Xác định đa hình kiểu gene ACE ID bằng kỹ thuật PCR và ACTN3 r577x bằng kỹ thuật PCR RFLP của một số vận động viên điền kinh và bơi lội ở việt nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành lựa chọn đề tài luận án: “Nghiên cứu đặc tính của chitinase tự nhiên và

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC HÌNH ix

DANH MỤC BẢNG xii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Những đóng góp mới của luận án 3

3

5

1.1 Nấm Lecanicillium lecanii 5

1.2 Chitinase 5

1.2.1 Nguồn gốc của chitinase 6

1.2.2 Phân loại chitinase 7

1.2.3 Cấu trúc và trung tâm hoạt động của chitinase 9

1.2.4 Cơ chế phản ứng của chitinase 12

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính của chitinase 14

1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp chitinase 16

Trang 2

1.3 Ứng dụng của nấm L lecanii và chitinase 19

1.3.1 Trong lĩnh vực nông nghiệp và bảo vệ môi trường 19

1.3.2 Trong lĩnh vực y học 23

1.3.3 Trong lĩnh vực công nghệ sinh học 24

1.4 Một số nghiên cứu về gen và biểu hiện gen mã hóa chitinase 25

1.4.1 Trên thế giới 25

1.4.2 Ở Việt Nam 29

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 33

2.1 Vật liệu và hóa chất 33

2.1.1 Chủng giống 33

2.1.2 Thiết bị 33

2.1.3 Hóa chất 33

2.1.4 Dung dịch và đệm 34

2.1.5 Môi trường nuôi cấy 34

2.1.6 Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận án 33

2.2 Phương pháp nghiên cứu 33

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy 33

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu trên enzyme/protein… 35

2.2.3 Các phương pháp sinh học phân tử 42

2.2.4 Các phương pháp thử nghiệm 47

2.2.7 Xử lý số liệu 49

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 50 3.1 Sàng lọc, kiểm tra và khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase

Trang 3

từ nấm L lecanii 50

3.1.1 Sàng lọc chủng nấm L lecanii sinh tổng hợp chitinase cao 50

3.1.2 Kiểm tra chủng nấm L lecanii 43H dựa vào đoạn gen 28S rRNA 50

3.1.3 Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase 53

3.2 Tinh sạch và đánh giá đặc tính lý hóa của chitinase từ chủng nấm L Lecanii 43H 61

3.2.1 Tinh sạch chitinase 61

3.2.2 Đánh giá đặc tính lý hóa của chitinase từ chủng nấm L lecanii 43H 64

3.3 Nhân dòng gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L lecanii 43H 67

3.4 Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của rChit trong nấm men P pastoris X33 71

3.4.1 Thiết kế plasmid pPChit biểu hiện gen Chit trong nấm men 71

3.4.2 Biểu hiện chitinase tái tổ hợp trong nấm men P pastoris 72

3.4.3 Tinh sạch rChit 77

3.4.4 Đánh giá đặc tính lý hóa của rChit từ nấm men P pastoris X33 79

3.5 Thử nghiệm khả năng ức chế rệp và nấm bệnh của chitinase và bào tử từ nấm L lecanii 85

3.5.1 Ảnh hưởng của chitinase tới sự phát triển của nấm bệnh hại cây trồng 85

3.5.2 Ảnh hưởng của rChit tới khả năng phát triển của rệp 87

3.5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của sợi nấm 88

3.5.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng nẩy mầm của bào tử nấm 89

3.5.5 Khả năng diệt rệp của chủng nấm L lecanii 43H 90

Trang 4

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 93

1 KẾT LUẬN 93

2 KIẾN NGHỊ 93

94 TÀI LIỆU THAM KHẢO 95 DANH MỤC PHỤ LỤC 114

Trang 5

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BLAST Basic local alignment search tool Phần mềm so sánh trình tự

CMC Cacboxyl methyl cellulose Cacboxyl methyl cellulose

DEPC Diethylpyrocarbonate Diethylpyrocarbonate

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

DNase Deoxyribonuclease Enzyme thủy phân DNA

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại gen

Trang 6

RT-PCR Reverse transcription polymerase

chain reaction

Phản ứng khuếch đại gen

rChit Recombinante chitinase Chitinase tái tổ hợp

TBE Tris boric acid EDTA Tris boric acid EDTA

TEMED N,N,N ,N

-Tetramethylethylenediamine

N,N,N ,N Tetramethylethylenediamine

Trang 7

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc bậc 2 của chitinase từ nấm C immitis 10 Hình 1.2 Cấu trúc của chitinase từ vi khuẩn Ralstonia sp A-471 11 Hình 1.3 Cơ chế xúc tác của chitinase B từ vi khuẩn S mecescens 12

Hình 1.4 Cơ chế thủy phân β-chitin bởi chitinase A từ vi khuẩn

Hình 3.1 Hoạt tính chitinase của 8 chủng nấm L lecanii 50

Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng nấm

L lecanii 43H; Sản phẩm Plasmid và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI 51

Hình 3.3 Trình tự đoạn gen 28S rRNA và cây phân loại trình tự gen 28S

rRNA từ chủng nấm L lecanii 43H với các loài khác……… 52

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng

sinh tổng hợp chitinase 53

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ chitin huyền phù và nguồn nitơ đến

khả năng sinh tổng hợp chitinase 55

Trang 8

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nguồn cacbon và pH nuôi cấy lên khả năng

sinh tổng hợp chitinase 56

Hình 3.7 Hình ảnh điện di SDS-PAGE của chitinase tinh sạch từ chủng nấm L lecanii 43H và hoạt tính chitinase của các phân đoạn qua cột DEAE-Sephadex A-50 trên đĩa thạch có bổ sung cơ chất chitin huyền phù 0,5% 59

Hình 3.8 Nhiệt độ và pH thích hợp của chitinase 61

Hình 3.9 Độ bền nhiệt và độ bền pH của chitinase 62

Hình 3.10 Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa lên hoạt tính chitinase 65

Hình 3.11 Phân tích TLC các sản phẩm thủy phân chitin bởi chitinase 67

Hình 3.12 Kết quả nhân dòng gen Chit từ DNA hệ gen 67

Hình 3.13 Trình tự gen Chit và amino acid suy diễn từ L lecanii 43H 68

Hình 3.14 Cây phân loại dựa vào so sánh trình tự gen Chit của chủng L Lecanii 43H và các chủng khác trong GenBank 69

Hình 3.15 Kết quả nhân dòng gen Chit từ mRNA 70

Hình 3.16 Cây phân loại dựa vào so sánh trình tự amino acid của rChit từ L Lecanii 43H và các chủng khác trong GenBank 71

Hình 3.17 Kết quả thiết kế cấu trúc vector biểu hiện pPChit 72

Hình 3.18 Điện di sản phẩm kiểm tra hệ biểu hiện rChit trong P pastoris X33 71

Hình 3.19 Khả năng sinh tổng hợp rChit của chủng tái tổ hợp khi được cảm ứng ở các nồng độ methanol khác nhau 74

Hình 3.20 Khả năng sinh tổng hợp rChit ở các khoảng thời gian khác nhau 75

Trang 9

Hình 3.21 Điện di SDS-PAGE của rChit tinh sạch từ P pastoris X33 78

Hình 3.22 Nhiệt độ và pH thích hợp của rChit 80 Hình 3.23 Độ bền nhiệt và độ bền pH của rChit 81 Hình 3.24 Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa lên hoạt tính

rChit 84

Hình 3.25 Ức chế sự phát triển của nấm bệnh F oxysporum và R solani

bởi chitinase 87

Hình 3.26 Sợi nấm của R solani và F oxysporum được xử lý với nước

và với chitinase từ chủng nấm L lecanii 43H 87

Hình 3.27 Hỗn hợp chitin của rệp được xử lý với nước và rChit từ nấm

men P pastoris X33 88

Hình 3.28 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỉ lệ nẩy mầm của

bào tử nấm L lecanii 43H 90

Hình 3.29 Mô hình lá cải có rệp sau khi được phun dịch bào tử nấm và

biểu đồ thể hiện khả năng diệt rệp bằng bào tử của chủng nấm L lecanii

43H 92

Trang 10

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Các môi trường thí nghiệm 32

Bảng 2.2 Các điều kiện nuôi cấy chủng nấm L lecanii 43H sinh tổng hợp chitinase 34

Bảng 2.3 Thành phần gel cô và gel tách 39

Bảng 2.4 Quan hệ giữa 1/[S] và 1/V 40

Bảng 2.5 Các cặp mồi sử dụng 44

Bảng 2.6 Thành phần PCR 45

Bảng 3.1 Kết quả tinh sạch chitinase từ chủng nấm L lecanii 43H 59

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của ion kim loại và EDTA đến hoạt tính chitinase 63

Bảng 3.3 Hoạt tính chitinase của các dòng nấm men P pastoris X33/pPChit tái tổ hợp 73

Bảng 3.4 Hoạt tính rChit ở các môi trường biểu hiện khác nhau 74

Bảng 3.5 Kết quả tinh sạch rChit từ nấm men P pastoris X33 77

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của các ion kim loại và EDTA lên hoạt tính rChit 82

Trang 11

nhanh và chỉ diệt các loài côn trùng có hại mà không ảnh hưởng tới nguồn nước, môi trường sinh thái và sức khỏe con người, vật nuôi

