lây nhiễm và đồng nuôi cấy

Thành phần môi trường cũng là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen Trong chuyển gen vào phôi ngô non, Ishida và cộng sự (1996) [34] đã sử dụng môi trường LS, Zhao và cộng sự (2001) [61] sử dụng môi trường N6 có bổ sung nitrat bạc Môi trường với hàm lượng khoáng giảm

đã kích thích khả năng chuyển T-ADN trong biến nạp gen vào mô sẹo phôi hoá ở phôi non ở ngô [15], [58]

Việc bổ sung acetosyringone (AS) - chất kích thích sự hoạt động của các gen

vir [13], [33], đã có trong hầu hết các quy trình chuyển gen ở cây một lá mầm Trong môi trường không có AS, mức độ biểu hiện tạm thời của gen gus rất

thấp, không tái sinh được các cây lúa và cây hành chuyển gen [31], [19]

Các chất kháng sinh để loại bỏ Agrobacterium

Các chất kháng sinh như: cefotaxim, carbenicillin, timentin thường được

sử dụng để loại bỏ vi khuẩn sau khi nuôi cộng sinh trong các nghiên cứu chuyển gen thông qua A tumefaciens [50] Cefotaxim biểu hiện rất hiệu quả

trong các nghiên cứu chuyển gen ban đầu ở ngô và lúa

Mật độ vi khuẩn Agrobacterium

Mật độ vi khuẩn Agrobacterium cao thường gây chết tế bào thực vật,

giảm khả năng tái sinh của các tế bào sau khi biến nạp, dẫn tới giảm tần số chuyển gen bền vững Tuy nhiên, mật độ vi khuẩn lây nhiễm cao là cần thiết đối với chuyển gen vào các loài, các mẫu mô khó, tần số chuyển gen

có thể được cải thiện bằng cách lây nhiễm thời gian ngắn, rửa mẫu sau khi lây nhiễm hoặc bổ sung các chất kìm hãm vi khuẩn vào môi trường đồng nuôi cấy [61], [58]

1.3 Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô

Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô trên thế giới

Chuyển gen vào thực vật hai lá mầm thông qua vi khuẩn A.tumefaciens đã được

biết đến như là một cơ chế đưa ADN mong muốn vào thực vật với hiệu quả cao Tuy

nhiên, hầu hết các cây một lá mầm đều không phải là vật chủ của A.tumefaciens, do

vậy những nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô ban đầu được xây dựng và phát triển hệ thống tái sinh từ việc chuyển gen vào các tế bào đặc biệt

Vào năm 1993, cây lúa là cây một lá mầm chuyển gen đầu tiên được thu nhận

nhờ lây nhiễm phôi non với A.tumefaciens [18] Tiếp đó, cây ngô chuyển gen cũng

được tạo ra bằng phương pháp này Một trong những nguyên nhân dẫn đến sự chậm trễ

trong các nghiên cứu biến nạp gen vào cây ngũ cốc thông qua A.tumefaciens là do thiếu

phản ứng gây tổn thương hoặc phản ứng gây tổn thương kém ở mô tế bào của cây ngũ cốc Phản ứng này là một trong những yếu tố cần thiết đối với sự lây nhiễm thành công

A.tumefaciens vào tế bào thực vật [45]

Cây ngô chuyển gen (Zea mays) đầu tiên được tạo ra bằng phương pháp sử

dụng súng bắn gen vào năm 1990 Kể từ sau đó công nghệ chuyển gen vào cây ngô

đã trở thành công cụ quan trọng trong nghiên cứu chất nguyên sinh của phôi và nghiên cứu về các vấn đề sinh học cơ bản thông qua nghiên cứu về cây ngô chuyển gen Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh phương pháp chuyển gen thông qua vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens là lựa chọn tốt hơn về sự kết hợp của gen vào

cây ngô so với việc sử dụng phương pháp súng bắn gen Hệ thống chuyển gen này giúp cho tỉ lệ ổn định của gen cao hơn, số bản sao của gen chuyển trong cây thấp hơn phương pháp súng bắn gen [34], [60] và có ưu điểm là có thể chuyển phân mảnh ADN có kích thước lớn tới các tế bào nhận, hiệu quả chuyển gen cao hơn Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium cho hiệu quả cao đã được chứng minh tại nhiều phòng thí nghiệm Tần số chuyển gen có thể đạt từ 5-30% khi đồng nuôi cấy Agrobacterium mang vector nhị thể ”super-binary” với phôi chưa trưởng thành của dòng ngô A188 [34]

