Khảo sát đột biến gen EGFR và K-RAS trên bệnh nhân Việt Nam bị ung thư phổi không tế bào nhỏ

Điều đáng chú ý là ngày nay phần lớn các trường hợp ung thư phổi được phát hiện tại các nước đang phát triển, với sự gia tăng từ 31% trong tổng số ung thư phổi được chẩn đoán trên thế gi

1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Yếu tố dịch tễ học – lâm sàng của ung thư phổi

Ung thư phổi chiếm tỷ lệ cao nhất và cũng là nguyên nhân tử vong hàng đầu trong tất cả các bệnh ung thư Về mặt chẩn đoán, ung thư phổi nguyên phát được chia thành nhóm ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC: non-small cell lung cancer) và ung thư phổi tế bào nhỏ Trên thế giới, trong số khoảng 12,7 triệu trường hợp ung thư mới được chẩn đoán hằng năm, ung thư phổi chiếm 1,61 triệu trường hợp (12,7% ), với 1,38 triệu trường hợp tử vong(1) Tại Mỹ, ước tính có khoảng 215.000 trường hợp bệnh mới và 161.000 bệnh nhân ung thư phổi chết trong năm 2008(2) Điều đáng chú ý là ngày nay phần lớn các trường hợp ung thư phổi được phát hiện tại các nước đang phát triển, với sự gia tăng từ 31% trong tổng số ung thư phổi được chẩn đoán trên thế giới vào năm 1980 lên 55% vào thời điểm hiện nay(1) Riêng tại khu vực Đông Nam Á, ung thư phổi chiếm hàng đầu của ung thư ở nam giới, với tỷ xuất bệnh mới là 29,6/100.000 dân, xếp trên cả ung thư gan (21,4/100.000) và ung thư đại trực tràng (15,2/100.000) Ở khu vực này, ung thư phổi của nữ giới xếp hàng thứ tư (11,9/100.000 dân) sau ung thư vú, ung thư cổ tử cung và ung thư đại trực tràng Tuy nhiên, ung thư phổi có tiên lượng rất xấu, là nguyên nhân tử vong hàng đầu do ung thư ở cả hai giới ở Đông Nam Á (ở nam là 26,3/100.000 dân, ở nữ là 10,4/100.000)

1.1 Nguyên nhân gây ung thư phổi

Khói thuốc lá, chứa hơn 60 loại chất sinh ung như nitrosamine và benzopyrene,

được xác định là nguyên nhân trực tiếp và quan trọng nhất gây nên ung thư phổi Hút thuốc lá là nguyên nhân của 85 – 90% trong tổng số các trường hợp ung thư phổi trên toàn thế giới(3) Nguy cơ trọn đời bị ung thư phổi của người không hút thuốc lá được ước tính khoảng 1,3 – 1,4 %; nguy cơ này sẽ gia tăng thành 17,2% ở người nam hút thuốc lá

và 11,6% ở người nữ hút thuốc lá(4)

Tiếp xúc lâu dài với nicotine gây nên sự ức chế hoạt động của đáp ứng miễn dịch chống lại sự tăng sinh ác tính trong các mô phổi Các chất

2

sinh ung có trong khói thuốc lá gây ra hàng chục ngàn kiểu đột biến trên DNA của tế bào, trong số đó có ít nhất 134 kiểu đột biến nằm trên các exon mã hóa protein(5)

Ngoài khói thuốc lá, tiếp xúc nghề nghiệp với các chất như asbestos, nickel,

chromium và arsenic cũng làm tăng nguy cơ bị ung thư phổi Các nghiên cứu cho thấy

tiếp xúc với khí radon trong không khí là nguyên nhân gây ung thư phổi quan trọng thứ hai sau khói thuốc lá(6) Khí radon không mùi vị, được tạo ra từ sự phân rã phóng xạ radium vốn xuất phát từ uranium có trong lớp vỏ trái đất Các sản phẩm phân rã phóng xạ gây nên sự ion hóa các vật chất di truyền, từ đó xuất hiện các đột biến gen và ung thư

Gần đây có những bằng chứng gợi ý vai trò của virus trong việc gây ra ung thư phổi(7) Các virus như human papillomavirus, simian virus 40 hay cytomegalovirus hiện

diện trong mô ung thư phổi, được cho là đã gây nên sự rối loạn chu kỳ tế bào và ức chế quá trình chết tế bào theo lập trình, mở đường cho hiện tượng ung thư phổi xuất hiện Chi tiết về các cơ chế phân tử mà virus khởi phát trong tế bào ký chủ để tạo nên các dạng ung thư, trong đó có ung thư phổi, là một lĩnh vực đang thu hút được rất nhiều nghiên cứu y sinh học trong thời gian qua Tỷ lệ HPV dương tính trong mẫu ung thư phổi trung bình là 24,5%, dao động từ 15% ở Châu Âu và Bắc Mỹ cho đến 35,7% ở Châu Á(8) Tất cả các kiểu ung thư phổi đều bị ảnh hưởng bởi các type virus nguy cơ cao là 16, 18, 31 và 33

Nguyên nhân di truyền của ung thư phổi mới chỉ được chú ý nghiên cứu trong thời

gian gần đây Ở cả người hút thuốc và không hút thuốc lá, tính đa hình thái của các gen

có vai trò điều hòa chuyển hóa các chất sinh ung, kiểm soát quá trình sửa sai DNA và chu

kỳ tế bào có thể có ảnh hưởng quan trọng vào tính mẫn cảm với ung thư phổi Ví dụ, các nghiên cứu đã tìm ra ít nhất 3 gen trên nhánh dài của nhiễm sắc thể 15 có liên quan với

nguy cơ mắc ung thư phổi, đó là các gen CHRNA3, CHRNA5 và CHRNB4, mã hóa cho

các tiểu đơn vị cấu trúc của thụ thể nicotinic acetylcholine(9, 10) Một phân tích gộp của 23 nghiên cứu bao gồm 15.857 đối tượng cho thấy alen Proline tại codon 72 của P53 là một yếu tố nguy cơ ung thư phổi, đặc biệt trên người Châu Á, người da trắng và người hút thuốc lá(11)

3

Chế độ ăn uống có thể cũng ảnh hưởng tới ung thư phổi Ở chuột, thức ăn có nhiều gốc phosphate có thể hoạt hóa đường truyền tín hiệu AKT trong tế bào gây nên kích thích quá mức sự tăng sinh tế bào, thúc đẩy tiến triển của ung thư phổi(12) Trái lại, một phân tích gộp của 22 nghiên cứu cho thấy trà xanh giúp giảm nguy cơ ung thư phổi(13)

1.2 Chẩn đoán và phân giai đoạn ung thư phổi

Các triệu chứng lâm sàng của ung thư phổi không hoàn toàn đặc hiệu, có thể cũng gặp trong các bệnh lý lành tính của phổi Cần lưu ý rằng khoảng 10% trường hợp ung thư phổi không hề có triệu chứng nào khi được chẩn đoán, chỉ được phát hiện tình cờ trên phim phổi khi khám sức khỏe tổng quát Khối u có thể phát triển bên trong khí đạo, gây khó thở do tắc nghẽn Sự tắc nghẽn cũng làm ứ đọng các chất tiết, tạo điều kiện cho viêm phổi xuất hiện Các khối u thường có hệ thống mạch máu cung cấp rất phong phú nhưng lại dễ vỡ, gây nên triệu chứng ho ra máu Các triệu chứng và dấu hiệu lâm sàng khác bao gồm đau ngực, mệt mỏi, chán ăn, ngón tay dùi trống, tràn dịch màng phổi,…

Với các triệu chứng gợi ý của ung thư phổi, trước tiên bệnh nhân nên được chụp X-quang phổi nhằm phát hiện các khối mờ hay hình ảnh dãn rộng trung thất (gợi ý sự xâm lấn hạch), xẹp phổi, đông đặc phổi do viêm hoặc hình ảnh tràn dịch màng phổi Chẩn đoán xác định ung thư phổi chỉ được kết luận bằng kết quả khảo sát giải phẫu bệnh

Để có được bệnh phẩm phù hợp, sinh thiết qua nội soi phế quản hoặc qua hướng dẫn của chụp cắt lớp điện toán thường được sử dụng

Dựa theo kết quả giải phẫu bệnh, ung thư phổi được chia thành 2 nhóm lớn với tiên lượng và điều trị khác nhau Ung thư phổi tế bào nhỏ chiếm 20%, hầu hết các trường hợp đã có di căn xa vào thời điểm chẩn đoán và có tiên lượng rất xấu Loại này thường xuất phát từ các khí đạo lớn và có diễn tiến rất nhanh Ung thư phổi không tế bào nhỏ chiếm 80%, bao gồm carcinôm tế bào vẩy, carcinôm tuyến và carcinôm tế bào lớn Carcinôm tế bào vẩy thường xuất phát gần phế quản trung tâm, có hoại tử giữa khối u,

60 bệnh nhân trong nhóm PET-CT và 73 bệnh nhân trong nhóm còn lại được phẫu thuật

mở lồng ngực, trong đó có 21 trường hợp trong nhóm PET-CT và có tới 38 trường hợp trong nhóm còn lại đã chịu phẫu thuật mở lồng ngực một cách vô ích (P = 0,05)(14) PET-

CT cũng hơn hẳn xạ hình xương trong chẩn đoán di căn xương trên bệnh nhân NSCLC

Ung thư phổi nguyên phát thường cho di căn sớm Trên 75% trường hợp ung thư phổi mới được chẩn đoán đã có di căn xa hoặc di căn vùng khiến cho tiên lượng rất xấu(15) Chính vì vậy,vấn đề chẩn đoán sớm ung thư phổi là một mục tiêu quan trọng mà các nghiên cứu hiện nay đang hướng tới, bằng cách tập trung vào việc phát hiện các thay đổi phân tử đặc hiệu cho ung thư phổi tại những vị trí có thể dễ dàng khảo sát như đường thở hay trong máu của bệnh nhân Trong một nghiên cứu so sánh các thay đổi nhiễm sắc thể bằng kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang giữa nhóm bệnh nhân carcinôm tại chỗ và nhóm loạn sản nặng do thuốc lá, hiện tượng lệch bội ở các nhiễm sắc thể 5p15.2, 7p12 và 8q24 xuất hiện trong 64% các trường hợp ung thư nhưng chỉ gặp ở 31% trong nhóm chứng(16) Trong một nghiên cứu khác, mất tính dị hợp tử của nhiễm sắc thể 3q liên quan

có ý nghĩa với sự phát triển ung thư phổi(17) Các nghiên cứu này cho thấy khả năng xét nghiệm phân tử có thể cho phép chẩn đoán sớm các trường hợp ung thư phổi ở những người thuộc nhóm nguy cơ cao, như nhóm bệnh nhân bị bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính và những người nghiện hút thuốc lá nặng

5

1.3 Các yếu tố tiên lượng

Tiên lượng rất xấu của ung thư phổi là do chẩn đoán thường chỉ thực hiện được trong giai đoạn trễ Ở giai đoạn này, can thiệp phẫu thuật không còn khả thi hoặc hiệu quả rất hạn chế do tế bào ung thư đã xâm lấn hay di căn xa, bệnh nhân chỉ còn trông chờ vào các phác đồ hóa trị liệu dựa trên platinum, với nhiều tác dụng phụ đi kèm Tỷ lệ sống thêm 5 năm của bệnh nhân ung thư phổi chỉ khoảng 15% Mặc dù cách phân giai đoạn kinh điển dựa theo lâm sàng – giải phẫu bệnh (hệ thống phân giai đoạn TNM) có ý nghĩa quan trọng cho tiên lượng và hướng dẫn điều trị, tuy nhiên trong ung thư phổi có rất nhiều trường hợp bệnh tiến triển rất nhanh dù được chẩn đoán ở giai đoạn sớm Các yếu

tố tiên lượng khác ở mức độ phân tử ngày càng được quan tâm nghiên cứu để tiên lượng cho bệnh nhân một cách chính xác hơn

Di căn hạch khiến cho tiên lượng của ung thư phổi không tế bào nhỏ xấu hơn Chẩn đoán sớm tình trạng di căn hạch cần có những kỹ thuật phân tử nhạy và chuyên biệt cao Trong những trường hợp di căn hạch ở giai đoạn rất sớm, khi mà lượng tế bào di căn còn rất ít thì chẩn đoán giải phẫu bệnh có thể chưa phát hiện được Với những loại vi di căn hạch (0,2-2 mm), kỹ thuật giải phẫu bệnh thường quy khó phát hiện Khi đó, chẩn đoán tình trạng vi di căn hạch có thể được thực hiện nhờ các kỹ thuật sinh học phân tử Ở bệnh nhân NSCLC giai đoạn I, chẩn đoán tình trạng vi di căn hạch có thể được thực hiện

bằng khảo sát PCR định lượng cho RNA thông tin của gen CEACAM5 và PLUNC(18) Thời gian sống thêm của bệnh nhân có biểu hiện của RNA thông tin trong tế bào hạch xấu hơn so với bệnh nhân không có biểu hiện 2 gen này Tiềm năng di căn hạch và khả năng tăng sinh mạnh mẽ của NSCLC cũng có liên quan tới biểu hiện của survivin trong nhân tế bào(19)

Những bệnh nhân có survivin trong nhân âm tính và chỉ số Ki-67 thấp thì tiên lượng sống thêm tốt nhất, đặc biệt nếu không thuộc loại carcinôm tế bào vẩy

Tình trạng khuếch đại gen MET, được đánh giá bằng FISH, là một yếu tố tiên

lượng độc lập trong NSCLC(20) Trong số 431 trường hợp NSCLC được phẫu thuật, thời

gian sống thêm trung vị cho nhóm có khuếch đại gen MET (gồm 48 bệnh nhân, 11%) chỉ

2 Các cơ chế bệnh sinh phân tử của ung thư phổi không tế bào nhỏ

Đột biến EGFR trong NSCLC được báo cáo lần đầu tiên năm 2004 trên những bệnh

nhân có đáp ứng với gefitinib(23, 24)

Gen EGFR nằm trên nhiễm sắc thể số 7, mã hóa cho

protein cùng tên Protein EGFR là một thụ thể ở màng tế bào, có hoạt tính tyrosine kinase khi được gắn và hoạt hóa bởi yếu tố tăng trưởng biểu bì (epidermal growth factor: EGF) Trong tế bào bình thường, sự hoạt hóa EGFR cần thiết cho nhiều chức năng quan trọng của tế bào như quá trình tăng sinh và biệt hóa tế bào Tuy nhiên, sự hoạt hóa quá mức do đột biến của gen có thể dẫn đến tăng sinh bất thường cũng như sự chuyển dạng tế bào Quan trọng hơn nữa, những rối loạn hoạt động của EGFR do đột biến có thể dẫn đến bệnh lý ác tính Đột biến xảy ra tại các exon 18 – 21, khiến cho protein EGFR luôn trong trạng thái hoạt hóa không phụ thuộc chất truyền tín hiệu là EGF Do các đột biến rất đa dạng, kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA được coi là tốt nhất để khảo sát các đột biến

EGFR Thường gặp nhất là đột biến mất đoạn (deletion) xảy ra trên exon 19, kế đến là

đột biến điểm L858R tại exon 21 Các đột biến thêm đoạn (duplication) trên exon 20 hay đột biến điểm trên exon 18 ít gặp hơn Đặc biệt, đột biến hầu như chỉ gặp trên loại carcinôm tuyến, rất hiếm khi tìm thấy ở carcinôm gai – tuyến(25, 26) Hơn nữa, tỷ lệ bệnh

nhân có mang đột biến EGFR rất khác nhau giữa các chủng tộc: Tỷ lệ này chỉ xấp xỉ 3%

ở người Mỹ, nhưng lên đến khoảng 32% ở người Nhật(24), 36,4% ở Hàn Quốc(27), 55% ở Đài Loan(28) và 57,4% ở Thái Lan(29) Đột biến cũng thường tìm thấy hơn trên bệnh nhân

7

nữ so với bệnh nhân nam, trên bệnh nhân không có tiền căn hút thuốc lá so với người từng hút thuốc lá Tỷ lệ đột biến cao tìm thấy trên người châu Á phù hợp với quan sát trong những thử nghiệm lâm sàng trước đây, trong đó bệnh nhân châu Á có đáp ứng cao hơn hẳn với điều trị đặc hiệu so với bệnh nhân Âu - Mỹ

Phương pháp thường được sử dụng nhất để phát hiện đột biến gen EGFR là giải trình

tự chuỗi DNA(30, 31) Đoạn gen quan tâm được khuếch đại bằng PCR nhờ những đoạn mồi đặc hiệu, sau đó trình tự DNA được phát hiện bằng máy giải trình tự tự động Kỹ thuật này đòi hỏi phải có khoảng 30% DNA mang đột biến trong mẫu thử thì mới có thể phát hiện được(25) Cần lưu ý là các tiêu bản mô bệnh học thường chứa các thành phần tế bào không đồng nhất gây khó khăn trong phân tích kết quả Ngoài ra, một số bệnh nhân có u phổi đa ổ Chính vì thế, việc lựa chọn vùng tế bào ung thư phù hợp cho phân tích kết quả đột biến gen là vai trò quan trọng của các chuyên gia giải phẫu bệnh Nhờ đó quần thể tế bào có mang đột biến được làm giàu thêm, giúp tăng cơ hội phát hiện được đột biến gen bằng giải trình tự DNA Mô cố định trong formalin và được vùi nến thường được chọn cho khảo sát đột biến, nhưng cần lưu ý bảo quản bệnh phẩm đúng quy cách để có kết quả chính xác Các bệnh phẩm cố định trong ethanol hoặc khử canxi, cũng như những bệnh phẩm có chứa quá nhiều mô hoại tử thì không nên dùng để phân tích đột biến gen

Các phương pháp khác bao gồm PCR phân tích tính đa hình chuỗi đơn strand conformational polymorphism analysis), phân tích sản phẩm PCR dựa trên tính nóng chảy (high resolution-melting amplicon analysis), Scorpions amplified refractory mutation system,… So với giải trình tự chuỗi DNA, các phương pháp này có lợi điểm nhanh hơn và đảm bảo độ nhạy cũng như độ đặc hiệu khá cao Tuy nhiên, các phương pháp này có thể bỏ sót các đột biến mới và cần đến giải trình tự chuỗi DNA để khẳng định lại các đột biến(25, 32, 33)

(PCR-single-Erlotinib (biệt dược Tarceva của Roche) và gefitinib (biệt dược Iressa của Astrazeneca) là thuốc ức chế hoạt tính tyrosin kinase của EGFR Trên bệnh nhân châu Á,

Iressa tỏ ra rất hiệu quả, đặc biệt nếu bệnh nhân có mang đột biến của EGFR Một nghiên

8

cứu trên bệnh nhân Nhật Bản công bố năm 2008 cho thấy tỷ lệ sống thêm 1 năm là 79%(34) Tháng 5/2008, nhóm tác giả của Mỹ công bố kết quả rất khả quan về hiệu quả

của gefitinib khi được chỉ định ưu tiên cho bệnh nhân có mang đột biến của EGFR, với tỷ

lệ sống thêm 1 năm là 73% và thời gian sống thêm trung vị là 17,5 tháng(35) Ngay cả những trường hợp đã có di căn não, erlotinib và gefitinib cũng tỏ ra có hiệu quả trên bệnh

nhân có mang đột biến EGFR(36)

Cả erlotinib và gefitinib đều có khả năng gắn lên vùng tyrosine kinase của phân tử EGFR để cạnh tranh với ATP, vì vậy ngăn cản được sự phosphoryl hóa của phân tử đích Các kết quả nghiên cứu nhằm tìm ra những chỉ điểm sinh học cho đáp ứng với thuốc ức chế đặc hiệu EGFR cho thấy tình trạng đột biến gen

EGFR chính là yếu tố tiên đoán chính xác nhất, trong khi đó hóa mô miễn dịch để đánh

giá biểu hiện protein lại không cho thông tin có ý nghĩa nào cho tiên đoán đáp ứng điều trị(37, 38) Những đột biến nhạy với thuốc thường gặp nhất là mất đoạn của exon 19, đột biến điểm của exon 21 (L858R, L861Q và L861R), đột biến điểm của exon 18 (G719A/C/S) và đột biến điểm của exon 20 (V765A, T783A và S768I) Tuy nhiên, đột biến chèn đoạn của exon 20 (D770_N771insNPG, D770_N771insSVQ và D770_N771insG) và đột biến điểm của exon 20 (V769L và N771T) lại gây ra kháng thuốc(39, 40)

Mặt khác, trong những con đường truyền tín hiệu nội bào của thụ thể EGFR, có sự tham gia của trục RAS/RAF/MAPK(41) Trong đó KRAS là một gen rất quan trọng của quá trình này KRAS là một thành viên của gia đình gen RAS, mã hóa cho một guanosine

triphosphate GTPase vốn có hai trạng thái: trạng thái bất hoạt có gắn GDP và trạng thái hoạt động có gắn với GTP Là một chất truyền tin hạ nguồn của EGFR, KRAS có vai trò quan trọng trong việc khởi phát và tiến triển của một số ung thư như carcinôm tuyến của đại tràng, phổi và tụy Khi đột biến xảy ra sẽ làm mất hoạt tính ATPase và giữ phân tử protein KRAS ở trạng thái gắn ATP liên tục, dẫn đến hậu quả là các phân tử truyền tin hạ nguồn luôn hoạt động để duy trì tín hiệu tăng sinh tế bào(42)

9

Nếu KRAS ở trạng thái bình thường (wild-type KRAS), hoạt động của nó phụ thuộc vào hoạt tính của thụ thể EGFR Trái lại, khi có đột biến của KRAS, nó sẽ tự hoạt hóa không phụ thuộc EGFR KRAS đột biến đóng vai trò quan trọng cả trong hình thành ung thư cũng như sự đề kháng với điều trị Bệnh nhân NSCLC mang đột biến codon 12 của gen KRAS có tiên lượng xấu hơn, với thời gian sống toàn bộ và thời gian sống không bệnh ngắn hơn(43) Nhiều nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng trong NSCLC cũng như trong ung thư đại trực tràng đã chứng minh rằng điều trị bằng thuốc ức chế hoạt tính tyrosin kinase của EGFR chỉ có hiệu quả trong những trường hợp không kèm theo đột biến tại

KRAS(44, 45)

Gen tổ hợp EML4-ALK được hình thành từ sự đảo đoạn của nhánh ngắn nhiễm sắc thể

số 2 Trong nhóm bệnh nhân NSCLC không có mang đột biến EGFR và KRAS, 33 –

44,8% bệnh nhân có mang gen tổ hợp này(46, 47) Ngày 26/8/2011, Cơ quan quản lý thuốc – thực phẩm của Mỹ (U.S FDA) đã phê chuẩn crizotinib trong điều trị bệnh nhân

NSCLC có mang gen tổ hợp EML4-ALK, mở ra thêm cơ hội điều trị cho bệnh nhân

3 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Tại Việt Nam, ung thư phổi nguyên phát có xuất độ cao, đặc biệt ở nam giới, với tỷ lệ 24,6 bệnh nhân/ 100.000 dân tại khu vực Thành Phố Hồ Chí Minh và – 38,8 bệnh nhân/ 100.000 dân tại khu vực Hà Nội(48) Trong giai đoạn 2 năm từ 2005 -2006, trong 93.719 trường hợp tử vong do ung thư có 22.209 do ung thư phổi(49) Đã có nhiều nghiên cứu về dịch tễ học, lâm sàng và giải phẫu bệnh của ung thư phổi, nhưng thiếu các nghiên cứu đi sâu tìm hiểu cơ chế phân tử của căn bệnh phổ biến này

Điều trị nhắm trúng đích phân tử cho một số bệnh ung thư đã bắt đầu được chỉ định tại Việt Nam Trong ung thư vú, kháng thể đơn dòng Herceptin được chỉ định khi bệnh

nhân có tăng biểu hiện gen HER2/neu qua khảo sát bằng kỹ thuật lai tại chỗ gắn huỳnh

quang (FISH) hoặc tăng biểu hiện protein HER2/neu qua đánh giá bằng hóa mô miễn dịch Trong u mô đệm đường tiêu hóa, thuốc ức chế đặc hiệu phân tử c-kit là imatinib

10

mesylate (Gleevec) cũng đã được chỉ định tại Bệnh viện Ung Bướu TP.HCM nhưng chưa

dựa trên phân tích đột biến gen c-kit

Đã có những báo cáo về đáp ứng lâm sàng của bệnh nhân NSCLC được điều trị bằng erlotinib tại Việt Nam(50, 51) Tuy nhiên các chỉ định này đều dựa theo các chỉ số lâm sàng,

vẫn thiếu các bằng chứng về sinh học phân tử là tình trạng đột biến của gen EGFR và

KRAS

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm mục tiêu xác định tần suất đột biến gen

EGFR và KRAS ở bệnh nhân Việt Nam bị NSCLC, qua đó giúp dự đoán đáp ứng lâm

sàng với thuốc ức chế hoạt tính tyrosin kinase của EGFR

Ung thư phổi thường được chẩn đoán trễ, với tiên lượng xấu, thời gian sống thêm chỉ tính bằng tháng với những mô thức trị liệu kinh điển Nhu cầu của bệnh nhân về một mô thức điều trị nhắm trúng đích phân tử trong thời gian tới sẽ đi kèm với yêu cầu chẩn đoán được những dấu ấn sinh học giúp lựa chọn bệnh nhân hiệu quả Nghiên cứu xác định đột

biến gen EGFR và KRAS trong ung thư phổi sẽ giúp ích thiết thực cho việc ứng dụng

điều trị nhắm trúng đích phân tử trên bệnh nhân Việt Nam

2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu

Tất cả các mẫu bệnh phẩm đều được chẩn đoán xác định bằng nhuộm Hematoxylin – Eosin (HE) thường quy, thuộc 1 trong các thể giải phẫu bệnh sau: carcinôm tuyến, carcinôm tế bào gai, carcinôm gai – tuyến và carcinôm tế bào lớn

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ: Ung thư phổi tế bào nhỏ hoặc ung thư phổi không tế bào

nhỏ nhưng bệnh phẩm sinh thiết có tỷ lệ tế bào ung thư dưới 30% trong tổng số tế bào quan sát được trên tiêu bản giải phẫu bệnh

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả loạt ca

2.2.2 Các bước thực hiện

Quy trình chung (Phụ lục 1): Tách chiết genomic DNA (từ mô vùi nến)  PCR  Tinh sạch sản phẩm PCR  Cycle sequencing  Kết tủa ethanol  Đọc trình tự DNA

tự động  Phân tích kết quả

Tách chiết genomic DNA: Bệnh phẩm là mô vùi nến đã dùng để chẩn đoán giải

phẫu bệnh Trường hợp là bệnh phẩm phẫu thuật, vùng mô ung thư được đánh dấu trên tiêu bản giải phẫu bệnh để phân biệt với vùng mô lành xung quanh (từ 5 – 10 tiêu bản), rồi được cạo vào tube ly tâm 1,5 mL bằng các lưỡi dao phẫu thuật riêng biệt Những trường hợp bệnh phẩm sinh thiết quá nhỏ không thể đánh dấu phân biệt vùng ung thư và

12

mô lành nên được thu toàn bộ vào tube ly tâm (đã được bác sĩ giải phẫu bệnh nhận định

có ít nhất 30% số tế bào ung thư) Xylene (Merck, Đức) được thêm vào tube ly tâm 2 lần

để khử nến, sau đó được rửa lại bằng ethanol tuyệt đối và để khô trước khi ủ với proteinase K (Invitrogen, Mỹ) trong dung dịch đệm ở 480C trong 14 – 16 giờ Tinh sạch sản phẩm DNA sau khi ủ proteinase K được thực hiện bằng phenol – chloroform (Invitrogen, Mỹ) Cuối cùng, kết tủa DNA bằng ethanol tuyệt đối trong muối NH4OAC DNA được pha loãng trong 25 – 50 µL nước cất và định nồng độ DNA bằng spectrophotometer

Khuếch đại các exon bằng PCR: Các đoạn mồi (Bảng 2.1) được thiết kế bằng

phần mềm Oligo 4.1 dựa trên trình tự chuẩn của EGFR mang accession number NG_007726 trong GenBank và của KRAS mang accession number NG_007524 Trong

mỗi tube PCR có tổng thể tích 50 µL, các thành phần gồm có PCR buffer, dNTP (250

µM cho mỗi loại), 2 loại mồi xuôi và ngược (0,5 µM cho mỗi loại), 1,25 unit TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản) và 20 ng genomic DNA Chu kỳ luân nhiệt được thực hiện trên máy GeneAmp® PCR system 9700 (Applied Biosystems, Mỹ) bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu ở 980C trong 2 phút, theo sau bằng 40 chu kỳ gồm biến tính ở 980C trong 10 giây, gắn mồi ở 600C trong 15 giây, tổng hợp chuỗi DNA ở

720C trong 1 phút và kết thúc bằng giai đoạn kéo dài sản phẩm ở 720C trong 5 phút Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 1,5% có nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới màn soi gel Pringraph (Atto, Nhật Bản) Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen, Mỹ) và được kiểm tra lại bằng điện

di trên thạch agarose 1,5% Trong mỗi đợt thực nghiệm luôn có một tube chứng âm, trong đó genomic DNA được thay bằng nước cất đã dùng để pha master mix

ASO-PCR (allele specific oligonucleotide PCR): Khuếch đại alen mang đột biến

DelE746_A750 của exon 19 và L858R của exon 21 được thực hiện bằng ASO-PCR với các cặp mồi đặc hiệu dựa theo Dahse và cộng sự(52) Cặp mồi dùng để phát hiện đột biến DelE746_A750 bao gồm mồi xuôi 19P (5-GTAACATCCACCCAGATCACTG-3’) bổ

13

sung với chuỗi DNA bình thường của intron 18 và mồi ngược 19B GTTGGCTTTCGGAGATGTTTTGATAG-3’) trên exon 19 có phần 3’ và 5’ ngăn cách nhau bởi 15 bp đã bị mất đi trong đột biến này Cặp mồi để phát hiện đột biến L858R gồm mồi xuôi 21P (5’-AGGGTCTTCTCTGTTTCAGGGCAT-3’) bổ sung với chuỗi DNA bình thường của vùng tiếp giáp intron 20 – exon 21 và mồi ngược 21B (5’-CGCACCCAGCAGTTTGGTTC-3’) đã được thay đổi 3 nucleotide ở đầu 3’ để cho phép chỉ khuếch đại alen đột biến Chu kỳ luân nhiệt cho cả hai phản ứng bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu ở 980C trong 2 phút, theo sau bằng 40 chu kỳ gồm biến tính ở 980

(5’-C trong 10 giây, gắn mồi ở 580

C trong 30 giây, tổng hợp chuỗi DNA ở 720C trong 40 giây

và kết thúc bằng giai đoạn kéo dài sản phẩm ở 720C trong 5 phút Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 1,5% có nhuộm ethidium bromide

Bảng 2.1: Các đoạn mồi dùng trong nghiên cứu

Tên mồi Trình tự (5’ - 3’) Exon được khuếch đại Sản phẩm PCR (bp)

Thực hiện giải trình tự chuỗi DNA: Sản phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ được

thực hiện phản ứng cycle sequencing với BigDye Terminator Version 3.1 từ Applied Biosystems (Mỹ), theo 2 chiều xuôi và ngược cho mỗi exon Sản phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan trong Hi-Di formamide, biến tính ở 950C trong 2 phút trước khi làm lạnh đột ngột Trình tự DNA được đọc bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer và capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ) Kết quả được phân tích

14

bằng phần mềm SeqScape, so sánh với trình tự tham chiếu của EGFR và KRAS để chẩn

đoán tình trạng đột biến của các exon Quy trình chẩn đoán đột biến gen được thực hiện tại Trung tâm Y Sinh học Phân tử, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh

Xử lý số liệu: Số liệu được nhập và xử lý bằng phần mềm SPSS 16.0 Phép kiểm

chi bình phương được sử dụng để so sánh tỉ lệ của biến số nhị giá ở hai nhóm Các giá trị

so sánh được coi là khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05

15

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Nội dung 1-3: Thiết lập quy trình chẩn đoán đột biến gen EGFR và KRAS 3.1.1 Tách chiết DNA từ mô vùi nến

Chúng tôi đã thiết lập quy trình sử dụng proteinase K để tách chiết genomic DNA

từ mô vùi nến Đây là giai đoạn rất quan trọng trong toàn bộ quy trình chẩn đoán đột biến gen Trong thời gian từ tháng 11/2010 – 11/2012, có 135 mẫu bệnh phẩm đã được sử dụng thành công cho việc tách chiết genomic DNA phù hợp để khuếch đại các exon cần nghiên cứu, bệnh phẩm được lưu trữ lâu nhất là 21 tháng Trong thực tế lâm sàng, thời gian lưu trữ bệnh phẩm ung thư phổi cho đến khi có nhu cầu cần được chẩn đoán đột biến gen để giúp quyết định điều trị thường chỉ vài tháng, đảm bảo cho tách chiết DNA bằng proteinase K có tỷ lệ thành công cao trong hầu hết các trường hợp

Kỹ thuật tách chiết DNA bằng proteinase K không đòi hỏi nhiều phương tiện tốn kém nhưng có một số điểm cần tuân thủ để đảm bảo kết quả chẩn đoán đột biến gen được chính xác:

+ Việc bảo quản và xử lý mô cần theo tiêu chuẩn nghiêm ngặt của chẩn đoán giải phẫu bệnh Bệnh phẩm được cố định trong formol 10% đệm trung tính Sau đó các mẫu

mô được xử lý bằng máy tự động Citadel hay Microm và đúc khối nến Cắt mỏng tiêu bản bằng máy Microm HM325 với độ dày 3 – 5 µm Việc sử dụng nến không đúng chất lượng ảnh hưởng đến quá trình khử bằng xylene, gây khó khăn cho việc tách chiết DNA

+ Việc thu hoạch được tế bào ung thư là khâu quyết định cho chẩn đoán chính xác đột biến gen bằng giải trình tự chuỗi DNA Tỷ lệ tế bào ung thư so với tế bào bình thường càng cao thì sản phẩm PCR có mang alen đột biến sẽ càng rõ khi phân tích trên hình ảnh giải trình tự Các trường hợp là bệnh phẩm phẫu thuật phải được khoanh vùng phân biệt mô u với mô lành trên tiêu bản nhuộm HE Sau đó vùng có tế bào ung thư từ 5 – 10 tiêu bản sẽ được thu hoạch vào tube ly tâm để tiến hành tách DNA Các bệnh phẩm sinh thiết chỉ được chọn khi có ít nhất 30% tế bào ung thư trong tiêu bản Như vậy, quá

3.1.2 Chuẩn hóa điều kiện PCR với các đoạn mồi đặc hiệu để khuếch đại các exon 18 – 21 của gen EGFR và exon 2 của gen KRAS

Khuếch đại thành công các đoạn gen đặc hiệu cần khảo sát đột biến là khâu quan trọng nhất trong toàn bộ quy trình chẩn đoán đột biến gen Hình 3.1 minh họa kết quả

điện di trên thạch agarose 1,5% sau khi khuếch đại các exon của EGFR và KRAS

Hình 3.1: Kết quả PCR (A) Vị trí các cặp mồi dùng để khuếch đại các exon của

gen EGFR (B) Kết quả điện di trên thạch agarose 1,5% các sản phẩm PCR

độ bắt cặp khác nhau Takara Taq TM

HotStart polymerase, Code No R007A (Takara, Nhật Bản) đã được tối ưu hóa các thành phần đệm của phản ứng trong buffer kèm theo Với mỗi cặp mồi, nhiệt độ bắt cặp được thử nghiệm bắt đầu từ 550C, tăng thêm 10

C nếu

có xuất hiện sản phẩm không đặc hiệu Qua quá trình chuẩn hóa, chúng tôi đã xác định được cả 5 cặp mồi đều cho sản phẩm đặc hiệu và hiệu quả khuếch đại tốt nhất (độ đậm của sản phẩm khi điện di kiểm tra sản phẩm) trong khoảng 58 – 600C

3.1.3 Tiến hành chẩn đoán đột biến gen bằng giải trình tự chuỗi DNA của các sản phẩm PCR

Các sản phẩm PCR sau khi đã được tinh sạch bằng QIAquick Gel Extraction kit đã được kiểm tra lại bằng điện di trên thạch agarose 1,5% Phản ứng cycle sequencing được thực hiện theo 2 chiều xuôi và ngược cho mỗi exon Hình 3.2 minh họa kết quả giải trình

tự DNA của exon 21 theo 2 chiều xuôi và ngược