Nấm kí sinh côn trùng thường tác động đến những loại mô nhất định như tuyến mỡ và các mô khác bị hòa tan là do các enzyme (chitinase, protease) của nấm Trong quá trình tác động lên côn trùng, nấm tiết ra các enzyme càng mạnh thì tốc độ hủy hoại và tiêu diệt côn trùng gây bệnh càng nhanh, tiết kiệm được thời gian Dựa vào đặc tính này của nấm, việc tạo ra một lượng lớn enzyme đặc biệt là chitinase bổ sung vào chế phẩm sinh học là rất cần thiết

Chitinase là enzyme thuỷ phân chitin thành các đơn phân N-acetyl glucosamine, chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết β-1,4-glucoside giữa C1 và C4 của 2 phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp nhau trong chitin Chitinase có ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực nông nghiệp, y học

Từ thực tế trên, việc nghiên cứu đặc tính chitinase và qui trình tạo ra chitinase cao góp phần làm tăng hiệu quả của chế phẩm bào tử nấm là rất cần thiết

Trang 12

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành lựa chọn đề tài luận án:

“Nghiên cứu đặc tính của chitinase tự nhiên và biểu hiện chitinase tái tổ hợp

trò diệt rệp, nấm bệnh hại cây trồng của chitinase

3 Nội dung nghiên cứu

(1) uyển chọn chủng nấm L lecanii sinh chitinase cao và khảo sát

điều kiện sinh tổng hợp chitinase

chủng nấm đã tuyển chọn

, tinh sạch và nghiên cứu một số tính chất lí hóa của chitinase tái tổ hợp

Trang 13

nấm bệnh và rệp hại cây trồng

4 Những đóng góp mới của luận án

4.1 Luận án đã , đánh giá một số tính chất lý hóa

khả năng ức chế sự phát triển sợi nấm Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani của exochitinase từ chủng nấm L lecanii 43H

khả năng diệt được rệp bào tử nấm L lecanii

: (i) Gen

Chit từ chủng nấm L lecanii 43H

định đư ; đoạn gen Chit được đăng kí trong GenBank với mã số JX665045 (ii) Biểu hiện thành công gen Chit mã hóa endochitinase thuộc họ

18 glycosyl hydrolase trong nấm men P pastoris X33 cho hoạt tính cao Tinh

sạch được chitinase tái tổ hợp và đánh giá được một số tính chất lý hóa cơ bản (iii) Chứng minh được rChit làm suy giảm lớp vỏ chitin của rệp

i) Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp dẫn liệu khoa học về phương pháp tinh sạch chitinase, các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính của chitinase và khả năng

diệt nấm bệnh của chitinase từ chủng nấm L lecanii

ii) Cung cấp những thông tin về gen mã hóa chitinase ở chủng nấm L lecanii

43H, chitinase tái tổ hợp và các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính rChit và khả năng thủy phân lớp vỏ rệp của rChit

iii) Cung cấp thông tin về khả năng diệt rệp của bào tử và đặc điểm sinh học của

nấm L lecanii

Những kết quả đánh giá toàn diện từ khâu lựa chọn điều kiện sinh tổng hợp chitinase, tinh sạch và xác định tính chất lý hóa, khả năng diệt nấm bệnh và rệp của chitinase, cũng như quá trình nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa chitinase

Trang 14

làm căn cứ để đánh giá và ứng dụng của chitinase với bào tử nấm trong quá trình

tạo chế phẩm sinh học diệt rệp của chủng nấm L lecanii

Trang 15

Chương 1

1.1 Nấm Lecanicillium lecanii

Lecanicillium là chi nấm kí sinh côn trùng thuộc ngành nấm túi

Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae Chi nấm

Lecanicillium gồm nhiều loài như: Lecanicillium lecanii, L attenuatum,

L longisporum, L muscarium hoặc L nodulosum Nấm L lecanii trước đây được gọi là Verticillium lecanii Ngày nay, L lecanii được biết là một hình thức sinh sản vô tính trong nhóm trùng thảo Cordyceps confragosa [124]

Nấm Lecanicillium có khả năng kí sinh tự nhiên và giết chết nhiều loại côn

trùng như rệp, ruồi trắng, bộ cánh đều, bộ cánh cứng, bộ cánh thẳng, bướm [22],

[47], [49], [60], [93] Cơ chế diệt côn trùng của Lecanicillium dựa trên sự tiếp

xúc trực tiếp của bào tử với côn trùng Sau khi bám vào cơ thể côn trùng, các bào

tử nảy mầm và tạo thành sợi nấm đâm sâu vào các khoang trong cơ thể, tại đây chúng sinh trưởng và phá hủy mô Sau đó, sợi nấm sẽ phát triển xuyên qua các lớp biểu bì của côn trùng Trong điều kiện độ ẩm cao, bào tử được tạo thành bên ngoài cơ thể côn trùng và có thể lây truyền bệnh cho côn trùng khác [95]

Dựa vào đặc tính diệt côn trùng của nấm L lecanii, các nghiên cứu hiện

nay đi theo hai hướng chính là: đi sâu khai thác đặc điểm sinh học của chế phẩm

bào tử nấm L lecanii sử dụng trong kiểm soát côn trùng; và tìm hiểu vai trò của

hệ enzyme (chitinase, protease, lipase) hoặc độc tố do nấm L lecanii sinh ra

trong quá trình diệt côn trùng

Các nghiên cứu về chitinase từ nấm Lecanicillium đã được các tác giả

nghiên cứu theo các hướng chính là (i) tối ưu quá trình sinh tổng hợp chitinase; (ii) tinh sạch và xác định khả năng thủy phân lớp vỏ trứng của côn trùng và (iii) nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa chitinase Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu chỉ dừng lại ở từng khâu nghiên cứu riêng lẻ và hoạt tính chitinase sinh ra còn rất

thấp Mặt khác, chủng nấm L lecanii nói riêng và các vi sinh vật nói chung

Trang 16

thường hay xuất hiện các biến dị và quá trình sinh chitinase luôn thay đổi ở các điều kiện môi trường, dẫn tới tính chất của chitinase sinh ra từ các chủng nấm là khác nhau Do vậy, quá trình nghiên cứu đầy đủ về chitinase từ bước lựa chọn điều kiện môi trường thích hợp cho việc nâng cao khả năng tổng hợp chitinase đến tinh sạch và xác định các điều kiện ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme; cũng

như việc nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L lecanii

trong nấm men để nâng cao khả năng biểu hiện, sau đó thử nghiệm hoạt tính của chitinase và chế phẩm bào tử trong quá trình diệt rệp và nấm bệnh hại cây trồng

là hướng nghiên cứu cần thiết để nâng cao hiệu quả của chế phẩm sinh học

1.2 Chitinase

Chitinase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-glycoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp nhau trong phân tử chitin, chitobiose và chitotriose Chitinase được chia thành 2 loại chính là endochitinase (EC 3.2.1.14) và exochitinase Exochitinase gồm chitobiosidase (EC 3.2.1.29) và N-acetyl glucosaminidase (EC 3.2.1.30) Mỗi loại enzyme tham gia vào thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàn toàn tạo các đơn phân N-acetyl glucosamine

Cơ chất thủy phân của chitinase thường là chitin Chitin là một polysacharide mạch thẳng không cuộn xoắn, có màu trắng, cứng và không đàn hồi được tạo nên từ các đơn phân N-acetyl glucosamine thông qua liên kết 1,4-β glycoside Chitin là chất hữu cơ đứng thứ 2 trong tự nhiên sau cellulose Trong tự nhiên, chitin gồm 3 dạng cấu trúc là α, β và γ-chitin Trong đó, dạng α-chitin có cấu trúc đối song song gồm các chuỗi polysaccharide xếp xen

kẽ nhau và là dạng phổ biến nhất trong tự nhiên α-chitin là thành phần cấu tạo nên bộ xương ngoài của côn trùng, giáp xác, nhuyễn thể và vách tế bào của nấm Dạng β-chitin thường hiếm hơn, có cấu trúc song song gồm các chuỗi polysaccharide xếp xen kẽ nhau và tồn tại ở dạng liên kết với protein Dạng

Trang 17

γ-chitin được tạo nên từ 2 chuỗi song song xen kẽ với 1 chuỗi đối song song Dạng γ-chitin thường tồn tại ở các loài nấm [57]

Chitin nguyên bản thường có màu trắng đục, mềm dẻo, đàn hồi và khá dai nên khó bị thủy phân Trong động vật chân đốt, chitin được sửa đổi và liên kết với protein giống như một ma trận và tạo thành bộ xương ngoài Ở dạng tinh khiết chitin thường dai, nhưng khi tham gia vào thành phần cấu tạo ở hầu hết các động vật không xương chitin lại là nguyên liệu tổng hợp Trong vỏ giáp xác và động vật thân mềm, chitin kết hợp với canxi cacbonat tạo thành hỗn hợp bền vững hơn Sự kết hợp này giúp cho chitin cứng và đặc hơn so với dạng tinh khiết, đồng thời bền vững và ít giòn hơn so với canxi cacbonat [27]

1.2.1 Nguồn gốc của chitinase

Chitinase được tổng hợp từ rất nhiều nguồn sinh vật khác nhau trong tự nhiên như thực vật, động vật và vi sinh vật Trong đó, vi sinh vật được xem là nguồn cung cấp chitinase nhiều hơn so với động vật và thực vật

