Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của lợn con theo mẹ mắc bệnh viêm ruột hoại tử do clostridium perfringens và đề xuất biện pháp phòng trị

Một trong những bệnh tiêu chảy ở lợn con gây thiệt hại lớn về kinh tế cho người chăn nuôi là bệnh viêm ruột hoại tử VRHT ở lợn con theo mẹ.. Bệnh gây viêm ruột hoại tử, rối loạn đường ti

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

NGUYỄN VIỆT DŨNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN CON THEO MẸ

MẮC BỆNH VIÊM RUỘT HOẠI TỬ DO CLOSTRIDIUM

PERFRINGENS VÀ ĐỀ XUẤT BIỆN PHÁP ĐIỀU TRỊ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện cùng với sự cộng tác giúp đỡ của PGS.TS Nguyễn Hữu Nam - Trưởng bộ môn Bệnh lý - Học viện Nông nghiệp Việt Nam Các số liệu, hình ảnh và kết quả trong luận văn

là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác Tôi xin đảm bảo rằng các thông tin, trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Nguyễn Việt Dũng

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Học viên Nông nghiệp Việt Nam, Bộ môn bệnh

lý thú y và Trường Đại học Nông Lâm Bắc Giang đã tạo điều kiện giúp đỡ cho tôi hoàn thành luận văn này

Xin bày tỏ lòng biết ơn PGS TS Nguyễn Hữu Nam, trưởng bộ môn Bệnh

lý thú y, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn của mình

Để góp phần thực hiện thành công luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp

đỡ động viên lớn của gia đình và đồng nghiệp Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với mọi sự giúp đỡ quí báu đó

Xin trân trọng cảm ơn !

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Nguyễn Việt Dũng

1.3.1 Bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn con do C perfringens typ C gây ra 11

1.3.2 Bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn con do C perfringens typ A gây ra 15

2.2.2 Thời gian nghiên cứu 22

2.5.6 Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của chủng

3.1 Kết quả xác định tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết và tỷ lệ tử vong của lợn con mắc

3.7 Kết quả xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của chủng

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

3.1 Kết quả điều tra tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết, tỷ lệ tử vong ở lợn mắc VRHT

3.2 Kết quả xác định tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết, tỷ lệ tử vong ở lợn do mắc bệnh

3.4 Kết quả phân lập vi khuẩn C perfringens trong bệnh phẩm của lợn bị

3.5 Kết quả giám định đặc tính sinh học của các chủng C perfringens

3.12 So sánh giá trị trung bình hàm lượng Hemoglobin (g/l) của lợn bệnh

3.17 So sánh giá trị trung bình số lượng bạch cầu của lợn bệnh với lợn

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

3.1 Biểu đồ so sánh tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết, tỷ lệ tử vong ở lợn do mắc

DANH MỤC HÌNH ẢNH

3.11 Gan sung huyết nghiêm trọng, hồng cầu tràn ngập vi quản xuyên tâm

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong những năm gần đây, nền nông nghiệp nước ta đang ngày càng phát triển, trong đó ngành chăn nuôi đóng vai trò rất quan trọng trong sự tăng trưởng chung của đất nước Chăn nuôi đã và đang trở thành ngành sản xuất chính trong cơ cấu nông nghiệp, đặc biệt chăn nuôi lợn ngày càng chiếm ưu thế Theo Niên giám thông kê năm 2012, tỉ trọng giá trị ngành chăn nuôi trong toàn ngành nông nghiệp trong năm 2012 là 26,8%, tỉ trọng giá trị chăn nuôi lợn trong ngành chăn nuôi là 78% (http://www.gso.gov.vn/)

Chăn nuôi lợn đã góp phần đáp ứng nhu cầu tiêu dùng trong nước, giải quyết công ăn việc làm, xóa đói giảm nghèo và tăng thu nhập cho nông dân Theo thống

kê của tổ chức nông lương thực thế giới (FAO), Việt Nam là nước nuôi nhiều lợn đứng 7 trên thế giới, thứ 2 châu Á và ở vị trí hàng đầu khu vực Đông Nam Á Sản lượng thịt lợn của Việt Nam đứng thứ nhất Đông Nam Á (chiếm 42,2%) và đứng thứ 2 châu Á sau Trung Quốc (http://www.baomoi.com/Chan-nuoi-lon-Thieu-quy-hoach-tong-the/45/13655798.epi)

Tuy nhiên, chăn nuôi lợn ở nước ta phổ biến là quy mô nhỏ, chiếm 70% về đầu con và 60% về sản lượng, phân tán trong nông hộ với trên 4 triệu hộ; trong đó chỉ có 1% số hộ nuôi từ 50 con trở lên, 12,7% số hộ nuôi 10 - 50 con Số hộ nuôi 1 -

2 con chiếm tới 51,8%… dẫn tới năng suất chăn nuôi thấp, giá thành đầu vào cao

Vì vậy, hiệu quả kinh tế do chăn nuôi lợn đem lại là chưa cao Do đó, xu hướng chuyển dịch từ chăn nuôi nhỏ lẻ sang chăn nuôi tập trung quy mô lớn là yêu cầu cấp thiết đối với ngành chăn nuôi

Trong những năm gần đây xu hướng chuyển dịch từ chăn nuôi nhỏ lẻ sang chăn nuôi tập trung quy mô lớn, cải thiện môi trường chăn nuôi, đa dạng giống vật nuôi, chăn nuôi nhiều giống mới có năng suất và chất lượng cao kết hợp với việc áp dụng các kĩ thuật chăn nuôi tiên tiến, hiện đại, ngành chăn nuôi bước đầu đã gặt hái được những thành tựu đáng kể

Tuy nhiên, chăn nuôi nói chung và chăn nuôi lợn nói riêng vẫn gặp phải

những khó khăn trong việc kiểm soát, phòng chống dịch bệnh Dịch bệnh ở đàn lợn vẫn xảy ra thường xuyên, trong đó hội chứng tiêu chảy ở lợn con với các đặc điểm dịch tễ phức tạp đã làm giảm số lượng, chất lượng lợn giống, gây thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi

Một trong những bệnh tiêu chảy ở lợn con gây thiệt hại lớn về kinh tế cho người chăn nuôi là bệnh viêm ruột hoại tử (VRHT) ở lợn con theo mẹ Nguyên

nhân gây tiêu chảy ra máu ở lợn chủ yếu là do vi khuẩn Clostridium perfringens

(C perfringens) typ C gây ra Đây là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy

hiểm với lợn con Bệnh gây viêm ruột hoại tử, rối loạn đường tiêu hóa, khi mắc bệnh thường tiêu chảy ra máu, phân thối khắm lẫn keo nhầy, lợn con chết nhanh

và chết nhiều

Theo Phan Thanh Phượng và cs (1996), vi khuẩn C perfringens gây viêm ruột

hoại tử xuất huyết trầm trọng, cấp tính ở lợn sơ sinh, tỷ lệ chết do bệnh này gây ra

từ 50 – 100%

Tuy nhiên, đặc điểm bệnh lý trên lợn bệnh do C perfringens gây ra chưa có

những nghiên cứu đầy đủ, do đó người chăn nuôi chưa hiểu rõ về mức độ nghiêm

trọng của bệnh viêm ruột hoại tử do C perfringens gây ra

Xuất phát từ thực tiễn nêu trên cũng như để hiểu biết rõ hơn về bệnh viêm ruột

hoại tử do vi khuẩn C perfringens gây ra, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của lợn con theo mẹ mắc bệnh viêm ruột hoại tử

do Clostridium perfringens và đề xuất biện pháp điều trị”

2 Mục tiêu

- Làm rõ đặc điểm bệnh lý của lợn con theo mẹ bị VRHT do C perfringens

- Đề xuất một số phác đồ điều trị

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Đã xác định được đặc điểm bệnh lý của lợn con theo mẹ bị VRHT do C

các hộ chăn nuôi trong phòng trị hội chứng tiêu chảy ở lợn, góp phần giảm thiệt hại và tăng thu nhập trong chăn nuôi lợn

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới

1.1.1 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn do C perfringens gây ra từ lâu đã

gây nhiều thiệt hại cho chăn nuôi và cho sức khỏe cộng đồng Các thông báo về bệnh trên người lần đầu tiên đã được công bố vào những năm 70 của thế kỷ XX

Ở gia súc, năm 1994, bệnh viêm ruột hoại tử đã gây chết rất nhiều hươu nai Nguyễn Ngọc Nhiên và cs (1996) đã nghiên cứu và xác định được nguyên nhân gây

bệnh này là vi khuẩn C perfingens Kết quả cho thấy, C perfingens không chỉ gây

viêm ruột hoại tử cho lợn con, gây nhiễm độc ruột huyết cho ngựa con mà còn gây viêm ruột hoại tử cho hươu, nai ở mọi lứa tuổi Tuy nhiên, vào thời điểm này các

nhà khoa học vẫn chưa xác định được bệnh do C perfingens thuộc typ nào gây ra

Nghiên cứu của Phan Thanh Phượng và cs (1996) về bệnh viêm ruột tiêu chảy

ở lợn cũng đã thấy số lượng C perfingens tăng tới hàng triệu vi khuẩn trong 1 gam

phân so với lợn khỏe mạnh

Năm 1997, tại nhiều địa phương trong nước đã xuất hiện hiện tượng bê, nghé, trâu, bò chết đột ngột với số lượng lớn Ban đầu, bệnh này đã nhầm với bệnh

tụ huyết trùng bởi cả hai bệnh này đều gây chết đột ngột Tuy nhiên, khi áp dụng các biện pháp phòng trị tụ huyết trùng đối với các gia súc có triệu chứng của bệnh thì không thấy có hiệu quả Sau đó, các chẩn đoán trong phòng thí nghiệm đã xác

định được nguyên nhân gây bệnh là vi khuẩn C perfingens và E coli, trong đó, C

như: bệnh ký sinh trùng đường máu, khẩu phần ăn mất cân đối… các yếu tố này tác

động đến sự phát triển của vi khuẩn C perfingens, khả năng sản sinh độc tố ruột của vi

khuẩn tăng lên và gây bệnh (Lê Văn Tạo, 2006)

Trần Thị Hạnh (2000) đã nghiên cứu vai trò của vi khuẩn E coli và

là nguyên nhân gây bệnh chính, một tác nhân gây bệnh cũng quan trọng khác là C

Theo thông báo của Nguyễn Thị Nội và cs (1989), Lê Minh Chí (1995), trong một vài thập kỷ qua hội chứng tiêu chảy ở Việt Nam là một vấn đề thời sự, lợn ở rất nhiều địa phương bị bệnh và gây thiệt hại khá nghiêm trọng Theo các kết quả nghiên cứu của Hồ Văn Nam và cs (1997), Hoàng Văn Tuấn, Lê Văn Tạo (1998) cho thấy, tỷ lệ mắc bệnh đường tiêu hóa ở lợn rất cao, nhất là viêm ruột ỉa chảy Theo các tác giả: Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng và cs (1996), Hồ Văn Nam và cs (1995), cho dù bất cứ nguyên nhân nào dẫn đến tiêu chảy, thì hậu quả của nó cũng gây ra viêm nhiễm tổn thương thực thể đường tiêu hóa và cuối cùng là quá trình nhiễm trùng

Hồ Văn Nam và cs (1997) nhấn mạnh rằng: vi khuẩn đường ruột có vai trò không thể thiếu được trong hội chứng tiêu chảy Nguyễn Thị Nội và cs (1989), sau khi điều tra tình hình nhiễm vi khuẩn đường ruột tại một số cơ sở chăn nuôi lợn đã

có kết luận: nguyên nhân gây tiêu chảy chủ yếu ở một số cơ sở chăn nuôi lợn là do

E.coli, Salmonella, Streptococus, C perfingens bên cạnh đó còn thường xuyên

phân lập được Klebsiella, Proteus và Pseudomonas Đào Trọng Đạt, Phan Thanh

Phượng, Lê Ngọc Mỹ, Huỳnh Văn Kháng (1996) cho biết: đứng đầu trong số các

mầm bệnh vi khuẩn đường ruột gây tiêu chảy là E.coli Cũng theo tác giả, vi khuẩn yếm khí C perfingens gây bệnh khi có điều kiện thuận lợi sẽ trở thành vai trò chính

gây tiêu chảy

Kết quả nghiên cứu trong nước của các tác giả Nguyễn Văn Sửu và cs (2008)

về tình hình mắc bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn con tại một số huyện của tỉnh Thái

Nguyên cho thấy, C perfingens là một trong các nguyên nhân gây bệnh quan trọng

trong hội chứng tiêu chảy ở lợn lứa tuổi 1 – 60 ngày

Năm 2008, tác giả Nguyễn Quang Tính đã thông báo kết quả nghiên cứu xác

định một số đặc tính và định typ của C perfingens phân lập từ dê bị tiêu chảy ở

tỉnh Thái Nguyên và sử dụng autovacxin phòng bệnh

Năm 2010, tiến sĩ Huỳnh Thị Mỹ Lệ đã có báo cáo “Nghiên cứu tình hình

nhiễm, vai trò của vi khuẩn C perfingens trong hội chứng tiêu chảy ở bò, lợn nuôi tại Hà Nội và các tỉnh phụ cận” Nghiên cứu đã khẳng định vai trò của vi khuẩn C

độc tố ruột và độc tố β-2 của các chủng C perfingens phân lập từ bò và lợn tại Việt Nam; đã giải trình tự gen một số chủng của vi khuẩn C perfingens, đem lại hiểu biết về dịch tễ học phân tử của vi khuẩn C perfingens tại Việt Nam

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về vai trò gây bệnh của

định được C perfingens đóng vai trò quan trọng trong việc gây bệnh (đặc biệt là

các bệnh đường tiêu hóa) ở người và các loài gia súc Hiện nay các nghiên cứu

thường tập trung vào cấu trúc phân tử các độc tố của C perfingens, phương pháp

xác định độc tố và vai trò gây bệnh của chúng (Camacho và cs, 2008)

Năm 1865, nhà vi trùng học Feser đã phát hiện ra vi khuẩn C perfingens đầu tiên trên mô bào của một số bò bị mắc bệnh tiêu chảy Vi khuẩn C perfingens được phân lập

đầu tiên vào năm 1892 bởi Welch và Nuttall trong tổ chức có hơi của xác người chết Năm 1931, bằng phương pháp trung hòa kháng độc tố với độc tố thu được từ

môi trường nuôi cấy vi khuẩn, Wilsdon đã phân lập được 4 typ C perfingens gây

bệnh là A, B, C, D Năm 1943, cũng bằng phương pháp trên Bosworth đã phát hiện thêm typ E (Hatheway, 1990)

Fairbrother J.M (2006) cho biết: tiêu chảy là một bệnh gây thiệt hại đáng kể cho ngành chăn nuôi lợn trên thế giới Bệnh xuất hiện ở cả ba lứa tuổi: lợn sơ sinh, lợn con theo mẹ và lợn sau cai sữa

Theo Khooteng Huat (1995) ở lợn có tới 11 loài virus và 16 loài vi khuẩn gây ra

hội chứng tiêu chảy, trong đó có C perfingens gây ra bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn con

Trong các typ vi khuẩn C perfingens gây bệnh, typ C có sự phân bố rộng và

khả năng gây bệnh cho người cũng như động vật cao hơn cả so với những typ khác

Viêm ruột hoại tử ở những động vật non do vi khuẩn C perfingens bởi typ C được

tìm ra ở Anh và Hungari từ năm 1955, sau đó vi khuẩn này được nghiên cứu và tìm

ra ở nhiều quốc gia khác trên thế giới như: Mỹ, Liên Xô, Hà Lan, Canada, Nhật Bản cũng như hầu hết các quốc gia trên thế giới, Taylor và cs (1986)

Đặc biệt, trong thời gian từ 1/10/2001 đến 31/12/2004, EU đã có chương trình

QLK2-2001-01267 “Nghiên cứu bệnh lý học và mối quan hệ của giống Clostridium

ở người, động vật và thực phẩm - nguyên nhân gây bệnh, dịch tễ học và cách phòng bệnh” Mục đích của chương trình giúp các nhà khoa học Châu Âu có thể trao đổi

những nghiên cứu và hiểu biết về giống Clostridium (Mainil và cs, 2006) Kết quả đã nêu rõ những đặc điểm dịch tễ bệnh do Clostridium gây ra, xác định các đặc tính của

vi khuẩn gây bệnh và đề xuất biện pháp phòng chống có hiệu quả Chương trình cũng

đem lại một sự hợp tác nghiên cứu toàn diện về Clostridium trong nhân y, thú y và vệ

sinh an toàn thực phẩm

1.2 Một số hiểu biết về vi khuẩn C perfingens

1.2.1 Tổng quan về giống, chi Clostridium

từ năm 1892 trong tổ chức xác hơi của người chết (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự,

1976) Vi khuẩn có tên gọi khi được phân lập lần đầu là Bacillus aerogenes

capsulatus Sau này vi khuẩn được đổi tên thành Bacillus enteritidis sporogenes,

khuẩn có tên khoa học chính thức là C perfringens

Vi khuẩn C perfringens thuộc họ Bacillaceae, giống Clostridia là vi khuẩn kị

khí, có khả năng hình thành nha bào và H2S Vi khuẩn này phân bố rộng rãi trong tự nhiên (đất, nước, phân và không khí) do đó dễ nhiễm vào thức ăn và gây ngộ độc

Sự phân bố rộng rãi mầm bệnh trong tự nhiên, nguồn nước, vật liệu, dụng cụ chăn nuôi, phương tiện vận chuyển… là những nhân tố quan trọng tham gia vào sự phát tán mầm bệnh đi khắp nơi

1.2.2 Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

C perfringens là trực khuẩn thẳng, hai đầu tròn, có kích thước 0,8 - 1,5 x 3 - 8

µm Vi khuẩn bắt mầu gram (+), trong canh khuẩn già có thể bắt mầu gram (-) Trong

tổ chức bệnh, trong canh khuẩn non thấy vi khuẩn ngắn mập, đứng riêng lẻ hoặc ghép đôi thành song trực khuẩn Trong canh khuẩn già có hình dài, uốn cong hoặc sợi dài Vi khuẩn không có lông, không di động có hình thành giáp mô, có khả năng hình thành nha bào trong môi trường trung tính hoặc kiềm, kích thước nha bào lớn hơn chiều ngang thân vi khuẩn nên thường làm biến dạng vi khuẩn, thường nằm ở giữa hoặc gần ở 1 đầu (Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương, 1997) Nha bào to hơn thân vi khuẩn, có hình oval cân xứng hay lệch tâm

Vi khuẩn có thể hình thành giáp mô trong cơ thể bệnh, hình thành nha bào trong môi trường trung tính hoặc kiềm, trong thực tế rất ít khi quan sát được nha bào Khi nuôi cấy trên môi trường thích hợp vi khuẩn mọc có đặc điểm:

- Trên môi trường nước thịt gan yếm khí: Vi khuẩn phát triển nhanh chóng làm đục môi trường, sinh nhiều hơi, khi mở nắp có nhiều bọt khí

- Trên môi trường thạch máu có 2% Glucose: vi khuẩn tạo ra các khuẩn lạc xung quanh có vòng dung huyết đôi đặc trưng, vòng ngoài tan máu không hoàn toàn Hiện tượng dung huyết được hình thành do các độc tố Alpha (α), Beta (β) và Theta (υ) Hiện tượng dung huyết có xảy ra hay không và mức độ của nó phụ thuộc vào độc tố của vi khuẩn được sinh ra và hồng cầu của loài động vật nào đưa vào môi trường Thường thì máu cừu và bò gây dung huyết mạnh

- Khi nuôi cấy vào môi trường sữa quỳ (Litmus milk medium): vi khuẩn phát triển tạo thành dạng vẩn mây điển hình do đường lactose trong môi trường bị lên men, tạo ra acid, làm đông vón casein và làm chuyển màu môi trường, từ màu xanh da trời thành màu hồng Sau đó, các đám vẩn acid đó bị vỡ, nứt ra do sự hình thành hơi

- Trên môi trường có huyết thanh người hay lòng đỏ trứng gà: vi khuẩn phát triển, làm phân hủy chất lecithin trong môi trường, tạo ra 1 vùng màu trắng đục ở quanh đường cấy vi khuẩn

chính kể trên, hầu hết các chủng C perfringens sản xuất nhiều loại độc tố ngoại

bào và enzyme khác nhau, gây ra quá trình bệnh phong phú về thể loại và phức tạp trong bệnh lý Mặt khác, mỗi loại độc tố có vai trò quan trọng trong việc nhận biết

các chủng gây bệnh khác nhau của C perfringens (Nguyễn Vĩnh Phước, 1976)

Các độc tố còn lại là Gamma, Delta, Eta, Theta, Kappa, Lambda, Mu, Nu, Neuraminidase và độc tố ruột

- Độc tố alpha (α - toxin): là một photpholipase C, kích thước 42,5 kDa (370 amino axit) Chúng phá hủy hồng cầu, là độc tố gây chết, hoại tử tổ chức mềm, được gọi là nguyên nhân gây hoại tử cơ trong bệnh hoại thư sinh hơi, có khả năng dung huyết, ảnh hưởng đến chức năng của tim (gây giảm huyết áp và rối loạn nhịp tim làm

con vật shock) Độc tố này được sản sinh bởi tất cả các typ C perfringens, hình

thành vùng dung huyết không hoàn toàn khi nuôi cấy trên môi trường thạch máu

- Độc tố beta (β - toxin còn gọi là β - 1): là độc tố gây chết và hoại tử, là nguyên nhân gây viêm ruột hoại tử xuất huyết, làm tăng huyết áp và giảm nhịp tim Hiện nay người ta quan tâm nhiều tới vai trò gây bệnh của độc tố β - 2 phát hiện lần

đầu tiên năm 1997 phân lập từ chủng C perfringens CWC245 thuộc typ C gây

bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn con (Gibert và cs., 1997) Đã có nhiều nghiên cứu

chứng minh được C perfringens mang độc tố β - 2 là nguyên nhân gây tiêu chảy ở

lợn con (Gibert và cs., 1997; Johansson và cs., 2006; Petit và cs., 1999; Songer và Uzal, 2005; Waters và cs., 2003)

- Độc tố epsilon (ε - toxin): Độc tố ε là một tiền độc tố được hoạt hóa bởi enzyme phẩn giải protein và được sản sinh ra bởi các chủng typ B và D Độc tố này làm tăng khả năng lên men của ruột non, do vậy làm tăng việc hấp thu của chính độc tố này Độc tố ε cũng đóng vai trò như một độc tố gây chết Trong trường hợp

này, nó gây ra sưng và xuất huyết thận, phù phổi, tràn dịch màng tim Chuỗi nucleotide của gene mã hóa độc tố ε chỉ ra rằng tiền độc tố này ở dạng trưởng thành

có 297 amino acid với khối lượng phân tử là 33 kDa Độc tố ε ít gây bệnh ở gia súc non hơn ở gia súc trưởng thành

- Độc tố iota (ι - toxin): Đây là một loại độc tố kép gồm hai tiểu đơn vị là ι - a

và ι - b Hai tiểu đơn vị này khác nhau về mặt hóa sinh và miễn dịch học Chuỗi gene mã hóa các tiểu đơn vị này đã được xác định và chuỗi amino acid dùng cho protein hoạt động chức năng nằm trong nhóm polipeptit có khối lượng phân tử từ 40

- 81 kDa Chuỗi này không thể tự thực hiện được điều đó; ι - b nhận diện vị trí nối trên tế bào vỏ não, nối vào vị trí đó và tác động qua lại để giúp ι - a xâm nhập vào tế

bào đích Độc tố ι của C perfringens được sản sinh từ C perfringens typ E, được

hoạt hóa bởi Trypsinase hay tự hoạt hóa khi có mặt độc tố λ

- Độc tố ruột: được sản sinh bởi C perfringens là nguyên nhân gây bệnh tiêu

chảy do ngộ độc thực phẩm sau khi tiêu thụ một lượng thức ăn nhiễm vi khuẩn Độc

tố ruột được sản sinh bởi C perfringens các typ A, C và D Hầu hết các chủng của

typ A đều có khả năng sản sinh ra độc tố ruột

Độc tố ruột được sản sinh trong ruột trong quá trình tạo nha bào của vi khuẩn Độc tố ruột được sản sinh trong ruột trong quá trình tạo nha bào của vi khuẩn Độc

tố ruột có khả năng phản ứng với bề mặt tế bào biểu mô ruột, gây phá hủy mô và gây rối loạn dịch trong khoang ruột

Độc tố ruột của C perfringens khi được tách và tinh khiết là một chuỗi peptit

có trọng lượng phân tử 35 kDa gồm 309 acid amin, độ đẳng điện pH = 4,3 C

gấp 3 khi kết hợp với Trypsin, tạo thành 1 protein gồm 284 acid amin và 2 chuỗi peptit ngắn gồm 10 - 15 acid amin

- Các độc tố phụ của C perfringens:

+ Độc tố Gamma (γ - toxin): độc tố này không có vai trò chủ yếu gây chết vật chủ,

không gây hoại tử và tan máu, chúng được sinh bởi C perfringens typ B, typ C

+ Độc tố Dellta (δ - toxin): là độc tố gây chết và tan máu do chúng dung giải

hồng cầu, được sinh ra bởi C perfringens typ B, C

+ Độc tố Theta (θ - toxin): là độc tố gây chết và tan máu

+ Độc tố Kappa (K - toxin): là một enzyme collagenaza, được sinh ra bởi các

typ C perfringens

+ Độc tố Lambda (λ - toxin): là enzym proteinaza và gelatinaza sinh ra bởi C perfringens typ B, D, E

gặp hyaluronic (Polisacharide) trong mô liên kết, được sinh ra bởi C perfringens

tye B và một số từ typ A, C, D, E

+ Độc tố Nu (V - toxin): là enzym deoxyribonucleaza, có nhiều tác động khác

nhau đến hồng cầu, được sinh ra bởi C perfringens typ A, B, C, D, E

2.2.4 Các typ của vi khuẩn C perfringens

Vi khuẩn C perfringens từ lâu đã được công nhận là một tác nhân gây bệnh quan

trọng cho cả con người và động vật Năm 1931, căn cứ vào khả năng trung hòa trên chuột của huyết thanh kháng độc tố có trong chất lọc canh trùng nuôi cấy vi khuẩn, đã chia vi khuẩn này thành 4 typ là A, B, C, D Năm 1943, typ thứ năm là typ E được

Bosworth phát hiện Như vật, tới nay vi khuẩn C perfringens đã được chia thành năm

typ A, B, C, D, E theo sự tồn tại của bốn độc tố chính là đôc tố alpha (α – toxin); độc

tố beta (β – toxin); độc tố epsilon (ε – toxin) và độc tố iota (ι – toxin)

ở người và gia cầm, sản xuất độc tố chủ yếu là α

- C perfringens typ B: có khả năng sản sinh nhiều loại độc tố α, β, ε gây bệnh lỵ

ở cừu non, viêm ruột xuất huyết ở bê và ngựa non, nhiễm độc tố ruột huyết ở cừu

trên gia súc thường gặp ở bê, nghé, dê, cừu và lợn con Trong các typ vi khuẩn C

cũng như động vật cao hơn cả so với những typ khác Viêm ruột hoại tử ở những

động vật non do vi khuẩn C perfringens typ C được tìm ra ở Anh và Hungari từ

năm 1995, sau đó vi khuẩn này được nghiên cứu và tìm ra ở nhiều quốc gia khác trên thế giới như: Mỹ, Đan Mạch, Liên Xô, Hà Lan, Canada, Nhật Bản cũng như hầu hết ở các quốc gia trên thế giới

- C perfringens typ D: sản sinh độc tố chính là α và ε Typ này thường gây bệnh nhiễm độc ruột huyết ở cừu, bê và dê; gây nhũn thận ở người và nhiều loài động vật như cừu, trâu bò, dê và 1 số loài khác.

sinh độc tố chủ yếu là α và ι

Ngoài ra, còn một nhóm vi khuẩn C perfringens đặc biệt có độc tố β - 2

không được xếp vào một trong năm typ trên (Gibert và cs., 1997) Các chủng vi

khuẩn C perfringens mang độc tố ruột có thể gây bệnh đường tiêu hoá cho người

(đặc biệt là tiêu chảy) do ngộ độc thực phẩm Các vi khuẩn này cũng được tìm thấy

ở lợn con và ngựa bị rối loạn tiêu hóa

1.3 Một số hiểu biết về bệnh do C perfringens gây ra ở lợn con

Viêm ruột hoại tử ở lợn con do C perfringens được coi là một bệnh ở lợn con

từ năm 1995, khi những trường hợp bệnh đầu tiên được mô tả ở Anh và Hungari (Nguyễn Bá Hiên, 2001) Nhiều năm sau, bệnh đã được phát hiện và nghiên cứu ở

Mỹ (Barnes và Moon, 1964), Đan Mạch (Hogh, 1965), Cộng hòa Liên Bang Đức (Mathias, 1968) Đến nay, bệnh đã thấy ở hầu hết các nước trên thế giới (Bergeland, 1992)

Ở Việt Nam, bệnh viêm ruột ở lợn đã thấy tại nhiều cơ sở chăn nuôi lợn tập trung và đã gây nhiều thiệt hại cho lợn con lứa tuổi 1 – 4 tuần lễ (Bộ môn vi trùng, Viện Thú Y, 1985)

Hiện nay, người ta đã xác định được 2 typ gây ra bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn

con là do C perfringens typ A và typ C

1.3.1 Bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn con do C perfringens typ C gây ra

Bệnh VRHT ác tính ở lợn gây ra bởi C perfringens typ C thường gặp nhất ở

giai đoạn lợn con theo mẹ 1 - 14 ngày tuổi và đặc biệt xảy ra trầm trọng lúc sơ sinh, dưới 1 tuần tuổi Bệnh có biểu hiện lâm sàng tiêu chảy xuất huyết nặng và có

tỷ lệ tử vong cao trong trường hợp thể bệnh là cấp tính, ở thể á cấp tính mức độ hoại tử thường nhẹ hơn

Bệnh được mô tả lần đầu tiên vào năm 1955 ở Anh và Hungari, sau đó

Mỹ, Đan Mạch, Đức, Newzeland, Canada, Nhật cũng đều có thông báo phát hiện bệnh Đến nay, bệnh đã được phát hiện hầu hết ở các vùng chăn nuôi lợn trên

thế giới (Taylor D.J, 1986; Bergeland M.E 1986)

- Mầm gây bệnh

x 4 - 8µ m, tạo nha bào to hơn thân vi khuẩn, có hình trứng cân xứng hay lệch tâm Trong thực tế rất ít khi có thể quan sát được nha bào (Taylor D.J, 1986; Bergeland M.E, 1986)

Trên môi trường thạch máu cừu hay bò 7%, sau 24h nuôi cấy vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc rõ ràng, có đường kính 3 - 5mm màu xám, tròn,

dung khuyết kiểu beta C perfringens typ C sản sinh độc tố phần lớn là α và β,

nhưng chủ yếu là độc tố β gây hoại tử xuất huyết Đây cũng chính là nhân tố quan trọng nhất trong sinh bệnh học của bệnh này

Ngoài ra, trong quá trình nghiên cứu về bệnh VRHT do C perfringens typ C

gây ra trên lợn sơ sinh, Bakhtin A.G (1956) đã phát hiện trong một hội chứng

tương tự thấy C perfringens typ B cũng sản sinh ra β - toxin Sau này, Harbola P.C, Khera S.S (1990) cũng thông báo phát hiện thấy độc tố này ở C perfringens typ D

Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây của Radostits O.M (1994) đã khẳng định:

theo như hầu hết các đặc điểm mô tả lại thì đều thuộc vai trò gây bệnh của C

perfringens typ C

- Cơ chế sinh bệnh

Vi khuẩn C perfringens có trong hệ vi sinh vật đường ruột bình thường của

động vật và con người Vì vây, thường có 2 yếu tố gây nên bệnh: do vi khuẩn có

sẵn trong đường ruột và do thức ăn bị nhiễm C perfringens, cùng với một số thay

đổi về môi trường, khẩu phần thức ăn, thức ăn chứa nhiều protein… dẫn tới cơ thể

bị giảm nhu động ruột, giữ lại vi khuẩn trong cơ thể và cuối cùng, cơ thể hấp thu các độc tố gây bệnh Cacbonhydrat không tiêu hóa được là môi trường thuận lợi

cho vi khuẩn C perfringens sinh trưởng và phát triển nhanh chóng Bình thường,

vi khuẩn này có nhiều ở ruột già nhưng khi sức đề kháng của cơ thể giảm, vi khuẩn lại xâm nhập lên ruột non và sản sinh ra một lượng lớn độc tố gây nhiễm

độc đường ruột Trong đường tiêu hóa, với sự bội nhiễm về số lượng, vi khuẩn C

của độc tố gây xuất huyết, hoại tử tổ chức nhung mao ruột, từ đó lan dần vào sâu

tới các lớp niêm mạc ruột Trong nhiều trường hợp, vi khuẩn xâm nhập vào thành ruột tạo thành những ổ viêm nhiễm, gây khí thũng dưới lớp niêm mạc hoặc lớp cơ hay đi sâu vào trong các tổ chức hay các hạch lympho lân cận

- Dịch tễ

Vi khuẩn C perfringens typ C gây bệnh viêm ruột hoại tử cho lợn con dưới

7 ngày tuổi (thường lợn 3 ngày tuổi có tỉ lệ mắc bệnh rất cao), có thể gây bệnh mãn tính ở lợn lớn hơn từ 2 - 4 tuần tuổi và cả khi đã cai sữa (Mackinnon, 1989) Bệnh xảy ra ở hầu hết các nước trên thế giới Mầm bệnh thường được thải qua phân tồn tại lâu ở ngoài môi trường dưới dạng nha bào, có sức đề kháng với nhiệt độ, chất sát trùng, tia tử ngoại chính là nguồn lây lan bệnh cho lợn Taylor D.J, Bergeland M.E, (1992) cho biết: lợn con bị VRHT có tỷ lệ chết khá cao, nhiều khi lên tới 100% Đối với những chuồng nuôi không đảm bảo điều kiện vệ sinh, chính phân và da của lợn mẹ bị ô nhiễm bởi vi khuẩn yếm khí này là vật mang trùng, nguồn reo rắc mầm bệnh cho lợn sơ sinh Trong phân lợn nái chứa một số lượng ít vi

khuẩn C perfringens typ C nhưng vi khuẩn sẽ tăng lên rất nhiều, chiếm ưu thế trong

đường tiêu hóa của lợn con (có thể lên tới 108 - 109 CFU/g chất chứa trong vòng một vài giờ sau khi nhiễm), lấn át các vi khuẩn khác thuộc hệ vi sinh vật đường ruột và gây bệnh (Ohnuna và cs., 1992) Mầm bệnh thường được thải ra ngoài theo phân, tồn tại lâu trong môi trường chăn nuôi dưới dạng nha bào, có sức đề kháng cao với nhiệt

độ, tia tử ngoại, chất sát trùng chính là nguồn gây bệnh cho lợn

Ở Việt Nam, bệnh thường xảy ra vào mùa mưa, nóng ẩm từ mùa hè đến mùa thu Thông thường 3 - 4 đàn hoặc một số con trong đàn bị bệnh, nhưng cũng có những thông báo về dịch xảy ra trên 50 đàn (Taylor, 2006) Bệnh làm lợn chết với

tỷ lệ cao 50 – 100% Hog (1967) đã theo dõi ở 24 đàn lợn bị bệnh ở Đan Mạch thấy

tỉ lệ chết là 54% Ở Việt Nam, các đàn lợn con theo mẹ ở lứa tuổi 2 - 3 tuần tuổi thuộc nông trường Toàn Thắng (1982) có tỷ lệ chết từ 60 - 80% (Bộ môn Vi trùng, Viện Thú Y, 1985)

- Triệu chứng lâm sàng

Lợn có thời gian ủ bệnh từ 1 - 2 ngày, sau đó thể hiện các thể bệnh sau:

+ Thể quá cấp tính: lợn con bị nhiễm trực khuẩn ngay sau khi sinh, rất yếu và chết ngay trong ngày thứ nhất hoặc ngày thứ hai Chúng thường thể hiện sự nhiễm

khuẩn ngay sau 10 giờ đầu sau sinh, thể hiện ỉa chảy và xuất huyết rất nặng, yếu ớt, không đi lại được, không bú được và chết nhanh

+ Thể cấp tính: bệnh đột ngột xuất hiện trong khoảng 2 ngày và lợn thường chết vào ngày thứ 3 Lợn bệnh có biểu hiện và triệu chứng như: phân lỏng có màu

đỏ nâu, hoại tử niêm mạc ruột, yếu ớt không đi lại được và chết thường vào ngày thứ 3 sau khi sinh

+ Thể thứ cấp tính: thường gặp ở lợn 5 - 7 ngày tuổi, lợn con không xuất hiện

ỉa chảy xuất huyết mà phân của lợn bệnh đầu tiên sệt màu vàng, sau là chất dịch nhày màu xám có nhiều niêm mạc ruột bị hoại tử bong ra, giống như nước gạo đặc Con vật vẫn hoạt động, ăn uống bình thường nhưng ngày càng gầy còm và chết do mất nước

+ Thể mãn tính: lợn bệnh ỉa chảy nhưng gián đoạn kéo dài từ 1 tuần đến nhiều tuần, phân màu vàng xám và có các mảng niêm mạc bị hoại tử, vùng đuôi và khoeo chân thường dính đầy phân Lợn bệnh có thể hồi phục sau 10 ngày hoặc hơn nhưng sau đó còi cọc, chậm lớn với tỷ lệ cao Phần lớn lợn bệnh bị chết sau 5 – 6 tuần do kiệt sức

- Bệnh tích

Lợn mắc VRHT do C perfringens typ C bị chết đột ngột thường thể trạng bình

thường và có thể không quan sát thấy phân ở vùng mông Khi dùng tăm bông ấn vào hậu môn hoặc kích thích nhẹ nhàng sẽ khiến cho phân có thể thải ra ngoài Phân thường nhão và có màu đỏ, vùng bụng biến màu chuyển sang màu xanh

Mổ khám lợn chết thấy:

+ Thể quá cấp tính: ruột non đỏ sẫm do xuất huyết Xuất huyết ở cả dạ dày, phần ruột non nối với ruột già và cả ruột già Các hạch ruột cũng sưng và xuất huyết đỏ Kiểm tra kính hiển vi có thể thấy lớp nhung mao ruột bị phá hủy, tróc ra từng mảng và xuất huyết sâu cả trong từng cơ vòng của ruột

+ Thể cấp tính: thấy hiện tượng hoại tử ruột rõ ràng hơn thể quá cấp tính nhưng xuất huyết thì ít hơn thể quá cấp tính Ruột có thể tổn thương từng đoạn dài tới 40 cm (Bergeland, 1992), không tràng bị viêm, xuất huyết có màng giả, thường căng phồng, có màu đỏ tím đậm, bên trong đầy chất chứa sền sệt có lẫn máu

+ Thể mãn tính: màng ruột có thể nhạt màu và sưng dày lên, trên niêm mạc ruột hình thành một lớp bựa hoặc nhiều dịch nhày, có nhiều đám hoại tử, mỗi đám

kéo dài từ 1 - 2 cm, kiểm tra kính hiển vi ở những đám hoại tử thấy có nhiều trực

khuẩn C perfringens và tổ chức viêm tiến triển

1.3.2 Bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn con do C perfringens typ A gây ra

Vi khuẩn C perfringens typ A là vi khuẩn thường xuyên có sẵn trong đường

ruột của lợn, có thể là nguyên nhân gây bệnh viêm ruột ở lợn con theo mẹ và lợn sau cai sữa Mầm bệnh có mặt ở trong đất, phân, chất chứa đường tiêu hóa nên bệnh có thể xảy ra bất kỳ lúc nào; cùng một trang trại có thể thấy nhiều con trong

đàn bị mắc bệnh (Taylor, 2006) Bệnh viêm ruột do C perfringens typ A chủ yếu là

gây hiện tượng tiêu chảy do tiết dịch còn hiện tượng hoại tử tế bào biểu mô ruột thì không rõ ràng

- Mầm gây bệnh

của typ A trên môi trường thạch máu tạo thành 2 vòng dung huyết đặc trưng Vòng

dung huyết ngoài tạo ra do α-toxin, còn vòng trong do γ-toxin

Một số C perfringens typ A sản sinh ra độc tố ruột khi tạo nha bào (dạng nha bào), có một số khác (C perfringens typ A dạng dinh dưỡng) sinh ra độc tố

ruột và thường tạo ra nhiều độc tố α Vì thế đã làm xuất hiện hai hội chứng có liên

quan đến C perfringens typ A Cả hai nhóm tạo nha bào sản sinh độc tố ruột và

nhóm tạo độc tố ruột sản sinh α - toxin khi ở dạng dinh dưỡng đều đã được xác minh ở trên lợn (Taylor D.J, 1986; Bergeland M.E, 1986)

- Đặc điểm dịch tễ

Vi khuẩn thường tồn tại ở chất chứa trong đường ruột và đất Nha bào có thể sống sót trong đá lạnh 00C và nước sôi 1000C trong 10 phút, nhưng các tế bào dinh dưỡng lại rất dễ bị tác động bởi nhiệt Trong thực tế, đặc điểm dịch tễ của bệnh do

còn nhiều điểm chưa được làm sáng tỏ

Bệnh xảy ra ở các trang trại chăn nuôi và trong một ổ lợn là sự kết hợp

của các nhóm C perfringens typ A, với các đặc tính sinh vật giống nhau Tuy

nhiên cho đến nay người ta vẫn chưa có thể xác định một cách chắc chắn chúng

thuộc nhóm vi khuẩn C perfringens typ A nào (dạng nha bào hay dinh dưỡng)

Taylor D.J (1986), Bergeland M.E (1986) cho biết: Một số nhóm C

độc thực phẩm cho người, thường xảy ra với đồ ăn nguội là thịt lợn và cho đến bây giờ người ta vẫn chưa biết một cách chính xác mối liên quan giữa các nhóm vi khuẩn gây ngộ độc cho người này với khả năng gây bệnh cho vật nuôi

- Sinh bênh học

Bệnh nhiễm khuẩn C perfringens typ A thường xảy ra ở lợn con sau khi đẻ

khoảng vài giờ, vi khuẩn có thể được tìm thấy ở ngay phân su Trong chất chứa ruột (đoạn ruột chay, ruột hồi) có thể phát hiện được 108 - 109 CFU/g tương đương với số lượng vi khuẩn có trong ruột già và trong phân Vi khuẩn dạng dinh dưỡng (Vegetative forms) sản sinh độc tố α và có thể một số độc tố khác gây hoại tử ở tế bào biểu mô ruột của lợn trong gây bệnh thực nghiệm

Dạng hình thành nha bào sản sinh độc tố ruột, gây hoại tử lông nhung khá nặng và hút nước vào trong lòng ruột, độc tố cố định vào tế bào biểu mô của ruột kết, làm mất khả năng tái hấp thu nước Kháng thể của cả hai loại độc tố ruột này

có trong sữa đầu, bệnh thường quan sát được khi lợn con đã cai sữa lúc 5 - 7 tuần tuổi (Taylor D.J, 1986; Bergeland M.E, 1986)

- Triệu chứng

bệnh chủ yếu là do nhiễm từ mẹ Lợn con có thể chết đột ngột trong vòng 48 giờ sau khi nhiễm bệnh Triệu chứng của lợn bệnh chủ yếu là ỉa chảy, phân nát màu vàng có lẫn màng nhày niêm mạc ruột và có các vệt máu tươi Con vật chậm chạp, bụng thóp, hậu môn dính bết, con vật không sốt, có thể chết sau khi sinh 36 – 48 giờ với tỉ lệ chết thấp

Trường hợp bệnh gây ra bởi C perfringens dạng nha bào, lợn bệnh tháo chảy

ra nước, kéo dài 24 - 48h Đối với lợn cai sữa từ 5 - 7 tuần tuổi, thường thấy ỉa chảy hoặc phân nhão khi nhiễm bệnh kéo dài 4 - 7 ngày Dạng ỉa chảy này lợn thường ít chết nhưng sau đó rất chậm hồi phục Lợn mắc bệnh thường do ăn phải thức ăn bị ô

nhiễm nha bào Clostridia

- Bệnh tích

Biến đổi bệnh lý đại thể quan sát được đó là: lợn bị bệnh thường biểu hiện mất

nước, thành ruột non dày, trong đó chất chứa tựa như bột nhão, rất hiếm trường hợp thấy có máu, niêm mạc viêm nhẹ và có dính chút ít chất hoại tử Trong ruột già cũng đầy chất chứa nhão, niêm mạc thường là bình thường hoặc thỉnh thoảng thấy

có mảnh vụn hoại tử Bệnh xảy ra trên lợn sau cai sữa rất ít thấy biến đổi bệnh lý trên niêm mạc ruột, nhưng có thể thấy bọt và các chất nhầy chứa trong ruột

Ruột non ở những lợn chết thường sung huyết, chất chứa có nhiều dịch và nước, nhưng không có máu Trên bề mặt niêm mạc không tràng và hồi tràng quan sát thấy các đám hoại tử Những quan sát sau khi mổ khám không thể chứng minh

được là trường hợp bệnh do viêm ruột C perfingens typ A Tuy nhiên, điều này giúp phân biệt bệnh do C perfingens typ B và C, vì những con bị bệnh không có

hiện tượng ruột non có màu đỏ đậm Ngoài hiện tượng xung huyết bên ngoài ruột

và xác chết màu thẫm, các biến đổi khác không rõ Trong thể bệnh mãn tính,

cũng có thể quan sát thấy một số biến đổi tương tự C perfingens typ C perfingens

typ A có thể phân lập được từ môi trường nuôi cấy ruột non của những động vật bị bệnh viêm ruột do một số nguyên nhân khác như bệnh viêm dạ dày ruột - ruột (TGE), rotavirus, cầu trùng và nhiễm crystosporidia Bệnh tích quan sát được cũng

như phần triệu chứng đã mô tả, tuy nhiên C perfingens typ A có thể gây teo lông

nhung và có chứa nhiều chất nhày niêm mạc

1.3.3 Chẩn đoán bệnh do C perfingens gây ra ở lợn

- Chẩn đoán lâm sàng: dựa vào triệu chứng lâm sàng, các đặc điểm dịch tễ học

và bệnh tích đặc trưng (bệnh thường chỉ xảy ra ở lợn con từ 1 - 30 ngày tuổi, nặng nhất là lứa tuổi từ 1 - 7 ngày với các hội chứng điển hình: ỉa chảy ra máu, xuất huyết, lợn chết đột ngột và hoại tử ruột)

- Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm: bệnh dễ nhầm lẫn với một số bệnh như cầu trùng lợn (do Isospora suis), bệnh do Rotavirus, bệnh PED, bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm do virus TGE… do đó cần lấy mẫu bệnh phẩm (thường là đoạn ruột non còn nguyên của lợn bệnh) để phân lập và xác định độc tố của vi khuẩn hoặc lấy ruột để làm tiêu bản chẩn đoán tổ chức học

Các bước tiến hành trong phòng thí nghiệm để chẩn đoán bệnh do C

perfingens gây ra:

+ Lấy bệnh phẩm: bệnh phẩm thường lấy là chất chứa ở ruột của gia súc chết hoặc phân gia súc nghi mắc bệnh Mẫu bệnh phẩm cần vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm trong điều kiện yếm khí

+ Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn trên các môi trường thích hợp: căn cứ vào tính chất mọc của vi khuẩn trên các môi trường để kết luận

+ Làm tiêu bản, nhuộm Gram, soi kính quan sát hình thái, tính chất bắt màu của vi khuẩn

+ Giám định các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn: khả năng lên men đường, phản ứng Catalase, Urease, khả năng sinh Indol, H2S…

+ Một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C perfingens được trình bày ở bảng sau:

Bảng 1.1 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C perfingens

+ Xác định độc tố của vi khuẩn: có thể sử dụng các phương pháp như thử trên chuột, sử dụng phản ứng miễn dịch đánh dấu enzyme (ELISA), phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch kép, phản ứng ngưng kết hồng cầu, phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính… Ngoài ra, ngày nay người ta còn sử dụng kỹ thuật PCR để

phân lập, xác định độc tố và định typ vi khuẩn C perfingens

1.3.4 Điều trị bệnh

Bệnh do vi khuẩn C perfingens gây ra khi đã xuất hiện các triệu chứng lâm

sàng đặc trưng thường rất khó can thiệp do bệnh tiến triển rất nhanh (Szabo và Szent – Ivanyi, 1957; Hog, 1967) Dùng kháng sinh có hiệu quả thì chỉ có thể loại

bỏ được vi khuẩn chứ không tác động được đến độc tố, con vật bệnh thường còi cọc

và chậm lớn Vì vậy, để giảm tỷ lệ tử vong cũng như thiệt hại về kinh tế trong chăn nuôi chúng ta cần tiến hành điều trị sớm Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh điều trị lại cho các kết quả khác nhau và hiện tại đã có nhiều công bố về sự kháng thuốc của một số chủng vi khuẩn này Do vậy, cần tiến hành làm kháng sinh đồ để nâng cao hiệu quả điều trị

Hiện nay, có rất nhiều loại kháng sinh được sử dụng để điều trị bệnh do C

perfingens gây ra như: Penicillin, Ceftiofur, Amoxicilin, Sulphamethoxazole + Trimethoprim, Enrofloxacin, Cephalosporin… và Bacitracin (đã bị cấm sử dụng ở Châu Âu)

Trong quá trình sử dụng kháng sinh để điều trị cần bổ sung thêm các thuốc trợ sức, trợ lực, các vitamin, chất điện giải, các chế phẩm sinh học để khôi phục hệ vi sinh vật đường ruột, thuốc để tạo khuôn phân (dung dịch Kaolin – pectin), kết hợp với công tác hộ lý chăm sóc Ngoài ra, cần chú ý đến vấn để xử lý môi trường, quét dọn, vệ sinh tiêu độc, khử trùng chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi, khu vực xung quanh để hạn chết mầm bệnh và sự xâm nhiễm của chúng đối với vật chủ

2.3.5 Phòng bệnh

- Vệ sinh phòng bệnh

Vi khuẩn C perfingens thường xuyên có mặt trong đường tiêu hóa của người,

động vật khỏe mạnh và phân bố nhiều ở trong môi trường tự nhiên Vì vậy, phòng bệnh phải bắt đầu từ việc vệ sinh phòng bệnh như: vệ sinh thức ăn, nước uống hàng

ngày, thường xuyên quét dọn và định kỳ tiêu độc sát trùng môi trường sống, chuồng trại và dụng cụ chăn nuôi, xử lý phân, chất thải và xác chết theo quy định Khâu nuôi dưỡng, chăm sóc có vai trò quan trọng, cần phải đảm bảo khẩu phần ăn hợp lý, cân đối các chất, hạn chế sử dụng kháng sinh qua đường tiêu hóa, đảm bảo cân bằng

hệ vi sinh vật đường ruột đồng thời khống chế các bệnh đường tiêu hóa khác

- Phòng bệnh bằng vaccine

Bệnh VRHT ở lợn có tỷ lệ chết rất cao, do đó việc sử dụng vaccine để tạo miễn dịch chủ động cho con vật là rất cần thiết Hiện tại, ở Việt Nam đang sử dụng một số loại vaccine để phòng bệnh cho lợn như:

+ LitterGuard LT – C: do hãng Pfizer Animal Health cung cấp, phòng bệnh do

+ Prosystem®TREC (hoặc Prosystem®2*1*4*3) do Intervet cung cấp, dùng

để phòng bệnh viêm dạ dày ruột (TGE); tiêu chảy do Rotavirus; phòng, chống bệnh

+ Colisuin – CL: là vaccine vô hoạt bổ trợ dầu, do hãng HIPRA (Tây Ban Nha) cung cấp, dùng để phòng bệnh E coli (K88, K99, 987P), bệnh viêm ruột hoại

tử ở lợn con do C perfingens typ C gây ra và bệnh chết đột ở lợn nái, lợn vỗ béo do

C novyi typ B

+ SCOURMUNE® - C: do hãng Schering – Plough Animal Health Corp (Mỹ)

cung cấp, phòng bệnh do E coli (K88, K99, 987P) và bệnh do C perfingens typ C

gây ra

+ ZAMBAC MD 100: do công ty CTCBIO sản xuất, dùng để kiểm soát và

phòng ngừa bệnh viêm ruột hoại tử do C perfingens trên gia súc, cải thiện năng

suất nái và heo con

Để phòng bệnh do C perfingens cho lợn con, theo Bergeland (1992), có thể sử dụng giải độc tố yếm khí C perfingens để tiêm cho lợn mẹ 2 lần trong thời kỳ mang

thai (lần tiêm thứ nhất vào giữa kỳ và nhắc lại lần 2 trước khi đẻ 2 – 3 tuần) Lợn con sẽ được bảo vệ bởi globulin miễn dịch trong sữa đầu, tác dụng phòng bệnh có thể kéo dài tới khi cai sữa

- Phòng bệnh bằng chế phẩm sinh học

Trần Thị Hạnh và Đặng Xuân Bình (2004) đã nghiên cứu và chế tạo thử

nghiệm thành công chế phẩm sinh học C perfingens – toxid để phòng và trị bệnh ỉa chảy ở lợn con do C perfingens gây ra Năm 2008, Phạm Thế Sơn và Phạm Khắc

Hiếu đã thử nghiệm chế phẩm EM – TK2 trong phòng và điều trị tiêu chảy ở lợn con và cho kết quả tốt, chế phẩm có tác dụng kháng khuẩn mạnh với các vi khuẩn

E coli , Salmonella và C perfingens

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Lợn con dưới 30 ngày tuổi (lợn trắng chủ yếu là landrace và yorkshire) khỏe

mạnh và mắc bệnh VRHT do vi khuẩn C perfringens gây ra

- Địa điểm theo dõi lợn bệnh và lấy mẫu: Việt Yên - Bắc Giang

2.2.2 Thời gian nghiên cứu

- Từ tháng 8/2013 đến tháng 10/2014

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết của lợn con mắc VRHT nghi do C

perfringens

- Phân lập vi khuẩn C perfringens

- Xác định triệu chứng lâm sàng của lợn mắc VRHT

- Xác định bệnh tích đại thể của lợn mắc VRHT

- Nghiên cứu bệnh tích vi thể của ruột, gan, thận, hạch, lách và phổi của lợn bệnh

- Xác định các chỉ tiêu huyết học của lợn bệnh

- Thử kháng sinh đồ với các chủng vi khuẩn C perfringens phân lập được

- Mẫu máu lấy từ lợn mắc tiêu chảy ra máu dưới 10 ngày tuổi

- Dụng cụ mổ khám, chẩn đoán: dao, kéo, panh…

- Hóa chất sử dụng để làm tiêu bản bệnh lý gồm: cồn, xylen, parafin, thuốc nhuộm Hematoxilin, Eosin

2.5 Phương pháp nghiên cứu

Để tiến hành nghiên cứu và thực hiện các nội dung đã đề ra của đề tài, chúng tôi đã sử dụng kết hợp những phương pháp nghiên cứu thường quy và hiện đại trong lĩnh vực thú y

2.5.1 Cách tiếp cận nghiên cứu

Chúng tối liên hệ với các trang trại, gia trại nuôi lợn nái, lợn giống và tiến hành theo dõi các đàn lợn con theo mẹ trên địa bàn huyện Việt Yên - tỉnh Bắc Giang Khi có thông tin về dịch bệnh chúng tôi đến tận nơi theo dõi, ghi chép, mổ khám lợn chết và lấy mẫu theo kế hoạch

2.5.2 Phương pháp quan sát, thống kê sinh học

Để xác định được tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết và các triệu chứng lâm sàng chủ yếu của

lợn bị tiêu chảy ra máu do C perfringens gây ra, chúng tôi tiến hành quan sát, ghi

chép, thống kê các biểu hiện của lợn từ khi xuất hiện các dấu hiệu bệnh lý đầu tiên

2.5.3 Phương pháp lấy mẫu

- Mẫu phân: dùng tăm bông vô trùng, ngoáy sâu vào trực tràng của lợn bị tiêu

chảy ra máu nghi do C perfringens gây ra Ghi ký hiệu mẫu, ngày và địa điểm lấy

mẫu Mẫu phân của lợn bị tiêu chảy phải lấy trước khi con vật được điều trị

- Mẫu phủ tạng: lấy phủ tạng (gan, lách, ruột, hạch màng treo ruột) của lợn bị

tiêu chảy ra máu nghi do C perfringens gây ra và được đựng trong túi nilon đựng

mẫu chuyên dụng Mẫu được bảo quản trong hộp chuyên dụng ở điều kiện thích

hợp và chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 2 - 24 giờ

2.5.4 Phương pháp mổ khám

Mổ khám nhằm xác định được các biến đổi đại thể của các cơ quan, tổ chức

của lợn bị tiêu chảy ra máu do C perfringens, cần tiến hành mổ khám những lợn có

biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh Lợn bệnh được cố định cẩn thận, tiến hành lấy máu tĩnh mạch Lột da và bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách các cơ quan nội tạng khỏi cơ thể, quan sát và chụp ảnh Tiến hành thu các cơ quan có tổn thương điển hình của bệnh như: ruột sung huyết, xuất huyết, gan, lách, hạch sưng, sung huyết… Bệnh phẩm sau khi lấy cần được ngâm trong formol 10% để được cố định, tránh gây ngộ nhận các tổn thương thoái hóa, hoại tử đem đến kết quả sai lệch

2.5.5 Phương pháp phân lập vi khuẩn

Vi khuẩn C perfringens được tiến hành phân lập và giám định theo quy

370C/24-48 giờ (mở hờ nắp lọ để khí gas sinh ra không làm nổ lọ)

- Bước 2:

Sau 24 - 48 giờ, tiến hành ria cấy lên môi trường CW (có bổ sung 4% lòng

đỏ trứng gà) và đưa vào nuôi ở tủ yếm khí ở 370C/24 - 48 giờ Chọn khuẩn lạc

điển hình, có hình thái đặc trưng của vi khuẩn C perfringens như: khuẩn lạc

tròn, gọn, màu trắng, hơi vàng, có mặt vồng đặc trưng, vùng môi trường bao xung quanh khuẩn lạc mờ đục, có màu vàng, môi trường thạch chuyển từ màu

da cam thành màu vàng tươi

- Bước 3:

Chọn khuẩn lạc có các đặc điểm như trên, tiến hành kiểm tra hình thái, tính chất bắt màu, xác định một số đặc tính nuôi cấy trên các môi trường (Phản ứng CAMP test, Litmus milk, SIM) và các đặc tính lên men một số môi trường đường Arabinose, Fructose, Lactose, Maltose, Glucose, Xylose, Saccarose) Sau đó, tiến hành giữ giống trên môi trường Cooked Meat (370C/24 giờ) Với phương pháp này, chủng vi khuẩn sau

khi cấy và được bảo quản ở 40C có thể duy trì được tới 50 năm

- Bước 4:

Các chủng vi khuẩn, sau khi được phân lập và thuần nhất sẽ được tiến hành xác định các loại độc tố cơ bản bằng phản ứng PCR, trên cơ sở đó sẽ xác định typ của vi khuẩn

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình phân lập và giám đinh vi khuẩn C perfringens

Làm nguội nhanh dưới vòi nước Nuôi trong tủ ấm 37 0 C/24-

48h Tiêm chuột bạch

Thạch CW, có bổ sung 4% lòng đỏ trứng

37 0 C/24-48h/yếm khí Khuẩn lạc màu trắng, hơi vàng, tròn, gọn, mặt vồng,

vùng môi trường bao xung quanh mờ đục, màu vàng

Xác định độc tố bằng phản ứng PCR

2.5.6 Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của chủng C perfringens phân lập được

Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng C perfringens được kiểm

tra bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và đánh giá kết quả theo Hội đồng quốc gia Hoa kỳ về các tiêu chuẩn lâm sàng phòng thí nghiệm (National Committee

of Clinical Laboratory Standards – NCCLS, 1999) (bảng 2.1)

Bảng 2.1 Tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm và kháng kháng sinh

- Cố định bệnh phẩm: Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%, để sau

7 - 10 ngày là có thể sử dụng được

- Rửa formol

Lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành miếng theo chiều dài có độ dài

4 – 5 mm Đem rửa trong nước chảy nhẹ 24h, để rửa formol

- Khử nước: Cho qua hệ thống gồm 4 lọ cồn

+ Parafin II: 6 giờ (ở 560C)

+ Parafin III: 12 giờ (ở 560C)

Đúc Block: Đúc mẫu bệnh phẩm trong parafin

- Cắt mảnh và dán mảnh

+ Cắt mảnh bằng máy Microtom với độ dàn mảnh cắt khoảng 3 – 5 µm, sao cho mảnh cắt không rách, nát phần tổ chức

+ Tãi mảnh: Dàn lát cắt bằng phẳng trên phiến kính trong nước ấm 480C Sau

đó để tủ ấm ở 370C đến khi bệnh phẩm khô là có thể đem đi nhuộm được

- Nhuộm tiêu bản: Các bước nhuộm như sau:

+ Khử parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống gồm 3 lọ Xylen

Xylen I: 6 giờ Xylen II: 6 giờ Xylen III: 12 giờ + Khử Xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 3 lọ:

Cồn 1000 I: 15 phút Cồn 1000 II: 15 phút Cồn 900 III: 15 phút + Nhuộm Hematoxilin (nhuộm nhân)