Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của lợn mắc PCV2 (porcine circovirus type 2) và áp dụng phương pháp hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --- --- MẠC THỊ YẾN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA LỢN MẮC PCV2 PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 VÀ ÁP DỤ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

MẠC THỊ YẾN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA LỢN

MẮC PCV2 (PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2) VÀ ÁP DỤNG

PHƯƠNG PHÁP HÓA MÔ MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ

rõ nguồn gốc Mọi sự giúp đỡ đã được cảm ơn

Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2014

Tác giả luận văn

Mạc Thị Yến

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Hữu Nam đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và xây dựng luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc, tập thể các thầy giáo, cô giáo, Ban chủ nhiệm Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn

Chân thành cảm ơn các trại chăn nuôi lợn ở địa phương và đội ngũ thú y viên

cơ sở trên địa bàn thành phố Hải Phòng đã tạo mọi điều kiện giúp tôi được thực tập

và có được số liệu thực tế để xây dựng luận văn

Nhân dịp này tôi xin trân trọng cảm ơn ban Lãnh đạo Cơ quan Thú y Vùng II, các bạn bè, đồng nghiệp và gia đình đã giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2014

Tác giả luận văn

Mạc Thị Yến

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii

1.1 Tình hình nghiên cứu về bệnh do PCV2 (Porcine Circovirus type 2)

1.4.1 Lịch sử phát triển của kỹ thuật hoá mô miễn dịch 19

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv

2.3.5 Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry – IHC) 27

3.2 Kết quả khảo sát một số chỉ tiêu huyết học ở lợn bệnh 31 3.2.1 Kết quả khảo sát một số chỉ tiêu hệ hồng cầu lợn bệnh 32 3.2.2 Kết quả khảo sát một số chỉ tiêu bạch cầu ở lợn bệnh 34 3.3 Kết quả xác định một số triệu chứng lâm sàng chủ yếu 36 3.4 Kết quả bệnh tích đại thể trên một số cơ quan của lợn mắc PMWS 39

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ab-ELISA : Antibody Enzym Linked Immunosorbent Assay

APP : Actinobacillus pleuropneumoniae

CSFV : Classical Swine Fever Virus

DNA : Deoxyribonucleic acid

ELISA : Enzym Linked Immunosorbent Assay

IFA : Indirect Immunofluorescense Assay

IPMA : Immuno Peroxidae Monolayer Assay

ISH : In Situ Hybridization

nPCR : Nested Polymerase Chain Reaction

PCR : Polymerase Chain Reaction

PCV : Porcine Circovirus

PCV1 : Porcine Circovirus type 1

PCV2 : Porcine Circovirus type 2

PCVAD : Porcine Circovirus Associated Disease

PDNS : Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome

PK15 : Pig Kidney 15

PMWS : Postweaning multisystemic wasting syndrome

PNP : Proliferating Necrotizing Pneumonia

PPV : Porcine parvovirus

PRDC : Porcine Respiratory Disease Complex

PRRS : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism

RNA : Ribonucleic Acid

ssDNA : Single-stranded DNA

TGEV : Transmissible Gastro Enteritis Virus

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi

DANH MỤC BẢNG

1.1 Các vắc xin tiêm phòng PCV2 được sử dụng trên thế giới hiện nay 17

3.2 Kết quả xác định nguyên nhân bệnh bằng phản ứng PCR 30 3.3 Kết quả khảo sát một số chỉ tiêu hệ hồng cầu ở lợn bệnh 32 3.4 Kết quả khảo sát chỉ tiêu bạch cầu của lợn mắc PMWS 35

3.8 Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch xác định sự phân bố của virus ở

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii

DANH MỤC HÌNH

1.3 Tình hình nhiễm PMWS trên thế giới (Allan và Ellis, 2000) 13

3.4 Hạch dưới hàm, hạch màng treo ruột sưng, xuất huyết 41

3.7 Hạch màng treo ruột sưng, xuất huyết; Thành ruột mỏng 41

3.12 Thâm nhiễm bạch cầu ái toan ở lợn nhiễm Circovirus (H.E 20X) 47

3.13 Thâm nhiễm bạch cầu ái toan ở lợn nhiễm Circovirus(H.E 40X) 47

3.14 Tế bào khổng lồ nhiều nhân ở gan lợn nhiễm Circovirus

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii

3.21 Hạch lâm ba sung huyết, xuất huyết (H.E 10X) 48

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Ngành chăn nuôi giữ một vai trò rất quan trọng trong nền sản xuất nông nghiệp ở nước ta, chiếm 27% – 28% tổng giá trị toàn ngành Để đáp ứng tốt hơn nhu cầu ngày càng cao của xã hội về các sản phẩm chăn nuôi, xu hướng chăn nuôi

đã chuyển từ nhỏ lẻ, phân tán sang tập trung, trang trại Trong đó, chăn nuôi lợn cũng không phải là một ngoại lệ với sản lượng đáp ứng khoảng 75% – 80% nhu cầu của xã hội Tuy nhiên, bên cạnh những bất ổn về giá cả, nguồn gốc thức ăn sử dụng trong chăn nuôi, các chất tồn dư trong sản phẩm chăn nuôi thì dịch bệnh bùng phát cũng khiến cho ngành chăn nuôi lợn gặp nhiều khó khăn và thách thức Một trong các bệnh đang gây thiệt hại lớn và lưu hành với tỷ lệ cao trên đàn lợn ở Việt Nam

và nhiều nơi trên thế giới đó là bệnh do Porcine Circovirus type 2 (PCV2) gây ra

PCV2 có cấu tạo DNA (single-stranded DNA) (với khoảng 1,76 – 1,77 kilobase) (Meehan và cs., 1998) PCV2 gây suy giảm hệ thống miễn dịch (suy giảm tế bào lympho), cùng với các tác nhân gây bệnh kế phát khác gây nên hội chứng bệnh liên quan với PCV2 (PCVAD) gồm có: Hội chứng suy đa tạng ở lợn sau cai sữa (PMWS), hội chứng Viêm da sưng thận (PDNS), rối loạn sinh sản ở lợn, phức hợp bệnh hô hấp trên lợn (PRDC), viêm phổi hoại tử và tăng sinh (PNP)

Hội chứng suy đa tạng ở lợn sau cai sữa (PMWS) được phát hiện lần đầu tiên

ở miền Tây Canada vào năm 1991, sau đó cũng được tìm thấy ở Bắc Mỹ, châu Âu, châu Á (Harding và cs., 1998) với các đặc điểm như: giảm khối lượng cơ thể, còi cọc, chậm lớn, suy hô hấp, khó thở, hoàng đản, hạch lympho sưng to, tiêu chảy trên lợn trong giai đoạn 5 – 12 tuần tuổi Hiện nay, PMWS đang trở nên rất phổ biến và gây thiệt hại lớn về kinh tế và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe đàn lợn chăn nuôi quy

mô công nghiệp của thế giới PCV2 đã được phân lập từ lợn mắc PMWS ở nhiều nơi trên toàn thế giới có mức độ tương đồng về trình tự nucleotide là 94,6% – 99,0% (Fenaux và cs., 2000)

Ở nước ta các năm gần đây, hội chứng bệnh liên quan tới PCV2 trong đó hội chứng suy đa tạng ở lợn sau cai sữa đang được coi là vấn đề gây thiệt hại đáng kể

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2

cho ngành chăn nuôi lợn như: giảm khối lượng tăng trọng của lợn, lợn còi cọc, sinh trưởng phát triển kém, giảm hiệu quả sử dụng thức ăn, có thể gây chết lợn khi mắc các tác nhân gây bệnh kế phát khác do PCV2 đã làm suy giảm sức đề kháng của con vật Bên cạnh đó các nghiên cứu ở trong nước về PCV2 nói chung và về những đặc điểm bệnh lý của bệnh nói riêng chỉ đạt được những nền tảng ban đầu và cần những nghiên cứu tiếp theo Từ yêu cầu của thực tiễn sản xuất, được sự đồng ý của khoa Thú y – trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội chúng tôi thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của lợn mắc PCV2 (Porcine Circovirus type 2) và áp dụng phương pháp hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán bệnh”

2 Mục tiêu đề tài

- Làm rõ những triệu chứng lâm sàng, biến đổi bệnh lý đại thể và vi thể của

lợn mắc Porcine circovirus type 2 (PCV2)

- Xác định được sự có mặt của PCV2 trong một số mô bào của lợn bệnh

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu về bệnh do PCV2 (Porcine Circovirus type 2) gây ra

trên lợn

1.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Hội chứng suy đa tạng ở lợn sau cai sữa (Postweaning multisystemic wasting syndrome - PMWS) xuất hiện lần đầu tiên ở Saskatchewan (Canada) vào năm 1990 (Harding, 1996), và sau đó xuất hiện ở nhiều nơi trên thế giới (Allan và Ellis, 2000) PMWS gồm các triệu chứng như: hao mòn, da xanh xao, nhợt nhạt và đôi khi thấy hoàng đản ở lợn cai sữa; bệnh tích ở nhiều cơ quan nhưng chủ yếu ở hạch lympho (Harding và cs., 1998) Bên cạnh PMWS, PCV2 cũng liên kết với một vài bệnh khác gồm hội chứng viêm da sưng thận (PDNS), rối loạn sinh sản và phức hợp bệnh đường hô hấp (PRDC), run bẩm sinh (Congenital tremor - CT) (Hines và Lukert, 1994), u hạt ruột (Chae, 2005), viêm biểu bì tiết dịch (Kim và Chae, 2004) và viêm hạch lympho hoại tử (Chae, 2005) Năm 2002, Allan và cs đã dùng khái niệm

“bệnh do Circovirus gây ra trên lợn - PCVD” để nhóm tất cả các bệnh và hội chứng

liên quan đến PCV2 Sau đó, tháng 3 năm 2006, Tổ chức thú y Hoa Kỳ (AASV)

đưa ra thuật ngữ “bệnh liên quan tới Circovirus trên lợn – PCVAD (Porcine Circovirus Associated Disease)” với mục đích như trên Và hiện nay, PCVD và

PCVAD được sử dụng lần lượt ở Châu Âu và Bắc Mỹ

Ngày nay, nhiều nghiên cứu của nhiều tác giả sau thời gian dài đã chỉ ra các nhân tố thường kế phát với PCV2 như:

Virus: Parvovirus gây bệnh trên lợn (PPV), Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV), Torque teno sus virus (TTSuV), Virus gây bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn (PEDV), Virus cúm lợn (SIV), Porcine endogenous retrovirus (PERV), Porcine circovirus type 1 (PCV1), Virus giả dại (PRV), Virus dịch tả lợn

cổ điển (CSFV) (Opriessnig và Halbur, 2012)

Vi khuẩn: Mycoplasma hyopneumoniae, Lawsonia intracellularis, Salmonella spp, Streptococcus suis, Escherichia coli, Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 4

Động vật nguyên sinh, đa bào và nấm: Pneumocystis spp, Cryptosporidium parvum, Metastrongylus elongatus (Marruchella và cs., 2011)

Ở Canada: Harding và cs (1998) đã xác định dịch tễ học và triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PMWS: Ở lợn sau cai sữa tỷ lệ tử vong đạt mức cao nhất vào tháng thứ 9 của dịch (7,67%), sau đó trở lại vào tháng thứ 16 với tỷ lệ 2,1% – 2,5% Các nguyên nhân gây tử vong chủ yếu là còi cọc (giảm cân, hốc hác), hoàng đản (bệnh gan) và khó thở (bệnh đường hô hấp) (Ronald và cs., 2000) Qua phân tích các chủng PCV2 thu thập trong các năm 2005, 2006, 2007 ở Canada chủ yếu là PCV2b (Carl, 2007)

Tại Hoa Kỳ: Pallares (2002) phân tích hồi cứu các trường hợp mắc PMWS tại Mỹ cho thấy chỉ 1,9% nhiễm đơn PCV2 trong tổng số các ca khảo sát ở lợn còi cọc sau cai sữa Các trường hợp khác phát hiện có 35,5% PCV2 đồng nhiễm với

Mycoplasma hyopneumoniae, 51,9% trường hợp PCV2 đồng nhiễm với PRRSV

Opriessnig và cs (2006) đã nghiên cứu so sánh trình tự và sự gây nhiễm của các chủng PCV2 Kết quả hai chủng PCV2-4838 và PCV2-40895 có sự tương đồng khoảng 98,9% về trình tự nucleotide (Chủng PCV2-4838 phân lập từ một con lợn mắc PCV2 nhưng không có tổn thương ở hạch lympho và chủng PCV2-40895 phân lập từ một con lợn mắc PCV2 với các tổn thương ở hạch lympho)

Ở Hungary: Năm 2003, tỷ lệ mắc PMWS và PDNS được báo cáo đầu tiên ở Hungary Bằng phương pháp PCR cho thấy có 80% lợn có virus PCV2 trong các lợn nghi mắc hội chứng PMWS và PNDS Tại Hungary đang lưu hành chủng PCV2

có nhiều biến đổi so với các chủng Châu Âu khác (Harrach, 2003)

Tây Ban Nha: Rodríguez-Arrioja và cs (2003) đã tiến hành khảo sát hồi cứu từ các mô bảo quản trong formalin và vùi trong paraffin của 189 con lợn và huyết thanh của 388 con lợn được nuôi từ năm 1985 đến 1997 DNA của PCV2 được phát hiện bằng phương pháp lai tạo tại chỗ (ISH) cho kết quả dương tính là 41,3% Qua phương pháp miễn dịch peroxidase trên một lớp tế bào đã cho thấy 72,7% các mẫu huyết thanh là dương tính với PCV2

Đức: Sebastian và cs (2005) dùng phương pháp PCR chẩn đoán PCV2 từ các mẫu lách của 238 con lợn rừng ở 10 vùng săn bắn trong 4 miền của Rhineland -

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 5

Palatinate và Hesse thu thập từ 10/2003 đến 3/2004 cho kết quả dương tính là 18,1% với sự tương đồng về trình tự nucleotide của giữa các chủng dao động từ 95,5% đến 97,8%

Thổ Nhĩ Kỳ: Taner (2011) sử dụng phương pháp one-step PCR để xác định

sự có mặt của PCV trong 86 mẫu dịch swab ở mũi thu từ 2 trại lợn và 12 mẫu phổi của lợn đực rừng Trong 38 mẫu dương tính với PCV có 31 mẫu dương tính với PCV2, còn lại 7 mẫu dương tính với PCV1

Thái Lan: Năm 1998 những ca bệnh đầu tiên mắc PMWS xuất hiện ở Thái Lan nhưng có nghiên cứu đã chỉ ra việc phát hiện PMWS trên lợn là từ năm 1993 Bằng phương pháp PCR đã chỉ ra tỷ lệ nhiễm PCV2 ở Thái Lan là 10% Phân loại các chủng PCV2 dựa trên nucleotide 262 – 267 của các trình tự ORF2 phát hiện tại Thái Lan, PCV2 đang tồn tại một subtype mới là PCV2e Trong hai subtype PCV2b

và PCV2e, dường như PCV2b chiếm ưu thế (Tippawan, 2011)

Trung Quốc: Sự xuất hiện của PCV2 và PCVAD đã trở thành một trong số các nguyên nhân làm suy giảm nền kinh tế Trung Quốc khi dịch PMWS bùng phát đầu tiên ở nhiều trang trại lợn với cường độ cao vào năm 2002 (Wang và cs., 2002) Lang và cs (2000) đã kiểm tra 559 mẫu huyết thanh từ 22 đàn lợn ở Bắc Kinh, Hà Bắc, Sơn Đông, Thiên Tân, Giang Tây, Sơn Tây, Cát Lâm, Hà Nam bằng phương pháp ELISA cho tỷ lệ dương tính với kháng thể PCV2 là 42,9%, và tỷ lệ dương tính ở lợn cai sữa là 16,5%, 43,3% ở lợn nái hậu bị, 85,6% ở lợn nái, 51,0%

ở lợn vỗ béo Sau đó, các vụ dịch PMWS ở Thượng Hải cũng đã được báo cáo (Li

và cs., 2003)

Qua nghiên cứu của Wang và cs (2009) đã cho thấy những chủng PCV2 phân lập được giống nhau và giống với những chủng khác (tỷ lệ thấp nhất là 94,6%) và khác với chủng PCV2 từ châu Âu và Bắc Mỹ (tỷ lệ tương đồng thấp nhất là 93,4%) Một số chủng PCV2 với gen ORF2 mã hóa 234 axit amin đã được tìm thấy ở Trung Quốc, không phải ở Bắc Mỹ và Châu Âu (Wang và cs., 2005)

Nghiên cứu giải trình tự gen PCV2 được báo cáo vào năm 2005 bằng việc sử dụng PCR và phương pháp phân tích RFLP (Wen và cs., 2005) Kiểu gen PCV2 ở Trung Quốc nằm trong nhánh có kiểu gen 2a và 2b, một số chủng có kiểu gen 2d

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 6

(chỉ phát hiện ở Trung Quốc), nhưng không có chủng nào có kiểu gen 2c (được phát hiện ở Đan Mạch) (Dupont và cs., 2008) Kiểu gen PCV-2b chiếm ưu thế hơn hẳn ở Trung Quốc trong nhiều năm gần đây (Li và cs., 2009)

Hàn Quốc: PMWS được coi là căn bệnh tàn phá nghiêm trọng nhất trong lịch

sử chăn nuôi từ khi dịch bùng phát đầu tiên năm 1999 (Choi và cs., 2000) PMWS

và bệnh phức hợp hô hấp ở lợn (PRDC) là biểu hiện lâm sàng phổ biến nhất trong

số các căn bệnh liên quan Circovirus lợn (PCVAD)

Nhật Bản: Shibahara và cs (2000) đã chứng minh sự suy giảm tế bào lympho với cơ chế apoptosis tế bào lympho B là do PCV2 Họ cho rằng một số cơ quan dung giải tế bào là do cơ chế này Như vậy, PCV2 kích thích sự phát triển của hội chứng suy đa tạng ở lợn sau cai sữa (PMWS) bằng cơ chế gây suy giảm hệ thống miễn dịch Từ năm 2000 – 2003, Kenji và cộng sự đã nghiên cứu trên 629 con lợn tại 129 trại có dấu hiệu lâm sàng còi cọc, chậm lớn Dựa vào triệu chứng tổn thương và phát hiện kháng nguyên trong mô lympho, nghiên cứu đã chỉ ra có 23,4% (162/629) lợn, 50,4 % (65/129) trại dương tính với PCV2 Trong đó, tỷ lệ chết của lợn 30 – 120 ngày tuổi mắc PMWS là 0,1% – 30%

Anh: Các trường hợp mắc PMWS được tìm thấy trong các mô thu thập được trước khi dịch PMWS xảy ra vào năm 1990 Axit nucleic của PCV2 được tìm thấy

là 41% (9/22) trong các mẫu xét nghiệm vào năm 1990, và 31% (4/13) trong các mẫu sưu tập từ năm 1980, và 32% (8/25) trong các mẫu xét ngiệm năm 1970

1.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Theo kết quả khảo sát của Lâm Thị Thu Hương và Đường Chí Mai (2006) tại một số trại lợn công nghiệp ở thành phố Hồ Chí Minh và vùng phụ cận cho biết tỷ

lệ nhiễm PCV2 trên lợn khá cao: 7/9 trại khảo sát nhiễm bệnh và tỷ lệ nhiễm ở các trại rất biến động, từ 12,5% – 83,88%

Nguyễn Thị Thu Hồng và cs (2006) đã sử dụng kỹ thuật miễn dịch peroxidase trên tế bào một lớp (Immunoperoxidase monolayer assay - IPMA) khảo sát 988 mẫu huyết thanh của lợn nái và lợn đực ở một số tỉnh thành phía Nam cho biết PCV2 xuất hiện ở Việt Nam ít nhất từ năm 2000 và tỷ lệ nhiễm tăng dần: 38,97% năm 2000; 84,99% năm 2003 và 90,26% năm 2005

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 7

Lê Tiến Dũng (2006) sử dụng kỹ thuật PCR khảo sát trên địa bàn thành phố

Hồ Chí Minh cho kết quả 50,77% (33/65) lợn còi dương tính với PCV2 tại 17/22 trại khác nhau của 5/6 địa bàn lấy mẫu

Nguyễn Tiến Hà (2008) đã kiểm tra 1073 mẫu huyết thanh lợn đực giống và lợn nái ở 8 tỉnh thành phía Nam trong các năm 2000 – 2006 cho biết tỷ lệ dương tính huyết thanh học chiếm 38,9% (năm 2000) và 96,47% (năm 2006)

Nguyễn Thị Thu Hồng và cs (2008) đã khảo sát 17 mẫu bệnh phẩm thu thập

từ năm 2002 – 2007 trên lợn nghi nhiễm bệnh do PCV2 và cho kết quả 6/17 (35,29%) mẫu dương tính với PCV2 ở 5/6 tỉnh thành phía Nam Qua phân tích trình

tự nucleotide toàn bộ bộ gen virus cho thấy mức độ tương đồng rất cao giữa các chủng virus tại Việt Nam

Năm 2009, PCV2 cũng được phát hiện ở 60% mẫu thu thập từ lợn trong dịch bệnh sốt cao liên quan PRRS (Trần Thị Dân và cs., 2010)

Hội chứng suy đa tạng ở lợn sau cai sữa (PMWS) đã được xác định ở 110/170 (64,71%) lợn còi và loại thải có nguồn gốc từ 2 tỉnh thuộc miền Đông Nam Bộ dựa trên khảo sát bệnh tích đại thể và vi thể Trên lợn mắc PMWS, tỉ lệ nhiễm kèm vi

khuẩn E.coli cao nhất (55%), kế là Streptococcus (42,5%), Salmonella (32,5%), Pasteurella multocida (22,5%) và thấp nhất là Haemophilus parasuis (17,5%)

Nhiễm đồng thời 3 loại vi khuẩn chỉ gặp trên lợn mắc PMWS (20%) (Lâm Thị Thu Hương, 2012)

Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cs (2012) đã xác định được genotype của PCV2 đang lưu hành trên đàn lợn nuôi tại 4 tỉnh Hà Nội, Hòa Bình, Bắc Giang và Hải Dương bằng kỹ thuật nested PCR với 583 mẫu bệnh phẩm thu thập trong năm 2011 – 2012 đều thuộc genotype 2b

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan và Trần Thị Ánh (2012) đã chỉ ra lợn mắc PCV2 thường nhiễm kèm với một số bệnh khác như PRRS, PPV, và dịch tả lợn với

tỷ lệ nhiễm khá cao với tỷ lệ lần lượt là 32,3%, 3,2%, 6,5%

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 8

1.2 Virus PCV2 (Porcine Circovirus Type 2)

1.2.1 Lịch sử căn bệnh

Năm 1974, Tischer và cs đã tìm ra PCV1 gây bệnh trên dòng tế bào thận lợn

PK-15 (ATTC-CCL33), có kích thước và hình dạng giống với Picornavirus hay nó

cùng họ với virus gây bệnh lở mồm long móng Sau đó, nó đã được chỉ ra là tác

nhân virus gây bệnh với một vòng DNA đơn và được đặt tên là Porcine circovirus

(PCV) (Tischer và cs., 1982)

Năm 1991, PMWS đã được báo cáo ở miền Tây Canada Các triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PMWS: lợn giảm cân, rối loạn hô hấp và da xanh xao Bệnh tích chủ yếu ở lợn mắc bệnh biểu hiện ở nhiều cơ quan như: hạch lympho, viêm kẽ phổi, viêm gan, phì đại lách và loét dạ dày (Clark, 1997) Một năm sau đó, một tác nhân gây bệnh giống như PCV đã được phân lập từ mô của lợn mắc PMWS ở Bắc Mỹ và

Châu Âu (Allan và cs., 1998) So sánh về nguồn gốc giữa Circovirus không gây bệnh và Circovirus mới tìm thấy liên quan với dịch PMWS đã chỉ ra rằng các virus

gây bệnh là khác nhau về di truyền và kháng nguyên (Meehan và cs., 1998) Vì vậy,

Circovirus đã được chia ra làm 2 type: virus không gây bệnh trên dòng tế bào

PK-15 được coi là Circovirus type 1 (PCV1) và Circovirus phân lập từ lợn ốm là Circovirus type 2 (PCV2) (Hamel và cs., 1998) So sánh trình tự cho thấy sự khác

nhau đáng kể giữa hai chủng PCV1 và PCV2, với sự tương đồng DNA tổng thể là 76% Qua phương pháp PCR và lai tại chỗ (ISH) đã chứng minh có nhiều DNA virus tập trung ở nhiều cơ quan khác nhau khi lợn mắc PMWS

PCV2 có thể đã xuất hiện từ năm 1969 ở Bỉ, năm 1970 ở Anh, năm 1973 ở Ireland, năm 1985 ở Canada, năm 1995 ở Tây Ban Nha thông qua các nghiên cứu hồi quy trên các mẫu đã sưu tầm được bảo quản trong các phòng thí nghiệm

1.2.2 Đặc điểm phân loại của PCV2

PCV2 là thành viên của họ Circoviridae và theo ủy ban phân loại virus quốc

tế (ICTV) (www.ictvonline.org), họ virus này được chia ra dựa trên kích thước virion và cấu tạo bộ gen

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 9

Họ Circoviridae

Hình 1.2 Cấu trúc của PCV2 theo Hamel và cs (1998)

Gen của PCV2 gồm 11 khung đọc mở giả định (ORFs) (Hamel và cs., 1998), trong đó 3 protein được mã hóa từ 3 khung đọc mở được quan tâm là:

ORF1 (gen Rep) nằm ở sợi dương theo chiều kim đồng hồ, mã hóa cho 2 protein không tham gia vào cấu trúc là Rep (dài 314 axit amin và có trọng lượng phân tử là 35,8 kDa) và Rep’ (dài 178 axit amin)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 10

ORF2 (gen Cap) nằm ở sợi bổ sung theo chiều ngược kim đồng hồ, mã hóa protein (dài 233 – 234 axit amin và có trọng lượng phân tử là 27,8 kDa) tạo vỏ capsid của virus với vai trò trong việc gây đáp ứng miễn dịch của cơ thể

ORF3 nằm gối lên đoạn ORF1, nằm ở sợi đối diện và ngược chiều kim đồng

hồ ORF3 mã hóa cho một protein không cấu trúc dài 104 axit amin với trọng lượng phân tử là 11,9 kDa, đóng vai trò trong việc sao chép và khả năng gây bệnh của virus (Hamel và cs., 1998)

1.2.4 Sức đề kháng của PCV2

PCV2 có sức đề kháng cao với nhiệt độ cao, formalin, pH thấp Có thể duy trì tính gây nhiễm trong điều kiện pH<2 nhưng giảm đi đáng kể ở pH=11, gần như biến mất tại pH=12 Tính gây nhiễm của virus giảm ở 560C và không còn ở 700C trong 6 hoặc 24 giờ Trong điều kiện khô ráo, virus chịu được nhiệt độ 1200C trong

30 phút Trong điều kiện ướt, virus còn sống ở nhiệt độ 750C trong 15 phút và bị tiêu diệt ở 800C trong 15 phút Có thể phân lập virus trong mẫu bệnh phẩm bảo quản ở -700C (Kwang, 2009; Welch và cs., 2006)

PCV2 có khả năng kháng lại các chất khử trùng hòa tan lipid như rượu, chlorhexidine, iodine và phenol (Royer và cs., 2001) Tuy nhiên, PCV2 có thể bị bất hoạt bởi các chất khử kiềm (NaOH), các tác nhân oxy hóa (Natri hypochlorite) và các hợp chất amoni bậc bốn (Martin và cs., 2008)

Do virus có tính đề kháng cao, ngay trong điều kiện khử trùng nghiêm ngặt

mà vẫn có thể tìm thấy virus trong huyết tương lợn sau điều trị, ngay cả với chloroform Virus có thể sống sót lâu dài trong môi trường ô nhiễm (Kwang, 2009; Welch và cs., 2006)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 11

bào phế quản và tế bào tiểu phế quản; ngoài ra, các tế bào nội mô, tế bào gan, tế bào lympho khác cũng là tế bào đích (Krakowka và Ellis, 2002) Chang và cs (2006) đã báo cáo rằng sự thực bào và khả năng tiêu diệt vi sinh vật của các tế bào đại thực bào phế nang (tế bào đích đầu tiên của PCV2) lây nhiễm PCV2 qua đường hô hấp

và đường tiêu hóa đã giảm bớt dẫn tới kế phát các mầm bệnh khác

PCV2 khi xâm nhập vào cơ thể có khả năng sao chép và nhân lên ở tế bào đại thực bào và tế bào trình diện kháng nguyên của hạch lympho như hạch amidan

và hạch bạch huyết cục bộ, đồng thời khi con vật bị nhiễm các vi khuẩn kế phát sẽ kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ thể làm cho sự sao chép của virus tăng lên Sau khi lây nhiễm và sao chép trong các tế bào đại thực bào cư trú ở niêm mạc và các tế bào trình diện kháng nguyên, PCV2 có thể tồn tại trong tế bào hay tự do trong hệ bạch huyết và trong máu Sự lưu thông của các tế bào đích của PCV2 (tế bào đơn nhân, đại thực bào, tế bào đuôi gai (DC)) góp phần làm lan rộng sự nhiễm của virus tới nhiều cơ quan trong cơ thể (Rosell và cs., 1999)

Protein ở lớp vỏ capside hoặc DNA của PCV2 đã ngăn cản quá trình tiêu hóa nội bào (endocytic) trong tế bào võng lưới nội mô (dendritic cell), làm suy yếu khả năng truyền tín hiệu “nguy hiểm” và do vậy làm suy yếu hệ thống miễn dịch bẩm sinh Tế bào võng lưới nội mô đóng vai trò then chốt trong quá trình xâm nhập của PCV2 PCV2 in vitro xâm nhập tế bào đơn nhân dòng 3D4/31 (từ phế nang lợn) thông qua quá trình tiêu hóa nội bào (clathrin-mediated Endocytosis) và trong môi trường axít (McCullough và cs., 2009)

Ellis (2001) đã chứng minh ngựa, trâu, bò thịt, bò sữa không cảm nhiễm với

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 12

căn bệnh Không thấy bệnh tích đại thể và vi thể, không phát hiện kháng nguyên trong các mô sau khi gây nhiễm vào cừu hoặc bê

Qua thực nghiệm lây nhiễm ở cừu và thỏ với PCV2 đã không thấy sự biến đổi về huyết thanh hay các tổn thương (Allan và cs., 2000b)

Chuột nhắt và chuột nhà quanh những trại lợn mắc bệnh dương tính với PCV2 và kháng thể được tìm thấy trong huyết thanh chuột gây nhiễm Không phát hiện thấy kháng thể circovirus ở người, nhưng đây đang là vấn đề cần được quan tâm trong tương lai cấy ghép các nội tạng ở người từ lợn (Ellis, 2003)

1.3.1.2 Lứa tuổi mắc bệnh

PMWS thường gây bệnh chủ yếu ở lợn từ 4 tới 16 tuần tuổi, từ cuối giai đoạn theo mẹ và đầu giai đoạn vỗ béo (Harding, 1998; Segalés và Domingo, 2002), các lợn con có kháng thể từ nguồn sữa mẹ có khả năng chống lại PCV2 và không nhiễm virus cho tới khi những kháng thể này suy yếu Kháng thể của lợn sau khi mắc PMWS có thể tồn tại cho đến 28 tuần tuổi nhưng một vài con lợn vẫn liên tục mắc bệnh (Rodríguez-Arrioja và cs., 2002)

Virus có trong cơ tim và nhiều mô bào bị tổn thương khác ở thai lợn bị sảy, chết lưu và thai gỗ (Allan, 2006)

Kháng nguyên và acid nucleic PCV2 thường được tìm thấy trong các hạch lympho sưng to (100%), 88% ở lách, 64% tại phổi, 35% tại thận và 15% tại gan cũng tìm thấy trong các đại thực bào tại trung tâm của các ổ viêm, biểu mô đường

hô hấp, tế bào biểu mô, niêm mạc và hạ niêm mạc ruột non (Kwang, 2009)

1.3.1.4 Vùng phân bố, tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết

Trên thế giới, PMWS đã được chẩn đoán là có mặt ở khắp tất cả năm châu

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 13

lục PCV2 đã được phân lập ở Bắc Mỹ, Châu Âu, Đông Nam Á, trên tất cả các đàn lợn trên toàn thế giới Tỷ lệ nhiễm PCV2 trên lợn phổ biến hơn so với PMWS (Ellis, 2003)

Trong một nghiên cứu ở Nhật năm 2007, có tới 50,4% số đàn bị nhiễm PCV2 và 23,4% cá thể dương tính với DNA virus PCV2 Ở Canada tỷ lệ lợn chết sau cai sữa do PMWS là 6,7% ± 5,1% và có thể lên tới 18% Tỉ lệ tử vong bình thường ở lợn con là 2% – 3%, có thể tăng lên 14% – 30% ở những đàn nhiễm PCV2 (Harding và cs., 1998) Tỷ lệ mắc bệnh ở trại lưu hành bệnh thường là 4% – 30% (thỉnh thoảng là 50% – 60%) và tỷ lệ chết dao động từ 4% – 20% (Segalés và Domingo, 2002)

Hình 1.3 Tình hình nhiễm PMWS trên thế giới (Allan và Ellis, 2000)

Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm PCV2 tăng từ 38,97% năm 2000 đến 90,26% năm

2005 và 60% trong mẫu thu từ lợn trong dịch bệnh sốt cao liên quan đến PRRS Tỷ

lệ mắc bệnh phụ thuộc vào quá trình chăm sóc, quản lý và vệ sinh thú y tại trang trại, con giống, việc xác định và cách ly lợn bệnh (Trần Thị Dân và cs., 2010)

1.3.1.5 Đường truyền lây

Bệnh lây truyền trong bán kính khoảng 2 – 3 km, lây từ lợn rừng sang lợn nhà và ngược lại (Meehan và cs., 1997) Và có 2 con đường để lây truyền bệnh:

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 14

Truyền ngang: Các con lợn tiếp xúc trực tiếp với lợn bệnh thì xuất hiện các dấu hiệu lâm sàng sau 4 – 5 tuần so với nuôi trong từng chuồng riêng biệt Sự lây truyền virus có thể gián tiếp giữa các con lợn nuôi trong các chuồng liền kề (Kristensen và cs., 2009) Các con đường có thể lây nhiễm như qua miệng, mũi và qua các thức ăn từ động vật mắc bệnh chưa được nấu chín

Truyền dọc: Truyền qua nhau thai có thể được chứng minh sau khi gây nhiễm bằng mũi ở lợn nái mang thai 3 tuần trước khi đẻ (Park và cs., 2005), với PCV2 hiện diện trong cả lợn con bị sảy thai và lợn con sống sót sau sinh Lợn nái được thụ tinh bằng sử dụng tinh dịch có chứa PCV2 đã biểu hiện rối loạn sinh sản

và thai nhi của chúng có thể bị nhiễm (Madson và cs., 2009)

1.3.2 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích

1.3.2.1 Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PCV2

- Ở lợn sau cai sữa và lợn thịt: thường có các dấu hiệu lâm sàng như hao mòn hay giảm cân, da xanh xao, suy hô hấp, tiêu chảy và thỉnh thoảng hoàng đản (Harding và Clark, 1997) Hạch lympho dưới da sưng to là các dấu hiệu lâm sàng phổ biến ở giai đoạn đầu của bệnh (Clark, 1997; Rosell và cs., 1999)

- Thời gian nung bệnh: qua thí nghiệm cho thấy thời gian ủ bệnh ở lợn từ 2 đến 4 tuần (Gillespie và cs., 2009) Bệnh thường mắc ở lợn từ 5 – 10 tuần tuổi, đôi khi ở 12 – 16 tuần tuổi, tỷ lệ mắc bệnh ở các trại là 20% – 60%, và tỷ lệ tử vong dao động từ 5% – 35%, đa số đàn lợn phải chịu đựng phơi nhiễm với vi khuẩn kế phát,

chủ yếu là Haemophilus parasuis (Wang và cs., 2002) Gần đây, tỷ lệ mắc PMWS ở

đàn lợn là 10% – 20%, và tỷ lệ tử vong ít nhất là 10%; tuy nhiên, tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong sẽ tăng khi nhiễm các nhân tố gây bệnh kế phát (H Yang, quan sát cá nhân)

- Ở lợn nái: PCV2 gây hiện tượng rối loạn sinh sản như sảy thai ở các giai đoạn mang thai khác nhau, vô sinh, thai gỗ, lợn con sinh ra yếu ớt (Jaret, 2011)

1.3.2.2 Biến đổi bệnh lý ở lợn mắc PCV2

a Bệnh tích đại thể

Lợn con sau cai sữa và lợn thịt: xác gầy, ngả vàng Hạch lympho bao gồm hạch bẹn, hạch màng treo ruột, cuống phổi và hệ ngoại biên sưng to gấp 3 – 4 lần so với bình thường, đặc biệt là hạch giữa 2 chân sau, hạch màng treo ruột viêm, viêm

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 15

ruột, xuất huyết

Phổi phù thũng, đặc chắc, không xẹp xuống, các tiểu thùy có màu vàng đến hồng nhạt hoặc đỏ sẫm Lách không sưng, tiểu thuỳ gan xuất hiện lốm đốm Thận phù, có đốm trắng Các mô, cơ quan trong xoang ngực, xoang bụng phù nề, ứ dịch (Kwang, 2009)

Lợn nái nhiễm PCV2 có thể bị sảy thai, thai gỗ, lợn con chết khi sinh ra viêm

cơ tim rất nặng Có thể tìm thấy virus trong cơ tim và các cơ quan khác của bào thai (Jaret, 2011)

b Bệnh tích vi thể

Các tổn thương vi thể tìm thấy trong các cơ quan lympho: hạch lympho, hạch amidan, mảng peyer ruột và lách Trong hạch lympho, tổn thương đặc trưng là suy giảm tế bào lympho, thấy rõ ở các hạch sưng to Sự xuất hiện của thể vùi và tế bào khổng lồ đa nhân (thể hợp bào), tế bào đại thực bào đặc biệt là trong các xoang miền vỏ, thường chứa với số lượng lớn Sự xuất hiện của thể hợp bào, đuôi gai và ái toan là nổi bật (Ellis, 2003; Kwang, 2009)

Các tổn thương ngoài cơ quan lympho là: Viêm kẽ phổi, viêm và thâm nhiễm

tế bào đơn nhân ở gan với các mức độ khác nhau, viêm kẽ thận

Hoại tử biểu mô đường hô hấp, viêm tiểu phế quản với sự xâm nhập của tế bào bạch cầu đơn nhân lớn và bạch cầu trung tính Tổn thương phổi đặc trưng bởi

sự hình thành u hạt kẽ phổi, xâm nhập tế bào đại thực bào, tế bào lympho vào các phế nang Hoại tử lan rộng ở các tế bào gan, nhu mô gan thường bị phá vỡ

Thận có xâm nhiễm các tế bào lympho trong tế bào tổ chức u nang thận và viêm mạch vùng vỏ và tủy thận, rải rác hoặc một vùng rộng

Trong đường tiêu hóa các u tuyến (villous) từ nhẹ đến nặng Thường virus xâm nhập và nhân lên trong tế bào lympho biểu mô tuyến và lớp dưới biểu mô Sự bào mòn cả lông nhung từ nhẹ đến nặng (Kwang, 2009)

1.3.3 Chẩn đoán bệnh

1.3.3.1 Dựa vào triệu chứng, bệnh tích

- Triệu chứng: Lợn con sau cai sữa bị còi cọc chậm lớn, lông thô xơ xác, gầy

gò, khó thở, da xanh xao, nhợt nhạt hoặc hoàng đản, tiêu chảy với phân màu nâu

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 16

Lợn nái có hiện tượng sảy thai ở các giai đoạn khác nhau, thai gỗ, lợn con sinh ra yếu ớt (Segalés và cs., 2005)

- Bệnh tích mổ khám: hạch bạch huyết sưng to, viêm kẽ phổi, thoái hóa gan, viêm loét dạ dày Bệnh tích vi thể chủ yếu như: suy giảm tế bào lympho, thâm nhiễm tế bào viêm, xuất hiện thể hợp bào và thể vùi trong nguyên sinh chất của tế bào Lợn con chết trong bụng mẹ, khi sinh ra viêm cơ tim rất nặng (Ellis, 1998) Chẩn đoán phân biệt với các bệnh liên quan tới PCV2, bệnh truyền nhiễm khác, bệnh đường ruột, bệnh đường hô hấp và bệnh còi cọc do thiếu dinh dưỡng, rối loạn sinh sản

1.3.3.2 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

a Chẩn đoán virus học

Tế bào PK-15 được sử dụng để nuôi cấy PCV2 trong phòng thí nghiệm PCV2 không gây bệnh tích tế bào nên để xác định sự nhân lên của virus nên dùng các phương pháp miễn dịch huỳnh quang hay nhuộm miễn dịch peroxidase

b Chẩn đoán huyết thanh học

Phát hiện kháng thể kháng PCV2 trên lợn mắc PCV2 bằng các phương pháp như:

- Phương pháp trung hòa virus trong huyết thanh

- Miễn dịch peroxidase trên một lớp tế bào (Indirect Immunoperoxidase Monolayer Assay – IPMA)

- Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (Indirect Immunofluorescense Assay – IFA)

- Phương pháp ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay)

c Phát hiện axit nucleic của PCV2

- PCR (Polymerase chain reaction): được sử dụng để phát hiện axit nucleic của PCV2 với độ chính xác và độ nhạy cao (Choi và cs., 2000) Có các biến thể khác như: multiplex PCR, nested PCR, multiplex-nested PCR, quantitative real time PCR, reverse transcriptase (RT) PCR

- Lai tại chỗ (In situ hybridization – ISH): sử dụng một đầu dò DNA phù hợp với một đoạn đặc biệt của bộ gen PCV2 (Kim và Chae, 2003)

- Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP): RFLP sử dụng enzyme có khả năng tiêu hóa axit nucleic của virus (một phần hay toàn bộ) mà kết

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 17

quả là các mô hình đặc hiệu được chụp ảnh trên gel

d Phát hiện virus PCV2 hay khánng nguyên của virus PCV2

- Hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry – IHC): sử dụng kháng thể đa dòng để phát hiện kháng nguyên PCV2 trong dung dịch cố định formalin, lát cắt mô được vùi trong paraffin (McNeilly và cs., 1999)

- Kính hiển vi điện tử (EM): Phương pháp này được sử dụng để chứng minh

hạt giống Circovirus trực tiếp bên trong tế bào và để nghiên cứu cấu trúc và kích

thước của virus

- Phương pháp kháng thể huỳnh quang trực tiếp hay gián tiếp trên lát cắt mô (FA/IFA): IFA/FA sử dụng kháng thể đơn dòng hay kháng huyết thanh đa dòng để phát hiện kháng nguyên trên lát cắt mô đông lạnh (McNeilly và cs., 2002)

Ingelvac

circoflex

Boehringer Ingelheim

Protein từ gen ORF2 của PCV2

Tiêm bắp:

1ml/liều

Lợn con (trên 2 tuần tuổi) Suvaxyn PCV2

one dose

Fort Dodge Pfizer

PCV1-2 bất hoạt

Tiêm bắp:

2ml/liều

Lợn con (trên 4 tuần tuổi) Porcilis PCV

(EU)/circumvent

PCV (US)

Intervet Schering Plough Animal Health

Protein từ gen ORF2 của PCV2

Tiêm bắp:

2ml/1-2 liều hoặc 2ml/liều

Lợn con (trên 3 ngày/ trên 3 tuần tuổi)

hoạt

Tiêm bắp:

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 18

Việc sử dụng vắc xin đã làm giảm tỷ lệ lợn mắc PMWS và cải thiện tăng trọng trung bình hàng ngày và tỷ lệ hấp thụ thức ăn Hơn nữa, tiêm chủng làm giảm

số lượng các tác nhân kế phát và mức độ tổn thương nghiêm trọng ở các mô bạch huyết Ngoài ra, ở nước ta còn có 1 số vắc xin như Pro-vac Circomaster Vac (Komipharm international), SuiShot Circo One (Choongang vaccine laboratory), Circo Pig Vac (Daesung Microbiological Lab) cũng được phép lưu hành và sử dụng

để phòng bệnh

1.3.4.2 Quản lý và chăm sóc

Việc quản lý trang trại trên quy mô chăn nuôi công nghiệp cần lưu ý các tiêu chí như sau: “all in all out” - “tất cả vào và tất cả ra”; điều kiện vệ sinh khử trùng sạch sẽ đảm bảo các tiêu chuẩn vệ sinh thú y; hạn chế sự trộn lẫn các lô lợn và có mật độ chăn nuôi thích hợp cho từng lứa tuổi; cần duy trì các điều kiện chăn nuôi như nhiệt độ, lưu lượng không khí lưu thông trong chuồng nuôi; sử dụng các phương pháp điều trị chống ký sinh trùng, giảm thiểu các nhân tố gây stress cho vật nuôi; có khu vực cách ly các lợn mắc bệnh và cần có khu xử lý lợn mắc bệnh Quan trọng vẫn là khâu tiêm phòng cho đàn gia súc, kiểm soát các nhân tố kế phát

Cần quản lý và giám sát các con đực giống sử dụng cho trang trại, cần có nguồn gốc xuất xứ rõ ràng và được nhập từ cơ sở có uy tín, tốt nhất nên sử dụng phương pháp thụ tinh nhân tạo nhằm kiểm soát các mầm bệnh trong tinh dịch Việc bổ sung các phụ gia thức ăn chống oxy hóa, axit linoleic liên hợp và plasma phun khô khẩu phần thức ăn cho lợn con giai đoạn theo mẹ có thể cải thiện hiệu quả lâm sàng của PMWS Hơn nữa, có bằng chứng cho thấy việc quản lý các phytosterol điều hòa miễn dịch làm giảm những tổn thất sản xuất tại các trang trại bị ảnh hưởng bởi PRDC và PMWS (Fraile và cs., 2009)

1.3.4.3 Điều trị

Trước khi có mặt của vắc xin, huyết thanh trị liệu đã được sử dụng khi các đợt dịch bùng phát nghiêm trọng bằng cách tiêm huyết thanh nhân tạo vào lợn con nhằm bảo vệ cho lợn con Tuy nhiên việc điều trị bằng huyết thanh trị liệu vẫn còn tồn tại các rủi ro an toàn sinh học nên đã dẫn tới việc ra đời thế hệ vắc xin đầu tiên Các biện pháp điều trị khi lợn mắc PMWS đều không có hiệu quả, chủ yếu vẫn cần làm tốt công tác phòng bệnh, vệ sinh thú y

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19

1.4 Một số hiểu biết cơ bản về hóa mô miễn dịch

1.4.1 Lịch sử phát triển của kỹ thuật hoá mô miễn dịch

Hoá mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) là kỹ thuật không thể thiếu trong các phòng thí nghiệm với mục đích chẩn đoán và nghiên cứu Qua các thập kỷ, việc có thể phát hiện ra kháng nguyên trong mặt cắt mô đã được cải thiện nhanh chóng, bằng cách lợi dụng ảnh hưởng có hại của formaldehyt lên sự phục hồi kháng nguyên và tăng tính nhạy cảm của hệ thống nhận diện kháng nguyên Kỹ thuật sử dụng kháng thể huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên tế bào trong mặt cắt mô đã mở đầu cho kỹ thuật hoá mô miễn dịch Từ đó, hoá mô miễn dịch trở thành công cụ có giá trị trong chẩn đoán và nghiên cứu cơ chế lây nhiễm và hình thành bệnh của một số loài động vật Các khái niệm cơ bản liên quan đến hoá mô miễn dịch là sự biểu hiện kháng nguyên ở trong mặt cắt các mô bởi các kháng thể đặc trưng Sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể, được thể hiện bằng phản ứng màu mô hoá học có thể thấy được bởi phản ứng phát sáng vi thể hoặc phản ứng huỳnh quang cho ra màu nâu vàng Mặc dù nguyên lý của phản ứng đơn giản nhưng phương pháp hoá mô miễn dịch đã trở nên phức tạp hơn bởi tính chặt chẽ, độ nhạy

và đặc trưng của phản ứng Hoá mô miễn dịch được thiết lập như một phương pháp đáng tin cậy và chính xác cho cả hoạt động chẩn đoán và nghiên cứu thuốc thú y Trong những năm gần đây hóa mô miễn dịch được sử dụng trong các phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh như là một phương pháp nhuộm đặc biệt để giúp chẩn đoán phân biệt bệnh và xác định tác nhân gây nhiễm khuẩn Kỹ thuật này cho phép quan sát được sự hiện diện của kháng nguyên trên lát cắt mô Như vậy các nhà bệnh học có thể quan sát và đánh giá được cả hai phương diện hình thái học và loại hình miễn dịch trên mô hay tế bào Kỹ thuật này có thể được thực hiện trên khối nến và quan sát được dưới kính hiển vi quang học thông thường, không cần phải dùng mẫu

mô tươi cũng như kính hiển vi huỳnh quang

1.4.2 Nội dung của kỹ thuật hoá mô miễn dịch

Hoá mô miễn dịch là một xét nghiệm kỹ thuật cao, sử dụng các kháng thể đã biết để phát hiện các kháng nguyên đặc hiệu tương ứng có trong tế bào và mô Nếu

có kháng nguyên đặc hiệu sẽ xảy ra phản ứng tạo phức hợp kháng nguyên - kháng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20

thể, có thể phát hiện được bằng kính hiển vi

IHC là sự kết hợp giữa hai ngành mô bệnh học (Histopathology) và miễn dịch học (Immunology) Kỹ thuật hoá mô miễn dịch được dùng không những chỉ để xác định một mô có hoặc không có kháng nguyên đặc hiệu, mà còn để xác định tình trạng kháng nguyên của những tế bào đặc hiệu trong mô và vị trí của kháng nguyên trong tế bào Nhờ đó có thể xác định dòng tế bào, xác định rõ tính chất sinh học của quần thể tế bào trong cùng một dòng, và chức năng khác nhau của các loại tế bào, thậm chí còn có thể xác định các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn và virus nữa Chìa khoá chính trong hoá mô miễn dịch là phản ứng đặc hiệu của kháng thể với kháng nguyên Mặc dù được áp dụng rộng rãi với nhiều nguyên lý khác nhau trong nhiều lĩnh vực khác nhau, nhưng trong giải phẫu bệnh ngoại khoa, hoá mô miễn dịch có tác dụng rất lớn và sâu sắc trong việc chẩn đoán giải phẫu bệnh

Giải phẫu bệnh ngoại khoa vốn là một ngành có tính chất chủ quan cố hữu Mặc dù đã có nhiều tiêu chuẩn mô bệnh học "cơ bản" dùng cho chẩn đoán, song trong thực tế, sự trùng lặp và giống nhau của các thương tổn, cũng như có nhiều thương tổn không điển hình làm cho việc chẩn đoán mô bệnh học gặp nhiều khó khăn, khó đi đến chẩn đoán xác định hoặc khó thống nhất giữa các nhà giải phẫu bệnh với nhau Vì thế đã từ lâu các nhà giải phẫu bệnh trên thế giới đã tìm nhiều phương pháp giúp chẩn đoán phân biệt như mô hoá học (Histochemistry), mô-enzym học (Histoenzymology), miễn dịch huỳnh quang (Immunofluorescence), hoá

mô miễn dịch, lai tại chỗ (Hybridization in stitu) Hoá mô miễn dịch là một kỹ thuật hiện đại, mới được áp dụng tương đối rộng rãi ở những nước tiên tiến vì có độ chính xác cao, nhưng có nhược điểm là khá đắt tiền nên các nước nghèo khó có điều kiện áp dụng

Hóa mô miễn dịch là kết hợp phản ứng miễn dịch và hoá chất để làm hiện rõ các kháng nguyên hiện diện trong mô (bào tương, màng tế bào, nhân) Vì kháng nguyên không thể quan sát hình thái được nên người ta phải xác định vị trí của nó trên tế bào bằng các phản ứng miễn dịch và hóa học Có hai kỹ thuật: miễn dịch huỳnh quang và miễn dịch men

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21

* Nguyên lý của phản ứng

Cho kháng thể đặc hiệu lên mô, nếu trong mô có kháng nguyên sẽ có phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể Có hai cách để quan sát được phức hợp này: + Miễn dịch huỳnh quang: cho gắn với một chất phát huỳnh quang và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang

+ Miễn dịch men: cho gắn với một loại men (peroxidase hoặc alkaline phosphatase) và gắn với chất màu (chromogen), có thể quan sát dưới kính hiển vi quang học

* Hệ thống nhận biết

Vì phức hợp kháng nguyên - kháng thể không thể phát hiện được dưới kính hiển vi quang học nên cần một hệ thống để hiển thị vị trí có phản ứng kháng nguyên

- kháng thể Hệ thống này gồm 2 phần: (1) kháng thể thứ hai hay kháng thể bắt màu

và (2) hệ thống phóng đại dấu hiệu nhận biết

Kháng thể thứ hai là cầu nối kháng thể thứ nhất với hệ thống phóng đại dấu hiệu nhận biết, đó là kháng thể chống globulin miễn dịch (Ig) của kháng thể thứ nhất Thí dụ nếu kháng thể thứ nhất là IgG của chuột, thì kháng thể thứ hai là của thỏ hay dê chống IgG chuột) Trong phức hợp Avidin-Biotin và phương pháp Streptavidin kháng thể thứ hai được gắn biotin Hệ thống phóng đại dấu hiệu nhận biết gồm một men (enzyme), chất nền (subtrate) và chất màu (chromogen) Men phải được gắn với kháng thể thứ hai bằng một phản ứng kháng nguyên-kháng thể hay bằng cầu nối hóa học (avidin và biotin) Cần thêm vào một chất nền thích hợp với men và cuối cùng là chất màu được gắn lên để có thể thấy được sản phẩm, cho phép xác định sự hiện diện của kháng nguyên trong mô dưới kính hiển vi quang học (Yunus,1989)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và nguyên liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Lợn sau cai sữa từ 4 đến 16 tuần tuổi nghi bị bệnh do Porcine circovirus type

2 (PCV2) tại một số trại ở Hải Phòng

2.1.2 Nguyên liệu nghiên cứu

- Mẫu bệnh phẩm: gồm các loại mẫu lấy từ cơ thể lợn nhiễm hoặc nghi nhiễm PMWS bao gồm: máu, phổi, gan, thận, lách, hạch, ruột được thu tại địa điểm nghiên cứu

- Dụng cụ, hóa chất

+ Dụng cụ

Ống nghiệm, lọ chứa formol 10%, dao, kéo, pank kẹp, cốc dựng hóa chất, phiến kính, lamen, máy đúc block, khuôn đúc, tủ ấm 560, tủ ấm 370, tủ lạnh, máy cắt mảnh microtom và một số dụng cụ khác liên quan

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu

- Một số trại lợn tại Hải Phòng

- Bộ môn Bệnh lý – Khoa Thú y – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

2.2 Nội dung nghiên cứu

+ Điều tra tình hình nhiễm Porcine Circovirus type 2( PCV2)

+ Xác định một số chỉ tiêu huyết học của lợn bệnh

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23

+ Xác định các triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn bị bệnh do Porcine Circovirus type 2 (PCV2) gây ra

+ Xác định bệnh tích đại thể chủ yếu của lợn bị bệnh do Porcine Circovirus type 2 (PCV2)

+ Nghiên cứu bệnh tích vi thể một số cơ quan của lợn bị bệnh do Circovirus

(PCV2)

+ Ứng dụng phương pháp Hóa mô miễn dịch phát hiện sự có mặt của PCV2 trong một số loại mô của lợn bệnh

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp điều tra và xác định bệnh

- Dựa vào các số liệu theo dõi ghi chép trong thời gian thực tập

- Phương pháp quan sát: Đối với các triêu chứng lâm sàng, biến đổi bệnh lý

đại thể

- Phương pháp mổ khám toàn diện: Quá trình mổ khám được ghi chép lại và thực hiện theo quy trình nghiên cứu, để quan sát tổn thương đại thể và lấy mẫu bệnh phẩm

- Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý vi thể : Để xác định được mức độ tổn thương ở mức độ vi thể của bệnh do PCV2 trên lợn

2.3.2 Nghiên cứu các chỉ tiêu huyết học

- Chúng tôi tiến hành lấy máu lợn ở vị trí vịnh tĩnh mạch cổ

- Sử dụng máy đếm hồng cầu tự động CD – 3700

- Nguyên lý: Máy sẽ tách riêng các dòng tế bào theo kích thước tế bào, có nhân hay không có nhân, theo hình dạng nhân Đếm trên toàn bộ ống mẫu máu xét nghiệm mà không cần tách hay pha loãng mẫu

- Chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số chỉ tiêu huyết học như sau:

+ Số lượng hồng cầu (RBC, triệu/µl), (1mm3= 1µl)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24

+ Nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu (MCHC, g/l)

+ Số lượng bạch cầu (WBC, nghìn/µl) và công thức bạch cầu (%)

Phương pháp làm tiêu bản vi thể tẩm đúc bằng parafin theo Robert (1969)

và Burn ( 1974) Chúng tôi sử dụng phương pháp làm tiêu bản đúc bằng parafin, nhuộm Hematoxylin- Eosin (HE)

Mỗi lợn bệnh chúng tôi tiến hành lấy mẫu ở mỗi cơ quan hai miếng bệnh phẩm rồi đúc thành hai block Mỗi block chúng tôi tiến hành cắt, nhuộm tiêu bản rồi chọn ra 5 tiêu bản đẹp, sau đó tiến hành soi dưới kính hiển vi để đọc kết quả bệnh tích vi thể Nếu block nào có 2 tiêu bản có bệnh tích trở lên thì chúng tôi coi

là dương tính

Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất: Lọ chứa formol 10%, dao, kéo, pank kẹp, cốc đựng hóa chất, phiến kính, máy đúc block, khuôn đúc, tủ ấm 37ºC, máy cắt mảnh microtom, nước ấm 48-52ºC, xylen, paraffin, thuốc nhuộm Hematoxylin, Eosin…

Lấy bệnh phẩm: dạ dày, ruột, tim, gan, thận, lách, hạch lympho…

Quy trình làm tiêu bản vi thể:

Cố định bệnh phẩm: Ngâm miếng bệnh phẩm vào dung dịch formol 10% (chú

ý thể tích formol phải gấp 10 lần bệnh phẩm và bệnh phẩm phải ngập trong formol)

- Khử formol

Sau khi cố định bệnh phẩm trong dung dịch formol 10% từ 7 – 10 ngày lấy bệnh phẩm ra khỏi bình formol 10%, cắt thành miếng có độ dày 4-5 mm rồi xâu thành một dây sao cho các miếng bệnh phẩm cách nhau 0,5 cm Trên đầu dây có gắn một mẩu giấy ghi tên bệnh phẩm Sau đó đem rửa nước chảy nhẹ tối thiểu 24 giờ

- Khử nước

Bệnh phẩm sau khi khử formol thấm nhẹ trên giấy lọc, rồi cho qua hệ thống gồm 4 lọ cồn nhằm mục đích để khử nước ra khỏi mô

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25

Cồn I: 3 giờ Cồn II: 3 giờ Cồn III: 3 giờ Cồn IV: 12 giờ

- Khử cồn

Lấy bệnh phẩm ra khỏi hệ thống cồn thấm nhẹ trên giấy lọc, rồi cho vào hệ thống 3 cốc đựng xylen

Xylen I: 3 giờ Xylen II: 3 giờ Xylen III: 4 giờ Mục đích: khử hết cồn ra khỏi mô

Yêu cầu: Khi nào miếng bệnh phẩm trong như cục thạch là được Nếu để quá lâu tổ chức sẽ giòn, dễ vỡ và khó cắt

- Khử xylen

Cho qua hệ thống paraffin đã ổn định ( paraffin có từ 3- 5% sáp ong đã nấu, đảo nhiều lần thành môi trường đồng nhất ổn định, đặc chắc, không lẫn tạp chất, không bọt), gồm 3 lọ

Parafin I: 12 giờ trong tủ ấm 56ºC Parafin II: 3 giờ trong tủ ấm 56ºC Parafin III: 4 giờ trong tủ ấm 56ºC Mục đích: để khử hết xylen trong mô Trong mô chỉ còn paraffin thấm đều trong các kẽ mô bào

Nếu nhiệt độ trên 56ºC thì miếng mô sẽ giòn và dễ vỡ, khó cắt