Chitinase được sinh ra từ vi sinh vật gồm 2 loại là endochitinase và exochitinase Nấm mốc là một trong những nhóm vi sinh vật có khả năng sinh

tổng hợp chitinase mạnh nhất Các loài nấm mốc thuộc các chi như Trichoderma [32], [37]; Glicocladium; Metharhizium [61], [128]; Beauveria, Lecanicillium [23], [42], [91]; Aspergillus [145]; Penicillium [80] đã được nghiên cứu là có

khả năng sinh tổng hợp chitinase mạnh Bên cạnh đó, vi khuẩn cũng được xem là đối tượng có khả năng sinh chitinase khá phong phú Chitinase được sinh ra từ vi

khuẩn thuộc các chi như Serratia [148], Aeromonas [139], Arthrobacter [100], Micrococcus [19], Clostridium, Bacillus [24], [137] và đặc biệt là nhóm Streptomycetes [72], [144]

Chitinase được tạo ra từ vi sinh vật có vai trò phân giải chitin trong tự nhiên Thành tế bào của nấm sợi và nấm men được tạo nên từ các phân tử chitin

và các hợp chất khác (manan, glucan, cellulose) Tuy nhiên, cấu trúc chitin này

so với chitin trong tự nhiên có sự khác nhau về tính không tan, kích thước, độ

Trang 18

nhớt, độ phức tạp phân tử và tính không đồng nhất nên không bị thủy phân bởi chitinase của cơ thể

Ở thực vật, chitinase có mặt chủ yếu trong thân, củ, hạt và hoa của các loài như khoai tây, thuốc lá, đậu, cà chua, ngô, khoai lang và đậu Hà Lan Chitinase được sinh ra trong giai đoạn phát triển sớm của cơ thể có vai trò tham gia vào quá trình hình thành và phát triển phôi Chitinase trong cây được sinh ra khi có

sự kích thích của mầm bệnh giúp cây chống lại sự tấn công của các nấm kí sinh gây bệnh Ở thực vật, chitinase chủ yếu thuộc loại endochitinase và có kích thước nhỏ hơn so với các nhóm khác

Bên cạnh đó, hệ chitinase có thể được thu nhận từ một số động vật nguyên sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật không xương như ruột khoang, giun tròn, chân đốt, thân mềm (ví dụ trong dịch

ruột của ốc sên Helix aspersa) Đối với động vật có xương sống, chitinase được

tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ, trong dịch dạ dày của các loài chim, thú ăn sâu bọ [89], [90]

Ngoài ra, hệ chitinase còn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong suốt quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da Chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng cuticun của chúng trong quá trình biến thái hay lột xác

1.2.2 Phân loại chitinase

Theo danh pháp quốc tế, Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử quốc tế xếp chitinase vào phân lớp 3 (hydrolase, các enzyme xúc tác phản ứng thủy phân), tổ 2 (glycosidase, thủy phân các liên kết glycoside), nhóm

1 (thủy phân liên kết O- và S-glycoside) (International Union of Biochemistry and Molecular Biology, 1992; http://www.cazy.org/GH18_structure.html)

Chitinase là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau Tùy theo quan điểm của từng tác giả mà các enzyme thuộc phức hệ chitinase được xếp thành các nhóm khác nhau Dựa vào phản ứng thủy phân cơ chất, chitinase được chia

Trang 19

thành 2 dạng: dạng 1 là endochitinase (EC.3.2.1.14), dạng 2 là exochitinase gồm

2 loại là chitobiosidase (EC.3.2.1.29) và N-acetyl glucosaminidase (EC.3.2.1.30) Endochitinase thủy phân điểm cắt bên trong của phân tử chitin và chitodextrin tạo ra các phân tử có khối lượng thấp như chitotriose, chitotetraose và diacetyl chitobiose Chitobiosidase xúc tác quá trình phân cắt các vi sợi chitin ở đầu không khử giải phóng ra các diacetyl chitobiose N-acetylglucosaminidase phân cắt các oligomer (sản phẩm của sự thủy phân bởi endochitinase và chitobiosidase) để tạo ra các đơn phân N-acetyl glucosamine [106]

Dựa vào cấu trúc phân tử, chitinase được sắp xếp vào 3 họ là glycosyl hydrolase 18, 19 và 20 [52] Họ glycosyl hydrolase 18 là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi, có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, được tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc Eukaryote, Prokaryote và virus Họ này bao gồm chủ yếu là chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl glucosaminidase Các chitinase này hoạt động thông qua các cơ chế kiểm soát mà trong đó các đoạn β-polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm β-anomer Các chitinase thuộc họ glycosyl hydrolase 18 rất nhạy cảm với chất ức chế mạnh allosamidin [73] Các chitinase thuộc họ glycosyl hydrolase 18

được tổng hợp từ Aeromonas hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcescens Họ glycosyl hydrolase

19 có hơn 130 chi, chủ yếu ở thực vật (như cà chua, cải, đậu Hà lan); xạ khuẩn

Streptomyces griceus và một số vi khuẩn (Haemophillus influenzae) Họ

glycosyl hydrolase 19 có cấu trúc giống với lysozyme và chitosanase, chúng có cấu trúc hình cầu với một vòng xoắn và hoạt động thông qua cơ chế dịch chuyển Chitinase thuộc họ glycosyl hydrolase 19 từ vật bậc cao thì không bị ức chế bởi allosamidin [73] Họ glycosyl hydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine

acetyl hexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và người

Dựa vào trình tự amino acid đầu N, sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết và vùng cảm ứng, chitinase được phân chia thành 5 nhóm: là

Trang 20

nhóm I, II, III, IV và V Nhóm I là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu cacboxyl (C) (peptide nhận biết) Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt động xúc tác Nhóm II là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein ở đầu N và peptide nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tương tự chitinase nhóm I Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, vi khuẩn, chúng được cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài Nhóm III là trình tự amino acid hoàn toàn khác với nhóm I và II Nhóm IV là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá của cây 2 lá mầm, 41-47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I Nhóm V được nhận biết dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc cao [106]

1.2.3 Cấu trúc và trung tâm hoạt động của chitinase

1.2.3.1 Cấu trúc bậc một và bậc hai của chitinase

Các chitinase được sinh ra từ các cơ thể khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc khác nhau Sự khác nhau đó thể hiện trước hết ở sự đa dạng về khối lượng phân tử, thành phần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi

polypeptide Ở vi khuẩn, chitinase từ B cereus có khối lượng 37 kDa được mã hóa bởi 360 amino acid [53], từ Streptomyces sp M-20 có khối lượng 20 kDa [72], từ Streptomyces griserus HUT 6039 có khối lượng 49 kDa [132]

Ở nấm, chitinase từ Trichoderma atroviride có khối lượng phân tử 33 kDa

mã hóa bởi 321 amino acid [88] Chitinase từ Coccidioides immitis gồm 427 amino acid [135] Chitinase từ Clonostachys rosea (Crch1) có khối lượng

45 kDa được mã hóa bởi 426 amino acid, chứa 1 tín hiệu peptide với 22 amino

acid [43] Chitinase từ L psalliotae có khối lượng phân tử là 45 kDa, được mã

Trang 21

hóa từ 423 amino acid gồm 1 tín hiệu peptide dài 20 amino acid [42] Zhu và

đồng tác giả (2008) đã nghiên cứu về cấu trúc của endochitinase từ L lecanii

thuộc họ glycosyl hydrolase 18 là một chuỗi polypeptide cấu tạo bởi các dải α, β

và các vùng nối Chitinase này là một protein có tính acid, giá trị pI là 5,55

[151] Chitinase từ L lecanii có khối lượng phân tử là 40,93 kDa (CHI1) được

mã hóa bởi 370 amino acid và 45,95 kDa (CHI2) được mã hóa bởi 423 amino acid [150]

Thomas và đồng tác giả (2000) đã nghiên cứu chi tiết về cấu trúc bậc 2 của

chitinase từ nấm C immitis thuộc họ glycosyl hydrolase 18 Chitinase này là một

chuỗi polypeptide gồm 8 dải β (kí hiệu từ S1-S8) tạo thành lõi của enzyme và

8 dải α (kí hiệu từ H2-H9) Các dải β (S3-S6) và α (H3-H8) được nối đan xem với nhau Trong đó, không có xoắn α nằm giữa sợi β1 và β2 nên không có kí hiệu α1 Có 2 xoắn α theo sau chuỗi 2 kí hiệu là H2a và H2b, hai xoắn này xếp liền nhau giống như 1 xoắn liên tục và phình to ra Một đoạn xoắn ngắn (H9) nối tiếp với xoắn H8 nằm gần vị trí kết thúc của đầu C (Hình 1.1) [135]

Hình 1.1 Cấu trúc bậc 2 của chitinase từ nấm C immitis [135]

1.2.3.2 Cấu trúc không gian

Sự khác nhau về cấu trúc của các enzyme còn thể hiện ở sự sắp xếp trong không gian của các chuỗi polypeptide, các trung tâm xúc tác và các vùng liên kết

Trang 22

cơ chất Sự khác nhau về cấu trúc không gian của các enzyme dẫn tới sự khác nhau về các tính chất hóa lý của chúng

Cấu trúc của phân tử chitinase A từ vi khuẩn Bacillus circulans gồm

3 vùng: vùng N-terminal với một nếp gấp giống như kháng thể tham gia vào quá trình liên kết với chitin; vùng thủy phân gồm 8 chuỗi α/β và một vùng gấp nếp nhỏ chứa một chuỗi α+β để chèn vào vùng thủy phân [140]

