Khảo sát đột biến gen BCR/ABL gây kháng imatinib trên bệnh nhân bệnh bạch cầu mạn dòng tuỷ (CML) bằng phương pháp giải trình tự chuỗi DNA

Các phức hợp này chứa paxillin và talin, vốn là những phân tử protein rất quan trọng cho tính bám dính của tế bào, giải thích được một số khiếm khuyết về sự dính của các tế bào BCMDT.. T

ỦY BAN NHÂN DÂN TP HCM SỞ Y TẾ TP HCM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BV TRUYỀN MÁU – HUYẾT HỌC

BÁO CÁO NGHIỆM THU

KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN BCR/ABL GÂY KHÁNG IMATINIB TRÊN BỆNH NHÂN BỆNH BẠCH CẦU MẠN DÒNG TỦY (CML) BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: BSCKII NGUYỄN THỊ HỒNG NGA

ĐỒNG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TS.BS PHAN THỊ XINH

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 01/2013

ỦY BAN NHÂN DÂN TP HCM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN BCR/ABL GÂY KHÁNG IMATINIB TRÊN BỆNH NHÂN BỆNH BẠCH CẦU MẠN DÒNG TỦY (CML) BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

(Ký tên)

CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ

(Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận)

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 01/2013

3

1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Yếu tố dịch tễ học và nguyên nhân của bạch cầu mạn dòng tủy

Bệnh bạch cầu mạn dòng tủy (BCMDT) chiếm 3% trong tổng số ung thư trên thế giới và chiếm 20% trong các bệnh bạch cầu ở người lớn Tại các nước Châu Âu, tỷ lệ mắc bệnh mới là khoảng 1/100.000 dân, nam mắc bệnh nhiều hơn nữ với tỷ lệ nam/nữ là 3/2 và thường gặp nhất ở lứa tuổi 40 đến 60 Đa số các trường hợp BCMDT thì không tìm được nguyên nhân Tuy nhiên, tiếp xúc với chất phóng xạ liều cao có thể làm tăng tỷ

lệ bệnh [4] Trong một số nghiên cứu trên nhóm người Nhật tiếp xúc với phóng xạ từ vụ

nổ bom nguyên tử tại thành phố Hiroshima và Nagasaki, và những phụ nữ bị ung thư cổ

tử cung được điều trị với tia xạ, thì tần suất mắc bệnh BCMDT cao hơn có ý nghĩa so với nhóm dân số không tiếp xúc với tia xạ

2 Sinh bệnh học của BCMDT

2.1 Nhiễm sắc thể Philadelphia

Thay đổi quan trọng nhất và trở thành đặc hiệu cho BCMDT là nhiễm sắc thể (NST) Philadelphia (NST Ph), là NST 22 có nhánh dài bị ngắn đi, được tạo ra do chuyển vị hỗ tương của nhánh dài NST 9 và nhánh dài của NST 22, gọi là t(9;22)(q34;q11) (Hình 1.1) NST Ph được tìm thấy trong tất cả các tế bào máu bao gồm cả tế bào B và tế bào T, và nó hiện diện trong suốt quá trình bệnh cả trong giai đoạn cấp NST Ph được tìm thấy trong hơn 90% bệnh nhân BCMDT, ngoài ra còn gặp trong khoảng 30% bệnh nhân bạch cầu

cấp dòng lympho (BCCDL) ở người lớn [25] và 3% BCCDL ở trẻ em [29]

2.2 Các tổ hợp gen BCR/ABL và protein BCR/ABL

Chuyển vị giữa nhánh dài NST 9 băng q34 và nhánh dài NST 22 băng q11 tạo ra

tổ hợp gen BCR/ABL mà exon 1 của ABL trên 9q34 được thay thế bằng những exon ở đầu 5’ của BCR (Hình 1.2) [18] Điểm gãy của gen BCR trên 22q11 gồm có 3 vùng là minor-

BCR (breakpoint cluster region), major-BCR và micro-BCR mà tùy vào vị trí điểm gãy

của BCR,những tổ hợp gen được tạo ra là e1a2, b2a2 hoặc b3a2, và e19a2 (Hình 1.2) mã

P210 BCR/ABL

der(9)

ABL/BCR gene ABL/BCR mRNA

No.9

ABL gene

6.0 kb 7.0 kb

Họat tính tyrosine kinase (-)

Hình 1.1: Chuyển vị nhiễm sắc thể t(9;22)(q34;q11) và các gen liên quan.

