Phát hiện tần suất thiếu hụt G6PD ở dân tộc Tày và dân tộc Nùng bằng phương pháp bán định lượng Formazan

Glucose 6 phosphatdehydrogenase (G6PD) là một enzym ôxy hoá khử, là một enzym then chốt trong quá trình chuyển hoá Glucose theo con đường Hexose monophosphate trong hồng cầu.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Glucose 6 phosphatdehydrogenase (G6PD) là một enzym ôxy hoá khử, làmột enzym then chốt trong quá trình chuyển hoá Glucose theo con đườngHexose monophosphate trong hồng cầu Con đường này chỉ tạo ra năng lượngkhông đáng kể (10%glucose tham gia vào con đường này) nhưng lại đảm nhiệmhai chức năng quan trọng là cung cấp ribose cho quá trình sinh tổng hợp cácnucleotid, acid nucleic và đặc biệt tạo ra một chất khử vô cùng quan trọng làNADPH Chất này có khả năng chống lại tác nhân gây oxy hóa, loại bỏ H202,giúp bảo vệ cho màng hồng cầu đựơc bền vững, bảo vệ cấu trúc củaHemoglobin, cấu trúc của các enzym có trong hồng cầu để duy trì sự sống cho

tế bào hồng cầu

Bệnh thiếu hụt G6PD là một trong những bệnh lý hay gặp nhất của hồngcầu Cơ sở di truyền học của bệnh này là đột biến gen nằm trên đầu mút tậncùng nhiễm sắc thể X ở đoạn q với các dạng đột biến khác nhau (nhưGâoh,Viangchan ) Các dạng đột biến khác nhau có thể tạo những mức độ thiếuhụt G6PD khác nhau và gây ra những biểu hịên lâm sàng khác nhau Đây làbệnh di truyền gen lặn liên kết nhiễm sắc thể giới tính X không có alen tươngứng trên Y nên gặp nhiều ở nam hơn ở nữ,bệnh mang tính di truyền do đó biểuhiện khác nhau ở những dân tộc khác nhau Các nghiên cứu gần đây cho thấynhững biểu hiện lâm sàng của bệnh cũng đa số xuất hiện do sử dụng các biệnpháp điều trị như thuốc hay sử dụng thức ăn có tính oxy hoá, do vậy ở vùnglãnh thổ khác nhau do tập quán sinh hoạt, thói quen và đặc điểm bệnh tật khácnhau nên tỷ lệ thiếu hụt của enzym này cũng thay đổi Việt Nam là một trongnhững nước nằm trong bản đồ thiếu hụt G6PD, với tỷ lệ mắc bệnh tương đốicao

Thiếu G6PD thường có những biểu hiện tan máu gây vàng da, đái huyếtsắc tố, thiếu máu, suy thận cấp và trường hợp nặng là tử vong Bệnh xuất hiệnkhi tiếp xúc với các tác nhân gây oxy hoá như vi sinh vật, hoá chất (thuốc, thực

phẩm) Người bình thường với số lượng và chất lượng G6PD đảm bảo thì khitiếp xúc với hàm lượng cao chất oxy hoá thì vẫn có khả năng sản xuất ra đủNADPH để loại bỏ tác động của chúng và sẽ không có những biểu hiện lâmsàng trên Trưòng hợp thiếu hụt nặng enzym thì hay gây ra những cơn tan máucấp kể cả khi sử dụng rất ít chất õy hoá, nhưng cũng có trưòng hợp do sử dụngmột lượng chất oxy hoá tuy ít nhưng kéo dài sẽ dẫn đến hiện tưọng không đủenzym để tham gia quá trình khử, đây chính là hiện tượng thiếu enzym thứ phát.Bởi vậy việc phát hiện ra sự thiếu hụt G6PD là rất quan trọng Qua sự pháthiện bằng những phưong pháp định tính, định lượng chúng ta có thể biết đượcmức độ suy giảm để có được kế hoạch điều trị cũng như cách thức sinh hoạthợp lý nhằm hạn chế thấp nhất sự biểu hiện của bệnh Sử dụng phương phápbán định lượng tạo vòng Formazan với ưu điểm nhanh chóng, đơn giản sẽ giúpcho chúng ta phát hiện được sự thiếu hụt này một cách đồng loạt và có hiệuquả.

Tôi tiến hành làm khoá luận tốt nghiệp về đề tài:

"Phát hiện tần suất thiếu hụt G6PD ở dân tộc Tày và dân tộc Nùng bằng phương pháp bán định lượng Formazan."