Một tiến bộ mới trong cải tiến quy trình biến nạp gen ở ngô là sử dụng chủng

A.tumefaciens LBA4404 và hệ thống siêu vector hai nguồn đã tạo bước đột phá trong chuyển gen thông qua A.tumefaciens [34], cải thiện tần số chuyển gen lên đến 5 - 30% Các nghiên cứu chuyển gen vào tế bào ngô thông qua A.tumefaciens cho thấy quá trình

chuyển gen thường bị tắc nghẽn ở sự kết hợp của T-ADN trong hệ gen của thực vật [41] Sự kết hợp của ADN ngoại lai trong hệ gen thực vật có thể xảy ra thông qua sự tái

tổ hợp bất thường Sử dụng các siêu vector hai nguồn, gen hpt/bar được chuyển vào

phôi non dòng ngô A188 và các dòng lai với A188 [34]

Negrotto và cộng sự (2000) [42] đã sử dụng phospho-mannose-isomerase giống như chỉ thị chọn lọc đã thu được các cây ngô chuyển gen bằng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium Zhao và cộng sự (2001) [61] đã tối ưu hóa các điều kiện chuyển gen vào callus của giống ngô Hi-II tăng hiệu suất chuyển gen trung bình xấp xỉ 40% Frame và cộng sự (2002 [27] sử dụng vi khuẩn Agrobacterium mang vector nhị thể chuyển gen vào dòng ngô A188 thu được hiệu suất chuyển gen đạt 5,5% Xueqing Huang và cộng sự (2005) [56] đã cải tiến quy trình chuyển gen vào bốn dòng ngô chọn lọc, hiệu suất thu được đạt từ 2,35 – 5,26%

Năm 2002, trong nghiên cứu của mình, Frame và cộng sự đã tiến hành chuyển gen vào phôi non mới tách của dòng ngô lai HiII, sử dụng vector hai nguồn và bổ sung cystein trong môi trường nuôi cộng sinh thu được hiệu quả chuyển gen tương đối cao lên đến gần 5,5%

Gần đây nhất, Hensel và cộng sự (2009) [30] đã sử dụng hệ thống vector hai

nguồn pGH218 để chuyển thành công gen chỉ thị chọn lọc pat và gen gus vào phôi non của dòng ngô lai HiII với tần số lên đến 24% Mặc dù vậy, các công trình chuyển gen

thành công ở ngô vẫn bị giới hạn bởi việc sử dụng dòng ngô A188 hoặc dòng lai trong

đó dòng A188 là bố hoặc mẹ làm vật liệu

Trong hầu hết các nghiên cứu biến nạp gen thành công ở ngô nhờ vi khuẩn

A.tumefaciens, phôi non mới tách được xem là dạng vật liện ban đầu có khả năng

chuyển nạp tốt nhất Mặc dù vậy, một số nghiên cứu gần đây cho thấy các dạng mẫu

mô khác của cây ngô như cờ non, bao phấn, cây con in vitro và tế bào gốc là cũng có khả năng tái sinh và sử dụng làm vật liệu cho biến nạp gen [20] Các nghiên cứu

chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium của các dòng ngô sử dụng các mẫu mô

khác nhau bao gồm callus phôi hóa [22], callus bắt nguồn từ lá [11] Năm 2006,

Sidorov và cộng sự đã nhận được cây chuyển gen khi biến nạp vector mang gen gfp và nptII/CP4 vào mô sẹo tạo thành từ đốt thân mầm của cây con in vitro 7 - 10 ngày tuổi

của 5 dòng ngô khác nhau Tần số biến nạp thu được từ 2 - 11% và có khoảng 60% cây

To có 1 – 2 bản copy của gen chuyển [55]

Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô tại Việt Nam

Tại Việt Nam cùng với phương pháp chọn tạo giống truyền thống ngày càng hiệu quả hơn thì việc ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo các giống cây trồng có khả năng chống chịu với điều kiện bất thuận sinh học và phi sinh học đã được nghiên cứu Bắt đầu từ các nghiên cứu nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy noãn ngô để tạo dòng ngô thuần, Lê Huy Hàm và cộng sự (2003) [3], Nguyễn Thị Khánh Vân và cộng sự (2005) [10] đã thực hiện và chuyển giao ứng dụng thành công tại Viện Nghiên cứu Ngô

Sử dụng chỉ thị phân tử để đánh giá đa dạng di truyền, tính khoảng cách di truyền và tìm ra sự tương quan di truyền để dự đoán ưu thế lai sớm cho chọn tạo giống ngô đã được một số tác giả nghiên cứu [4]

