Sự hiện diện của các vi khuẩn kị khí ở các bệnh nhân bị chảy máu dạ dày ở việt nam

Một số đặc điểm của các vi khuẩn phân lập ở điều kiện kị khí từ Microbiota dạ dày của người bệnh bị viêm dạ dày cấp tính chảy máu ………..... Xuất phát từ nhu cầu hiểu biết và phục vụ công

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU - 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU - 3

1 HỆ VI SINH VẬT MICROBIOTA CỦA NGƯỜI - 4

1.1.1 Các Microbiota bản địa - 5

1.1.2 Các Microbiota bệnh - 6

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MICROBIOTA - 7

1.2.1 Phương pháp cổ điển - 7

1.2.2 Phương pháp sinh học phân tử - 7

1.2.3 Kết hợp phương pháp nuôi cấy cổ điển và phương pháp hiện đại - 9

1.3 MICROBIOTA DẠ DÀY NGƯỜI - 9

1.3.1 Microbiota bản địa dạ dày người khỏe mạnh - 10

1.3.2 Microbiota dạ dày của người bệnh - 11

1.4 HỘI CHỨNG CHẢY MÁU DẠ DÀY - 12

1.4.1 Các dấu hiệu nhận biết chảy máu dạ dày - 12

1.4.2 Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ gây chảy máu dạ dày - 13

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 15

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU - 16

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU - 16

2.2.2 Hóa chất, thiết bị máy móc - 16

2.2.3 Địa điểm thực hiện nghiên cứu - 17

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 18

2.3.1 Khám lâm sàng - 19

2.3.2 Nội soi và lấy bệnh phẩm - 19

2.3.3 Đo pH dịch vị dạ dày - 19

2.3.4 Nuôi cấy và phân lập chủng vi khuẩn - 20

2.3.5 Nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi thường - 21

2.3.6 Test Helicotest - 21

2.3.7 Tách chiết ADN từ vi khuẩn và từ sinh thiết - 21

2.3.8 Xác định HPstatus của các bệnh nhân - 21

2.3.9 PCR nhân gen 23S rARN của H pylori - 22

2.3.10 PCR nhân gen 16S rARN của vi khuẩn - 23

2.3.11 Giải trình tự - 23

2.3.12 Định tên vi khuẩn - 24

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN - 25

3.1 ĐẶC ĐIỂM CÁC BỆNH NHÂN - 26

3.1.1 Đặc điểm tuổi, giới, độ pH dạ dày - 26

3.1.2 Hình ảnh nội soi dạ dày của các bệnh nhân - 27

3.2 XÁC ĐỊNH HP STATUS CỦA CÁC BỆNH NHÂN - 28

3.3 PHÂN LẬP CÁC VI KHUẨN Ở ĐIỀU KIỆN KỊ KHÍ - 31

3.4 NGHIÊN CỨU CÁC VI KHUẨN - 35

3.4.1 Xác định Gram của các chủng phân lập - 35

3.4.2 Định tên vi khuẩn - 35

KẾT LUẬN - 44

KIẾN NGHỊ - 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO - 46

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nhóm tuổi và giới tính ……… 26

Bảng 2 Kết quả phân tích 4 gen chỉ thị của vi khuẩn H pylori của 27 bệnh

nhân ……… 30

Bảng 3 Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm vi khuẩn ……… 31 Bảng 4 Tên các loài vi khuẩn phân lập từ bệnh phẩm ……… 39 Bảng 5 Một số đặc điểm của các vi khuẩn phân lập ở điều kiện kị khí từ Microbiota dạ

dày của người bệnh bị viêm dạ dày cấp tính chảy máu ……… 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Sự khác biệt giữa các Microbiota của người trẻ và người già ……… 5

Hình 2 Cấu trúc bậc hai của 16S rARN ……… 8

Hình 3 Microbiota đường tiêu hóa của người ……… 10

Hình 4 Hình ảnh nội soi niêm mạc dạ dày xuất huyết ……… 13

Hình 5 Đĩa môi trường thạch máu dùng để nuôi cấy vi khuẩn ……… 17

Hình 6 Hộp giấy đo pH 0~14 (EMD-Mỹ) ……… 19

Hình 7 Hệ thống bình nuôi cấy kị khí ……… 20

Hình 8 Xác định độ pH dịch dạ dày của 27 bệnh nhân bị chảy máu dạ dày ……… 27

Hình 9 Ảnh chụp dạ dày xuất huyết của 27 bệnh nhân ……… 28

Hình 10 Hình ảnh các khuẩn lạc vi khuẩn trên đĩa thạch máu của một số bệnh nhân………31

Hình 11 Hình ảnh các khuẩn lạc được nhận định ban đầu giống với H pylori … 32

Hình 12 H pylori sau khi nhuộm Gram dưới kính hiển vi quang học ………33

Hình 13 Kết quả thử hoạt tính Urease bằng Helicotest ……… 33

Hình 14 Sản phẩm PCR khuếch đại gen 23S rARN xác định H pylori ……… 33

Hình 15 Các chủng H pylori phân lập ở điều kiện kị khí ……… 34

Hình 16 Một số chủng vi khuẩn được phân lập và làm sạch ở điều kiện kị khí ….….34 Hình 17 Ảnh chụp một số chủng vi khuẩn dưới kính hiển vi Olympia ……… 35

Hình 18 Sản phẩm PCR khuếch đại từ gen 16S rARN ………36

MỞ ĐẦU

Biến đổi khí hậu Toàn cầu đi kèm với suy thoái tài nguyên, ô nhiễm môi trường làm thay đổi toàn diện, sâu sắc các hệ sinh thái tự nhiên, dẫn đến sự thay đổi nhiều bệnh đã biết cũng như sự xuất hiện của nhiều bệnh mới Đây là những thách thức lớn nhất của nhân loại trong thế kỷ 21

Viêm dạ dày cấp tính chảy máu là một Hội chứng hay gặp ở người trưởng thành

- lứa tuổi phải chịu nhiều áp lực từ công việc lao động, xã hội và gia đình cũng như dễ nhiễm những thói quen sinh hoạt có hại cho sức khỏe như hút thuốc lá, nhậu nhẹt và rượu chè Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, cả những người 20 tuổi cũng bị chảy máu dạ dày Nguyên nhân sự dịch chuyển về tuổi tác của Hội chứng chưa được xác định