Với hai mục tiêu sau đây:

- Đánh giá các điều kiện của phản ứng Formazan.

- Sử dụng kỹ thuật bán định lượng Formazan để phát hiện tần suất thiếu hụt G6PD ở dân tộc Tày và Nùng.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Những hiểu biết về G6PD:

1.1.Đại cương:

G6PD được Warburg và Christan phát hiện năm 1931 ở hồng cầu ngưạ,động vật, vi sinh vật, men bia và hồng cầu người Năm 1936 G6PD đã đượcnghiên cứu và tiến hành chiết suất làm sạch nhưng phải 25 năm sau mới thànhcông Bước đầu nghiên cứu enzym đã đựơc tìm hiểu về cấu trúc phân tử, dạng

có hoạt tính sinh học, các dạng biến thể của enzym Quá trình tách chiết enzym

ra khỏi hồng cầu cũng ngày càng đạt được độ tinh sạch cao hơn, trải qua cácbước như điện di, phương pháp sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực độ tinh sạchcủa enzym đã đạt đựơc tới 1448,2 lần [2] Cùng với sự phát triển của sinh họcphân tử các dạng đột biến của G6PD ngày càng được phát hiện nhiều, cácphương pháp phát hiện thiếu hụt từ định lượng, định tính, bán định lượng, testnhanh ngày càng được phát triển chính xác hơn và áp dụng rộng rãi hơn trongcộng đồng

1.2.Cấu trúc:

Cấu trúc bậc một (monomer): là chuỗi polypeptid gồm 515 acid amin

liên kết với nhau bằng những liên kết peptid (nhóm cacboxyl(-C00H) của acidamin trước sẽ liên kết với nhóm amin (-NH2) của acidamin sau bằng cách chungnhau mất đi một phân tử nước) Trọng lượng phân tử của enzym nặng 59265Daltons Trình tự acid amin đã được giải mã, tính đồng nhất của trình tự nàythay đổi tuỳ theo từng vùng Vùng có tính đồng nhất cao được cho là vùng cóchức năng quan trọng (hay còn gọi là trung tâm hoạt động) của enzym, ở ngườivùng này thuộc acidamin 188-291

Cấu trúc bậc cao hơn:

G6PD có cấu trúc không gian là pôlymer, đó là các dạng dimer, tetramer,hexamer Dạng cấu trúc không gian mới đảm bảo cho enzym hoạt động được.Trong hồng cầu người thì dạng dimer chiếm ưu thế hơn Các cấu trúc bậc 1, bậc

cao hơn có sự chuyển dạng lẫn nhau tuỳ vào điều kiện của môi trường, như ở

pH thấp thì chủ yếu là dạng tetramer, pH gần trung tính thì là dạng dimmer, ở

pH trung tính thì hai dạng đó gần bằng nhau G6PD là một enzym không đồngnhất và đa dạng phân tử, bằng phương pháp hoá sinh WHO đã mô tả có 442dạng khác nhau [1,3]

Chu trình Hexomonophosphate ( pentosephosphat)

Sự oxy hóa glucose theo con đường Hexomonophosphate xảy ra ở các

mô song song với con đường đương phân song chiếm tỉ lệ thấp hơn nhiều 10%) Tuy nhiên ở một số tế bào như: hồng cầu, gan, tuyến mỡ, tuyến sữa thời

(7%-kì hoạt động Sự thoái hóa glucose theo con đường này chiếm ưu thế xảy ratrong phần dịch bào của tế bào

+ G6P được tạo ra qua sự phosphorin hóa Glutathion dưới tác dụng của enzymHexokinase

+ G6P bước vào con đường Pentose qua 2 giai đoạn:

Giai đọan 1: khử cacboxyl oxy hóa G6P thành pentose phosphat, quá trình nàytạo ra NADPH2 ở một số tổ chức con đường pentose dừng tại đây và phươngtrình tổng quát là:

G6P + 2NADP+ + H2 O > R5P + CO2 + 2NADPH + 2H

NADPH dùng cho các phản ứng sinh tổng hợp, còn R5P là tiền chất tổng hợpNucleotid

Giai đoạn 2: biến hóa tiếp tục của pentose phosphat có sự vận chuyển các đơn

vị 2C hoặc 3C dưới tác dụng của các enzym tương ứng là fructose 6 phosphat

và 1 phân tử phospho glyconat:

6 G6P + 12NADP+ + 6 H2 O > 5G6P +12 NADPHH+ + 6CO2 + PiĐây là giai đoạn oxy hóa ở những tổ chức cần nhiều NADPH hơn R5Pthì các pentose phosphat được đi vào chu trình biến hóa thành G6P để tiếp tụcoxy hóa nhờ sắp xếp lại khung C mà 6 phân tử pentosephosphat trở thành 5Hexo phosphat