Xây dựng hệ thống tái sinh và chuyển gen vào cây ngô đã được bắt đầu nghiên cứu một cách bài bản ở Việt Nam từ năm 2002 [5], [6], [7], [8], [9] Tiếp đó, nhóm

nghiên cứu đã biến nạp thành công gen kháng sâu cry1Ac vào các dòng ngô mô hình

(HR8 và HR9) và các dòng ngô chọn lọc, bước đầu thu nhận được các dòng ngô có khả năng kháng sâu đục thân [1] Ngoài đặc tính kháng sâu bệnh, các đặc tính chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường như hạn, lạnh cũng đã được bắt đầu đưa vào nghiên cứu trên các đối tượng cây trồng như ngô, lúa, đậu tương

Nguyễn Văn Đồng và cộng sự năm 2013 [2] đã chuyển thành công vector mang gen chịu hạn CaMV35S:: ZmNF-YB và SARK::IPT Kết quả đã thu được 6 dòng ngô được xác định có khả năng kháng hạn

Đây là những nghiên cứu rất quan trọng, tạo tiền đề cho các nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng biến đổi gen ở Việt Nam

1.4 Nghiên cứu tạo cây trồng biến đổi gen kháng thuốc trừ cỏ

1.4.1 Thuốc trừ cỏ Glyphosate

Glyphosate (N-(phosphonomethyl) glycine) là chất diệt cỏ phổ rộng, không chọn lọc được sử dụng để diệt các loài cỏ dại, cây có lá rộng và các cây lấy gỗ Nó được phun hoặc cho hấp thụ qua lá, hoặc tiêm vào thân và di chuyển tới phần mô đang phát triển Sản phẩm thương mại đầu tiên có tên là Roundup do Công ty Monsanto sản xuất vào năm 1970 Theo số liệu thống kê ở Mỹ hằng năm sử dụng glyphosate khoảng từ 2500 -

4000 tấn ở mức độ gia đình và 40000 - 50000 tấn cho sản xuất nông nghiệp

Glyphosate là một chất ức chế cạnh tranh với phosphoenolpyruvate (PEP) trong quá trình tổng hợp 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate (EPSP) Dưới sự xúc tác đặc biệt của enzyme 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase (EPSPS), glyphosate ngăn cản phản ứng của PEP và 3-phosphate-shikimate (S3P) để tạo

thành 5-enolpyruvul 3-phosphate-shikimate

Phản ứng tổng hợp EPSP từ S3P và PEP dưới sự xúc tác của enzyme EPSPS Glyphosate ức chế hoạt động của EPSPS thông qua cơ chế cạnh tranh vị trí hoạt động của PEP Sự ức chế các tổng hợp acid shikimic, tiền chất để tổng hợp các loại amino acids thơm như trypsine, tryptophane và phenylalanine, sẽ gây chết đối với các loài thực vật và vi khuẩn Con đường sinh tổng hợp shikimate chỉ có mặt trong thực vật, vi khuẩn và nấm; không có trong động vật, bởi vậy EPSPS là mục tiêu tác dụng của chất diệt cỏ và các chất kháng khuẩn [21], [44] Sử dụng glyphosate không ảnh hưởng tới con người và môi trường, không gây độc hại đối với thành phần của đất và thường không phát sinh các loại cỏ kháng thuốc

Ở đa số các loài cây trồng và cỏ dại đều không có khả năng kháng với glyphosate Tính tự kháng với glyphosate chỉ tìm thấy khi nuôi cấy mô của một

số loài thực vật Tuy nhiên, ở các trường hợp này không có giá trị sử dụng do tính kháng glyphosate hoặc là không ổn định về mặt di truyền hoặc là không có tính di truyền

EPSPS là enzyme chìa khóa trong con đường sinh tổng hợp các acid amino thơm ở thực vật và vi khuẩn EPSPS đã được quan tâm rất nhiều khi các nhà khoa học phát hiện nó bị ức chế bởi glyphosate vào những năm 1980 Trong tự nhiên có

2 dạng EPSPS với độ tương đồng về acid amino khoảng 50%, bao gồm: dạng EPSPS I tồn tại ở thực vật và vi khuẩn, dạng này đã được đa số công trình tập trung nghiên cứu cấu trúc và vị trí xúc tác của EPSPS Dạng EPSPS II chỉ có ở một số vi khuẩn, ví dụ Pseudomonas sp strain PG2982, A.tumefaciens sp strain CP4 và Staphylococcus aureus[44]

Một số nghiên cứu cho thấy cấu trúc EPSPS I thay đổi sẽ làm giảm ái lực của glyphosate Điều này đã được chứng minh trong nghiên cứu cấu trúc và