Viêm dạ dày cấp tính chảy máu là đợt tiến triển cấp tính của viêm dạ dày mạn tính, có thể biểu hiện bất ngờ và gây ảnh hưởng nặng nề đến khả năng lao động cũng như chất lượng cuộc sống của người bệnh Hội chứng có tỷ lệ tái phát cao sau khi điều trị Nguyên nhân chính gây viêm dạ dày cấp tính chảy máu vẫn đang còn là vấn đề tranh cãi [6], [30]

Mối liên quan giữa các bệnh lý viêm loét dạ dày và biến chứng chảy máu dạ dày

với vi khuẩn Helicobacter pylori đã được thừa nhận Các bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp

tính chảy máu được điều trị khỏi nhờ liệu pháp kháng sinh Tuy nhiên thực tế y học lâm sàng đã xác nhận, có nhiều trường hợp bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp tính chảy

máu không nhiễm H pylori, nhưng khi phác đồ điều trị có kháng sinh thì mang lại kết quả tốt Vấn đề đặt ra là, ngoài H pylori trong dạ dày người còn có thể có các loài vi

khuẩn nào khác liên quan mà khoa học chưa biết?

Hiện tại, trên thế giới cũng như ở Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu về viêm dạ dày cấp tính chảy máu và vì thế có ít thông tin về thành phần

Microbiota dạ dày của người bệnh Sự hạn chế này có thể ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả điều trị – theo dõi diễn biến bệnh cho bệnh nhân Xuất phát từ nhu cầu hiểu biết và phục vụ công tác chẩn trị các bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp tính chảy máu, chúng tôi

tiến hành đề tài nghiên cứu “Sự hiện diện của các vi khuẩn kị khí ở các bệnh nhân

bị chảy máu dạ dày ở Việt Nam", với mục tiêu là góp phần tìm hiểu thêm về các vi

khuẩn có mặt Microbiota dạ dày của nhóm bệnh nhân này

Nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm:

1 Phân lập các loại vi khuẩn từ bệnh phẩm dạ dày chảy máu ở điều kiện kị khí

2 Xác định tỷ lệ nhiễm H pylori của các bệnh nhân

3 Định tên các vi khuẩn bằng phương pháp giám định gen 16S rARN

4 Tham khảo các đặc tính của các vi khuẩn được phân lập qua các dữ liệu trên Internet

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 HỆ VI SINH VẬT MICROBIOTA CỦA NGƯỜI

Microbiota được định nghĩa là quần thể vi sinh vật sống trong cùng một ổ sinh thái hoặc ở một giai đoạn địa lý riêng biệt Trong cơ thể người, các Microbiota gồm khoảng 1000 loài khác nhau Số lượng vi khuẩn trong các ổ sinh thái cộng lại khoảng

1014 tế bào vi khuẩn, có khối lượng khoảng 2 kg, nhiều gấp 10 lần số tế bào cơ thể người

Microbiota được hình thành trong quá trình phát triển của con người, đạt cao điểm ở tuổi trưởng thành và thoái hóa ở tuổi già Như đã biết, sự ra đời của trẻ sơ sinh gắn liền với sự hình thành nhanh chóng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa với số lượng lên tới 1011 vi khuẩn trên một gram phân: chỉ 24 tiếng sau khi sinh, các loài vi khuẩn

như Enterobacteriaceae, Enterococcus, Lactobacillus, vi khuẩn gây thối Clostridium

và Staphylococcus đã xuất hiện trong phân của trẻ Hình 1 giới thiệu sự khác biệt của

các Microbiota ở người trẻ và người già trên 100 tuổi [24]

Thành phần các vi sinh vật trong các Microbiota có thể thay đổi dẫn đến bệnh tật [24] Chẳng hạn, các bệnh nhân bị tiểu đường tuýp 2 có Microbiota đường ruột bị thoái hóa Các vi khuẩn sản xuất butyrate, đóng vai trò quan trọng trong cung cấp năng lượng cho các tế bào biểu mô và điều khiển các đáp ứng của tế bào chủ giảm đáng kể, trong khi đó các vi khuẩn gây bệnh mang chức năng khử sulphate và kháng với stress oxy hóa lại tăng [54]

Còn rất nhiều điều chưa biết về thành phần các Microbiota của người, do khoảng 99% các loài vi khuẩn không thể nuôi cấy được trong các phòng thí nghiệm [12] Hiện nay, các nhà khoa học đang áp dụng Metagenomic kết hợp với Genomic, Tin sinh học để tiếp cận thế giới vi sinh vật Metagenomics cho phép xác định các loài

vi sinh vật có trong quần thể vi sinh vật Microbiota phức tạp không cần nuôi cấy chúng Phân tích Metagenomic cho thấy, mặc dù các Microbiota có thể khác nhau về thành phần do các chế độ ăn uống, nhưng mỗi người đều mang một số vi khuẩn đặc trưng và không thay đổi theo thời gian, bao gồm 400 loại ở người khỏe mạnh [36]

Hình 1 Sự khác biệt giữa các Microbiota của người trẻ và người già [24]

Các Microbiota được chia thành hai loại dựa theo tiêu chí, liệu chúng có gây hại hay không đối với con người:

- Các Microbiota bản địa, bao gồm các vi sinh vật cộng sinh cư trú thường xuyên ở mắt và da, đường hô hấp trên, đường tiêu hóa trên và dưới, đường tiết niệu và sinh sản của phụ nữ và nam giới, dịch cơ thể và máu

- Các Microbiota bệnh, bao gồm các vi sinh vật cơ hội gây hại cho người

Các loài vi khuẩn sống trong các Microbiota có thể là loài cư trú thường xuyên, loài vãng lai và loài đi ngang qua ổ sinh thái Trong một số điều kiện đặc biệt, các vi sinh vật cơ hội có thể xuất hiện

