Chức năng: dự trữ các enzyme thủy phân, polyphosphate, ion kim loại, các sản phẩm trao đổi chất trung gian, điều hòa áp suất thẩm thấu của tế bào.. Tất cả điều đó dẫn đến sự thay đổi lớn
Trang 1Chương I: Tổng quan lý thuyết
1.1 Tổng quan về nấm men Saccharomyces cerevisiae.
Saccharomyces cerevisiae là một loài nấm men được biết đến nhiều nhất, có
trong bánh mì nên thường gọi là men bánh mỳ, là một loại vi sinh vật thuộc chi
Saccharomyces lớp Ascomycetes ngành nấm Nó được dùng rộng rãi trong quá
trình lên men làm bánh mỳ, rượu, bia, một số khác dùng để sản xuất glyxerol hoặc enzyme invertase
1.1.1 Đặc điểm hình thái và cấu tạo của nấm men:
1.1.1.1 Hình thái:
Tế bào nấm men có dạng hình cầu, hình ovan, elip, hình trụ, hình chùy, hoặc cũng có thể là hình sợi Hình dạng và kích thước của nó có thể thay đổi tùy vào từng giai đoạn phát triển và điều kiện môi trường xung quanh Nó có kích thước tương đối lớn, đường kính khoảng 1µm, chiều dài 8 µm Tế bào nấm men lớn gấp
10 lần tế bào vi khuẩn
Hình 1.1 Nấm men Saccharomyces cerevisiae
Trang 21.1.1.2 Cấu tạo:
Cấu tạo của tế bào nấm men phức tạp hơn của tế bào vi khuẩn Tế bào nấm men
Saccharomyces cerevisiae được bao bọc bởi lớp thành tế bào.
Thành tế bào: Cấu tạo chủ yếu của thành tế bào là hemixenlulo chiếm 70%
trọng lượng khô ( 31% manan, 29% glucan) Ngoài ra nó còn chứa 1-3% kitin, 6-10% protein, 8-8,5% lipit và 7% chất khoáng Chức năng của thành tế bào là bảo
vệ và duy trì hình dạng của tế bào Thành tế bào của nấm men còn có khả năng kết dính, chính vì vậy mà nó còn có ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp sản xuất rượu vang, bia
Màng tế bào chất: Dưới lớp thành tế bào là lớp màng tế bào chất, là lớp màng
mỏng, dày 0,1 nm, dính chặt với tế bào chất Cấu tạo chủ yếu là protein (chiếm 50% khối lượng khô), phần còn lại là lipit (40%) và 1 số ít polysaccarit
Hình 1.2 Cấu tạo chung của tế bào nấm men
Chức năng của màng sinh chất:
Bảo vệ, hàng rào thẩm thấu
Điều chỉnh chất dinh dưỡng từ ngoài vào trong và ngược lại
Thực hiện tổng hợp thành phần của vỏ tế bào
Nơi khu trú của 1 số enzyme và bào quan
Trang 3Tế bào chất: ở thể keo được cấu tạo từ protein, lipit, khoáng và nước (90%)
và các hợp chất khác Có độ nhớt cao và chứa các bào quan
Màng nhân: có cấu tạo 2 lớp và trên màng có nhiều lỗ nhỏ Lỗ màng nhân
tham gia vào việc kiểm tra quá trình trao đổi chất của tế bào
Nhân: chứa thông tin di truyền DNA được bao bọc bởi 1 lớp màng, bên trong
là lớp dịch nhân, trong đó có 1 thể rắn gọi là hạch nhân hay nhân con Kích thước nhân không đồng đều ở các chủng nấm men và ngay cả cùng 1 chủng
Không bào: chứa đầy dịch tế bào, bên ngoài được bao bọc bởi một lớp màng
hypoprotein gọi là màng không bào Chức năng: dự trữ các enzyme thủy phân, polyphosphate, ion kim loại, các sản phẩm trao đổi chất trung gian, điều hòa áp suất thẩm thấu của tế bào
Hạt dự trữ: là chất dự trữ các chất dinh dưỡng của tế bào, tham gia vào việc
điều hòa quá trình sinh trưởng, phát triển của tế bào
Ty thể: dạng hạt nhỏ hoặc hình que, dạng sợi Hình dáng thay đổi trong quá
trình nuôi cấy Số lượng ty thể dao động mạnh từ 1-50 Hầu hết các phản ứng năng lượng đều xảy ra ở đây Cấu trúc của ty thể biến đổi khi nấm men chuyển từ điều kiện kị khí sang hiếu khí Ở môi trường kị khí không có lipit thì ty thể rất đơn giản gồm 2 lớp màng và không có nếp gấp Nếu thêm lipit thì sẽ tạo nếp gấp