động học của enzyme ở chủng đột biến E coli G96A [27] Những nghiên cứu

về đột biến EPSPS kháng glyphosate không chỉ làm sáng tỏ cơ chế ức chế của glyphosate, mà còn trở thành công cụ để tạo cây trồng kháng glyphosate Tuy nhiên chưa có công bố về hiệu quả kháng glyphosate ở các nghiên cứu cây chuyển gen tăng cường biểu hiện EPSPS dạng nguyên bản hay dạng đột biến cho đến nay

Năm 1983, các nhà khoa học đã phát hiện gen mã hóa cho EPSPS từ chủng

A.tumefaciens CP4 có tính kháng glyphosate mức độ cao Sử dụng các kỹ thuật

công nghệ sinh học trên cơ sở di truyền học, các cây trồng đã được chuyển gen này Các cây chuyển gen đều có chứa cả 2 dạng EPSPS: EPSPS từ chính bản thân cây trồng sẽ chịu sự ức chế bởi glyphosate; EPSPS từ vi khuẩn CP4 biến nạp sẽ có tính kháng lại glyphosate Vì glyphosate không bám kết với EPSPS vi khuẩn nên EPSPS

vi khuẩn trong cây biến nạp tiếp tục sinh tổng hợp các aromatic amino acids, trong khi đó dạng enzyme EPSPS của thực vật sẽ bị bất hoạt bởi sự ức chế của

glyphosate EPSPS từ chủng vi khuẩn A tumefaciens CP4 đã tỏ ra và ứng dụng

thành công trong các cây trồng chống chịu glyphosate

1.4.2 Thuốc diệt cỏ gluphosinate

Glufosinate là thuốc diệt cỏ không chọn lọc, kiểm soát cỏ dại theo phương thức ức chế enzyme sinh tổng hợp glutamin Quá trình tổng hợp glutamine là sự kết hợp giữa glutamate và ammonia để hình thành nên glutamine Ức chế hoạt động của enzyme này là nguyên nhân làm tăng dần hàm lượng ammonia trong các tế bào thực vật cũng như làm cạn kiệt nguồn amino acid và ức chế quang hợp ở cây

L-phosphinothricin là thành phần thuốc diệt cỏ bialaphos, là một dạng

tri-peptide tự nhiên được tạo thành bởi ít nhất hai loài Streptomyces hygroscopicus

giống như sản phẩm ngoại bào Glufosinate là tên của quá trình tổng hợp hóa học của hỗn hợp hai chất triệt quang D, L phosphinothricin Sau khi tách chiết thuốc

diệt cỏ bialaphos từ loài Streptomyces hygroscopicus, các nhà khoa học đã tách chiết được hai gen pat và bar

Dòng B napus L HCN92 chứa gen pat, là loài thực vật chuyển gen đầu tiên kháng lại L-PPT nhận được sự tán thành của chính phủ (CFIA, 1995b) Kể từ sau

đó có nhiều loài thực vật chuyển gen kháng lại L-PPT bao gồm ngô, rau diếp và củ cải đường cũng đã được thương mại hóa

1.4.3 Các gen sử dụng trong tạo giống cây trồng biến đổi gen chống chịu thuốc trừ cỏ

Các loại thuốc trừ cỏ phổ rộng được sử dụng phổ biến hiện nay là glyphosate (ức chế EPSPS synthase), glufosinate ammonium (ức chế glutamine synthetase), nhóm imidazolinone và nhóm sulfonyurea (ức chế acetolactate synthase –ALS) Bên cạnh đó bromoxynil (ức chế quang hợp do đình chỉ sự vận chuyển điện tử trong

hệ thống quang hóa II) là thuốc trừ cỏ chọn lọc cũng được sử dụng rộng rãi nhằm điều khiển cỏ dại hai lá mầm Việc phát triển cây trồng kháng cỏ dại dựa vào 3 cơ chế sau:

- Tạo ra các enzyme không bị ảnh hưởng bởi thuốc trừ cỏ: tạo ra những thay đổi trong enzyme là mục tiêu của thuốc trừ cỏ nhằm mục đích ngăn cản sự tác động của thuốc trừ cỏ vào enzyme đó

- Tăng cường sự biểu hiện enzyme bị hại do thuốc trừ cỏ: Tăng cường sự biểu hiện của các protein (enzyme) mục tiêu bằng cách chuyển gen nhằm tăng số bản sao/ tăng cường sự biểu hiện của gen mục tiêu Số lượng enzyme/protein mục tiêu của thuốc trừ cỏ sẽ nhiều hơn so với lượng mà thuốc trừ cỏ có thể tác động nhờ