1.1.1 Các Microbiota bản địa

Microbiota của người khỏe mạnh hay còn được gọi là bản địa bao gồm các vi

Một số vi khuẩn tạo butyrate và loại gây bệnh

Một số vi khuẩn tạo butyrate và loại gây bệnh

sinh vật không gây bệnh, chủ yếu là vi khuẩn và một vài loại nấm, prostist sống ở khoang miệng, thực quản, đường tiêu hóa, mũi, họng, da và vùng gần quanh mắt Các loài vi sinh vật này giúp đỡ bảo vệ cơ thể người chống lại các loài vi sinh vật gây bệnh do:

i ganh đua gắn với các tế bào biểu bì hoặc tế bào niêm mạc của người

ii tranh giành vị trí sinh thái

iii tranh giành thức ăn để sống

iv, tiết ra các chất giết các loài gây bệnh

Các vi sinh vật trong quần thể Microbiota bản địa gồm (i) các loài vi sinh vật

cư trú thường xuyên không gây hại và có mối quan hệ tương hỗ với người; (ii) các vi sinh vật vãng lai bao gồm các vi sinh vật chỉ tồn tại một thời gian ngắn từ một vài ngày đến vài tuần trong cơ thể người do không thể cạnh tranh với các vi sinh vật cư trú thường xuyên, bị hệ miễn dịch của chủ tấn công và các điều kiện ở mới thích hợp cho sự phát triển của chúng; (iii) các vi sinh vật đi ngang qua một Microbiota đến một Microbiota khác

1.1.2 Các Microbiota bệnh

Trong điều kiện bình thường, các vi sinh vật cư trú thường xuyên, các vi sinh vật vãng lai cũng như các vi sinh vật đi ngang qua Microbiota bản địa không gây tác hại cho con người Tuy nhiên khi Microbiota bản địa thay đổi do nhiều lý do như bị tổn thương trong các trường hợp viêm nhiễm và các bệnh tự miễn (bệnh Crohn, bệnh loét ruột kết, bệnh viêm khớp, bệnh tiểu đường loại 1, bệnh đa khớp, bệnh béo phì ), một vài trong số các vi sinh vật cư trú thường xuyên, các vi sinh vật vãng lai và ngay đến các vi sinh vật đi ngang qua Microbiota có thể trở thành vi sinh vật cơ hội gây bệnh

Theo y học hiện đại, các nguyên nhân dẫn đến sự hình thành Microbiota bệnh mang các vi sinh vật cơ hội gây bệnh gồm ba khả năng:

1 Hệ miễn dịch của con người làm việc sai lệch, các quần thể bản địa có thể phát triển

vượt và chuyển đến các vùng khác của cơ thể Ví dụ Escherichia coli thường sống

trong ruột non, một khi đi vào bàng quang sẽ gây các bệnh đường tiết niệu

2 Sự mất cân bằng của các vi sinh vật bản địa xảy ra khi các bệnh nhân dùng kháng sinh phổ rộng

3 Các vi sinh vật bản địa di dời vào vùng trước kia chúng không ở như trường trong các vết thương phẫu thuật

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MICROBIOTA

1.2.1 Phương pháp cổ điển

Để nghiên cứu một hệ vi sinh vật, phương pháp tiếp cận đầu tiên thường được

sử dụng là nuôi cấy và phân lập các vi sinh vật, sau đó dựa trên các đặc điểm kiểu hình cũng như đặc điểm hình thái, các đặc tính sinh lý, sinh hóa… mà định tên và sắp xếp chúng vào các nhóm [38]

Trong y học, nuôi cấy thành công được coi là tiêu chuẩn vàng để xác định sự

có mặt của một loài vi khuẩn nào đó trong bệnh phẩm Mặt khác, qua nuôi cấy có thể thu được các chủng vi khuẩn dùng cho các nghiên cứu hệ gen vi khuẩn, xác định tính kháng thuốc của vi khuẩn

1.2.2 Phương pháp sinh học phân tử

Vào những năm 1960, các nhà khoa học chú ý đến gen 16S rARN vì chúng bảo tồn cao ở các loài vi khuẩn và cổ khuẩn [20] Các nghiên cứu cho thấy, đột biến của gen 16S rARN xảy ra với tần số thấp [57] Ngoài ra, các nhà khoa học còn phát hiện trên gen 16S rARN có một vùng riêng đặc thù cho vi khuẩn và một vùng chung đặc trưng cho tất cả các sinh vật sống Gen 16SrARN còn chứa 9 vùng siêu biến, ký hiệu

V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8 và V9 cung cấp các tín hiệu để định danh vi khuẩn Vùng siêu biến VI có nghĩa trong phân loại

Dựa trên tính chất này, người ta thiết kế một vài cặp mồi để khuếch đại gen 16S rARN từ bất cứ loài vi khuẩn nào [19] Sản phẩm PCR là một đoạn ADN có phân tử lượng khoảng 1,5 kb Phân tích, so sánh trình tự của gen 16S rARN của một chủng vi

khuẩn các gen đã biết trên Genbank cung cấp là cơ sở để xác định tên của chủng cũng như xác định quan hệ phát sinh chủng loại của các taxon bậc trên loài [39]

Hình 2 Cấu trúc bậc hai của 16S rARN

Giám định gen 16S rARN nhằm định tên vi khuẩn là một phương pháp tốt và

hữu ích, nhưng vẫn có những nhược điểm nhất định Đôi khi, các loài vi khuẩn khác

nhau có cùng một trình tự gen 16S rARN Do vậy, khi quyết định tên vi khuẩn cần cân

nhắc cẩn thận các kết quả nhận được sau khi giải trình tự gen Trong các trường hợp

chưa rõ ràng, để định tên chủng vi sinh vật có trình tự gen 16S rARN tương tự 100%

với gen tương ứng của các loài khác, các nghiên cứu thêm bao gồm các đặc điểm hình

thái, các đặc điểm sinh lý sinh hóa, giải trình tự toàn bộ một phần hoặc toàn bộ genome của vi khuẩn cần được tiến hành bổ sung nếu thấy cần thiết

Theo các nhà khoa học: hơn 99% các loài vi khuẩn trong môi trường tự nhiên chưa được định tên do không thể nuôi cấy được bằng các phương pháp cổ điển trong phòng thí nghiệm [12] Hiện nay, kỹ thuật Metagenomic kết hợp Genomic, Tin sinh học đang được sử dụng để tiếp cận thế giới vi sinh vật Đây là kỹ thuật mới và mạnh nhất cho phép giải mã thông tin di truyền các quần thể vi sinh vật phức tạp không cần thông qua nuôi cấy và phân lập từng sinh vật đơn lẻ

1.2.3 Kết hợp phương pháp nuôi cấy cổ điển và phương pháp hiện đại

Định tên vi sinh vật bằng phương pháp sinh học phân tử có nhiều ưu điểm nhưng vẫn có những nhược điểm nhất định do khó phân biệt các ADN có nguồn gốc từ các vi sinh vật sống hay chết Các nhà khoa học đánh giá cao việc phối hợp sử dụng cả hai phương pháp truyền thống (nuôi cấy) lẫn hiện đại (Metagenomic) để định tên các vi sinh vật, qua đó nghiên cứu thành phần của Microbiota [19]

Tác giả Clarridge J (2004) lưu ý một số điểm sau khi định tên vi sinh vật [19]:

- Khi đối tượng định tên là các vi sinh vật mới tìm thấy, cần thiết giải toàn bộ trình

tự gen 16S rRNA của vi khuẩn và trình tự không chứa hơn 1% các base không xác

1.3 MICROBIOTA DẠ DÀY NGƯỜI

Hệ tiêu hóa của người bao gồm nhiều ngăn với các hệ vi sinh vật Microbiota khác nhau Số lượng và chủng loại các vi sinh vật trong Microbiota hệ tiêu hóa tăng dần khi đi xuống phần dưới, với số lượng nhiều nhất ở manh tràng, trực tràng và ít nhất

ở dạ dày-nơi có độ pH khoảng 1-2 do dịch dạ dày tiết ra [47], [48] (Hình 3)

Hình 3 Microbiota đường tiêu hóa của người [47]

Microbiota dạ dày đóng vai trò quan trọng đối với đời sống con người như hỗ trợ tiêu hóa, khử độc, đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh… Tuy nhiên, sự thành phần của Microbiota bản địa dạ dày có thể bị biến đổi do nhiều nguyên nhân như ngoại cảnh, điều kiện môi trường, tuổi tác, chế độ ăn uống, các yếu tố miễn dịch, việc sử dụng kháng sinh, thuốc điều trị [33]

1.3.1 Microbiota bản địa dạ dày người khỏe mạnh

Môi trường dạ dày được coi là quá khắc nghiệt đối với các loài vi sinh vật do dịch vị dạ dày (pH 1-2) quá axit, các loài vi sinh vật trôi rửa từ phía trên thực quản và khoang miệng cũng như từ phía dưới ở tá tràng không thể xâm nhập và tồn tại trong dạ

dày Trước kia dạ dày được coi là vô khuẩn, nhưng năm 1984, Helicobacter pylori

được chứng minh là loại vi khuẩn cư trú thường xuyên trong Microbiota bản địa dạ dày

[45] Ngoài ra, Microbiota bản địa dạ dày còn chứa các vi sinh vật khác như Veillonella

sp., Lactobacillus sp., và Clostridium sp [68], [13]

Bằng phương pháp giám định gen 16S rARN, một tập hợp các loài vi khuẩn

phong phú đa dạng hơn được tìm thấy trong dạ dày Các chi vi khuẩn khác không phải

là Helicobacter pylori bao gồm các chi Lactobacillus, Streptococcus, Prevotella,

Veillonella, Stomatococcus [50] và Rothia [14], [43] Lactobacilli và streptococci là hai

trong những loài được nuôi cấy từ dạ dày và cả hai chi này đều bao gồm các loài chịu

được pH thấp [55], [56], [43]

Tóm lại, ở người trưởng thành có chế độ tiết dịch axit bình thường, ngoài H pylori còn có vô số các loại vi khuẩn khác sống trong Microbiota bản địa dạ dày [64],

trong đó chủ yếu là các vi khuẩn sinh axit lactic chịu axit

1.3.2 Microbiota dạ dày của người bệnh

Lớp chất nhày (mucus) trong dạ dày là hàng rào bảo vệ ngăn chặn vi khuẩn làm tổ ở lớp biểu mô cũng như ngăn chặn sự khuếch tán của các hóa chất độc và axit

dạ dày đến bề mặt biểu mô Do đó, một khi vi khuẩn xâm nhập vào lớp chất nhày hoặc lớp chất nhày bị phân hủy thì viêm nhiễm của đường tiêu hóa xẩy ra [60] Tính di động

và khả năng xâm nhập vào lớp chất nhày phụ thuộc rất cao vào sự vận động và hình dạng của vi khuẩn [61] và khả năng phân hủy chất nhày của chúng [22]

Nhiễm H pylori thời gian dài dẫn đến thay đổi cấu trúc niêm mạc dạ dày, làm

giảm tiết axit, tạo ra môi trường kiềm , dẫn đến sự xâm nhập và phát triển vượt trội của các vi sinh vật khác trong dạ dày Khi pH dạ dày trở nên kiềm, độ nhớt của lớp chất nhầy giảm, dễ dàng để các vi sinh vật thâm nhập [32]

Theo Giáo sư Zboril (2002), Microbiota dạ dày bản địa của người bình thường khỏe mạnh không chứa vi khuẩn kị khí [67] Từ dạ dày của các bệnh nhân

nhiễm H pylori lâu ngày và bị viêm, loét, ung thư dạ dày, các loại vi sinh vật như nấm,

vi khuẩn đã được phân lập [51], [14], [23] Năm 1990-1991, vi khuẩn Gastrospirillum hominibee được phát hiện trong dạ dày người bệnh viêm dạ dày mạn tính [44], [65]

Ở Việt Nam, năm 2004, GS Giao và cộng sự đã công bố một số vi khuẩn phân lập ở

điều kiện kỵ khí từ sinh thiết dạ dày của người bệnh Việt Nam [5] Nấm Candida

krusei, trước kia được cho là chỉ có ở các bệnh nhân bị HIV/AIDS đã được tìm thấy trong thượng và hạ vị của các bệnh nhân bị chảy máu dạ dày [29] Nấm Candida parapsilosis

cũng đã được tìm thấy trong Microbiota dạ dày của các bệnh nhân bị viêm dạ dày mãn tính [10]

1.4 HỘI CHỨNG CHẢY MÁU DẠ DÀY

Viêm dạ dày cấp tính chảy máu là hậu quả của các tổn thương viêm loét dạ dày cấp hoặc mãn tính không được điều trị triệt để Y học hiện đại cho rằng, viêm dạ dày cấp tính chảy máu không phải là một bệnh mà là một hội chứng Chảy máu ở đây thường khởi phát đột ngột, ồ ạt, diễn biến nhanh, có thể nguy hiểm đe dọa tính mạng người bệnh, do đó đòi hòi phải theo dõi kỹ càng để xử trí kịp thời [16]

1.4.1 Các dấu hiệu nhận biết chảy máu dạ dày [9], [16], [30]

* Triệu chứng lâm sàng

a, Xuất huyết tiêu hóa: Khi chảy máu dạ dày xảy ra, bệnh nhân có thể nôn ra máu đỏ hoặc màu cà phê, đi ngoài phân đen

b, Rối loạn tiêu hóa, chán ăn, buồn nôn, nôn

c, Đau vùng thượng vị: Tùy trường hợp mà bệnh nhân có thể bị đau tức, cồn cào nóng rát đến đau bụng quặn thành cơn dữ dội

d, Hiện tượng chóng mặt có thể xảy ra, bệnh nhân mệt mỏi và yếu, nhợt nhạt, thở ngắn, mạch nhanh và huyết áp giảm

* Triệu chứng cận lâm sàng

Dịch dạ dày đục, niêm mạc phù nề, có các vùng trợt và xuất huyết Xuất huyết có thể là những nốt hoặc đốm xảy ra riêng lẻ hoặc tập trung tạo thành những đám, mảng máu tụ đen hoặc hơi rỉ máu trên niêm mạc Vị trí chảy máu phân bố lan tỏa khắp niêm mạc hoặc phân bố khư trú ở thân vị và hang vị Hình 4 giới thiệu hình ảnh nội soi một số trường hợp chảy máu dạ dày của một số bệnh nhân Việt Nam (a, b, c) và nước ngoài (d,

e, f)

a b c

d e f

Hình 4 Hình ảnh nội soi niêm mạc dạ dày xuất huyết

của các bệnh nhân Việt nam (a,b,c) và nước ngoài (d,e,f)

1.4.2 Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ gây chảy máu dạ dày

Chảy máu dạ dày có nhiều nguyên nhân, trong thực tế thường khó xác định chắc chắn vì trên một bệnh nhân có thể có sự phối hợp của nhiều yếu tố Đó là:

a) Loét và viêm dạ dày

Loét và viêm dạ dày thường gặp ở các bệnh nhân nhiễm H pylori Chảy máu do

loét hoặc viêm dạ dày gây mất nhiều máu, có thể dẫn đến tình trạng thiếu máu trầm trọng Các bệnh nhân mang hội chứng di truyền Zollinger-Ellison tiết quá nhiều acid dạ dày gây loét dẫn đến chảy máu dạ dày [30]

b) Ung thư dạ dày

Các bệnh nhân ung thư dạ dày có thể nôn máu đen, khối lượng máu ít nhưng

nhiều lần Chảy máu thường tiềm tàng, phân đen hay gặp hơn là nôn ra máu [9]

c) Do dùng thuốc

Các loại thuốc giảm đau, chống viêm, hay gặp nhất là aspirin thường gây chống đau, nhất là, khi dùng aspirin với liều 1g/24 giờ, có tới 50% bệnh nhân bị tổn thương

dạ dày Các thuốc chống viêm không steroid cũng gây tổn thương niêm mạc dạ dày và

tá tràng, theo cơ chế ức chế enzyme cylo-oxygenase và giảm sự tổng hợp prostaglandin

[7], [31] Khi dùng thuốc chống viêm không steroid phối hợp với các loại thuốc

corticoid, thuốc chống đông thì tỷ lệ nguy cơ chảy máu tiêu hóa càng tăng, có thể gấp 2-3 lần

d) Do các chất ăn mòn niêm mạc dạ dày như rượu, axit hoặc kiềm

Có 20% người nghiện rượu xuất huyết tiêu hóa là do viêm dạ dày xuất huyết do

tăng thẩm thấu ở niêm mạc dạ dày [7] Khi bệnh nhân uống phải dung dịch axit (như

HCl, H2SO4) hoặc dung dịch kiềm đặc (như xà phòng giặt) cũng gây tổn thương dạ dày, thực quản, thậm chí gây thủng thực quản

e) Stress

Trạng thái stress trong một số bệnh như suy hô hấp, bỏng, chấn thương sọ não, nhiễm khuẩn huyết, trụy tim mạch, suy gan, suy thận có thể gây viêm dạ dày xuất huyết Các stress tinh thần như lo âu, mất ngủ, làm việc căng thẳng, tình trạng trầm cảm kéo dài cũng là nguyên nhân Tổn thương và xuất huyết dạ dày thường xảy ra

trong vòng 18 giờ sau stress [6]

g) Viêm nhiễm

Nhiễm H pylori hiện nay được coi là nguyên nhân chính gây ra các bệnh về dạ

dày, trong đó có chảy máu dạ dày [9]

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Hai mươi bảy bệnh nhân được chẩn đoán viêm dạ dày cấp tính chảy máu qua hình ảnh nội soi tại khoa Nội tiêu hóa, bệnh viện Bưu Điện và 10 người khỏe mạnh không

có bệnh gì về dạ dày đồng thuận được lựa chọn cho nghiên cứu

Tiêu chuẩn chọn lựa bệnh nhân nghiên cứu:

- Trước nội soi một tháng không dùng các thuốc kháng sinh, thuốc ức chế tiết axit

- Nội soi có hình ảnh chảy máu dạ dày

- Không phân biệt tuổi tác, nghề nghiệp, nơi ở

- Tự nguyện tham gia vào nghiên cứu

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.2.2 Hóa chất, thiết bị máy móc

a, Hóa chất

Các hóa chất dùng trong thí nghiệm mua của các hãng nước ngoài (Amersham Pharmacia Biotech; Amersham Life Science; Eurogen; Promega; Sigma…) có độ tinh khiết cao

b, Thiết bị máy móc

- Máy nội soi dạ dày video OLYMPUS Evis EXERA 160 và các dụng cụ kèm theo

- Máy lắc ổn nhiệt nuôi cấy tế bào (Multitron, Đức)

- Máy PCR 9700 (Applied Biosystems, Mỹ)

- Máy điện di và máy UV soi ADN (Mupid, Nhật Bản)

- Máy ly tâm lạnh bé

- Bể ổn nhiệt (Memmert, Đức)

- Máy giải trình tự gen tự động - ABI Prism 3100 Sequencer (Applied Biosytems, Mỹ)

- Máy đo quang phổ (Shimadzu, Nhật Bản)

- Máy NanoDrop 1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific, Mỹ)

c, Dung dịch và môi trường sử dụng

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn kị khí (1 lit)

Hình 5 Đĩa môi trường thạch máu dùng để nuôi cấy vi khuẩn

Dung dịch để giữ chủng vi khuẩn

Dung dịch (1 lit) chứa 28 g Brucella Broth (BB), bổ sung thêm 30% glycerol (v/v), bảo quản ở -80oC