Ty thể cung cấp năng lượng cho tế bào hoạt động Khoảng cách giữa các lớp là nơi xảy ra phản ứng tạo thành ATP
Ribosom: cấu tạo 2 loại hạt 80s tồn tại tự do, hạt 70s liên kết với cấu trúc
màng Ribosom tham gia mọi quá trình tổng hợp các chất trong cơ thể
1.1.1 Đặc tính sinh sản của nấm men:
Nấm men có nhiều hình thức sinh sản ( sinh sản vô tính, sinh sản hữu tính) Bình thường, tế bào nấm men sinh sản nảy chồi, khi gặp điều kiện không thuận lợi,
1 số có thể sinh sản theo cách tạo bào tử
Sinh sản vô tính: nảy chồi là cách sinh sản vô tính điển hình của nấm men Khi
tế bào phát triển đến mức độ nhất định thì cơ thể của nó đâm ra 1 chồi nhỏ gọi là mầm (hay chồi) Mầm sinh ra ở vị trí lệch tâm trên đầu của tế bào mẹ Ở mỗi chồi
sẽ nhận được 1 phần chất nhân và chất nguyên sinh ở tế bào mẹ Sauk hi nảy mầm,
tế bào con có thể tách ra khỏi tế bào mẹ sống độc lập, cũng có thể không tách khỏi
tế bào mẹ mà tiếp tục nảy mầm tạo ra 1 lớp tế bào nấm men giống hình cành cây Nấm men còn có khả năng hình thành bào tử Bào tử được sinh ra trong những túi nhỏ gọi là túi nang
Trang 4Sinh sản hữu tính: là hình thức hợp nhất 2 tế bào nấm men thành hợp tử Tế
bào này phát triển thành túi trong đó có giảm nhiễm để hình thành các bào tử.Dạng sinh sản hữu tính ở nấm men là dạng các bào tử túi được sinh ra từ các túi Có thể xảy ra sự tiếp hợp giữa 2 tế bào nấm men tách rời hoặc giữa tế bào mẹ và chồi Còn có cả sự biến nạp trực tiếp trong 1 tế bào sinh dưỡng Tế bào này biến thành túi không qua tiếp hợp Thường trong mỗi túi có 4 hay đôi khi có 8 bào tử túi
Quá trình sinh sản nấm men Saccharomyces cerevisiae liên quan chặt chẽ đến sự
nảy chồi Chồi tách khỏi tế bào mẹ khi có kích thước bằng tế bào mẹ và bắt đầu sinh sản Thời gian thế hệ chu kỳ sinh sản được tính là khoảng thời gian giữa 2 lần phân chia Và thời gian thế hệ của nấm men này là 2h Quá trình nảy chồi diễn ra đồng thời với bắt đầu tổng hợp DNA Từ chồi mới hình thành các vật liệu mới của
tế bào lớn dần lên, hình thành vách ngăn mannan, glucan
1.2 Tổng quan về quy trình lên men bia.
1.2.1 Nguyên liệu:
Nước là thành phần chính của bia ( chiếm từ 80%-90%) Nhiều loại bia chịu
ảnh hưởng hoặc thậm chí được xác định theo đặc trưng của nước trong khu vực sản xuất bia Nước cứng phù hợp hơn cho sản xuất các loại bia sẫm màu trong khi nước mềm là phù hợp hơn cho sản xuất các loại bia sáng màu như bia vàng
Malt là sản phẩm được chế biến từ các loại hạt hòa thảo như đại mạch, ngô v.v.
sau khi cho nảy mầm ở điều kiện nhân tạo và sấy đến độ ẩm nhất định với điều kiện bắt buộc
Malt là một loại bán thành phẩm và giàu chất dinh dưỡng: 16 – 18% chất thấp phân tử dễ hòa tan hệ enzyme đặc biệt phong phú, chủ yếu là amylaza vàproteaza Malt cung cấp toàn bộ lượng glucid (chủ yếu dưới dạng tinh bột) để chuyển hóa thành đường, và từ đường chuyển hóa thành cồn và các chất khác
Malt chứa đầy đủ enzyme amilaza để thủy phân tinh bột Nếu sử dụng thế liệu nhiều thì lượng enzym này cung cấp không đầy đủ và ta buộc phải bổ sung enzym
từ bên ngoài vào, chủ yếu là enzyme từ vi sinh vật
Malt cung cấp khá đủ lượng protein và có chứa hệ enzyme proteaza để thủy phân chúng Trong giai đoạn ươm mầm, hệ enzyme này được hoạt hóa mạnh mẽ Khi chuyển sang giai đoạn nấu, chúng thủy phân protein tạo thành các phức chất
có khả năng giữ CO2 tốt, tạo vị bia đặc trưng
Hoa bia trong sản xuất bia chỉ sử dụng hoa cái chưa thụ phấn.
Trang 5Men bia là các vi sinh vật có tác dụng lên men đường Các giống men bia cụ
thể được lựa chọn để sản xuất các loại bia khác nhau, nhưng có hai giống chính là
men ale (Saccharomyces cerevisiae) và men lager (Saccharomyces uvarum), với
nhiều giống khác nữa tùy theo loại bia nào được sản xuất Men bia sẽ chuyển hóa đường thu được từ hạt ngũ cốc và tạo ra cồn và CO2
1.2.2 Cơ sở hóa học của lên men bia.
Khi tiến hành lên men dịch đường houblon hóa tạo thành rượu etylic, khí CO2,
và các sản phẩm phụ Ngoài gluxit bị tác động mạnh, các thành phần khác của dịch đường cũng chịu những thay đổi lớn Một phần bị nấm men đồng hóa, biến đổi thành những hợp chất khác nhau, còn một số khác thì chuyển đổi thành trạng thái không hòa tan và bị tách ra ngoài dưới dạng kết lắng Tất cả điều đó dẫn đến sự thay đổi lớn về lượng và biến đổi sâu sắc về chất trong các cấu tử hợp thành chất hòa tan của dịch đường
Ta thấy rằng hàm lượng chất hòa tan trong bia là thấp hơn so với dịch đường houblon hóa Nguyên nhân của việc giảm này là từ ba lý do sau:
Do nấm men tiêu tốn một phần để cung cấp năng lượng cho việc phát triển sinh khối
Do một số sản phẩm tạo thành là hỗn hợp dễ bay hơi
Do một phần bị kết lắng
Tổng lượng chất hòa tan đã bị tiêu hao trong thời gian lên men chính gọi là chất
chiết đã lên men.
Khối lượng chất chiết đã lên men biểu thị bằng phần trăm so với lượng chất hòa
tan ban đầu của dịch đường gọi là mức độ lên men hay độ lên men.
Một phần chất hòa tan ban đầu của dịch đường houblon hóa tồn tại trong bia
như là 1 cấu tử hợp thành chất hòa tan của nó gọi là chất chiết không lên men hay
chất khô sót.
Trong thành phần của chất hòa tan ban đầu của dịch đường nấm men có thể hấp
thụ được 1 phần rất lớn, phần đó gọi là chất chiết có khả năng lên men.
Phần còn lại nấm men không có khả năng hấp thụ gọi là chất chiết không có
khả năng lên men.
Trang 6Khối lượng của chất chiết có khả năng lên men biểu thị bằng phần trăm theo
lượng chất chiết ban đầu của dịch đường houblon hóa gọi là độ lên men cuối
cùng.
Độ lên men và độ lên men cuối cùng của các loại bia khác nhau dao động trong
những khoảng rất lớn Đây là những chỉ số cơ bản và đặc trưng cho chủng loại và chất lượng của bia Những chỉ số này có thể điều chỉnh được thông qua việc điều khiển các quá trình hóa sinh ở giai đoạn sản xuất dịch đường
Về lý thuyết thì toàn bộ lượng chất chiết có khả năng lên men, có thể sẽ được lên men hoàn toàn Lúc đó độ lên men sẽ có giá trị bằng độ lên men cuối cùng Nhưng trong thực tế sản xuất, không bao giờ độ lên men của một dịch đường lại có thể đạt đến độ lên men cuối cùng của nó Vấn đề ở đây là hoàn thiện chu trình lên men, xác định được các điều kiện ở mức tối ưu với mục đích cao nhất là giảm đến mức thấp nhất sự sai lệch giữa 2 chỉ số độ lên men đó Và đây là 1 trong những tiền đề quan trọng nhất để thu nhận được các loại bia có độ bền sinh học cao
1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men.
Chất lượng của nấm men sản xuất: là yếu tố đầu tiên để bia đạt chất lượng
cao
Lượng nấm men gieo cấy ban đầu: liên quan mật thiết đến tiến trình lên men.
Nồng độ chất hòa tan của dịch đường houblon hóa: ảnh hưởng rất lớn đến sự
phát triển của nấm men và tốc độ lên men
Nhiệt độ của dịch lên men: ảnh hưởng khá mạnh đến lên men Nếu nhiệt độ
cao sẽ tăng hiệu suất quá trình và rút ngắn thời gian Chú ý mỗi loại nấm men đều
có nhiệt độ thích hợp nên phải lựa chọn thích hợp để không vượt qua giới hạn đó
Áp suất bề mặt: ảnh hưởng trực tiếp đến các quá trình công nghệ như lượng
sinh khối tạo thành, trạng thái sinh lý nấm men cũng như xác định mức bão hòa CO2
Hàm lượng O2 và thế oxi hóa khử: ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ sinh sản
của nấm men và lượng sinh khối tạo thành đồng thời là yếu tố tác động mạnh đến tốc độ suy giảm đặc tính công nghệ của nấm men
Cường độ khuấy đảo dịch lên men: yếu tố mạnh, đẩy nhanh quá trình lên
men
Trang 7Nồng độ của sản phẩm lên men: ở nồng độ nhất định sẽ bắt đầu ức chế hoạt
động sống của tế bào nấm men Khả năng chịu đựng độ cồn của các nấm men khác nhau thì khác nhau phụ thuộc vào khả năng thích ứng cũng như trạng thái sinh lý
1.3 Tổng quan về quy trình cố định nấm men
1.3.1 Định nghĩa:
Kỹ thuật cố định tế bào được định nghĩa: “Kỹ thuật bao bọc hoặc định vị các tế bào còn nguyên vẹn trong 1 vùng không gian nhất định nhằm bảo vệ các hoạt tính xúc tác mong muốn” (Karel và cộng sự, 1975)
Kỹ thuật cố định tế bào bắt đầu được nghiên cứu sâu rộng từ những năm 70 của thế kỷ trước Nhiều chất mang cũng như kỹ thuật mới đã được nghiên cứu và áp dụng nhằm mở rộng và phát triển các ứng dụng của tế bào cố định
1.3.2 Ưu và nhược điểm của nấm men cố định.
1.3.2.1 Ưu điểm:
Có thể tái sử dụng nhiều lần
Sản phẩm sạch, giảm chi phí tinh sạch
Bền với môi trường nhờ sự bảo vệ của chất mang
Tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách sinh khối ra khỏi môi trường lên men, đơn giản hóa quá trình tách sinh khối và thu sản phẩm lên men
Dễ điều khiển mật độ tế bào trong thiết bị lên men
Điều chỉnh hình dạng kích thước phù hợp với thiết bị
Thực hiện được quá trình lên men liên tục mà tế bào ít bị rửa trôi
Hạn chế được ảnh hưởng của các vi sinh vật tạp lên tế bào
Tăng khả năng chống lại các điều kiện bất lợi của môi trường lên tế bào như sự thay đổi về nhiệt độ, pH, áp suất thẩm thấu hay sự xuất hiện các chất ức chế trong môi trường lên men
Giảm chi phí, giá thành
1.3.2.2: Nhược điểm:
Hoạt lực tế bào thấp hơn tế bào tự do, vì tế bào tiếp xúc với cơ chất phải thông qua chất mang, nên việc trao đổi chất diễn ra khó khăn hơn
Vận tốc phản ứng chậm vì cơ chất và sản phẩm phải thông qua chất mang để trao đổi
Trang 8Sự phát triển sinh khối bên trong chất mang có thể phá hỏng cấu trúc của nó, làm cho tế bào bị rửa trôi ra khỏi chất mang Khi đó việc tách và thu nhận sản phẩm sẽ khó khăn
Một số chất mang và phương pháp cố định có thể làm ảnh hưởng đến hoạt tính của tế bào
Cấu trúc của chất mang có thể ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của tế bào với môi trường
1.3.3 Chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào.
1.3.3.1 Yêu cầu chất mang:
Có tính trơ cao (bền hóa học), không bị hòa tan, không tác dụng với những sản phẩm thứ cấp sinh ra trong dịch
Bền sinh học (không bị vi sinh vật phá hủy)
Tính chất cơ lý bền vững, ổn định để chịu tác động môi trường
Có độ xốp để quá trình trao đổi chất được thực hiện dễ dàng
Không gây ức chế hay làm mất hoạt tính enzyme của vi sinh vật
Có khả năng bám dính tốt, dễ gắn vi sinh vật vào
An toàn với môi trường
Không cạnh tranh với cơ chất
Phù hợp hình dạng thiết bị
Rẻ tiền, dễ tìm
1.3.3.2 Phân loại:
Có 2 loại chất mang:
Chất mang tự nhiên: tinh bột, cellulose, agar, alginate,…
Chất mang nhân tạo: polyme từ mủ cao su, poly srtiren, poly acetae,…
Trang 91.3.4 Kỹ thuật cố định trong tế bào.
1.3.4.1 Phương pháp cố định vi sinh vật trên bề mặt chất mang
Phương pháp gắn tế bào lên bề mặt chất mang:
Vật liệu: thủy tinh xốp, cellulose, than, các oxit kim loại, đất hiếm, cao lanh… Nguyên tắc thực hiện:
Thông qua các liên kết cộng hóa trị (giữa nhóm amin và nhóm cacboxyl), liên kết tĩnh điện giữa bề mặt mang điện tích, lực Vanderwalls Các phương pháp gắn này cụ thể dựa trên các nguyên tắc sau:
Gắn tế bào bằng liên kết ion: dựa vào sự tích điện trái dấu giữa tế bào và chất mang
Gắn tế bào bằng liên kết cộng hóa trị: có thể xảy ra 2 trường hợp:
Trường hợp 1: chất mang có chứa các nhóm có thể tham gia trực tiếp với nhóm amin của protein vi sinh vật
Trường hợp 2: phải hoạt hóa chất mang bằng cách gắn lên chất mang những chất có khả năng phản ứng Tiếp đó là tạo liên kết giữa các nhóm trên chất mang với tế bào vi sinh vật
Ưu nhược điểm của phương pháp này là có thể tạo được những liên kết hóa học mạnh giữa tế bào và chất mang Tuy nhiên, để tạo ra các mối nối đồng hóa trị này thường tốn công và mắc tiền
Phương pháp hấp phụ:
Vật liệu: sử dụng các chất có hoạt tính bề mặt mạnh như cellulose, agarose, polyacrylamide, chitin, nylon, thủy tinh,…
Nguyên tắc thực hiện: dựa vào cơ chế hấp phụ, có thể xảy ra những trường hợp sau:
Trường hợp 1: chất mang có nhiều lỗ xốp, tế bào vi sinh vật bám vào các lỗ xốp
và toàn bộ bề mặt chất mang
Trường hợp 2: đối với chất mang không có lỗ xốp (thủy tinh) tế bào sẽ bám trên
bề mặt chất mang
Trang 10Trường hợp 3: khi chất mang tích điện (nhựa trao đổi ion) chúng sẽ tạo liên kết ion
Phương pháp thực hiện: tế bào vi sinh vật được phối trộn với chất mang trong môi trường lỏng, khuấy trộn trong điều kiện thích hợp, sau đó rửa bã để loại bỏ phần tế bào vi sinh vật dư
Ưu nhược điểm của phương pháp này là dễ thực hiện, đơn giản Tuy nhiên liên kết vậy lý này rất yếu nên vi sinh vật dễ tuột khỏi chất mang
1.3.4.2 Phương pháp nhốt tế bào trong cấu trúc gel
Vật liệu: có thể sử dụng những loại sau:
Ion gel: các polymer mà tế bào gắn kết với nhau tạo thành mạng lưới bằng liên kết ion
Covanlent gel: polymer gắn kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị, tạo thành mạng lưới
Non- covanlent gel: polymer gắn với nhau thường bằng liên kết hydro
Cryogel: là cấu trúc gel polymer mới được tạo bởi phương pháp lạnh đông các tiểu phần polymer có phân tử lượng cao hay thấp
Alginate là vật liệu lấy từ rong biển, có khả năng tạo gel tốt, rất tốt để bao gói enzyme hay tế bào
Nguyên tắc thực hiện: trong hệ gel, các polymer sẽ tạo thành mạng lưới bao bọc
tế bào Mạng lưới có lỗ nhỏ đến mức tế bào không thể ra ngoài, nhưng đủ lớn để
cơ chất và sản phẩm chui vào Đối với chất mang tạo liên kết ion, ta trộn chung huyền phù tế bào và hỗn hợp chất mang đa điện tích và dung dịch đa điện tính trái dấu
Với chất mang polymer như covanlent: trộn huyền phù tế bào vi sinh vật với các monomer rồi đem trùng hợp, hoặc trộn chung với polymer tạo liên kết giữa các sợi polymer
Gel alginate được tiến hành như sau: đầu tiên gel alginate được đun sôi để nguội đến 30oC Sau đó, khuấy trộn alginate và huyền phù tế bào tỉ lệ 1:1, khuấy