Bệnh nhân BCMDT chủ yếu có điểm gãy ở vùng major-BCR, tuy nhiên, một số ít trường hợp điểm gãy xảy ra ở vùng µ-bcr và bệnh cảnh của những bệnh nhân này thường

có tăng ưu thế neutrophil Khoảng 2/3 trường hợp BCCDL, và rất hiếm trường hợp

BCMDT và bạch cầu cấp dòng tủy có điểm gãy trên BCR ở vùng minor-BCR Khi đầu 5’ của ABL được thay thế bởi gen BCR trong tổ hợp p210BCR/ABL

thì hoạt tính men tyrosin

kinase của ABL tăng lên rất mạnh, làm khởi động nhiều đường truyền tín hiệu bất thường

trong tế bào như ras, myc, hoặc myb

b2 b3 a2 e1

b2 a2 e1

a2

b3a2 : b2a2 : 198bp

287bp 212bp

Major BCR/ABL mRNA

Minor BCR/ABL mRNA 1 2

3

2.2.1 BCR/ABL và sự truyền tín hiệu nội bào

Trên bệnh nhân BCMDT hoạt tính tyrosine kinase của p210BCR/ABL là yếu tố được chứng minh gây ra bệnh Protein p210BCR/ABL

tương tác với một số yếu tố của các con đường truyền tín hiệu, và gắn với hoặc phosphoryl hóa hơn 20 protein nội bào có vai trò sinh ung thư Sự tương tác của tiểu đơn vị phosphatidylinositol-3’-kinase (PI3K) với p210BCR/ABL thì cần thiết cho sự tăng sinh các dòng tế bào có BCR/ABL và tế bào BCMDT sơ khởi Các mối tương tác thông qua hoạt động BCR/ABL ảnh hưởng nhiều và

phức tạp đến sự phân bào do các protein kinase hoạt hóa [10] Ngoài ra, p210BCR/ABL điều hòa hoạt tính serine-threonine kinase do RAF mã hóa Giảm biểu hiện của RAF ức chế sự

tăng trưởng tế bào BCMDT phụ thuộc BCR/ABL và sự tăng sinh các tế bào gốc tạo máu

bình thường phụ thuộc yếu tố tăng trưởng [24] Khả năng chuyển dạng tế bào của

BCR/ABL liên quan tới các tín hiệu tyrosine kinase, mà nó được gọi là protein tiếp hợp

(adaptor protein), được truyền đến RAS Protein p210BCR/ABL hoạt hóa nhiều đường khác

nhau của RAS PI3K được hoạt hóa liên tục do BCR/ABL để tạo ra các lipid inositol và bị

rối loạn điều hòa bởi những polyinositol phosphate ức chế khối u bên dưới BCR/ABL như PTEN and SHIP1