NADPH+ H+

Ribulose-5-phosphat

Phosphopentose isomerase

D-Ribose-5-phosphat ( 5C)

Hình 2: giai đoạn 1 của chu trình Hexomonophosphate

Hình 4: Sơ đồ hoạt động của G6PD

Thông qua quá trình photphoryl hóa tạo thành G6P qua xúc tác của G6PD đểtạo ra sản phẩm 6PG đồng thời tạo thành NADPH từ NADP+ là chất cung cấp

H+ để khử Glutathion dạng oxy hóa thành dạng khử thông qua enzymGlutathion reductase để từ đó trực tiếp bảo vệ hồng cầu chống lại các tác nhângây oxy hóa ngoài ra còn khử MetHb thành Hb do đó tránh được sự biến tínhHb.Nếu không đủ G6PD thì lượng NADPH không đủ dẫn đến màng hồng cầudiễn ra quá trình peroxy hóa lipit dẫn đến hiện tượng vỡ hồng cầu gây ra tanmáu và Hemoglobin sẽ bị kết tủa thành thể Heinz

1.4.Các yếu tố ảnh hưởng đến cấu trúc và hoạt động sinh lý của G6PD:

Một số tính chất chung của enzym:

Enzym là những chất xúc tác sinh học bản chất là prôtêin do cơ thể sốngsinh ra nhờ đó mà các phản ứng hóa học trong cơ thể sống xảy ra với tốc độ rấtnhanh trong điều kiện sinh lý bình thường: nhiệt độ, áp suất không cao, pH môitrường gần như trung tính Có những enzym chỉ là những prôtêin đơn thuầnnhưng cũng có những enzym có thành phần cấu tạo gồm có 1 thành phần làprôtêin đơn thuần (Apoenzym) và một thành phần là chất hữu cơ đặc biệt (chấtcộng tác cofactor hay coenzym)

Ngoài ra còn cần đến sự có mặt của các ion kim loại trong cấu trúc củaenzyme, là thành phần để liên kết enzym và cơ chất, liên kết apoenzym vàcoenzym Vị trí diễn ra phản ứng của enzym là trung tâm hoạt động có tính chấtđặc hiệu đối với từng cơ chất cấu trức và hoạt tính của enzym chịu tác động củarất nhiều yếu tố khác như: nhiệt độ, pH muối kim loại nặng, chất hoạt hóa và ứcchế hay các dung môi hữu cơ như rượu, axeton Mỗi một cơ chất enzym cómột Km xác định, đây chính là hằng số Michailis-Menten: là nồng độ của cơchất (mol/lit) đủ làm cho tốc độ phản ứng enzym đạt tới một nửa tốc độ cực đại

(Vmax) Km thể hiện ái lực của enzym tới cơ chất Km càng nhỏ thì ái lực cànglớn và ngược lại

Có 6 loại enzym: enzym oxy hoá -khử (oxidoreductase), enzym vậnchuyển nhóm (Transferase), enzym thuỷ phân (Hydrolase), enzym phân cắt(lyase), enzym chuyển đồng phân (Isomerase), enzym tổng hợp (Ligase) G6PD

là enzym oxy hoá khử

Những điều kiện ảnh hưởng đến hoạt động của G6PD:

+ Nhiệt độ: enzym bắt đầu biến tính nhẹ từ 40C, đến 60C thì hoạt tính củaenzym còn lại không đáng kể

+ Độ pH: pH kiềm nhẹ sẽ làm cho nồng độ dạng dimer nhiêù và enzym

sẽ hoạt động tốt nhất, bởi vậy có mặt một lượng nhỏ NaHCO3 sẽ giúp enzymphản ứng tốt hơn pH tối ưu của G6PD là 8,0 [2]

+ Nồng độ của của các chất nội bào như cơ chất, cofactor, chất tạo thành:tuân theo quy luật của các phản ứng hoá học khác Sự trùng hợp của enzym từdạng monomer sang dạng dimer và các cấu trúc bậc cao hơn cần có sự có mặtcủa NAPD+, chất vừa là cơ chất vừa là cofator Mỗi dimer có 2 vị trí gắnNADP+, đó là NADP+ xúc tác, gắn lỏng lẻo và dễ dàng bị khử thành NADPH,còn lại là NAPD+ chức năng gắn chặt chẽ hơn cần thiết để duy trì cấu trúc hoạtđộng của enzym

+Khi ở ngoài cơ thể thì để đảm bảo cho enzym hoạt động được tốt thì vấn

đề bảo quản là hết sức quan trọng G6PD là một enzym mất nhạy cảm, khôngbền vững, nhưng nếu hồng cầu được rửa và bảo quản nguyên vẹn trong dungdịch NaCl 0,9% ở nhiệt dộ lạnh (40C) ngay sau 24h thì hoạt độ enzym chưa bịthay đổi Trái lại chỉ bảo quản theo tiêu chuẩn máu thì sau 24h sẽ giảm 17%hoạt tính

+Ion Mg2+ là ion đặc hiệu cho hồng cầu người, với nồng độ 0,01 mol/l thìhoạt độ enzym là 100%[2], theo nghiên cứu thì ion kim loại này đóng vai tròtạo phức hợp giữa enzym và cơ chất

1.5 Cơ sở di truyền học của G6PD

Gen quy định cấu trúc của G6PD nằm trên nhánh dài, locus q28 của nhiễmsắc thể X (vùng 2, băng 8) không có alen tương ứng trên Y Vùng 2 là vùngmang thông tin di truyền mã hóa khá nhiều tính trạng khác như: nhìn màu,hemophilia A

Gen G6PD gồm có 13 exon và 12 intron Dài khoảng 18,5 kilobases Chứcnăng của từng exon khác nhau, và kích thước của các exon mã hóa thay đổi rấtnhiều từ 38 - 236 bp Trong đó exon 1 không mã hoá [12], exon 6 mã hoá sảnphẩm là nơi gắn cơ chất G6P [6] mARN G6PD gồm 2269 ribonucleotid, mRNA của G6PD có một đoạn đầu 3' không mã hóa dài 655 bp và đoạn đầu 5'không mã hóa dài 69 bp

Gen G6PD có sự điều hòa và kiểm soát chặt chẽ Vùng promotor của G6PDkéo dài khoảng 300 nucleotid giầu GC và nhiều GC không bị methyl hóa

2 Bệnh lý thiếu hụt G6PD

2.1.Cơ chế bệnh sinh và cơ sở di truyền học:

2.1.1 Cơ chế bệnh sinh :

Giảm G6PD sẽ giảm lượng Glutathione dạng khử không đủ để khử HbH

2O2 tạo thành Met Hemoglobin và Choleglobin do đó Hemoglobin bị biến tính

và kết tủa thành thể Heinz [2][9]

Cơ chất tạo ra là NADPH còn có tác dụng bảo vệ nhóm -SH (nhóm chứcnăng hoạt động) của enzym phosphoglyceral-dehydrogenase, đây là 1 enzymquan trọng trong chuỗi phản ứng xúc tác NAD+ thành NADH (một chất khửquan trọng chống lại sự ôxy hóa của hồng cầu [2])

Ngoài ra giảm NADPH dẫn đến hồng cầu phải sử dụng nhiều NADH2làmgiảm lượng ATP cần thiết và lượng Na+ trong tế bào bị ứ đọng, nước vào tronghồng cầu nhiều cộng với sự bền vững của màng hồng cầu bị yếu dẫn đến hồngcầu bị hủy hoại

2.1.2 Bệnh lý gen học của thiếu hụt G6PD:

Giảm G6PD là bệnh di truyền gen hoặc nằm trên nhiễm sắc thể X khôngalen tương ứng trên Y do vậy tỷ lệ bị bệnh gặp ở nam giới là nhiều hơn vàthường nặng hơn.

Nam giới XY: giả sử a là gen quy định tính trạng giảm G6PD sẽ có kiểu

gen là XaY: ở nam giới chỉ cần người alen a ở X là có biểu hiện bị bệnh

XaXa: biểu hiện kiểu hình thiếu nặng nhưng tần suất gặp kiểu gen này rấtnhỏ

Gen cấu trúc đột biến sẽ bây biến đổi về mặt chất lượng ngược lại gen điềuhòa bị đột biến gây thiếu G6PD về mặt số lượng, nhưng biến đổi ở intron khônggây biến đổi cấu trúc và sản lượng G6PD Hoạt tính G6PD phụ thuộc vào cảchất lượng và số lượng

Ngày nay đã phát hiện được hơn 140 dạng đột biến khác nhau đại diện cho

442 biến thể khác nhau có tính chất đặc hiệu và phân biệt bằng các chỉ số sinhhóa Do 1 axit amin có thể được quy định bởi người bộ ba nên có khi 2 biến đổikhác nhau trên AND chỉ gây nên một loại đột biến Ví dụ như:

- Dạng đột biến Aaches: đột biến nucleotid 1089C -> G

- Dạng đột biến Loma Linda: 1089C -> A hai loại này đều làm thay đổi

acid amin 363 Asn -> Lys

Dựa vào hoạt độ của enzym trong hồng cầu và những bệnh nhân lâm sàngcủa chúng, WHO đã chia các biến thể của thiếu hụt G6PD ra làm 4 lớp:

+ Lớp 1: thiếu enzym nặng với biểu hiện thiếu máu tan máu, hồng cầuhình không trò người mạn tính

+ Lớp 2: Thiếu G6PD nặng (hoạt độ enzym < 10% so với bình thường + Lớp 3: Thiếu G6PD vừa đến nhẹ.

(Hoạt độ từ 10 - 60% so với bình thường)

+ Lớp 4: thiếu rất nhẹ hoặc không thiếu G6PD (60 - 100%)

Tuy vậy nhưng sự phân biệt này là không rõ ràng giữa các phân lớp

Lớp 1, lớp 2 là gây nguy hiểm nhất vì thường có tan máu cấp diễn

Hiện nay ở Việt Nam đã tìm thấy được các dạng đột biến khác nhau, trong

đó có một dạng không làm ảnh hưởng đến sự mã hóa acid amin trong cấu trúcG6PD đó là dạng Silent tồn tại dạng còn lại đều là những dạng hay gặp ở cácdân tộc châu Á Dạng Silent xuất hiện là do đột biến thay nucleotid C thànhnucleotid T dẫn đến bộ ba mã hoá TAC chuyển thành TAT vẫn mã hoá acidamin Tyrosin, đây cũng chính là một ví dụ cụ thể biểu thị tính bảo thủ củathông tin di truyền

B ng 1: M t s d ng ảng 1: Một số dạng đột biến G6PD gặp ở Châu Á ột số dạng đột biến G6PD gặp ở Châu Á ố dạng đột biến G6PD gặp ở Châu Á ạng đột biến G6PD gặp ở Châu Á đột số dạng đột biến G6PD gặp ở Châu Á t bi n G6PD g p Châu ến G6PD gặp ở Châu Á ặp ở Châu Á ở Châu Á Á

STT Dạng độtbiến Vị trí biến đổi Acid amintương ứng

4 Chinese - 5 9 1024 C -> T 342 leu - > Phe

7 Kaiping 12 1388 G -> A 463 Arg -> His

8 Silent 11 1311 C -> T TAC -> ATA -> Tyrosil

2.2 Dịch tế học.

Năm 1996 Blood Ernest Beutler đã phát hiện có 400 triệu người thiếu máuG6PG gặp ở tất cả các dân tộc Việt Nam nằm trong vùng có tỉ lệ thiếu hụtG6PD khác nhau tùy từng vùng và tùy từng dân tộc

Theo nghiên cứu của tác giả Đoàn Hạnh Nhân thiếu G6PD hồng cầu, có tỉ

lệ cao tại một số vùng Sốt Rét Kim Bôi (34,1%), Mai Châu (20,4%), Như Xuân(19,7%), tỷ lệ thiếu lại thường thấp ở nơi không có lưu hành bệnh sốt rét ở dântộc Mường (tỉ lệ cao nhất 31%) tiếp đến là dân tộc Thổ (19,3% dân tộc Thổ, dântộc Thái 19,3%) rất thấp ở dân tộc kinh 0,5%.

Hình 5: phân bố thiếu hụt G6PD trên thế giới

2.3 Biểu hiện lâm sàng

Thường biểu hiện khi tiếp xúc với chất oxi hóa đó là những cơn tan máu.Primaquine là một loại thuốc có tính o xi hoá cao nhưng rất hay được sử dụngtrong điều trị sốt rét vì đây là thuốc duy nhất được sử dụng để diệt thể ẩn tronggan với bệnh nhân nhiễm P.vivax và thể giao bào với bệnh nhân nhiễmP.falciparum [6]

Tùy thuộc vào dạng thiếu hụt G6PD tùy vào tính chất hay nồng độ củatính chất hay nồng độ của các chất oxi hóa sẽ dần dần tan máu nhiều hay ít từ

Bilirubin glucuronid (trực tiếp)

Bài tiết xuống ruột

Stercobiline, urobilinogen

Hình 6: Sơ đồ chuyển hoá của bilirubin.

Vàng da sơ sinh có hai loại là sinh lý và bệnh lý Vàng da sinh lý thường diễn

ra trong ba ngày đầu và kết thúc tối đa là 10 ngày, mức độ vàng da nhẹ, hiện tưọngnày là do sự suy giảm nhất thời chức năng chuyển hoá bilirubin của gan do tăng quátrình táI hấp thu bilirubin tại ruột, tăng thấm vào tổ chức Trong khi đó chất này đượcsản sinh hàng ngày ở giai đoạn sơ sinh nếu tính trên cân nặng lớn gấp đôi ngườilớn.Vàng da bệnh lý thấy xuất hiện khi nồng độ bilirubin trong máu cao hơn20mg/dl Hậu quả nghiêm trọng của bệnh lý này là vàng nhân não Trẻ sơ sinh

sẽ có biểu hiện là những cơn tăng trương lực cơ, xoắn văn, mất các phản xạ sơsinh, ngừng thở tím tái và rất dễ tử vong Nếu trẻ qua khỏi thì sẽ để lại những

di chứng nặng nề như rối loạn ngoại tháp (múa vờn, múa giật, rối loạn ngônngữ…) hoặc bất thường thính lực, thị giác và thiểu sản phát triển răng Vàng da

nhân não ảnh hưởng đến khả năng phát triển tinh thần và vận động của trẻ Việcphát hiện ra bệnh lý này không khó và việc đIệu trị có kết quả rất nhanh chóng

và dễ dàng bằng phương pháp chiếu đèn, thuốc làm giảm nồng độ bilirubintrong máu và hiệu quả nhất là phương pháp chiếu đèn Nhưng nếu để lâu,Bilirubin đã ngấm và các nhân xám của não thì sẽ để lại hậu quả nặng nề khôngthể hồi phục lại được do tổn thương các tế bào thần kinh như đã nêu trên

Thiếu G6PD như một yếu tố nguy cơ dẫn đến vàng da bệnh lý Do đó việcphát hiện thiếu hụt G6PD sẽ giúp cho quá trình phát hiện những triệu chứngnặng giúp cho quá trình theo dõi tốt hơn tránh bỏ sót đáng tiếc

Tỷ lệ vàng da dẫn đến vàng nhân não ở nước ta còn rất cao Năm 1996 2000: tại Viện Nhi Trung ương tỷ lệ này khoảng 25%, tại bệnh viện Nhi Đồng Ithành phố Hồ Chí Minh phát triển từ 147 trường hợp (1995) đến 238 trườnghợp (1997)

-Ở những trẻ em bị thiếu hụt G6PD thì Bilirubin huyết thanh cao hơn đáng

kể so với nhóm chứng, cao hơn vào ngày thứ 3 sau sinh Loại thiếu hụt G6PDlớp 3 thường biểu hiện vàng da sau sinh Ví dụ: G6PD Aures thường gây vàng

da với đột biến cao Thiếu G6PD được di truyền đồng thời với đột biến genVGI1A1 (Gilbert) thì nguy cơ cao dẫn đến vàng da nhân

2.3.2 Tan máu do dùng thuốc và do sử dụng một số thực phẩm.

Ernet Beutler phát hiện ra hiện tượng tan máu sau khi nghiên cứu một sốbệnh nhân sử dụng thuốc chống sốt rét là Primaquin Sau đó qua nghiên cứungười ta đã khám phá ra rằng không chỉ pnimaquin mà sau sử dụng một sốthuốc khác cũng gây nên hiện tượng tan máu: Aspirin (thuốc giảm đau),Procainamide (thuốc điều trị bệnh tim mạch), DDS (diệt khuẩn) Triệu chứngtan máu dẫn đến vàng da thường xảy ra vào ngày thứ 2,3 sau khi dùng thuốc.Ngoài ra hiện tượng tan máu còn được biết đến sau khi bệnh nhân sửdụng một số loại thức ăn có tính oxi hóa cao như long não, rượu vang đỏ, các

sản phẩm từ đậu tương, đậu nành và đặc biệt là các loại đậu Fava dẫn đến hộichương Favism.

Hội chứng favism: là bệnh lý thiếu máu tan máu đã được biết đến từ thời

Pythagoras Người ta nhận thấy rằng sau khi ăn đậu Fava, thì một số người24giờ sau có thể xuất hiện hiện tượng tan máu có khi rất dữ dội Sau đó nhiềunghiên cứu cho thấy rằng tình trạng này liên quan đến thiếu hụt G6PD Đa sốcác trường hợp xảy ra ở những cá thể thiếu G6PD nặng nhưng đôi khi cũng thấy

ở thiếu hụt nhẹ Ngược lại cũng có trường hợp thiếu mà không có bệnh sinh lýsau khi ăn đậu Fava Trong đậu Fava thành phần liên quan trực tiếp gây ra hiệntượng tan máu là glucosidevicine và dividine Aglycone của chúng được thaythế bởi prymidune đến tổn thương oxi hóa cho xu hướng oxi hóa tự phát ởnhững bệnh nhân này thường thấy Hemoglobin niệu trong vài ngày

Về sau phát hiện được người do có giảm G6PD Giảm G6PD nhẹ thườngbệnh sinh lý nhẹ hơn do chỉ ở những hồng cầu già (do khối lượng enzyen G6PD

ở hồng cầu non) Ở bệnh nhân nặng thì cả những hồng cầu non cũng không có

đủ hàm lượng G6PD, không có khả năng tự bảo vệ trước các tác nhân oxi hóagây nên hiện thượng tan máu nặng dẫn đến đái ra huyết sắc tố có thể gây viêmthận hay suy thập cấp mà biểu hiện lâm sàng là thoạt đầu có đái đỏ, về sau đauvùng thắt lưng hố thận dẫn đến vô niệu

Các triệu chứng cận lâm sàng của bệnh nhân: Hemoglobin giảm dần đếnngày 7 - 8 sau đó phục hồi dần đến ngày thứ 10 xuất hiện thể Heinz gắn trên bềmặt hồng cầu đó là phần Protein và Hemoglobin bị biến chất gắn vào mànghồng cầu gây nên hình thái bất thường của hồng cầu và dẫn đến tan máu

Hình7: Đậu fava

2.3.4.Các triệu chứng khác:

Tan máu do nhiễm trùng – đái tháo đường

Quá trình nhiễm trùng thường kích hoạt tan máu Đái tháo đường giai đoạntoàn phát sẽ khởi phát những đợt tan máu ở bệnh nhân

Tan máu mạn tính hồng cầu hình không tròn di truyền.

Năm 1958 người ta tìm thấy rằng thiếu G6PD cũng có thể dẫn đến tan máumạn tính Loại tan máu này thì thường không xảy ra ở những loại đột biến haygặp như G610A - G6PD med nhưng lại hay gặp ở những đột biến có tần suấtxuất hiện nhỏ

2.4 Biểu hiện cận lâm sàng

2.4.1 Ở cơn tan máu cấp

Xét nghiệm máu: hồng cầu giảm, Hematocrit giảm, Hemoglobin giảm, soi

hồng cầu không cần nhuộm phát hiện được thể Heinz Chính những tế bào nàychỉ nhìn thấy sau cơn tan máu cấp sau đó nó sẽ rời tuần hoàn nhanh, không nhìnthấy sau 3 - 4 ngày, có vài tế bào đoạn và đã nhiễm sắc (hồng cầu lớn xanhnhạt), có tế bào lưới (thường không đáng kể), 5 - 15% Định lượng bilirubin qua

da, trong máu tăng

Xét nghiệm nước tiểu: Hemoglobin niệu (+), trụ hồng cầu (-)

2.4.2 Kỹ thuật tế bào:

Nghiên cứu sâu hơn bằng xét nghiệm hồng cầu có thể phát hiện 2 dònghồng cầu ở những người nữ dị hợp tử định lượng erzym ở 2 dòng hồng cầu thấykhác nhau, một dòng thiếu hoàn toàn, một dòng không thiếu hoàn toàn đó là kếtquả của hiện tượng bất hoạt nhiễm sắc thể Ví dụ: Ditk Roos nghiên cứu mộtbệnh nhân thiếu G6PD Vonledam đã phát hiện 94% hồng cầu hoạt độ G6PDbằng không và 6% hồng cầu còn lại thì hoạt độ chỉ còn 5% so với bình thường

2.5 Chẩn đoán.

- Dịch tễ và tiền sử: trẻ bịcác bbệnh nhiễm trùng,đẻ non ,thiếu thánggia

đình đã có trẻ bị vàng da,hay trong vùng sốt rét,vùng có tỷ lệ thiếu hụtG6PD,hay sau khi sử dụng một số thuốc và thực phẩm có tính oxy hoá.

- Lâm sàng

- Cận lâm sàng

- Chẩn đoán nguyên nhân:

Cụ thể như do thiếu hụt G6PD, định lượng G6PD bằng phưong phápquang phổ hấp thụ, bán định lượng như phương pháp Formazan hay test nhanh.Việc định lượng G6PD ngay khi tan máu, lượng hồng cầu non và lưới chiếmkhá cao những tế bào này có hoạt động enzym cao hơn tế bào già Vì vậy xétnghiệm cần phải được trì hoãn sau đợt tan máu đến khi mức enzym thấp xuốngrồi mới xét nghiệm đến chẩn đoán Tuy vậy có nghiên cứu cho rằng dù vậy thìG6PD cũng không đạt được tới mức bình thường

Ngoài ra có thể sử dụng kỹ thuật phân tích gen (phương pháp PCR) đểphát hiện được nguyên nhân và dạng đột biến gen từ đó có hướng tiên lượng và

dự phòng Tuy độ chính xác của kỹ thuật này cao nhưng lại tốn kém

3.1.Các mức độ phát hiện thiếu hụt G6PD:

Phương pháp định tính:

Phương pháp phát quang (Beutler và Mitchelt-1968), phương pháp đượctiến hành bằng cách lấy máu từ đầu ngón tay sau đó dùng thuốc chống đông.Trộn đều máu đã chống đông bằng dung dịch đã chuẩn bị sẵn gồm NADP vàG6P, sau đó nhỏ vào giấy Whatman số 1 vào thời điểm 0 phút, 5 và 10 phút Đểkhô, đọc kết quả dưới ánh sáng đèn cực tím Nếu hàm lượng G6PD đủ thì cácgiọt dung dịch và máu sẽ phát quang và không phát quang khi không đủ lượngG6PD Đây là một phương pháp đã được uỷ ban quốc tế về các tiêu chuẩn tronghuyết học đề nghị sử dụng trong phát hiện sàng lọc các đối tượng thiếu menG6PD Tuy vậy phương pháp này có giá thành cao do cần phải có các thiết bịchuyên dụng như đèn chiếu tia tử ngoại [12], ngoài ra phương pháp này khóphát hiện trường họp thiếu men G6PD ở nữ dị hợp tử [6]

Phương pháp nhanh của AkiraHirono-1998: là phương pháp tiến hành dựatrên nguyên lý G6P được chuyển thành 6GP thông qua sự xúc tác của enzymG6PD, từ đó tạo ra NADPH là một chất khử tham gia phản ứng chuyển MTTthành Formazan, chuyển từ màu vàng sang màu xanh thẫm( hình minh hoạ cho

nguyên lý xin xem ở kỹ thuật Formazan).

- Trường hợp không thiếu G6PD lượng NAPDH tạo ra đủ thì sản phẩmtạo ra có màu xanh thẫm của Formazan Đọc kết quả (-)

- Trường hợp thiếu G6PD thì phản ứng xảy ra không hoàn toàn, sảnphẩm tạo ra có màu xanh nhạt, đọc kết quả (+) : bán thiếu

- Trường hợp không có G6PD : phản ứng không xảy ra , sản phẩm tạo rachỉ có màu hồng ( màu của Hb ) đọc kết quả (++) ( +++) thiếu hoàn toàn

Đây là một phương pháp đọc kết quả ngay sau 30 phút, đọc kết quả bằngmắt thường dễ nhận biết vvà không đòi hỏi thiết bị tốn kém Phương pháp này

đã được các tác giả như Akira Hirono, Kuni Iwai áp dụng ở một số nứơc ĐôngNam A để điều tra hàng loạt [6] Theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn MinhHùng độ nhạy của phương pháp này ở trường hợp thiếu hoàn toàn là 97,9%, ở

trường hợp bán thiếu là 61,5%, độ đặc hiệu là 100%.Ta có thể thấy độ nhạy và

độ đặc hiệu tương đối cao, có thể áp dụng cho test sàng lọc

Phương pháp định lượng

Nguyên tắc: Tiến hành chống đông máu sau đó tách hồng cầu rồi tách

enzym G6PD Xác định hoạt độ G6PD do sự thay đổi phổ hấp thụ tại bướcsóng 340 mm do coenzym NAPDH sinh ra trong quá trình phản ứng Hoạt độG6 PD tỷ lệ thuận với độ hấp thụ của NADPH

Sơ đồ minh họa

Tính kết quả: A: độ thay đổi mật độ quang học

+ Hoạt độ G6PD (UI/ml = A/phút x 30476

+ Hoạt độ G6PD (UI/1012HC) = A/phút x 30476

Sản lượng hồng cầu trong 1 lít

+ Hoạt độ G6PD UI/gHb = A/phút x 30476

Giai đoạn 1: gây biến tính để tháo xoắn và làm đứt các liên kết Hiđro của

chuỗi xoắn kép AND

Giai đoạn 2: là giai đoạn ủ mồi, ứng với mỗi exon thì có một đoạn mồi

khác nhau