Trong khi, chitinase từ vi khuẩn Ralstonia sp A-471 thuộc họ glycosyl

hydrolase 19 được cấu tạo nên từ 6 chuỗi xoắn α là α1 (từ vị trí 111-123), α2 (từ

vị trí 129-141), α3 (từ vị trí 163-177), α4 (từ vị trí 186-204), α5 (từ vị trí 216) và α6 (từ vị trí 234-247); và 1 xoắn 310 (từ vị trí 154-156) Vị trí thủy phân (Glu141) được xác định ở điểm cuối của xoắn α2 và được che phủ với vòng lặp dài nhất L-7 (từ vị trí 217-233), nơi nối giữa xoắn α5 và α6 L-7 được gắn bởi mạng lưới liên kết hydro và tạo nên một khoang hình ống (Hình 1.2) [131]

207-Hình 1.2 Cấu trúc của chitinase từ vi khuẩn Ralstonia sp A-471 [131] 1.2.3.3 Trung tâm hoạt động và vùng liên kết cơ chất

Trung tâm hoạt động của chitinase từ nấm L lecanii chứa 9 gốc amino acid

(Phe-Asp-Gly-Ile-Asp-Trp-Glu) Vai trò liên kết cơ chất khi tham gia xúc tác thủy phân chitin của chitinase được thực hiện nhờ các vùng liên kết đặc hiệu

Trang 23

Các vùng liên kết đó có thể nằm trong trung tâm hoạt động của enzyme hoặc không Tùy thuộc vào từng loại enzyme mà vùng liên kết này có cấu tạo hóa học

và cấu trúc không gian khác nhau Vùng liên kết với cơ chất của chitinase từ

nấm L lecanii gồm 7 amino acid (Val-Met-Leu-Ser-Ile-Gly-Gly) và vùng liên

kết này nằm ở phía ngoài trung tâm hoạt động [151]

1.2.4 Cơ chế phản ứng của chitinase

Cơ chế xúc tác của chitinase thực hiện theo 2 hướng: hướng thứ nhất là cơ chế chuyển dịch với sự tham gia của nhóm lân cận; nhóm cacboxyl bề mặt hoạt động như một tác nhân có ái lực với điện tích dương, dưới sự hỗ trợ từ Asp hoạt động để loại bỏ proton H+

ra khỏi nhóm N-acetamido trong sự cố định của ion oxazolinium Hướng thứ hai là cơ chế hoạt động xúc tác các phần còn lại để hỗ trợ cho sự thủy phân các đơn phân

Mô hình thủy phân chitin được giải thích bằng chitinase B từ vi khuẩn

S marcescens là một loại exochitinase, với sự tham gia của các nhóm ái lực

trong trung tâm hoạt động của enzyme Vị trí liên kết của chitinase thuộc họ glycosyl hydrolase 18 với cơ chất có chứa 3 amino acid là Asp-140, Asp-142 và Glu-144 Sự luân chuyển Asp-142 trên cơ chất có vai trò giúp ổn định điện tích dương của các ion trung gian oxazolinium và là chất cho proton, dẫn tới làm giảm giá trị pKa của Glu-144 Glu-144 đóng vai trò là chất nhận proton, tham gia hình thành liên kết với cơ chất và giải phóng phân tử nước Khi ở trạng thái nghỉ Asp-142 nằm quá xa so với Glu-144 (Hình 1.3A) [99]

Trang 24

Hình 1.3 Cơ chế xúc tác của chitinase B từ vi khuẩn S mecescens [99]

Khi có sự liên kết của trung tâm hoạt động với cơ chất N-acetyl glucosamine gây ra sự biến dạng của vòng pyranose làm luân chuyển Asp-142

về phía Glu-144, liên kết hydro hình giữa các nhóm amin của Asp-142 và Glu-144 được hình thành (Hình 1.3B) Sự thủy phân các ion trung gian oxazolinium để giải phóng các proton đến Glu-144 và luân chuyển proton của Asp-142 nơi chia sẻ với Asp-140 (Hình 1.3C) Sau khi sự liên kết giữa cơ chất

và trung tâm hoạt động diễn ra, phân tử nước được giải phóng có vai trò thủy phân các liên kết glycoside bởi axit amin Tyr-214

Cơ chế thủy phân theo hướng 2 được giải thích bởi chitinase A từ vi khuẩn

B circulans Sự liên kết của chitinase A trên bề mặt phân tử chitin thông qua

tương tác của nhóm ái lực gồm 3 amino acid là Trp-69, Trp-33, Trp-245 và

1 phân tử N-acetyl glucosamine trên bề mặt chuỗi đơn của chitin tại miền N-terminal Chuỗi chitin tương tác với nhóm ái lực của 3 amino acid được đưa vào bên trong của khe xúc tác từ các điểm cuối của chuỗi thông qua sự tương tác với Phe-232 Sự tương tác với các điểm ái lực càng nhiều dẫn đến sự liên kết càng chặt của chuỗi chitin với miền xúc tác thủy phân của enzyme Kết quả, các sản phẩm được giải phóng trong quá trình thủy phân các chuỗi đơn trong tinh thể chitin là các nối đôi của N-acetyl glucosamine (Hình 1.4) [106]

Trang 25

Hình 1.4 Cơ chế thủy phân β-chitin bởi chitinase A từ vi khuẩn B circulans [106]

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính của chitinase

Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme mạnh nhất ở nhiệt độ và pH nhất định Độ bền đối với nhiệt độ và pH hay mức độ và tính chất chịu ảnh hưởng của các ion kim loại, chất tẩy rửa, dung môi hữu cơ cũng có sự khác nhau

1.2.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiệt độ Enzyme xúc tác phản ứng hoạt động thích hợp ở dải nhiệt độ từ 20-50°C Nhiệt độ quá cao làm cấu trúc enzyme bị biến tính dẫn tới hoạt tính xúc tác giảm mạnh hoặc mất hoạt tính Nhiệt độ thấp dưới 0°C, enzyme ngừng hoạt động và được phục hồi trở lại khi đưa về nhiệt độ thích hợp Tùy theo nguồn gốc thu nhận chitinase mà giá trị nhiệt độ tối ưu cho enzyme hoạt động là khác nhau Chitinase từ các vi

khuẩn như S macescens B4A [147], Enterobacter sp G-1 [103], B subtilis và

B atrophaeus [20] hoạt động tốt nhất ở 40°C; từ S plymuthica HRO-C48 hoạt động tốt nhất ở 55°C [41]; từ S maltophilia [48] hoạt động tốt nhất ở 60°C Trong khi, chitinase từ vi khuẩn B thuringiensis HBK-51 hoạt động tốt nhất ở

110°C và được coi là một loại enzyme chịu nhiệt [77] Các loài nấm như

Lecanicillium [23], [136]; Talaromyces flavus [36], Gliocladium catenulatum

Trang 26

[86], M anisopliae [61], Aspergillus fumigates [145] hoạt động tốt ở dải nhiệt độ

từ 40-60°C

1.2.5.2 Ảnh hưởng của pH

Giá trị pH tối ưu của chitinase phụ thuộc vào loài sinh vật sinh ra, nguồn cơ chất mà enzyme thủy phân và bản chất của enzyme Giá trị pH thích hợp để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc acid Theo nghiên cứu trước đây

cho thấy, chitinase từ một số loài như nấm Penicillium ochrochloron MTCC 517 [105], L psaliotae [42] và vi khuẩn S marcescens MO-1 [99] hoạt động tốt nhất

ở pH 7,0 và được xem như một loại protein trung tính Trong khi, chitinase từ

nấm L chlamydosporium và L suchlasporium [136], M anisopliae [61], vi khuẩn Streptomyces sp M-20 [72] hoạt động tốt nhất ở pH 5,2-5,7 và thuộc loại enzyme ưa acid Chitinase từ vi khuẩn Micrococcus sp.AG84 hoạt động tốt nhất

ở pH 8,0 [19] và thuộc loại protein kiềm

1.2.5.3 Ảnh hưởng của ion kim loại, chất tẩy rửa và dung môi hữu cơ

Các ion kim loại làm biến đổi vận tốc phản ứng của enzyme, chúng có thể kích thích hoặc ức chế hoạt động của enzyme Một số ion kim loại có khả năng liên kết phối trí với các nguyên tử oxy hoặc nguyên tử nitơ của nhóm cacboxyl, amine hoặc peptide của các enzyme, làm cho trung tâm hoạt động của enzyme

có độ bền rất lớn; đồng thời các ion kim loại này tạo ra một dạng thuận lợi cho enzyme hoặc làm cho enzyme kết gắn được với cơ chất Do đó tốc độ thủy phân của enzyme được tăng lên Các ion kim loại nặng ở nồng độ gây biến tính có thể kìm hãm không thuận nghịch hoạt độ của enzyme Theo nghiên cứu của Patil và đồng tác giả (2013), các ion Hg2+

, Zn2+, K+ và NH4+ ở nồng độ 10 mM ức chế

hoàn toàn hoạt tính chitinase từ chủng nấm P ochrochloron MTCC 517; trong

khi các ion Mg2+ và Ca2+ không ảnh hưởng tới hoạt tính chitinase [105] Các ion kim loại Mg2+