CRKL là protein cầu nối, có tính tương ứng với sản phẩm sinh ung thư v- crk và làm trung gian cho các tín hiệu sinh ung thư của BCR/ABL Protein p210BCR/ABL có thể liên kết tự nhiên với paxillin qua CRKL và tạo ra các phức hợp protein truyền tín hiệu Các phức hợp này chứa paxillin và talin, vốn là những phân tử protein rất quan trọng cho tính bám dính của tế bào, giải thích được một số khiếm khuyết về sự dính của các tế bào BCMDT Các dòng tế bào có biểu hiện p210BCR/ABL có hoạt tính cơ bản JAKs và STATs, thường là JAK2 và STAT5 Cả ABL và BCR đều là các bộ phận điều hòa đa chức năng của họ protein gắn GTP Rho và protein gắn yếu tố tăng trưởng Grb2, mà các protein này gắn các tyrosin kinase với RAS và hình thành phức hợp với BCR/ABL và yếu tố biến đổi nucleotide Sos dẫn đến sự hoạt hóa của RAS [17] Ngoài ra, protein p210BCR/ABL cũng hoạt hóa Jun kinase và cần sự tham gia của Jun kinase cho sự chuyển dạng tế bào

4

Hình 1.3: BCR/ABL hoạt hóa các con đường truyền tín hiệu chủ yếu trong tế bào

2.2.2 Ảnh hưởng của BCR/ABL lên sự dính tế bào

Các tế bào có NST Ph dính với fibronectin và chất nền của tủy xương kém hơn các tế bào bình thường do khiếm khuyết chức năng của intergrin Protein p210BCR/ABL gắn với actin và một số protein khung tế bào, và tương tác với sợi actin qua vùng gắn với actin làm các chuyển động tự nhiên tăng lên, thay đổi màng tế bào, kéo dài sợi actin, tăng tốc

độ lồi ra và co lại của giả túc trên bề mặt fibrinonectin Các khiếm khuyết trong sự dính (tiếp xúc và cố định lại) của tế bào nguyên thủy BCMDT tách chúng ra khỏi các tín hiệu kiểm soát bình thường Các tín hiệu này được truyền từ tế bào vi môi trường qua cytokine, giữ cân bằng giữa sự sống và chết, sự tăng sinh và biệt hóa của tế bào Phosphoryl hóa không thích hợp các protein khung tế bào là yếu tố chủ yếu trong rối loạn chức năng integrin của tế bào BCMDT [17]

2.2.3 Ảnh hưởng của BCR/ABL lên sự chết theo chương trình

Protein p210BCR/ABL ức chế quá trình chết theo chương trình của tế bào bằng cách trì hoãn chuyển qua giai đoạn G2/M của chu kỳ tế bào khi có DNA hư hỏng Tuy nhiên, protein p210BCR/ABL không ngăn được sự chết theo chương trình ở các tế bào giết tự nhiên

vì nó được hoạt hóa qua lymphokin chống lại tế bào BCMDT hoặc các tế bào bình

( Nguồn: Lichman MA., 2006)

BCR/ABL

Tế bào tăng sinh

Bất thường sự kết dích của tế bào

Ức chế sự chết theo chương trình

BCR/ABL

Tế bào tăng sinh

Tế bào tăng sinh

Bất thường sự kết dích của tế bào

Ức chế sự chết theo chương trình

5

thường Trong giai đoạn tiến triển và chuyển cấp, tốc độ chết theo chương trình của tế bào chậm hơn G–CSF và GM–CSF làm giảm đáng kể tốc độ chết theo chương trình của

tế bào trong BCMDT thể bạch cầu đa nhân trung tính [17]

3 Chẩn đoán và phân giai đoạn BCMDT

Triệu chứng lâm sàng phát triển rất chậm và hầu hết bệnh nhân được phát hiện ở giai đoạn mạn Ngày nay, nhiều trường hợp được phát hiện sớm khi khám sức khỏe định

kỳ Lúc đầu, triệu chứng mơ hồ và không đặc hiệu Khoảng 70% bệnh nhân có triệu chứng lúc chẩn đoán và thường than phiền nhất là mệt mỏi, biếng ăn, sụt cân, giảm thể lực, ra mồ hôi nhiều, bệnh nhân cảm thấy khó chịu, căng tức ở hạ sườn trái và ăn mau no Khám lâm sàng có thể thấy bệnh nhân xanh xao và lách to

Chẩn đoán BCMDT dựa trên huyết đồ và tủy đồ Trên huyết đồ cho thấy số lượng bạch cầu tăng trong khoảng từ 20 x 109 /L đến hơn 500 x 109 /L với sự hiện diện tất cả các giai đoạn của quá trình biệt hóa bạch cầu hạt từ myeloblast đến segment neutrophil gọi là không có “khoảng trống bạch cầu”, ngoài ra tiểu cầu và bạch cầu ưa kiềm tăng, và

có thiếu máu đẳng sắc, đẳng bào nhưng hồng cầu lưới bình thường trong đa số trường hợp Tủy đồ cho thấy mật độ tủy giàu với tăng sinh dòng bạch cầu (tỷ lệ tế bào blast < 5%) và dòng mẫu tiểu cầu, dòng hồng cầu có thể tăng, bình thường hoặc đôi khi giảm Xác định chẩn đoán BCMDT khi có sự hiện diện của NST Ph hoặc có sự hiện diện của tổ

hợp gen BCR/ABL

Bệnh tiến triển qua ba giai đoạn: mạn, tiến triển và chuyển cấp

3.1 Giai đoạn mạn (Chronic phase)

Hầu hết được chẩn đoán ở giai đoạn này với các triệu chứng điển hình và tỷ lệ tế bào blast < 5% Đáp ứng rất tốt với hóa trị và dễ kiểm soát bằng các thuốc chống tăng sinh tủy Chất lượng cuộc sống không thay đổi nhiều Tử vong trong giai đoạn này rất hiếm, thường do nguyên nhân không liên quan bệnh bạch cầu hoặc do tác dụng phụ của các phương pháp điều trị bệnh bạch cầu

3.2 Giai đoạn tiến triển (Accelerated phase): chẩn đoán khi có một hoặc nhiều

triệu chứng sau đây:

6

+ Blast 10 – 19 % trong máu ngoại vi và/hoặc trong tủy xương

+ Bạch cầu đa nhân ưa kiềm 20 % trong máu ngoại vi

+ Giảm tiểu cầu kéo dài

+ Tăng kích thước của lách và số lượng bạch cầu mặc dù đang được điều trị + Tiến triển về di truyền tế bào

Một số trường hợp chuyển cấp sau vài tháng Một số khác có tiến triển chậm và phức tạp hơn Thời gian sống trung bình của bệnh nhân khoảng một năm

3.3 Giai đoạn chuyển cấp (Blast crisis): chẩn đoán khi có một hoặc nhiều triệu

chứng sau đây:

+ Blast 20% trong máu ngoại biên hay trong tủy

+ Có tăng sinh blast ngoài tủy

+ Kết tụ từng đám lớn tế bào blast trong tủy

Giai đoạn này có các biểu hiện của bệnh bạch cầu cấp Bệnh nhân thường bị nhiễm trùng, nhiễm nấm và xuất huyết do giảm bạch cầu đa nhân và tiểu cầu Thời gian sống trung bình của giai đoạn này khoảng 4 - 6 tháng Rất hiếm trường hợp sống trên một năm Có thể chuyển cấp dòng lympho (30%) hoặc dòng tủy (70%)

4 Các phương pháp điều trị và theo dõi điều trị:

Trong các phương pháp điều trị BCMDT kinh điển như sử dụng các thuốc Busulfan, Hydroxyurea, Aracytine và Interferon alpha hoặc dị ghép tủy xương thì chỉ có

dị ghép tủy xương là phương pháp duy nhất có khả năng chữa lành bệnh nhưng khó tìm người cho phù hợp và nhiều biến chứng nặng trong quá trình ghép có thể gây tử vong [3] Busulfan và Hydroxyurea không tạo ra lui bệnh Interferon alpha kết hợp với Aracytine liều thấp kéo dài thời gian sống toàn bộ nhưng đắt tiền và có nhiều tác dụng phụ Những nghiên cứu dựa trên nền tảng sinh học phân tử về cơ chế sinh bệnh trong những thập niên gần đây đã đạt được nhiều tiến bộ quan trọng, nhất là sự ra đời của Imatinib (IM) và BCMDT là mô hình đầu tiên của việc điều trị nhắm trúng đích phân tử