2.2.3 Địa điểm thực hiện nghiên cứu

- Soi và sinh thiết dạ dày được thực hiện tại phòng Nội soi, bệnh viện Bưu Điện

- Các phân tích sau được thực hiện tại trường Đại học tổng hợp New York, NY, Mỹ:

+ Nuôi cấy và phân lập các chủng vi khuẩn kị khí

+ Xác định HP status của các bệnh nhân

+ Giải trình tự gen 16S rARN để định tên các chủng vi khuẩn

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU

- Đồng ý tham gia nghiên cứu

Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn trong điều kiện kị

khí

Định tên các chủng vi khuẩn phân lập Nghiên cứu hình thái học các vi khuẩn

2.3.1 Khám lâm sàng

Các bệnh nhân được thăm khám lâm sàng, hỏi bệnh và tiền sử theo mẫu phiếu thu thập số liệu thống nhất bao gồm các thông tin: tên; tuổi; giới tính; triệu chứng lâm sàng (đau thượng vị, cồn cào nóng rát, ợ hơi, ợ chua, buồn nôn, nôn, đầy bụng, rối loạn đại tiện ); tiền sử bệnh (bản thân, gia đình); tiền sử uống rượu bia, thuốc lá, uống thuốc kháng sinh hay thuốc ức chế axit; yếu tố stress; dị ứng

2.3.2 Nội soi và lấy bệnh phẩm

Việc nội soi, chụp ảnh và lấy mẫu sinh thiết dạ dày cho các nghiên cứu được thực hiện theo thường qui bởi các bác sĩ Nội khoa tiêu hóa cùng trang thiết bị của bệnh viện Bệnh nhân được chẩn đoán bị viêm dạ dày xuất huyết (về các mặt gồm vị trí tổn thương, hình ảnh tổn thương, mức độ tổn thương) sẽ được sinh thiết 2 mảnh, trong đó 1 mảnh ở hang vị, 1 mảnh ở thân vị Những mẫu bệnh phẩm này được cho vào ống nghiệm vô trùng và bảo quản trong bình N2 lỏng cho đến khi sử dụng vào các nghiên cứu tiếp theo

2.3.4 Nuôi cấy và phân lập chủng vi khuẩn

Hai mảnh sinh thiết dạ dày (1 mảnh lấy ở hang vị và 1 mảnh lấy ở thân vị) được lấy ra từ bình nitơ và được đặt vào trong đá khoảng 20 phút để cân bằng nhiệt độ, sau đó được nghiền kỹ trong 0,5 ml dung dịch muối sinh lý (0,9% NaCl) vô trùng Khoảng 30 – 50 l dịch nghiền của sinh thiết được nhỏ và trải đều trên bề mặt đĩa môi trường thạch Đặt các đĩa petri vào bình Jar với một bao khí BBL GasPak Plus (BD, Mỹ) để tạo điều kiện kị khí (10% CO2) (Hình 7) Đặt bình Jar vào tủ ấm ở 370C và đọc kết quả trong vòng 48 - 72 giờ

Mỗi khuẩn lạc có hình thù đặc trưng được nuôi riêng rẽ trên các đĩa thạch khác nhau Các đĩa nuôi được ghi tên, nguồn gốc bệnh nhân rõ ràng Quá trình phân lập được thực hiện cho đến khi nhận được các khuẩn lạc riêng rẽ và thuần nhất

Hình 7 Hệ thống bình nuôi cấy kị khí

Sau khi được phân lập, từng chủng vi khuẩn được nuôi trong môi trường lỏng Brucella Broth (BB) qua đêm để tăng lượng vi khuẩn Ly tâm thu tế bào vi khuẩn trong điều kiện vô khuẩn 4oC để lấy sinh khối Hòa tế bào vi khuẩn trong môi trường lỏng

BB có bổ sung 30% glycerol (v/v) rồi chia vào các ống giữ giống, giữ ở -80oC

2.3.5 Nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi thường

Vi khuẩn phết lên lam kính được cố định nhanh trên ngọn lửa đèn cồn và bằng tím kết tinh (2 g tím kết tinh trong 20 ml ethanol 95%, 0,8 g ammonium oxalate trong

80 ml nước cất) trong 1 phút Rửa tiêu bản bằng nước và nhuộm tiếp bằng dung dịch Lugol (1 g Iod, 2 g KI trong 300 ml nước cất) trong 1 phút Sau khi rửa lại tiêu bản bằng nước, phủ lên tiêu bản một lớp cồn 95% và rửa tiếp tiêu bản bằng nước Nhuộm

bổ sung tiêu bản bằng dung dịch safranin 0,5% trong 1 phút Rửa tiêu bản bằng nước cất và xem tiêu bản dưới kính hiển vi thường có độ phóng đại 100 lần Vi khuẩn Gram dương bắt màu tím, vi khuẩn Gram âm bắt màu đỏ

2.3.7 Tách chiết ADN từ vi khuẩn và từ sinh thiết

ADN được tách chiết từ sinh thiết dạ dày bằng Bộ Kít QIA-gene (Blood and Tissue Kit); từ vi khuẩn dùng Bộ Kít Genomic DNA purification Kit (Fermentas) ADN được được hòa trong 100-200 µl 1x TE Nồng độ và độ tinh sạch của chế phẩm ADN được kiểm tra trên máy NanoDrop1000, Thermo scientific

2.3.8 Xác định HPstatus của các bệnh nhân

HPstatus của các bệnh nhân được xác định nhờ phân tích các chỉ thị phân tử của

H pylori như gen glmM, gen hspA, gen cagA, gen 23S rARN [23] Bệnh nhân được xác định nhiễm H pylori (HPstatus +) nếu cho kết quả dương tính với tất cả hoặc ít nhất là

3/4 gen nghiên cứu của vi khuẩn Các mồi dùng trong phân tích được trình bày ở bảng dưới đây:

Gen Mồi Trình tự mồi (5' - 3') Ta Kích thước sp

- Taq ADN polymerase 10U/µl 0,125 µl

2.3.9 PCR nhân gen 23S rARN của H pylori

1-10 ng ADN tách chiết từ các chủng vi khuẩn được sử dụng làm khuôn để

khuếch đại gen 23S rARN của H pylori Cặp mồi được sử dụng để nhân toàn bộ gen 23S rARN có trình tự như Agudo và cộng sự (2010) đã miêu tả [11]:

23S-R CCACAGCGATGTGGTCTCAG

2.3.10 PCR nhân gen 16S rARN của vi khuẩn

1-10 ng ADN tách chiết từ các chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng làm khuôn để

khuếch đại gen 16S rARN của vi khuẩn Cặp mồi đƣợc sử dụng để nhân toàn bộ gen 16S rARN [63]:

cần tiến hành phân tích những sai sót đó, căn cứ vào trình tự trên hai mạch đơn theo nguyên tắc bổ sung giữa hai mạch

2.3.12 Định tên vi khuẩn

Các trình tự gen 16S rARN thu được sau khi giải trình tự được quét bằng chương

trình Blast qua kho dữ liệu NCBI Databases để so sánh với trình tự các vi sinh vật đã biết lưu trữ trong Database, qua đó định tên chủng vi khuẩn

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 ĐẶC ĐIỂM CÁC BỆNH NHÂN

3.1.1 Đặc điểm tuổi, giới, độ pH dạ dày

Các đặc điểm về tuổi và giới tính của các bệnh nhân tham gia nghiên cứu (danh sách bệnh nhân được liệt kê trong phần phụ lục I) được liệt kê ở bảng 1

Bảng 1 Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nhóm tuổi và giới tính

Tuy nhiên, khi so sánh với các nghiên cứu của một số tác giả khác trong nước và ngoài nước thì độ tuổi trung bình của các bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp tính chảy máu trong nghiên cứu của chúng tôi trẻ hơn nhiều [4], [2], [27], [16]: cả những người

<30 tuổi cũng bị chảy máu Sự trẻ hóa tuổi trung bình của các bệnh nhân cho thấy có

sự thay đổi đặc điểm dịch tễ của bệnh

Khả năng tiết dịch vị dạ dày của đa số các bệnh nhân (96,3 %) hoàn toàn bình thường (Hình 8): pH dịch vị trung bình ~2.5, chỉ có bệnh nhân số 25 có pH dịch vị

kiềm ~8

Hình 8 Xác định độ pH dịch dạ dày của 27 bệnh nhân bị chảy máu dạ dày

3.1.2 Hình ảnh nội soi dạ dày của các bệnh nhân

Các hình ảnh chụp nội soi chảy máu dạ dày của các bệnh nhân được trình bày ở hình 9 Xem xét hình ảnh, có thể nhận thấy niêm mạc dạ dày người bệnh bị phù nề, có các vùng trợt và xuất huyết Các vết trợt và vị trí chảy máu phân bố lan tỏa khắp niêm mạc hoặc phân bố khư trú Tại địa điểm bị chảy máu có thể có những đám bầm tím hoặc chảy màu vào trong lòng dạ dày

Các bệnh nhân 1, 3, 5, 6, 9, 10, 12, 14, 15, 18, 21 có hình ảnh nội soi chảy máu

dạ dày mức độ nhẹ, nốt chảy máu nhỏ màu đỏ hoặc nâu sẫm rải rác.Các bệnh nhân 7,

8, 11, 16, 17, 19, 24, 25, 26 chảy máu dạ dày mức độ vừa, có một lượng vừa phải những nốt nhỏ, vừa, mảng trợt xuất huyết nhỏ màu đỏ, nâu hoặc đen trên nền niêm mạc

dạ dày phù nề, xung huyết Các bệnh nhân 2, 4, 13, 20, 22, 23, 27 chảy máu dạ dày mức độ nặng, có nhiều mảng viêm trợt vừa và lớn trong dạ dày, hình ảnh là những mảng viêm trợt đen

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

3.2 XÁC ĐỊNH HP STATUS CỦA CÁC BỆNH NHÂN

Nhiễm H pylori, hay còn đƣợc gọi là HPstatus của 27 bệnh nhân đƣợc xác định dựa trên kết quả phân tích 4 gen chỉ thị của vi khuẩn (bao gồm gen glmM, gen hspA,

Hình 9 Ảnh chụp dạ dày xuất huyết

gen cagA, gen 23S rARN PCR nhân các gen này trực tiếp từ mẫu ADN genome tách từ

sinh thiết dạ dày của bệnh nhân

Chúng tôi xem xét đồng thời nhiều gen bởi lẽ trên thực tế, rất nhiều chủng H pylori có thể có hoặc khiếm khuyết một số gen, nghĩa là có khả năng mẫu bệnh phẩm chứa vi khuẩn H pylori nhưng vì không có gen nên không được thể hiện trên kết quả

PCR Bên cạnh đó, lại có thể có những loài vi khuẩn khác chưa biết cũng có chứa

những gen tương tự như gen của H pylori, đồng nghĩa với việc, có sự xuất hiện của gen nhưng chưa chắc sản phẩm PCR ấy đã được khuếch đại từ gen của H pylori Việc

kết hợp nghiên cứu trên nhiều gen và thống kê sự xuất hiện đồng thời của các gen ấy trong mẫu ADN bệnh phẩm cho phép chúng tôi khẳng định chắc chắn hơn về sự xuất

hiện của vi khuẩn H pylori trong mẫu sinh thiết bệnh nhân, cũng như tỷ lệ nhiễm H pylori ở các bệnh nhân này

Kết quả nhân từng gen được trình bày trong bảng 2 Bệnh nhân được cho là bị

nhiễm H pylori được xác định là có chứa tất cả hoặc ít nhất là 3/4 gen nghiên cứu Sau

khi thống kê sự xuất hiện của các gen, chúng tôi xác định được tỷ lệ bệnh nhân nhiễm

HP là 23/27 bệnh nhân, chiếm 85,19%

Nhiễm H pylori là một trong các nguyên nhân gây viêm dạ dày cấp tính chảy máu ở người Ngoài gây bệnh, vi khuẩn H pylori, do ức chế tiết axit dạ dày, còn thúc

đẩy quá trình định cư của các loại vi khuẩn khác trong Microbiota dạ dày Trong

nghiên cứu của chúng tôi, các bệnh nhân nhiễm H pylori hay mang HPstatus+ chiếm 85,19 % Tỉ lệ này cao hơn so với kết quả trong nghiên cứu của các tác giả khác trong

nước Theo Quách Trọng Đức và cộng sự (2009), tỷ lệ nhiễm H pylori chỉ là 49,6 %

[3]; còn trong nghiên cứu của GS Tạ Long và cộng sự (2010), tỷ lệ này dao động từ 61,2 đến 78,9 % [8] Con số này cũng cao hơn so với tỷ lệ nhiễm ở các nước phát triển

có điều kiện kinh tế - xã hội như Ý 46,9 % [26]; Nhật Bản 47,8 % [59]