, K+ và Ca2+ làm tăng hoạt tính chitinase từ vi khuẩn Enterobacter

sp NRG4; trong khi các ion Cu2+, Co2+, Ag+ và Hg2+ ở nồng độ 1 mM ức chế hoạt tính của chitinase [30] Để nghiên cứu ảnh hưởng của các cation tới hoạt

Trang 27

tính xúc tác của chitinase từ vi khuẩn S marcescens B4A, Zarei và đồng tác giả

(2011) đã bổ sung các ion kim loại và EDTA ở nồng độ 1 mM cùng với enzyme Kết quả cho thấy các ion kim loại và EDTA được khảo sát đều làm giảm hoạt tính của enzyme (ngoại trừ 2 ion Co2+

và Mn2+ làm hoạt tính chitinase tăng tới 36%) so với đối chứng [147]

Các chất tẩy rửa và các dung môi hữu cơ cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính của enzyme Các chất tẩy rửa làm tăng hoạt tính chitinase bằng cách làm tăng khả năng gắn kết giữa trung tâm hoạt động của enzyme và cơ chất thông qua việc giảm sức căng bề mặt trong môi trường nước Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng như bản chất của enzyme mà tính chất và mức độ ảnh

hưởng tới hoạt động của enzyme là khác nhau Chitinase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis MB-2 không bị ảnh hưởng bởi urê, Tween 20 và Triton X-100,

nhưng không bền với dimethyl sulphoxide và polyethylene glycol [137] Nghiên

cứu trên vi khuẩn Bacillus sp BG-11, Bhushan và Hoondal (1988) nhận thấy chất tẩy rửa Triton X100 làm tăng hoạt tính của chitinase từ vi khuẩn Bacillus

sp BG-11 [24] Hoạt tính chitinase từ vi khuẩn S griseus tăng lên khi xử lý với

1 mM β-mercaptoethanol và hoạt tính bị mất hoàn toàn khi ủ với 1 mM P-chloromercuri Trong khi, SDS ở nồng độ 1 mM không làm thay đổi hoạt tính chitinase [110] Zarei và đồng tác giả (2011) nhận thấy, các chất tẩy rửa Tween 80, Tween 20 và SDS ở nồng độ 0,1 mM làm tăng hoạt tính chitinase

(hoạt tính tăng lên 23%) từ vi khuẩn S marcescens B4A Trong khi,

iodoacetamide, axit iodoacetic acid, axit xitric và PMSF hoạt hóa nhẹ chitinase

và làm tăng hoạt tính xúc tác của chitinase Các chất này có vai trò liên kết đồng hóa trị với nhóm thiol của cystein làm cho protein không thể hình thành liên kết disulfide [147]

1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp chitinase

Nấm L lecanii chủ yếu sống hoại sinh phân giải nguồn cơ chất trong môi

trường nơi chúng sống dựa vào hệ enzyme ngoại bào do chúng tiết ra để sinh

Trang 28

trưởng và phát triển Tốc độ tiết enzyme phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường như nhiệt độ, pH, nguồn cacbon và nguồn nitơ

1.2.6.1 Nguồn cacbon

Tùy loài vi sinh vật mà nguồn cacbon được sử dụng để sinh chitinase là khác nhau, có loài chỉ thích hợp với một hoặc một số ít nguồn cacbon, có loài lại thích hợp với nhiều nguồn cacbon Nguồn cacbon có thể là các loại carbohydrate đơn giản như đường đơn, đường đôi hoặc phức tạp như tinh bột, cellulose, xylan, chitin Nguồn cacbon phức tạp này thường tồn tại ở hầu hết các sản phẩm, phế phẩm như trấu cám, vỏ quýt, sơ dừa, lõi ngô, bã mía, vỏ cà phê, mùn cưa, cũng như lớp vỏ chitin của các loài côn trùng, giáp xác Những chất này thường được

sử dụng làm nguồn cacbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp chitinase

Brzezinska và đồng tác giả (2012) nhận thấy, chitin huyền phù và vỏ tôm là

nguồn cacbon thích hợp để chủng nấm A niger LOCK 62 sinh tổng hợp

chitinase [25] Trong khi, hỗn hợp chitin và cám mì lại là nguồn cacbon thích

hợp cho nấm Penicillium sinh chitinase trên môi trường rắn [80]

1.2.6.2 Nguồn nitơ

Nguồn nitơ ảnh hưởng mạnh tới tốc độ tiết enzyme của các loài vi sinh vật Nguồn nitơ tồn tại ở dạng vô cơ như urê, ammonium sulfate, natri nitrate và ở dạng các hợp chất hữu cơ cao phân tử như cao thịt, cao thịt bò, bột đậu tương, bột cá hay pepton Tùy loài vi sinh vật mà nguồn nitơ được sử dụng là khác nhau Đa số các loài có khả năng sử dụng cả nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ, tuy nhiên mức độ đồng hóa từng loại nitơ để sinh enzyme lại phụ thuộc vào từng

loài Gomaa (2012) khi tối ưu điều kiện nuôi cấy vi khuẩn B thuringiensis và

B licheniformis nhận thấy, nguồn nitơ là casein thích hợp cho sự sinh trưởng và

sinh tổng hợp chitinase [45] Nguồn nitơ là cao nấm men ảnh hưởng mạnh tới

quá trình sinh tổng hợp chitinase từ chủng nấm A niger LOCK 62 [25] Zang và đồng tác giả (2004) khi nghiên cứu chủng nấm B bassiana Bb174 trong môi

trường lên men lỏng nhận thấy, nguồn nitơ là pepton thích hợp cho quá trình

Trang 29

sinh tổng hợp chitinase [149] Như vậy, nguồn nitơ hữu cơ thích hợp cho quá trình tổng hợp chitinase từ các chủng vi sinh vật

1.2.6.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

Nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc tới quá trình sống của vi sinh vật nói chung và

của nấm mốc nói riêng Mỗi loài vi sinh vật thích nghi với một vùng nhiệt độ

khác nhau, căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ, các loài vi sinh vật được chia làm 3 nhóm là nhóm vi sinh vật ưa lạnh và chịu lạnh; nhóm vi sinh vật ưa ấm và nhóm

vi sinh vật chịu nhiệt Các loài ưa lạnh sinh trưởng được trong điều kiện nhiệt độ dưới 15°C; các loài ưa ấm sinh trưởng và phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ 20-37°C Các loài chịu nhiệt sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ cao trên 50°C Ở mỗi nhiệt độ nuôi cấy, lượng chitinase được sinh ra là khác nhau và phụ thuộc vào từng loài vi sinh vật Những nghiên cứu trước đây cho thấy, nhiệt độ

thích hợp cho sinh tổng hợp chitinase từ nấm T harzianusm là 28°C [141],

C cellulans 191 là 25°C [85], L lecanii F091 là 24°C [83], từ vi khuẩn Streptomyces sp PTK19 là 30°C [134], Streptomyces sp ANU 6277 là 35°C

[74] Như vậy, hầu hết các loài vi sinh vật sinh chitinase đều thuộc nhóm ưa ấm

1.3 Ứng dụng của nấm L lecanii và chitinase

, nông nghiệp, bảo vệ môi trường và trong công nghệ sinh học

1.3.1 Trong lĩnh vực nông nghiệp và bảo vệ môi trường

Trong nông nghiệp, để khắc phục hạn chế của thuốc trừ sâu hóa học trong quá trình kiểm soát dịch hại cây trồng bằng việc áp dụng các tác nhân sinh học đang trở thành một trong những hướng phát triển hiện nay

1.3.1.1 Vai trò sinh lý của chitinase

Chitinase có ở các sinh vật chứa chitin (côn trùng, giáp xác, nấm) và không chứa chitin (vi khuẩn, thực vật bậc cao và động vật có xương sống) Ở động vật

Trang 30

chân đốt, chitinase liên quan đến quá trình lột xác và tiêu hóa chitin Quá trình lột xác này được điều hòa bởi sự tổng hợp chitinase trong dịch lột xác đã tích lũy

ở giữa lớp biểu bì cũ và lớp thượng bì Sản phẩm của quá trình thủy phân được tái chế để tổng hợp các lớp biểu bì mới Chitinase được tìm thấy trong ruột ấu trùng có chức năng tiêu hóa và phá vỡ chitin trong niêm mạc ruột [76]

Một số nghiên cứu cho thấy sự kết hợp của chitinase và quá trình tổng hợp chitin xuất phát từ mối quan hệ của hai hoạt động trong quá trình bào tử nảy

mầm của nấm Mucor mucedo [46], trong sự tăng trưởng theo cấp số nhân ở nấm Mucor rouxii và Candida albicans [115] Sahai và đồng tác giả (1993) nhận

thấy, chitinase xuất hiện trong quá trình trương của bào tử, sự nảy mầm bào tử, vào quá trình hình thành bào tử nang và đáp ứng với sự tổn thương cơ học ở

Choanephora cucurbitarum và 4 chi nấm tiếp hợp khác

Quá trình tự động ly giải thể quả trưởng thành ra khỏi cơ thể nấm Copronus lagopus được thực hiện dưới tác động của chitinase trước khi giải phóng bào tử