IM (biệt dược là Glivec hoặc Gleevec của công ty Novartis) là một chất có trọng lượng phân tử nhỏ, dẫn xuất của 2-phenylaminopyrimidine, có khả năng ức chế đặc hiệu

7

hoạt tính tyrosine kinase của protein BCR/ABL bằng cách cạnh tranh với ATP trong việc gắn vào protein này, vì vậy được dùng trong điều trị BCMDT [19] Năm 1998, IM được đưa vào điều trị BCMDT giai đoạn mạn đề kháng hoặc không dung nạp với interferon alpha cho tỷ lệ lui bệnh về mặt huyết học là 95% và đáp ứng cao về di truyền tế bào là 60% [15], trong khi đó ở nhóm bệnh nhân được điều trị bằng interferon alpha thì đáp ứng

về mặt huyết học là 70% và đáp ứng cao về di truyền tế bào sau 12 tháng chỉ 21% [11] Tháng 5 năm 2001, IM được FDA chấp thuận đưa vào sử dụng là phương pháp điều trị khởi đầu chuẩn cho những bệnh nhân BCMDT mới được chẩn đoán ở giai đoạn mạn Các tiêu chuẩn đáp ứng về mặt huyết học và di truyền được đánh giá theo bảng 1.1

Bảng 1.1: Các tiêu chuẩn đánh giá đáp ứng điều trị

Đáp ứng hoàn toàn về huyết học (CHR) Huyết đồ về bình thường

Đáp ứng tối thiểu (minimal) về di truyền tế bào 66–95% Ph+ metaphases

Đáp ứng thấp (minor) về di truyền tế bào 36–65% Ph+ metaphases

Đáp ứng một phần (partial) về di truyền tế bào 1–35% Ph+ metaphases

Đáp ứng hoàn toàn về di truyền tế bào(CCR) 0% Ph+ metaphases

Đáp ứng cao (major) về di truyền tế bào (MCR) 0–35% Ph+ metaphases

Đáp ứng cao về phân tử (MMR) Giảm ≥3-log của BCR-ABL mRNA Đáp ứng hoàn toàn về phân tử (CMR) Âm tính với RT-PCR

Theo kết quả nghiên cứu của IRIS (International Randomized Study of Interferon and STI571), với IM liều chuẩn là 400 mg mỗi ngày cho BCMDT giai đoạn mạn, tỷ lệ đáp ứng hoàn toàn về mặt di truyền tế bào là 69% sau 12 tháng và 87% sau 60 tháng và chỉ có khoảng 7% bệnh nhân chuyển sang giai đoạn tiến triển hoặc chuyển cấp trong 5 năm theo dõi [7] Trong một số nghiên cứu khác, bệnh nhân BCMDT giai đoạn tiến triển

và chuyển cấp được điều trị với IM 600 – 800 mg/ngày cho cho tỷ lệ đáp ứng tốt hơn hóa trị liệu Tỷ lệ đáp ứng về mặt huyết học và về mặt di truyền tế bào là 71% và 21% đối với BCMDT giai đoạn tiến triển [22], và 50% và 15% đối với BCMDT giai đoạn chuyển cấp [23]

8

5 Tình hình kháng IM

Sau điều trị IM một thời gian có khoảng 20% đến 30% bệnh nhân BCMDT giai đoạn mạn được phát hiện kháng IM Hiện tượng kháng IM được báo cáo đầu tiên vào năm 2000 Kháng IM được chia thành 2 nhóm là kháng nguyên phát và thứ phát Kháng

IM nguyên phát là không đạt được lui bệnh về mặt huyết học trong thời gian từ 3 đến 6 tháng tính từ lúc bắt đầu điều trị IM hoặc không đạt được bất kỳ lui bệnh về di truyền tế bào trong 6 tháng, hoặc không lui bệnh phần lớn về di truyền tế bào trong 12 tháng, hoặc không lui bệnh hoàn toàn về di truyền tế bào trong 18 tháng Kháng IM thứ phát là bệnh nhân có đáp ứng ban đầu với IM nhưng mất đáp ứng về mặt huyết học hoặc di truyền tế bào sau một thời gian dùng thuốc Ba cơ chế kháng IM được mô tả, trong đó có 2 cơ chế

liên quan trực tiếp đến gen BCR/ABL là những đột biến trên vùng tyrosine kinase domain

(chiếm 30 - 90% những trường hợp kháng IM tùy theo nghiên cứu) và tăng biểu hiện do

sự khuếch đại của gen BCR/ABL [1,5,13,31,9] Riêng cơ chế thứ ba thì ít được hiểu rõ

hơn, nó bao gồm tăng hoặc giảm điều hòa của những kênh bơm thuốc ra hoặc vào tế bào (drug efflux pumps and drug influx transporters), và tăng biểu hiện của những protein Lyn, Src-family kinase (SFK) [37] Trong 3 cơ chế trên, cơ chế chính gây ra kháng IM là việc phát hiện những đột biến gen tại vùng ATP-binding domain nằm trong phần ABL

Cho đến nay, hơn 100 vị trí và 136 loại đột biến của gen ABL được báo cáo, trong đó đột

biến ở nhóm bệnh nhân kháng IM thứ phát (57%) cao gần gấp đôi ở nhóm kháng IM nguyên phát (30%) [31] Trong 136 kiểu đột biến được phát hiện, có 16 kiểu đột biến

thường gặp chiếm đến 86,5% như bảng 1.2

Các đột biến trong vùng kinase domain của BCR/ABL thường gây kháng TKI Cơ

chế gây kháng thứ phát thường được mô tả nhất là sự xuất hiện các đột biến điểm, biểu hiện bởi sự thay thế một axit amin trong vùng kinase domain, làm giảm khả năng gắn kết thuốc Tỷ lệ các đột biến rất khác biệt tuỳ thuộc vào phương pháp phát hiện đột biến, bản chất đột biến và giai đoạn bệnh[28] Đột biến T315I tạo một liên kết hydro với IM gây ra

do thay thế một axit amin với một isoleucine lớn hơn, làm cho IM không gắn kết bên trong với ổ gắn kết ATP T315I là một trong những đột biến thường gặp nhất ở những

9

bệnh nhân điều trị với IM, xảy ra khoảng 4-19% các trường hợp [12,32] và kháng với tất

cả thuốc ức chế ABL kinase

Bảng 1.2: Các kiểu đột biến kháng IM thường gặp

Axit

(Guidelines for Mutation Analysis of BCR/ABL Kinase Domain, WMRGL, 2007)

Bốn nhóm đột biến liên quan đến kháng IM là: (1) vị trí gắn kết IM, (2) quai P (vị trí gắn kết ATP); (3) domain xúc tác và (4) quai A hoạt hoá (axit amin 379 – 398) (Hình 1.4) Đột biến ở vị trí phosphate (quai P, từ axit amin 244 đến 255 của ABL) chiếm tỷ lệ 48% trong tất cả đột biến kháng IM, làm mất ổn định cấu trúc cần thiết cho sự gắn kết

IM, có tiên lượng xấu dù còn nhạy với IM Đột biến quai P có tiên lượng xấu hơn so với

3 phân nhóm còn lại [31,5], tuy nhiên một số nghiên cứu khác đã không chứng minh điều này có lẽ do sự khác biệt trong cách chọn bệnh nhân Nhóm đột biến ở domain xúc tác từ axit amin 350 đến 363 của ABL tác động đến việc gắn kết của IM Quai hoạt hoá của ABL kinase là thành phần điều hoà chính của kinase domain Đột biến quai hoạt hoá dẫn đến kháng thuốc do thay đổi cấu hình cần thiết cho hoạt tính của IM Tuy nhiên, thay thế axit amin thường xảy ra ở 7 vị trí M244V, G250E, Y253F/H, E255K/V (quai P), T315I

10

(vị trí gắn kết IM), M351T, F359V (domain xúc tác) chiếm khoảng 85% trong tất cả đột biến [31]

Hình 1.4: Các kiểu đột biến BCR/ABL gây kháng IM trong BCMDT

Cơ chế kháng thuốc của M351 được xác định khi tương tác ABL SH2 domain và M351 được thực hiện trong các nghiên cứu Phá vỡ tương tác này biến kinase thành dạng hoạt hoá khiến cho IM không gắn lên được Một số đột biến có thể gây ra kháng IM tương đối do chỉ làm giảm khả năng gắn kết IM lên ATP-binding domain như M237I, M244V, G250A, V299L, F311L, T315A, F317V, M351T, Y353H, E355G, E355A, F359C, V379I, L387F, M388L, và E450K, nên bệnh nhân vẫn còn có đáp ứng với điều trị nếu được tăng liều IM Trái lại, có một số đột biến gây ra kháng IM tuyệt đối vì đã làm thay đổi hoàn toàn cấu hình protein, khiến cho thuốc không còn khả năng gắn lên ATP-binding domain như L248V, G250E, Y253H, Y253F, E255V, E255K, D276G, E279K, T315I, G321E, E373G [31] Trong trường hợp này, bệnh nhân cần phải được thay đổi điều trị bằng những tyrosine kinase inhibitor thế hệ sau như dasatinib hay nilotinib (Hình 1.5) hoặc dị ghép tủy

( Nguồn: Soverini S, Blood 2011;118(5):1208-15)

11

Hình 1.5: tương quan giữa đột biến BCR/ABL và tình trạng kháng thuốc

6 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Theo thống kê từ tháng 1/2008 đến tháng 6/2010 tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TPHCM, BCMDT chiếm tỷ lệ 5,73% trong bệnh lý của hệ tạo máu và chiếm 22,75% trong ung thư máu cấp và mạn, được xếp thứ 3 sau ung thư máu cấp dòng lympho và dòng tủy, với khoảng 150 trường hợp bệnh mới được chẩn đoán hằng năm Trong một nghiên cứu tiến hành trên 48 bệnh nhân BCMDT Việt Nam, chúng tôi ghi nhận tỷ lệ NST

Ph dương tính là 91,5%, tương đương số liệu của các nghiên cứu khác trên thế giới [26]

Ngoài ra, một số nghiên cứu khác tại TP Hồ Chí Minh và Hà Nội đánh giá đáp ứng điều trị BCMDT giai đoạn mạn bằng hydroxyurea đơn thuần hoặc phối hợp với ly

(Borrow J, West Midlands Regional Genetics Laboratory 2007)

Tăng liều imatinib

Kháng matinib Điều trị dasatinib Điều trị nilotinib

Thử nghiệm LS với MK-0457

(Borrow J, West Midlands Regional Genetics Laboratory 2007)

Tăng liều imatinib

Kháng matinib Điều trị dasatinib Điều trị nilotinib

Thử nghiệm LS với MK-0457

chưa có khảo sát đột biến BCR/ABL nên khi có tình trạng kháng IM trên lâm sàng thì các

bác sĩ quyết định tăng liều IM lên 600 mg đến 800 mg/ngày cho tất cả các bệnh nhân nên chỉ có một số bệnh nhân đáp ứng (theo bảng 1.2 thì 3 kiểu đột biến T315, E255 và Y253 chiếm đến 32,1% đều không đáp ứng với tăng liều IM)

13

CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng

Bệnh nhân chẩn đoán BCMDT được điều trị với IM và có biểu hiện kháng IM nguyên phát hay thứ phát tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học Tp Hồ Chí Minh trong giai đoạn từ 08/2010 đến 09/2012

2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu

Tất cả bệnh nhân BCMDT được điều trị bằng IM và có biểu hiện kháng IM nguyên phát hay thứ phát:

- Kháng IM nguyên phát:

+ Không đạt được lui bệnh về mặt huyết học trong thời gian từ 3 đến 6 tháng tính từ lúc bắt đầu điều trị IM

+ Không đạt được bất kỳ lui bệnh về di truyền tế bào trong 6 tháng

+ Không lui bệnh phần lớn về di truyền tế bào trong 12 tháng

+ Không lui bệnh hoàn toàn về di truyền tế bào trong 18 tháng

- Kháng IM thứ phát: Bệnh nhân có đáp ứng ban đầu với IM (đạt lui bệnh hoàn toàn về mặt huyết học trong vòng 3 tháng, đạt lui bệnh hoàn toàn về di truyền tế bào trong 6 tháng, 12 tháng hoặc 18 tháng) nhưng mất đáp ứng về mặt huyết học hoặc di truyền tế bào sau một thời gian dùng thuốc

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ

Bệnh nhân hoặc thân nhân không đồng ý tham gia nguyên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả loạt ca

14

Tách chiết RNA: Lấy 2 ml tủy xương từ gai chậu hoặc 5 ml máu ngoại biên trong

chất chống đông EDTA và vận chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 6 giờ ở nhiệt độ phòng Nếu mẫu để lâu hơn 6 giờ, thì giữ mẫu ở 4oC nhưng không được quá 12 giờ Tách chiết RNA từ tủy xương hoặc máu ngoại biên bằng RNeasy mini kit của QIAGEN Mẫu RNA được lưu trữ ở -80oC cho đến khi sử dụng, tối đa là 12 tháng Phần mẫu còn lại sau khi tách chiết RNA sẽ được xử lý bằng dung dịch red blood cell lysis buffer để loại bỏ hồng cầu và lưu trữ trong Sepazol, ở -80oC Tổng hợp cDNA từ RNA sử dụng men sao chép ngược SuperScriptTM

II Reverse Transcriptase kit của Invitrogen, sau đó, kiểm tra

chất lượng cDNA bằng cặp mồi trên gen ABL

Khuếch đại BCR/ABL bằng PCR: Các đoạn mồi (Bảng 2.1) được thiết kế bằng

phần mềm Oligo 4.1 dựa trên trình tự chuẩn mang accession number NM_007313.2

(Isoform b), NM_005157.4 (Isoform a) của ABL và mang accession number NM_004327.3 của BCR trong GenBank Trong mỗi tube PCR có tổng thể tích 20 µL, các

thành phần gồm có PCR buffer, dNTP (250 µM cho mỗi loại), 2 loại mồi xuôi 230FL và mồi ngược R1 (0,5 µM cho mỗi loại), 1,25 unit TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản) và 40 ng cDNA Chu kỳ luân nhiệt được thực hiện trên máy GeneAmp® PCR system 2720 (Applied Biosystems, Mỹ) bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu ở 980

C trong 2 phút, theo sau bằng 40 chu kỳ gồm biến tính ở 980C trong 10 giây, gắn mồi và tổng hợp chuỗi DNA ở 680C trong 2 phút và kết thúc bằng giai đoạn kéo dài sản phẩm ở 720C trong 5 phút Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 1,2% có nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới màn soi gel Pringraph (Atto, Nhật Bản) Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen, Mỹ) và được kiểm tra lại bằng điện di trên thạch agarose 1,2% Trong mỗi đợt thực nghiệm luôn có một tube chứng âm, trong đó cDNA được thay bằng nước cất đã dùng để pha master mix