đó quá trình sinh tổng hợp các hợp chất của cây vẫn được thực hiện bình thường ngay cả khi có mặt thuốc trừ cỏ

- Tạo ra các enzyme làm mất tính độc của thuốc trừ cỏ: Chuyển gen tổng hợp enzyme có khả năng phá vỡ hoặc thay đổi cấu trúc hóa học của phân tử thuốc trừ cỏ dẫn đến thuốc trừ cỏ bị mất hoạt tính

chọn lọc rất hữu hiệu ở ngô Gen CP4 EPSPS cũng có khả năng kháng lại

glyphosate khi cho nó biểu hiện ở genome của lục lạp tuy nhiên các cây chuyển gen được chọn lọc sử dụng tính kháng kháng sinh [57]

Sử dụng EPSPS tổng hợp trong các cây thực vật chuyển gen được đánh giá

là an toàn Thực vật chuyển gen có khả năng kháng lại glyphosate được sử dụng như một tính trạng nông học hoặc là chỉ thị chọn lọc sẽ được sử dụng cho mục đích

thương mại Gen EPSPS còn được sử dụng rộng rãi hầu hết tạo nên tính kháng glyphosate Trong năm 2001 và 2002, đã có 507 bài báo nói về gen EPSPS được

tìm thấy ở cơ sở dữ liệu thử nghiệm động ruộng

Gen PAT

Gen pat/bar mã hoá cho enzym phosphinothricin acetyl transferase (PAT) Gen pat được phân lập từ Streptomyces viridochromogenes, gen bar được tách từ Streptomyces hygroscopicus PAT xúc tác cho phản ứng acetyl hoá l-725010258

phosphinothricin, là enzym rất đặc hiệu, có ái lực rất thấp đối với các cơ chất so với

glufosinate Gene bar và gene pat đều được sử dụng thành công khi chuyển gen vào

nhiều đối tượng cây trồng với mục đích tạo cây trồng kháng cỏ Các dòng ngô, lúa, lúa mỳ và lúa mạch chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ đã được tạo ra

Hai gene (pat và bar) mã hóa cho enzyme phos-phinothricin N-acetyltransferase

(PAT) được sử dụng để kháng lại L-PPT trong các loài thực vật chuyển gen Gen

bar (kháng lại bialophos) được phân lập từ S hygroscopi-cus và gen pat được phân lập từ S viridochromo Hai gen này có độ tương đồng về mức độ nucleotide là 87%

PAT sử dụng acetyl CoA giống như một cofactor để xúc tác cho con đường acetyl hóa nhóm amino tự do của L-PPT Khi L-PPT bị acetyl hóa nó không thể gắn và làm bất hoạt được con đường tổng hợp glutamine Ức chế tổng hợp glutamine dẫn đến sự tích lũy mức độ cao ammoniac gây ra cái chết ở thực vật [43] Trong các bài

báo nghiên cứu đã công bố, gen bar là gen chỉ thị chọn lọc kháng lại thuốc trừ cỏ

được sử dụng phổ biến nhất (chiếm khoảng 4 – 31%) Tính kháng L-PPT cũng được

sử dụng rộng rãi trong các thử nghiệm đồng ruộng đối với các cây thực vật chuyển gen, chỉ trong năm 2001 và 2002 đã có 327 hồ sơ chứa enzyme PART được liệt kê

trong cơ sở dữ liệu thực nghiệm đồng ruộng US (Table 3; ISB, 2003) Qua hồ sơ trong cơ sở dữ liệu cho thấy có nhiều công ty và các nhà nghiên cứu sử dụng PAT trong các nghiên cứu của họ Các gen sử dụng trong tạo cây ngô chuyển gen mang

đặc tính chống chịu thuốc trừ cỏ bao gồm: gen epsps/cp4 epsps, gox – chống chịu thuốc trừ cỏ glyphosate, gen pat/bar – chống chịu thuốc trừ cỏ Gluphosinate ammonium (DL-phosphinothricin), gen gm-hra – chống chịu thuốc trừ cỏ nhóm

Imidazolinone

1.4.4 Giống cây trồng biến đổi gen kháng thuốc trừ cỏ - Thành tựu và triển vọng

Trong sản xuất nông nghiệp, kiểm soát cỏ dại là một vấn đề quan trọng, nếu không kiểm soát cỏ dại có thể làm giảm sản lượng cây trồng từ 20 – 60% Ngày nay, hàng loạt các biện pháp phòng trừ cỏ dại đã được áp dụng như: sử dụng các thuốc diệt

cỏ chọn lọc hoặc không chọn lọc, phun 1 lần hoặc phun liên tục trước và sau khi trồng Đặc biệt ở những vùng có hiện tượng xói mòn đất, thuốc diệt cỏ được sử dụng như một giải pháp duy nhất để loại trừ cỏ dại

Trong suốt 17 năm giai đoạn từ 1991-2013, đặc tính kháng cỏ là tính trạng nổi bật Giống ngô kháng thuốc diệt cỏ glyphosate đầu tiên được thương mại hóa vào năm 1996 bởi công ty Monsanto và được gọi lá “Roundup Ready Corn” Năm

2011 ngô biến đổi gen kháng thuốc trừ cỏ đã được trồng ở 14 quốc gia Đến năm

2013, 26 giống ngô kháng thuốc trừ cỏ đã được ủy quyền nhập khẩu vào liên minh Châu Âu

Vào năm 1997, cây đậu tương kháng thuốc diệt cỏ glufosinate và gen tăng hàm lượng axit oleic lần đầu tiên được thương mại hóa Trong số diện tích đậu tương chuyển gen thì 75% được trồng ở Bắc Mỹ Riêng ở Mỹ, diện tích đậu tương kháng thuốc diệt cỏ chiếm 85% diện tích trồng cây đậu tương Còn ở châu Á, đậu tương kháng thuốc diệt cỏ chiếm 6% tổng sản phẩm cây trồng biến đổi gen Trong năm 2007 đậu tương chuyển gen là cây trồng chủ đạo, chiếm diện tích 58,6 triệu

ha (chiếm 51% diện tích đất trồng cây chuyển gen), tiếp theo là diện tích trồng ngô (35,2 triệu ha, chiếm 31%), bông (15 triệu ha, chiếm 13%) và cải canola (5,5 triệu ha, chiếm 5% diện tích đất trồng cây chuyển gen trên toàn cầu) [30] Trong

số các cây trồng chuyển gen được đưa vào thương mại hóa từ năm 1996 đến năm

2007, chống chịu chất diệt cỏ vẫn là tính trạng được chú ý phát triển Năm 2007, cây chuyển gen kháng chất diệt cỏ được triển khai trên cây đậu tương, ngô, cải dầu, cỏ linh lăng với diện tích trồng là 72,7 triệu ha (chiếm 63% diện tích đất trồng cây chuyển gen toàn cầu [36] Năm 2013, diện tích cây trồng kháng cỏ bao gồm đậu tương, ngô, bông, mía đường, cỏ linh lăng, cải dầu chiếm 99,4 triệu ha (57% của 175,3 triệu ha) cây trồng công nghệ sinh học trên toàn cầu [37]

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1 Vật liệu

- Các dòng ngô VH1, CH9, CM8 thuộc tập đoàn các dòng/giống ngô của Viện Di truyền Nông nghiệp, được trồng trong nhà lưới chống côn trùng, cung cấp nguồn vật liệu phôi hợp tử chưa trưởng thành (phôi non) cho các thí nghiệm chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ

Hình 2.1 Các dòng ngô trồng làm vật liệu chuyển gen trong nhà lưới cách ly côn trùng

- Chủng Agrobacterium tumefaciens C58 mang vector pBI121 chứa gen EPSPS chống chịu thuốc trừ cỏ (được phân lập từ vi khuẩn Agrobacterium chủng CP4), được điều khiển bởi đoạn khởi động CaMV35S và gen chỉ thị chọn lọc thực vật nptII kháng kháng sinh kanamycin do Viện Công nghệ Sinh học cung cấp

Hình 2.2 Cấu trúc vector chuyển gen mang gen EPSPS

2.1.2 Hoá chất và thiết bị máy móc

Các vật tư hóa chất, máy li tâm các loại, thiết bị điện di ADN, tủ nuôi ổn nhiệt, máy nhân gen và các trang thiết bị khác của phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp

2.1.3 Địa điểm thực hiện

Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp và Trạm thực nghiệm Văn Giang, Hưng Yên

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens

Các thí nghiệm biến nạp gen kháng thuốc trừ cỏ EPSPS vào phôi hợp tử chưa trưởng thành thông qua vi khuẩn A tumefaciens được tiến hành theo quy trình

của Phạm Thị Lý Thu (2007) [9] và Zhao và cộng sự, 2001 [61] có cải tiến gồm các bước như mô tả dưới đây:

Tạo dịch huyền phù vi khuẩn

Cấy trải Agrobacterium cất giữ trong glycerol ở -80oC lên đĩa môi trường môi trường YEB đặc có bổ sung 50 mg/l kanamycin, nuôi ở 280C trong 2-3 ngày Trước khi biến nạp, hòa tan vi khuẩn trong môi trường lây nhiễm tới OD550 0,3-0,4; nuôi lắc 100 v/p trong thời gian 3 – 4 h, bổ sung 200 mg/l AS Dịch huyền phù

vi khuẩn này được sử dụng để lây nhiễm với phôi

Khử trùng bắp

Bắp non được thu từ các cây ngô mẹ trồng trong nhà lưới chống côn trùng Bóc bỏ các lớp bao bi bên ngoài sau đó khử trùng bắp trong dung dịch nước javen (NaClO) 30% với một vài giọt Tween-20 trong 20 phút sau đó rửa lại

5 lần bằng nước cất khử trùng và để bắp dựng đứng trên đĩa Petri cỡ 10cm đã

khử trùng (Hình 2.3)

Lây nhiễm vi khuẩn với phôi ngô non

Ngay sau khi khử trùng bắp, phôi non được tách trong điều kiện vô trùng Phôi non sau đó được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn khoảng 30 - 60 phút

Hình 2.3 Tách phôi từ bắp ngô dòng CM8 (Vụ Hè Thu, 8 ngày sau thụ phấn)

Giai đoạn đồng nuôi cấy

Phôi sau khi lây nhiễm với vi khuẩn được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy (CCM), nuôi trong điều kiện tối, ở nhiệt độ 20oC, thời gian 3 ngày

Nuôi phục hồi

Sau giai đoạn đồng nuôi cấy, chuyển phôi đã biến nạp từ môi trường CCM sang môi trường phục hồi (ReM) có chứa kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime (250 mg/l), nuôi trong điều kiện tối, ở nhiệt độ 28oC, thời gian 7 ngày

Chọn lọc mô sẹo chuyển gen

Mô sẹo tạo thành từ phôi non đã biến nạp trên môi trường ReM được cấy chuyển sang môi trường chọn lọc (EcM) (có bổ sung 100 mg/l Kanamycin), nuôi trong tối ở 28oC, thời gian 15 ngày

Tạo chồi chuyển gen

Mô sẹo phôi hoá tạo thành trên môi trường chọn lọc EcM được cấy chuyển sang môi trường tái sinh chồi (SeM) để tái sinh chồi, nuôi ở điều kiện chiếu sáng ở

28oC, thời gian 15 - 20 ngày

Tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh

Chồi tái sinh trong môi trường chọn lọc SeM khi đạt được chiều cao 2 – 3cm được cấy chuyển sang môi trường tạo cây hoàn chỉnh RM, nuôi trong điều kiện chiếu sáng với chu kỳ chiếu sáng 16:8 h sáng: tối, ở nhiệt độ 25oC, thời gian 10-20 ngày

Đưa cây ra đất

Cây tái sinh hoàn chỉnh sẽ được chuyển ra trồng trong túi bầu có chứa giá thể TN.1 (Viện Thổ Nhưỡng Nông Hóa); sau khi cây xuất hiện lá mới thì chuyển sang trồng trên luống đất trong nhà lưới cách ly côn trùng

Bảng 2.1 Công thức môi trường Môi trường Thành phần

YEB 10g/l peptone + 10 g/l yeast extract + 5g/l NaCl+ 12g/l agar; pH 7.0

IM - AS N6 (Chu & CS., 1975) + 2 mg/l glycine + 68,5 g/l sucrose + 36 g/l

glucose + 0,7 g/l L-proline + 1,5 mg/l 2,4D; pH 5,2; 200 mg/l AS CCM N6 (Chu & CS., 1975) + 2 mg/l glycine + 30 g/l sucrose + 0,7 g/l L-

proline + 1,5 mg/l 2,4D; 6 g/l gellan-gum; pH 5,8; 200 mg/l AS; 0,85 mg/l AgNO3

ReM N6 (Chu & CS., 1975) + 2 mg/l glycine + 30 g/l sucrose + 0,7 g/l

L-proline + 0,5 g/l MES + 1,5 mg/l 2,4D; 6 g/l gellan-gum; pH 5,8; 0,85 mg/l AgNO3; 250 mg/l cefotaxim

EcM N6 (Chu & CS., 1975) + 2 mg/l glycine + 30 g/l sucrose + 0,7 g/l

L-proline + 0,5 g/l MES+ 1,5 mg/l 2,4D; 6 g/l gellan-gum; pH 5,8; 10 mg/l AgNO3; 250 mg/l cefotaxim; 100 mg/l kanamycine

SeM N6 (Chu & CS., 1975) + 2 mg/l glycine + 30 g/l sucrose + 0,7 g/l

L-proline + 0,5 g/l MES; 6 g/l gellan-gum; pH 5,8; 1 mg/l BAP; 0,85 mg/l AgNO3; 250 mg/l cefotaxim; 100 mg/l kanamycine

RM MS (Murashige & Skoog, 1962) + 60 g/l sucrose + 100 mg/l

myo-inositol; 9 g/l agar; pH 5,8

2.2.2 Chọn lọc nồng độ glyphosate để chọn lọc cây ngô chuyển gen trong điều kiện nhà lưới

Các dòng ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ được xác định hoạt tính của

gen chuyển EPSPS bằng cách đánh giá tác động của thuốc trừ cỏ glyphosate lên

lá của các cây chuyển gen và các cây không được chuyển gen Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng thuốc trừ cỏ Vifosate (Sygenta) có chứa glyphosate ở các

nồng độ khác nhau bôi lên lá của các cây chuyển gen và các cây đối chứng khi cây ở giai đoạn 5 lá Dùng bút lông thấm các dung dịch glyphosate được pha theo nồng độ 200 mg/l; 400 mg/l; 600 mg/l và 1200 mg/l với 0,1 % Tween X -

100 để bôi lên mặt trên của lá Quan sát và đánh giá phản ứng của mô tế bào lá tại vùng bôi thuốc trừ cỏ sau 10 ngày

2.2.3 Thử khả năng kháng thuốc trừ cỏ của các cây chuyển gen trong điều kiện nhà lưới

Các dòng ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ sau khi tái sinh đã được chuyển ra đất trồng Khi cây ở giai đoạn có 5 – 6 lá, tiến hành thử khả năng kháng thuốc trừ cỏ bằng cách phun dung dịch Vifosate có chứa glyphosate 200 mg/l và 0,1% Tween 20

(v/v) đối với các cây chuyển gen EPSPS Phun đều lên lá của các cây đã được chuyển

gen và cây không được chuyển gen (đối chứng), 2 ngày phun 1 lần, phun 3 lần

Quan sát và theo dõi mức độ kháng thuốc trừ cỏ của các cây chuyển gen và đối chứng (cây bình thường không được chuyển gen) sau 10 ngày phun

2.2.4 Thí nghiệm nảy mầm của hạt ngô thế hệ T0

Hạt được khử trùng bề mặt bằng ethanol 70% trong thời gian 2 phút (20 hạt/ 100ml ethanol), sau đó cho hạt vào bình chứa 0,1% HgCl2, lắc đều 15 phút Rửa lại bằng nước cất khử trùng 6 lần Sau đó cho hạt nảy mầm trên môi trường MS có bổ sung 200 mg/l glyphosate

2.2.5 Phương pháp phân tích sinh học phân tử cây chuyển gen

2.2.5.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ lá ngô

Tiến hành thu mẫu lá khi cây ngô được 4 lá để tách chiết ADN tổng số ADN được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB của Saghai Maroof (1984) có cải tiến

Dung dịch đệm chiết CTAB có thành phần như sau:

Dung dịch mẹ Lượng cần lấy cho 100 ml Nồng độ cuối cùng (100 ml)

- Thêm thể tích tương đương 24 : 1 (Chloroform/isoamylalcohol) Votex trong 10 phút Ly tâm 15 phút ở 12.000 – 13.000 v/p thu lớp dịch lỏng phía trên

- Thêm thể tích tương đương isopropanol và ủ qua đêm ở -20oC để thu được lượng kết tủa lớn nhất

- Ly tâm thu tủa và rửa sạch bằng cồn 75o ít nhất 2 lần

- Thổi khô ADN đã rửa sạch và hòa tan bằng TE

- Bổ sung 20 mg/l ARNase Ủ ở bể ổn nhiệt 370C trong 1- 2h

2.2.5.2 Phân tích PCR các cây ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ

Các cây chuyển gen được sàng lọc bằng phản ứng PCR để kiểm tra sự có mặt

của gen EPSPS trong hệ gen thực vật Chúng tôi tiến hành các phản ứng PCR ở thể

tích phản ứng 20 l, sử dụng Taq DNA polymerase (Thermo) với 35 chu kỳ Thành phần, nồng độ các chất tham gia phản ứng PCR theo bảng 2.3

Để nhân gen EPSPS chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen có trình tự

được trình bày trong bảng 2.3; chương trình phản ứng với cặp mồi CP4-EPSPS là

95oC – 3 phút, 95oC – 1 phút, 57,5oC – 30 giây, 72oC – 1phút Từ bước 2 đến bước

4 lặp lại trong 35 chu kỳ, 72oC – 10 phút, kết thúc 4oC Sản phẩm PCR được điện di