Chitinase hoạt động kết hợp với các enzyme khác ở trong các khoảng gian bào của tế bào Enzyme này được giải phóng ngẫu nhiên trong thành tế bào khi hoạt động trao đổi chất không diễn ra ở những tế bào già Chitinase liên quan tới sự tự

phân vùng tiếp giáp thành tế bào của nấm Neurospora crassa và Aspergillus nidulans [119] Những căn cứ trên cho thấy, chitinase liên quan tới sự phân

nhánh của sợi nấm nhiều hơn sự tự phân hủy Như vậy, chitinase ở nấm liên quan tới quá trình phát triển sợi nấm, trương phồng và nảy mầm của bào tử, quá trình giải phóng bào tử, sự phân tách và nảy chồi của tế bào

Việc nghiên cứu tính chất vật lý, hóa học, động học enzyme và tính chất diệt khuẩn của chitinase đã thúc đẩy quá trình bảo vệ cơ thể chống lại tác nhân gây bệnh như nấm và côn trùng

1.3.1.2 Nghiên cứu chế phẩm bào tử nấm trong kiểm soát côn trùng

Lecanicillium là chi nấm có khả năng kí sinh tự nhiên trên nhiều loài côn

trùng Từ những năm 1960, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng

Trang 31

dụng của nấm Lecanicillium để diệt rệp bảo vệ cây trồng, nhiều sản phẩm đã

được sản xuất và thương mại hóa Tuy nhiên, kết quả đạt được trong nghiên cứu

và sử dụng chế phẩm sinh học diệt côn trùng còn hạn chế Năm 2004, giá trị thương mại của chế phẩm sinh học diệt côn trùng được sử dụng trên toàn thế giới chỉ chiếm 1,8% tổng giá trị của các loại thuốc diệt côn trùng [65] Vì vậy, việc tăng cường nghiên cứu phát triển các chế phẩm diệt côn trùng từ nấm

Lecanicillium là cần thiết

Năm 2007, Vu và đồng tác giả nghiên cứu sử dụng chủng nấm

Lecanicillium spp để kiểm soát rệp M persicae và Aphis gossypii Trong điều kiện phòng thí nghiệm, 100% rệp M persicae và A gossypii đã bị diệt sau 4-5 ngày phun Trong nhà kính, rệp A gossypii đã bị diệt 78% sau 14 ngày phun

[143] Trong một nghiên cứu khác, Kim và đồng tác giả (2008) đã sử dụng

chủng nấm L attenuatum CNU-23 để kiểm soát rệp M persicae Trong phòng thí nghiệm, chủng nấm L attenuatum CNU-23 diệt được 50% rệp sau 3 ngày

phun và 80% sau 7 ngày phun Khi thử nghiệm trên cây ớt được trồng trong nhà kính, chủng nấm này diệt được 72-97% rệp sau 12 ngày phun [68] Năm 2009,

Diaz và đồng tác giả đã khảo sát độc lực của chủng nấm L lecanii đối với một số loài rệp Kết quả là chủng này diệt được 95% rệp M persicae, trong khi sản

phẩm thương mại Vertalec® chỉ diệt được 91,6% [34]

Có nhiều sản phẩm diệt côn trùng có nguồn gốc từ nấm Lecanicillium đã

được thương mại hóa như Vertalec, Verelac, Mycotal, Enverto Liều sử dụng của các sản phẩm trên là 250 ml chế phẩm (nồng độ bào tử là 2×108

CFU/ml) cho

4000 m2 cây trồng làm côn trùng chết sau 5-7 ngày phun Các chế phẩm này không chỉ có tác dụng lên rệp mà còn tác dụng lên nhiều loại côn trùng khác như ruồi trắng, bọ trĩ, ve bét

Mặc dù tiềm năng kiểm soát các côn trùng gây hại cây trồng của nấm

Lecanicillium rất lớn, nhưng việc nghiên cứu ứng dụng nấm Lecanicillium để

bảo vệ cây trồng cũng như kết quả đạt được còn hạn chế, nhất là ở Việt Nam

Trang 32

Hiệu quả diệt côn trùng của chế phẩm nấm Lecanicillium cũng như các chế

phẩm sinh học khác còn kém, khối lượng chế phẩm sinh học diệt côn trùng được

sử dụng mới chỉ chiếm tỉ trọng thấp trong tổng khối lượng các loại thuốc diệt côn trùng Do vậy, việc tăng cường nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học diệt

côn trùng từ nấm Lecanicillium là cần thiết

1.3.1.3 Chitinase sử dụng trong quá trình kiểm soát côn trùng

Nấm kí sinh côn trùng có khả năng vượt qua hàng rào bảo vệ của côn trùng bằng cách sản xuất ra nhiều enzyme ngoại bào nhằm phân giải protein và chitin tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình xâm nhập vào lớp biểu bì và gây nhiễm

trùng [127], [128] Ở tuyến trùng Brugia malayi sử dụng chitinase để phá vỡ lớp

vỏ chitin bảo vệ và lớp niêm mạc để xâm nhập vào cơ thể muỗi kí sinh

Baculoviruses chứa các gen mã hóa cho chitinase, tuy nhiên vai trò của chitinase

trong quá trình xâm nhập của cơ thể chủ chưa thể hiện rõ Các enzyme thủy phân được côn trùng, nấm và các sinh vật khác sử dụng để lột xác hoặc xâm nhập có tiềm lực hữu ích trong quản lý dịch hại vì chúng có đặc tính phá hủy cấu trúc quan trọng như bộ xương ngoài hoặc niêm mạc của côn trùng

Chitinase được sử dụng để pha trộn trong thí nghiệm nhằm tăng hiệu lực

của vi nấm kí sinh côn trùng Chitinase từ vi khuẩn B thuringiensis và Baculovirus được sử dụng để tăng cường hoạt tính của thuốc trừ sâu vi sinh vật

Ấu trùng của sâu chồi cây Chi vân sam và Choristoneura firmiferanu chết nhanh hơn khi tiếp xúc với hỗn hợp chitinse-Bacillus so với khi tiếp xúc với enzyme hoặc Bacillus riêng lẻ Nghiên cứu của Shapiro và đồng tác giả (1987) cho thấy,

ấu trùng bướm Gypsy khi sử dụng chitinase kết hợp với B thuringiensis chết cao

hơn so với sử dụng vi khuẩn riêng lẻ và tỉ lệ chết tăng tuyến tính khi tăng nồng

độ chitinase

Chitinase xuất hiện để nấm kí sinh côn trùng xâm nhập vào lớp biểu bì của

cơ thể chủ Trong trường hợp này, chitinase và N-acetyl glucosaminidase được

tiết ra khi nấm kí sinh côn trùng (L lecanii, M anisopliae, B bassiana) phát

Trang 33

triển trên lớp vỏ côn trùng Độc tính của các chủng này tại thời điểm xâm nhập khi có chitinase cao hơn so với không bổ sung chitinase

1.3.1.4 Chitinase sử dụng trong quá trình kiểm soát nấm hại cây trồng

Thuốc trừ sâu sinh học chống lại một số nấm bệnh liên quan tới quá trình tổng hợp chitinase Vi khuẩn tạo ra chitinase hoặc glucanase thể hiện sự đối kháng với nấm trong nuôi cấy invitro Chitinase từ thực vật ức chế sự tăng

trưởng sợi nấm và từ xạ khuẩn Streptomyces phân giải thành tế bào nấm Vai trò

của chitinase còn được chứng minh khi gây đột biến gen mã hóa chitinase của vi

khuẩn S marcescens làm mất khả năng kiểm soát sinh học của chitinase Gen này được biểu hiện trong vi khuẩn E coli giúp vi khuẩn E coli giảm được tỉ lệ mắc bệnh do nấm Sclerotium rolfsii và R solani gây ra Nghiên cứu của

Sundhemi (1990) chứng minh rằng, gen mã hóa chitinase từ vi khuẩn

S marcescens được biểu hiện trong vi khuẩn Pseudomonas sp giúp cho chủng này có khả năng chống lại nấm bệnh F oxysporum và Gauemannomyces graminis [129]

1.3.2 Trong lĩnh vực y học

Trong lĩnh vực y học, chitinase tham gia vào quá trình miễn dịch bẩm sinh

và miễn dịch thu được Chitinase cần thiết cho các chức năng khác nhau như: chitinase được biểu hiện trong suốt quá trình phát triển của cơ thể nhằm hỗ trợ việc tái tạo sinh học của cơ thể để thích ứng với những thay đổi về kích thước và hình dạng cơ thể Ở một số cơ thể, chitinase tham gia vào tiêu hóa thức ăn có chứa chitin Chitinase biểu hiện trong động vật có vú (người và chuột) gây ra một số phản ứng với tác nhân gây bệnh có chứa chitin (nấm, kí sinh trùng) và làm suy giảm hệ thống chitin trên các vi sinh vật gây nhiễm [38], [104]

Ở động vật có vú, khi bị mầm bệnh ngoại sinh có chứa cấu trúc chitin tấn công thì các chitinase sẽ xuất hiện để chống lại các mầm bệnh bảo vệ cơ thể Các chitinase này bao gồm: chitinase thật và 1 loại protein chitinase phụ thuộc vào hoạt tính của nó (CLPs) Dạng chitinase thật gồm chitinase acid (AMCase) và