Bảng 2 Kết quả phân tích 4 gen chỉ thị của vi khuẩn H pylori của 27 bệnh nhân

Số người nhiễm H pylori cao ở các bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp tính chảy

máu xác nhận vai trò gây bệnh lý của vi khuẩn, mặt khác báo động tình trạng đỏ của vệ sinh cộng đồng và vệ sinh an toàn thực phẩm cũng như tình trạng ô nhiễm môi trường hiện nay

3.3 PHÂN LẬP CÁC VI KHUẨN Ở ĐIỀU KIỆN KỊ KHÍ

Vi khuẩn được phân lập từ sinh thiết dạ dày của 27 bệnh nhân trong điều kiện

kị khí Để đảm bảo các khuẩn lạc nhận được là vi khuẩn phát triển từ mẫu bệnh, một đĩa môi trường máu được trải với 30 µl dịch NaCl được sử dụng làm mẫu đối chứng

âm Sau 3-5 ngày ở điều kiện kỵ khí, 23/27 (85,1%) các mẫu bệnh phẩm cho kết quả nuôi cấy dương tính

Bảng 3 Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm vi khuẩn

Kết quả cho thấy, một bệnh nhân có thể (i) bị nhiễm một hay nhiều loại vi khuẩn; (ii) các khuẩn lạc đa dạng về hình thái, màu sắc, kích thước, số lượng; (iii) các đĩa nuôi cấy giữa các bệnh nhân khác nhau mang các khuẩn lạc khác nhau (Hình 10)

Hình 10 Hình ảnh các khuẩn lạc vi khuẩn trên đĩa thạch máu của một số bệnh nhân

Nguyễn Văn T 57t (A); BN Vũ Ngọc C 34t (B); BN Nguyễn Thị H 57t (C)

Đặc biệt, trên nhiều đĩa nuôi cấy đầu tiên còn thấy một loại khuẩn lạc màu trắng trong, nhỏ li ti như đầu mũi kim, có trường hợp như những phẩy bụi bé rất khó nhận thấy (Hình 11) Bằng kinh nghiệm chúng tôi nhận thấy chúng rất giống với khuẩn

lạc của Helicobacter pylori, một loại vi khuẩn cư trú thường xuyên trong Microbiota dạ

ở điều kiện kị khí

Hình 11 Hình ảnh

các khuẩn lạc được nhận định

giống với H pylori

Hình 12 H pylori sau khi nhuộm Gram dưới kính hiển vi quang học

Hình 14 Sản phẩm PCR khuếch đại gen 23S rARN xác định H pylori

(1-16): Sản phẩm PCR gen 23S rARN, (N): đối chứng âm, (D): đối chứng dương

Hình 13 Kết quả thử hoạt tính Urease

bằng Helicotest Dương tính: mẫu 2, 3, 4 và 6 (màu đỏ cánh sen) Âm tính: 1 và 5 (màu vàng)

N P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 (+) (-) 10 11 12 13 14 15 16

Hình 15 Các chủng H pylori phân lập ở điều kiện kị khí

Đối với các khuẩn lạc vi khuẩn không phải H pylori mọc đa dạng trên đĩa như

đã chỉ ra ở trên, chúng tôi cũng tiến hành các bước phân lập và làm sạch từng loại khuẩn lạc ở điều kiện kị khí quá trình được nhắc laị từ 3-5 lần cho đến khi nhận được chủng vi khuẩn thuần nhất, không bị nhiễm Kết quả phân lập được 26 chủng vi khuẩn

ngoài H pylori Các khuẩn lạc vi khuẩn mọc tốt, đồng nhất, và thể hiện rõ sự khác biệt

về hình dạng, màu sắc, kích thước khuẩn lạc giữa các chủng Hình 16 là đĩa phân lập cuối cùng của một số chủng vi khuẩn

Hình 16 Một số chủng vi khuẩn được phân lập và làm sạch ở điều kiện kị khí

3.4 NGHIÊN CỨU CÁC VI KHUẨN

3.4.1 Xác định Gram của các chủng phân lập

Các vi khuẩn phân lập ở điều kiện kị khí được xác định sau nhuộm Gram đa phần là Gram dương (Hình17)

Hình 17 Ảnh chụp một số chủng vi khuẩn dưới kính hiển vi Olympia

Các vi khuẩn phân lập ở điều kiện kị khí thường là loại Gram dương (số 1,2,3,5,6) chỉ có số ít

là loại Gram âm (số 4)

3.4.2 Định tên vi khuẩn

Để xác định các vi khuẩn nhận được là loài nào, chúng tôi tiến hành các bước

tách chiết ADN từ các chủng vi khuẩn phân lập, nhân bản toàn bộ gen 16S rARN Sản

phẩm PCR được kiểm tra trên gel Agarose 1.5 % (Hình 18), sau đó được tinh sạch và

đọc trình tự gen Trình tự 16S rARN được trình bày ở phụ lục III

1 2 3

4 5 6

1 2 3 4 N P

Hình 18 Sản phẩm PCR khuếch đại từ gen 16S rARN

(1-4): Sản phẩm PCR gen 16S rARN của chủng phân lập số 1 đến chủng 4

N: đối chứng âm, P: đối chứng dương

Các trình tự 16S rARN của các chủng vi khuẩn phân lập sẽ được xử lý bằng

chương trình Blast trên kho dữ liệu NCBI Database để so sánh với các chủng trên ngân

hàng thế giới, qua đó định tên loài vi khuẩn Vi khuẩn định tên có gen 16S rARN tương đồng ít nhất 98% với gen 16S rARN của loài vi khuẩn đã biết Ví dụ, một chủng vi khuẩn được định tên là Rothia dentocariosa có gen 16S rARN giống 100% với vi

khuẩn đã biết trong quĩ gen

Rothia dentocariosa ATCC 17931 strain ATCC 17931 16S ribosomal RNA, complete

sequence Sequence ID: ref|NR_074568.1|Length: 1515Number of Matches: 1

Related Information

Range 1: 4 to 1510GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match

Score Expect Identities Gaps Strand