Trang 34

chitinase 1, đây là các chitinase động vật đầu tiên được nghiên cứu Dạng CLPs gồm chitinase 31, chitinase 32 và một vài dạng khác Hoạt tính của AMCase và chitinase 1 tham gia vào phân hủy chitin và tiêu diệt tác nhân gây bệnh Các CLPs có vai trò sinh học quan trọng bằng cách liên kết ái lực cao với chitin Chúng có chức năng trong quá trình nhận dạng phân tử các tác nhân gây bệnh có chứa chitin, bằng cách phát tín hiệu đến hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ để gắn kết với tác nhân gây bệnh và tiêu diệt Ngoài ra, chitinase 31 giúp tăng cường đáng kể độ bám dính và sự xâm lược của các vi khuẩn gây bệnh vào trong lớp biểu bì ruột, bằng cách tương tác với chitin/phức hợp protein-chitin trên vi khuẩn [94]

Chitinase 1 hoạt động tích cực nhất trong các đại thực bào và bạch cầu trung tính, còn AMCase hoạt động chủ yếu trong các đại thực bào, các tế bào biểu mô và trong phổi Sutherland (2009) nhận thấy, sản phẩm của chitinase và CLPs được điều chỉnh tăng lên trong 2 loại tế bào lympho T liên quan tới phản ứng viêm (như hen phế quản, viêm mũi, dị ứng gây bởi viêm) [130] Chitinase 1 được chứng minh là một dấu hiệu cho bệnh Gaucher, xơ vữa động mạch, bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu và viêm khớp tự phát ở trẻ vị thành niên Chitinase

31 chủ yếu điều chỉnh tăng lên trong bệnh viêm ruột, xơ gan, thấp khớp và bệnh ung thư Như vậy, cả chitinase và CLPs được điều chỉnh tăng lên cao trong điều kiện viêm cấp tính hoặc mạn tính [59]

1.3.3 Trong lĩnh vực công nghệ sinh học

Trong lĩnh vực công nghệ sinh học, chitinase được ứng dụng để tạo tế bào trần, sản xuất các protein đơn bào và tham gia vào quá trình tạo các oligosaccharide

Tế bào trần có vai trò quan trọng trong quá trình nghiên cứu về nấm, cũng như chương trình cải biến các chủng nấm nhằm ứng dụng trong Công nghệ Sinh học Năm 1970, Itan và Matile nhận thấy tế bào trần được tạo ra khi cuống bào

tử được ủ trong dung dịch enzyme và hoạt tính thủy phân chủ yếu được thực

Trang 35

hiện do chitinase được hình thành ngay trước khi giải phóng bào tử Chitinase thương mại được sử dụng cho việc tạo tế bào trần từ sợi nấm rất có hiệu quả [56] Luciana và đồng tác giả (2009) đã sử dụng chitinase tinh sạch từ chủng

nấm C cellulans191 để thủy phân sợi nấm Rhizopus oligosporus và Penicillium

sp., kết quả thu được các tế bào trần sau 2 giờ ủ [85] Pe’er và Chet (1990) [107], Tschen và Li (1994) [138], Balasubramanian và đồng tác giả (2003) [21] đã tạo được tế bào trần khi sử dụng chế phẩm thương mại Novozym 234 (gồm chitinase, cellulase và pectinase)

Để sử dụng hiệu quả lượng chất thải chitin, Revah và đồng tác giả (1981)

đã đưa ra ý tưởng chuyển hóa sinh học chúng cùng với tế bào nấm men để tạo ra

các protein đơn bào Chitinase từ vi khuẩn S marcascens đã được sử dụng cho

sự chuyển hóa sinh học chitin thành các đường amin (chủ yếu là N-acetyl

glucosamine) sử dụng cho sự phát triển của tế bào nấm men Pichia kudriavzevii

Quá trình này đã tạo ra được các protein đơn bào chiếm tỉ lệ 45% và lượng acid nucleic giảm xuống đáng kể (duy trì 8-11%) [117]

1.4 Một số nghiên cứu về gen và biểu hiện gen mã hóa chitinase

1.4.1 Trên thế giới

Trên thế giới, gen mã hóa chitinase trên đối tượng vi sinh vật đã được nhiều tác giả nghiên cứu Zhu và đồng tác giả (2008) đã phân lập được gen mã hóa

endochitinase từ nấm L lecanii Gen từ mARN dài 1272 bp mã hóa phân tử

protein gồm 223 amino acid có khối lượng phân tử khoảng 46 kDa [151] Trên

chủng nấm L psalliotae, Gan và đồng tác giả (2007) đã phân lập được gen mã

hóa chitinase từ mRNA dài 1272 bp mã hóa cho phân tử protein dài 423 amino acid, có khối lượng phân tử khoảng 46 kDa [42]

Nghiên cứu trên nấm B bassiana cho thấy, gen mã hóa chitinase từ DNA

dài 1047 bp, không chứa intron và mã hóa cho phân tử protein dài 348 amino acid Phân tử protein tạo thành có kích thước khoảng 36 kDa [126] Al-Rashed

và đồng tác giả (2010) đã phân lập được gen mã hóa endochitinase từ mRNA dài

Trang 36

966 bp mã hóa cho phân tử protein gồm 321 amino acid, có kích thước 35 kDa

[16] Từ nấm Paecilomyces javanicus, Chen và đồng tác giả (2007) đã phân lập

được gen mã hóa chitinase từ DNA có chiều dài 1035 bp, không chứa intron, mã hóa cho phân tử protein gồm 344 amino acid với khối lượng 37 kDa [28] Ramli

và đồng tác giả (2011) đã phân lập được gen mã hóa chitinase từ mRNA của

chủng nấm Glaciozyma antarctica PI12 Gen dài 1215 bp, mã hóa cho phân tử

protein gồm 403 amino acid với khối lượng 39 kDa [113]

Như vậy, gen mã hóa chitinase từ một số chủng nấm là khác nhau về số lượng, kích thước và trình tự sắp xếp của các nucleotide Chitinase tái tổ hợp được tạo ra bằng kỹ thuật DNA tái tổ hợp mang đến một số thuận tiện trong quá trình sản xuất và tinh sạch Hơn nữa, chitinase tái tổ hợp còn có thể có một số tính chất thay đổi theo hướng có lợi so với enzyme tự nhiên Bên cạnh đó, việc

sử dụng các hệ biểu hiện để tạo enzyme tái tổ hợp cũng rất quan trọng cho sự phát triển các enzyme mới và sản xuất lượng lớn các enzyme này Gen mã hóa chitinase đã được nhiều tác giả nghiên cứu biểu hiện ở các hệ thống biểu hiện khác nhau

1.4.1.1 Biểu hiện chitinase trong vi khuẩn E coli

Vi khuẩn E coli có tốc độ sinh trưởng nhanh, thuận tiện cho các thao tác

sinh học phân tử nên được lựa chọn là hệ biểu hiện phổ biến dùng cho những mục đích khác nhau Trong đó, gen mã hóa chitinase đã được tách từ các đối

tượng sinh vật khác nhau và biểu hiện trong vi khuẩn E coli để tạo ra lượng lớn

phục vụ cho nhiều lĩnh vực

Barboza-Corona và đồng tác giả (2003) đã nhân dòng và biểu hiện gen mã

hóa endochitinase từ vi khuẩn B thuringiensis trong vi khuẩn E coli DH5α

Phân tử protein được tạo ra gồm 676 amino acid, có khối lượng 74 kDa Nhiệt

độ và pH tối ưu của chitinase tái tổ hợp lần lượt là 57,2°C và pH 6,0 [22]

Bên cạnh sự biểu hiện gen mã hóa chitinase ở các sinh vật nhân sơ trong vi

khuẩn E coli, nhiều gen mã hóa chitinase ở các nhóm Eucaryote cũng được biểu

Trang 37

hiện trong vi khuẩn E coli với mục đích nghiên cứu khả năng biểu hiện của

chúng Songjang và đồng tác giả (2006) đã phân lập gen mã hóa chitinase từ

chủng nấm B bassiana BCC3653 có kích thước 1047 bp và biểu hiện thành công trong vi khuẩn E coli TOP10 sử dụng vector pSE420, protein biểu hiện có

kích thước ~36 kDa [126] Năm 2008, Zhu và đồng tác giả đã phân lập và biểu

hiện thành công gen mã hóa chitinase từ nấm L lecanii trong vi khuẩn E coli sử

dụng vector pMAL-c2X Protein tái tổ hợp có kích thước 88,4 kDa (do xuất hiện quá trình dimer hóa) và hoạt tính enzyme đạt tối đa 53,1 mU/ml [151]

Ngoài ra, gen mã hóa chitinase ở thực vật cũng được biểu hiện trong vi

khuẩn E coli Nghiên cứu của Abd Elhamid và đồng tác giả (2010) đã phân lập gen mã hóa endochitinase dài 798 bp từ lúa mì Hordeum vulgare và biểu hiện ở

vi khuẩn E coli, protein tái tổ hợp được sinh ra có khối lượng 29 kDa gồm

266 amino acid Enzyme này có khả năng chống lại một số tác nhân gây bệnh

như sâu, bệnh đốm thuốc lá, nấm bệnh F oxysporium và F solani [15]

Tuy nhiên, các enzyme tái tổ hợp được biểu hiện trong vi khuẩn E coli còn

gặp phải một số hạn chế như chúng không hình thành được đúng cấu trúc giống trong tự nhiên và các protein được biểu hiện cao thường ở dạng không tan Thêm vào đó, quá trình sửa đổi sau dịch mã rất cần thiết để hình thành các protein có

hoạt tính đã không xảy ra ở vi khuẩn E coli Để giải quyết vấn đề này, các

nghiên cứu đi theo hướng đưa các protein tái tổ hợp tiết ra ngoài môi trường nuôi cấy bằng cách sử dụng các promoter, trình tự tín hiệu và các vật chủ khác nhau

để biểu hiện ở một số điều kiện hoặc biểu hiện cùng các chaperone giúp hình thành các protein có hoạt tính Ngoài ra, protein ngoại bào còn có một số thuận lợi so với protein nội bào như là hầu hết nó ở dạng hòa tan, có hoạt tính sinh học

và ít bị phân cắt bởi protease Đặc biệt, việc tinh sạch protein ngoại bào đơn giản

và ít tốn kém hơn nội bào [29]

Trang 38

1.4.1.2 Biểu hiện chitinase trong vi khuẩn Bacillus

Ngoài việc sử dụng vi khuẩn E coli là hệ biểu hiện, vi khuẩn Bacillus được

coi là đối tượng giúp nâng cao năng suất biểu hiện Nghiên cứu của Okay và

đồng tác giả (2005) nhận thấy, khi sử dụng vi khuẩn B thuringensis biểu hiện gen mã hóa chitinase từ vi khuẩn S marcescens BN10 sử dụng vector pHT315

với promoter cry3Aa11 hoạt tính riêng của enzyme tái tổ hợp đạt

5056 U/phút/mg và hiệu suất cao gấp 6,3 lần so với chủng gốc [101]

1.4.1.3 Biểu hiện chitinase trong nấm men

Một số chitinase từ các loài nấm sợi hoặc sinh vật bậc cao đã được biểu

hiện thành công ở nấm men P pastoris và S cerevisia Gan và đồng tác giả (2007) đã biểu hiện gen mã hóa chitinase từ nấm L psalliotae trong nấm men

P pastoris GS115 bằng việc sử dụng vector pPIC9K Protein tái tổ hợp tạo

thành có khối lượng 45 kDa, được mã hóa bởi 423 amino acid; protein này có nhiệt độ và pH tối ưu lần lượt là 37,6°C và pH 7,0 [42]

Năm 2012, Prasad và Palanivelu đã phân lập được gen mã hóa chitinase từ

chủng nấm T lanugunosus ATCC 44008 và biểu hiện trong nấm men

S cerevisiae SEY 2101 Chitinase tái tổ hợp được tạo ra có khối lượng khoảng

42 kDa, hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 60°C và pH 6,5 Enzyme này duy trì hoạt tính trên 60% sau ủ 6 giờ ở 50°C [108] Gen mã hóa endochitinase từ chủng

nấm T virens UKM1 được phân lập có chiều dài 1169 bp và biểu hiện trong nấm men P pastoris X33 sử dụng vector pPICZαC Protein tái tổ hợp tinh sạch có

khối lượng 35 kDa, nhiệt độ và pH tối lần lượt là 35°C và pH 6,0 Enzyme này bền ở dải nhiệt độ từ 30-55°C, dải pH từ 5,0-7,0 và hoạt tính riêng đạt 1,34 U/mg protein [16]

1.4.1.4 Biểu hiện chitinase trong thực vật

Bên cạnh việc đưa gen mã hóa chitinase từ các vi sinh vật biểu hiện trong

vi khuẩn, nấm men, một số tác giả đã biểu hiện các gen mã hóa chitinase từ vi sinh vật trong thực vật nhằm giúp thực vật nâng cao sức đề kháng với tác nhân

Trang 39

gây bệnh Từ nấm M anisopliae, Kern và đồng tác giả (2010) đã phân lập được

gen mã hóa endochitinase dưới sự kiểm soát của promoter CaMV35S và chuyển vào cây thuốc lá Sau đó tiến hành sàng lọc các dòng thuốc lá tái tổ hợp, thu được 2 dòng biểu hiện hoạt tính chitinase cao và có khả năng chống lại nấm

bệnh R solani [63] Rana và đồng tác giả (2012) phân lập 2 gen mã hóa chitinase

và chitosanase từ nấm T harzianum và chuyển vào cây lúa mì Triticum aestivum L giúp cây có khả năng chống lại nấm mốc trắng [114]

Ngoài việc đưa các gen mã hóa chitinase từ vi sinh vật vào thực vật, các gen mã hóa chitinase từ động vật cũng được được chuyển vào trong thực vật giúp thực vật có khả năng chống lại các loài côn trùng gây bệnh Nghiên cứu của Ding và đồng tác giả (1998) nhận thấy, cây thuốc lá chuyển gen chitinase từ côn

trùng có khả năng chống lại sâu bướm (Heliothis virescens) Ấu trùng bướm

giảm đáng kể sau khi ăn phải thuốc lá chuyển gen [35]

Ngoài ra, một số tác giả cũng phân lập gen mã chitinase từ thực vật và chuyển vào thực vật giúp thực vật nâng cao khả năng tiết chitinase Nirala và đồng tác giả (2010) đã nghiên cứu qui trình chuyển gen mã hóa chitinase từ cây

lúa vào cây nho (Vitis vinifera L.) sử dụng vector pGL2 nhờ vi khuẩn

A tumerfaciens nhằm tăng khả năng kháng lại nấm bệnh hại cây trồng [98]

1.4.2 Ở Việt Nam

Cho đến nay, ở Việt Nam đã có nhiều tác giả nghiên cứu về chitinase dựa trên những ứng dụng trong việc xử lý môi trường và khả năng ức chế chống lại nấm bệnh hại cây trồng

Nghiên cứu về vai trò của chitinase đã được một số tác giả chứng minh như: Nguyễn Thị Tuyết Nhung và đồng tác giả (2004) khi nghiên cứu khả năng

đối kháng nấm F oxysporum và Phytophthora của một số chủng vi khuẩn đã phân lập được vi khuẩn S liquefaciens 1A8 có khả năng sinh tổng hợp chitinase

cao trong môi trường có chứa chitin keo, ở 20°C và pH 7,0; trong dãy nồng độ NaCl 0,25-3,0% sau 48 giờ nuôi [10] Khi nghiên cứu về cơ chất cảm ứng cho

Trang 40

quá trình sinh tổng hợp chitinase, Cao Cường và Nguyễn Đức Lượng (2003)

nhận thấy nấm T harzianum có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao khi sử

dụng chitin vỏ tôm, chitin vách tế bào nấm và CMC; trong đó chitin từ vách tế bào nấm kích thích chitinase sinh ra cao nhất (đạt 5589,72 đvht/ml) sau 4 ngày

Chitinase từ nấm T harzianum có khả năng phân hủy vách khuẩn ty nấm

S rolfsii, làm cho khuẩn ty nấm S rolfsii nhăn nheo, đứt vụn và biến dạng [2]

Năm 2007, Đinh Minh Hiệp và đồng tác giả đã khảo sát hoạt tính chitinase từ

một số chủng nấm Trichoderma phân lập tại Việt Nam Kết quả cho thấy, có 24/92 chủng nấm Trichoderma cho hoạt tính chitinase cao (hoạt tính ≥ 14x10-2

đvht/ml) [5] Trong số 36 chủng nấm Trichoderma phân lập từ đất vùng Đông Nam Bộ, chủng Trichoderma TĐ14 sinh chitinase cao nhất sau 7 ngày nuôi được

sử dụng để tạo chitinase Chế phẩm chitinase thô có hoạt tính đạt 18,93 đvht/mg protein sau khi tủa với muối (NH4)2SO4 75% bão hòa được sử dụng để nghiên

cứu khả năng kháng nấm C albicans Kết quả cho thấy, chế phẩm này có khả năng kháng nấm C albicans ở nồng độ 2 mg/ml, giá trị MIC (nồng độ chitinase

thấp nhất mà ở nồng độ đó không còn quan sát thấy sự phát triển của vi nấm gây bệnh) là 4 mg/ml [6]

Quá trình tối ưu sinh tổng hợp chitinase cũng là hướng nghiên cứu được thực hiện Năm 2012, bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm, Quách Ngọc Tùng và đồng tác giả đã lựa chọn được môi trường tối ưu cho vi khuẩn

B licheniformis DS23 sinh tổng hợp chitinase cao nhất Môi trường tối ưu gồm

(g/l) cao nấm men 5,9; pepton 4,9; chitin 7,2; KH2PO4 0,5 sau 48 giờ lên men ở 30°C, hoạt tính chitinase đạt 110,3 U/ml, cao gấp 3,2 lần so với trước tối ưu Chitinase thô từ chủng này hoạt động tốt ở dải nhiệt độ 40-70°C và pH 5,0-7,0; một số ion kim loại như Co2+

, Mn2+, Ca2+ ở nồng độ 1 và 100 mM làm tăng hoạt tính enzyme; trong khi các ion Ba2+, Fe2+ và Sn2+ ở nồng độ tương ứng làm giảm hoạt tính enzyme [11] Năm 2013, Vũ Thị Thanh và đồng tác giả đã phân lập

được chủng nấm Penicillium sp M4 có hiệu lực diệt rệp ngô cao (đạt 92,3% sau

7 ngày phun) và được sử dụng để nghiên cứu khả năng sinh chitinase Điều kiện

Định dạng
Số trang	131
Dung lượng	3,11 MB

Xác định đa hình kiểu gene ACE ID bằng kỹ thuật PCR và ACTN3 r577x bằng kỹ thuật PCR RFLP của một số vận động viên điền kinh và bơi lội ở việt nam

Phƣơng pháp nghiên cứu

Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase