Lên men Malolactic trong sản xuất rượu vang cacao

Lợi ích của quá trình lên men malolactic bao gồm: giảm lượng acid trong những loại rượu vang có nồng độ acid cao, cải thiện hương vị đặc trưng của rượu vang nhờ sự hoạt động của vi khuẩn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA-VŨNG TÀU

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

LÊN MEN MALOLACTIC TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG CACAO

Trình độ đào tạo: Đại học

Ngành: Công nghệ kĩ thuật hóa học

Chuyên ngành: Hóa dầu

Giảng viên hướng dẫn: Th.S Chu Thị Hà Sinh viên thực hiện : Ngô Tiến Việt Anh

Bà Rịa-Vũng Tàu, tháng 7 năm 2014

I TÊN ĐỀ TÀI: Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang cacao

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG

‒ Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của

vi khuẩn Leuconostoc oenos

‒ Khảo sát tỉ lệ giống vi khuẩn Leuconostoc oenos thích hợp bổ sung vào dịch

vang non

‒ Khảo sát thời điểm bổ sung giống vi khuẩn Leuconostoc oenos

‒ Khảo sát tỉ lệ chất làm trong bentonite

‒ Lên men malolactic với các thông số tối ưu đã nghiên cứu

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN : tháng 7/2014

Vũng Tàu, ngày 20 tháng 7 năm 2014

dẫn là Th.S Chu Thị Hà Các số liệu và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào trước đây Các thông tin, tài liệu trích dẫn trong tài liệu tham khảo

TP Vũng Tàu, tháng 7 năm 2014

Ngô Tiến Việt Anh

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin chân thành cám ơn quý thầy cô trong Bộ môn Công nghệ

kĩ thuật Hóa học, Công nghệ Thực phẩm nói riêng và các thầy cô trong khoa Hóa học

và Công nghệ Thực phẩm nói chung đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành tốt đồ án này

Em xin cảm ơn cô Chu Thị Hà – người đã tận tình theo sát, chỉ bảo, giúp đỡ, tạo cho chúng em sự say mê trong học tập và nghiên cứu

Con xin cám ơn gia đình đã luôn theo sát, ủng hộ, khích lệ và động viên trong suốt quãng đường mà con đã đi

Cuối cùng, xin gửi những lời thân thương nhất đến tất cả những người đã sát cánh cùng tôi trong thời gian qua

TP Vũng Tàu, tháng 7 năm 2014

Ngô Tiến Việt Anh

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ, HÌNH ẢNH v

LỜI MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về cây cacao 3

1.1.1 Đặc điểm của cây cacao 3

1.1.2 Các giống cây cacao 3

1.1.3 Cấu tạo quả cacao 5

1.1.4 Thành phần hóa học của nước cacao 6

1.2 Giới thiệu quá trình lên men malolactic 6

1.2.1 Khái niệm lên men malolactic 6

1.2.2 Vị trí của lên men malolactic trong quy trình sản xuất rượu vang cacao 7

1.2.3 Mục đích và ứng dụng của quá trình lên men malolactic 7

1.2.4 Các kiểu lên men malolactic 9

1.2.5 Giới thiệu một số loại vi khuẩn lên men malolactic 12

1.2.6 Các biến đổi diễn ra trong quá trình lên men malolactic 16

1.3 Giới thiệu quá trình làm trong rượu vang 29

1.3.1 Mục đích của quá trình làm trong rượu vang 29

1.3.2 Một số tác nhân làm trong 30

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 Vật liệu nghiên cứu 34

2.1.1 Dịch quả cacao 34

2.1.2 Rượu vang non 34

2.1.3 Giống vi sinh vật 34

2.1.4 Môi trường nuôi cấy 35

2.1.5 Hóa chất 35

2.1.6 Thiết bị và dụng cụ 35

ii

2.2 Phương pháp nghiên cứu 36

2.2.1 Phương pháp lên men malolactic 36

2.2.2 Phương pháp làm trong rượu 36

2.2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 36

2.2.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 38

2.2.5 Các phương pháp phân tích 41

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 45

3.1. Các yếu tố ảnh hướng đến sinh triển và phát triển của chủng vi khuẩn Leuconostoc oenos 45

3.1.2 Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Leuconostoc oenos 46

3.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến sự sinh trưởng của Leuconostoc oenos 48

3.1.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ đến sự sinh trưởng và phát triển của Leuconostoc oenos 49

3.1.5 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Leuconostoc oenos 51

3.1.6 Ảnh hưởng của thành phần đường đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Leuconostoc oenos 53

3.2 Tỉ lệ giống thích hợp bổ sung vào dịch vang non 55

3.2.1 Sự thay đổi pH 56

3.2.2 Sự thay đổi độ acid tổng 57

3.2.3 Sự thay đổi độ cồn và hàm lượng chất khô 57

3.3 Thời điểm bổ sung giống vi khuẩn 58

3.3.1 Sự thay đổi pH 59

3.3.2 Sự thay đổi hàm lượng chất khô 60

3.3.3 Sự thay đổi độ acid tổng 61

3.3.4 Sự thay đổi độ cồn 61

3.4 Tỉ lệ chất làm trong bentonite 61

3.5 Lên men malolactic với các điều kiện nghiên cứu 63

3.6 Đánh giá cảm quan 64

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66

4.1 Kết luận 66

PHỤ LỤC 70

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của nước cacao 6

Bảng 1.2 Phân loại các vi khuẩn Lactobacillus 13

Bảng 1.3 Tốc độ phát triển vi khuẩn malolactic theo nhiệt độ 26

Bảng 2.1 Các chỉ tiêu của rượu vang non 34

Bảng 2.2 Thành phần môi trường MRS 35

Bảng 3.1 Định lượng vi khuẩn Leuconostoc oenos 47

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến vi khuẩn Leuconostoc oenos 48

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ đến vi khuẩn Leuconostoc oenos 50

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của pH đến vi khuẩn Leuconostoc oenos 52

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thành phần đường đến vi khuẩn Leuconostoc oenos 54

Bảng 3.6 Quá trình lên men malolactic với các nồng độ vi khuẩn bổ sung khác nhau 56

Bảng 3.7 Sự thay đổi độ cồn và hàm lượng chất khô sau quá trình lên men malolactic ứng với các tỉ lệ giống khác nhau 58

Bảng 3.8 Sự thay đổi các yếu tố sau quá trình lên men theo các thời điểm bổ sung giống khác nhau 59

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của hàm lượng bentobite tới hiệu quả lắng trong của rượu vang 62

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của hàm lượng bentonite tới chất lượng cảm quan của rượu vang 63

Bảng 3.11 Kết quả các chỉ tiêu của rượu vang cao cao khi lên men ở điều kiện tối ưu 64

Hình 1.1 Giống Criollo 4

Hình 1.2 Giống Forastero 5

Hình 1.3 Giống Trinitario 5

Hình 1.4 Cấu tạo quả cacao 6

Hình 1.5 Các loại vi khuẩn Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc 12

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 37

Hình 3.1 Hình ảnh của vi khuẩn Leuconostoc oenos dưới kính hiển vi 45

Hình 3.2 Khuẩn lạc của vi khuẩn Leuconostoc oenos trên môi trường MRS – Agar có bổ sung dịch vang cacao non 46

Đồ thị 1.6 Đường cong sinh trưởng của các vi khuẩn chính trong lên men rượu 17

Đồ thị 1.7 Sự phát triển của vi khuẩn malolactic trong suốt quá trình lên men rượu và lên men malolactic 19

Đồ thị 1.8 Sự phát triển của vi khuẩn malolactic trong suốt quá trình lên men rượu và lên men malolactic có kiểm soát bằng cách cấy giống trước khi lên men rượu 19 Đồ thị 1.9 Sự phát triển của vi khuẩn malolactic trong suốt quá trình lên men rượu và lên men malolactic có kiểm soát bằng cách cấy giống sau khi lên men rượu 20

Đồ thị 1.10 Một số nhân tố chính ảnh hưởng đến quá trình lên men malolactic 27

Đồ thị 3.3 Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Leuconostoc oenos 47

Đồ thị 3.4 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ cồn đến OD vi khuẩn Leuconostoc oenos 49

Đồ thị 3.5 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ đến OD vi khuẩn Leuconostoc oenos 50

Đồ thị 3.6 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của pH đến OD của vi khuẩn Leuconostoc oenos 52

Đồ thị 3.7 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thành phần đường đến OD của vi khuẩn Leuconostoc oenos 54

Đồ thị 3.8 Sự thay đổi pH của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau theo thời gian trong quá trình lên men malolactic 56

Đồ thị 3.9 Sự thay đổi nồng độ acid tổng của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau theo thời gian trong quá trình lên men malolactic 57

LỜI MỞ ĐẦU

Rượu vang là một loại thức uống có cồn thu được từ quá trình lên men nước ép nho hoặc một số loại trái cây khác Lên men rượu là một hình thức rất cổ xưa trong công nghệ thực phẩm trên thế giới, nó đã có cách đây hàng ngàn năm Việc sản xuất rượu vang đã trở thành một hình thức kinh doanh toàn cầu, nó đã và đang ảnh hưởng đáng kể đến nền kinh tế của nhiều nước trên thế giới (Walker, 2000) Việc lên men rượu vang (lên men chính) được thực hiện bằng cách bổ sung thêm giống nấm men

vào nước trái cây Giống vi sinh vật tốt nhất dùng cho quá trình này là Saccharomyces

cerevisiae, được sử dụng rộng rãi để chuyển hóa ethanol từ đường trong nước ép trái

cây (Klingshirn, 2002) [9]

Một nhóm vi sinh vật khác liên quan đến quá trình lên men rượu vang đó chính

là vi khuẩn lactic, chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men rượu lần hai hay còn gọi là lên men malolactic Hiệu suất của quá trình lên men malolactic phụ thuộc vào đặc điểm của từng loại quả (Bozoğlu và Yurdugül, 2000), đặc biệt là lượng acid malic có trong quả Nếu hàm lượng acid malic quá cao thì việc lên men malolactic là cần thiết để chuyển acid L-malic thành acid L-lactic, kết quả là làm giảm lượng acid trong rượu, giảm được vị chua gắt, cải thiện được hương vị của rượu vang (Steinkraus, 1992) [9]

Lên men malolactic là một quá trình quan trọng trong sản xuất rượu vang hay ít nhất là những loại rượu vang có hàm lượng acid cao ở những vùng có khí hậu mát

mẻ Lợi ích của quá trình lên men malolactic bao gồm: giảm lượng acid trong những loại rượu vang có nồng độ acid cao, cải thiện hương vị đặc trưng của rượu vang nhờ

sự hoạt động của vi khuẩn và ổn định hệ vi sinh vật có trong rượu vang (Bozoğlu vàYurdugül, 2000) Vi khuẩn acid lactic tham gia vào quá trình lên men malolactic

được gọi là vi khuẩn malolactic, thuộc chi Leuconostoc, Pediococcus và

Lactobacillus (Lonvaud-Funel, 2000; Văn Vuuren và Dicks, 1993; Versari,

Parpinello, và Cattaneo, 1999), chúng có khả năng chuyển hóa trực tiếp acid malic

(MLE) (Bozoğlu and Yurdugül, 2000; Fugelsang, 1997; Renault et al., 1988; Salema

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT

Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 2 Khoa Hóa học & CNTP

et al., 1996) Quá trình này có thể xảy ra tự phát trong thời gian lưu trữ rượu hoặc được điều khiển bởi các tác nhân vi sinh vật [9]

Ở Việt Nam, hầu hết các sản phẩm rượu vang đều trải qua 2 giai đoạn, đó là giai đoạn lên men rượu và lên men phụ nhằm lắng trong cũng như ổn định chất lượng rượu vang mà không có quá trình lên men malolactic Chính điều này cũng đã góp phần làm hạn chế chất lượng cũng như mùi vị của sản phẩm, đặc biệt là đối với những loại quả có hàm lượng acid malic cao Vì vậy chúng tôi nghiên cứ quá trình lên men malolactic trong sản xuất rượu vang cacao, nhằm khắc phục những khuyết điểm đã nêu trên

Trong đồ án này, chúng tôi nghiên cứu những nội dung sau:

‒ Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của

vi khuẩn Leuconostoc oenos

‒ Khảo sát tỉ lệ giống vi khuẩn Leuconostoc oenos thích hợp bổ sung vào

dịch vang non

‒ Khảo sát thời điểm bổ sung giống vi khuẩn Leuconostoc oenos

‒ Khảo sát tỉ lệ chất làm trong bentonite

‒ Lên men malolactic với các thông số tối ưu đã nghiên cứu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về cây cacao

1.1.1 Đặc điểm của cây cacao [4]

Cacao thuộc họ Sterculiaceae, giống Theobroma, loài Cacao, có nguồn gốc từ

miền nam châu Phi

Cacao là cây công nghiệp dài ngày, trồng thích hợp ở vùng nhiệt đới, thân gỗ, cao 5 – 7 m (thường phát triển dưới tán) Sau khi trồng 3 – 4 năm, cây bắt đầu ra trái, sau 10 năm thì cây phát triển hoàn thiện Cây ca cao có thể cho thu hoạch quả đến

50 năm

Hoa nhỏ, đường kính khoảng 15mm, có màu vàng, đỏ, trắng hay tím tùy theo loài Hoa mọc trực tiếp từ thân và cành, thuộc loại lưỡng tính và thụ phấn chủ yếu là nhờ côn trùng Có khoảng 0,5% hoa nở tạo quả, trong đó 90% quả non sẽ bị khô và rụng

đất: 6,5 – 6,7, phân bón: đạm, kali và các khoáng vi lượng

1.1.2 Các giống cây cacao

Cây cacao (Theobroma Cacao L.) thuộc họ Sterculiceae và còn được chia ra làm nhiều loại khác nhau, quan trọng nhất là các loại Criollo, Forastero và Trinitario

‒ Trái có màu nâu hoặc xanh trước khi chín

‒ Trái có dạng dài và có đỉnh nhọn rất rõ ở cuối trái, mang mười rãnh đều nhau đôi khi chia thành hai dãy Ta có thể phân biệt được hai nhóm do một trong năm rãnh không rõ nét

‒ Vỏ thường sần sùi, mỏng, dễ cắt, lớp trong mỏng và ít mô gỗ

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT

Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 7 Khoa Hóa học & CNTP

1.2.2 Vị trí của lên men malolactic trong quy trình sản xuất rượu vang cacao [1] Trong công nghiệp sản xuất rượu vang, quá trình lên men malolactic được tiến hành sau khi lên men chính, dịch lên men thu được gọi là “vang non” được tiến hành lắng gạn cặn và được chuyển sang bồn chứa để sang giai đoạn lên men tiếp theo Quá trình này lên men rất chậm nhằm phân giải những gram đường cuối cùng, song song với quá trình này vi khuẩn lactic sẽ phân giải acid malic thành acid lactic làm cho

phóng nhưng có xu hướng giảm dần, hương vị rượu vang dần được hoàn thiện Dung dịch lên men ở trạng thái tĩnh lặng, xác nấm men lắng xuống đáy bồn lên men Tiếp theo, dịch vang được lắng gạn tiếp vài lần, mỗi lần từ 20 đến 30 ngày để ổn định thành phần của rượu vang rồi tiếp tục vào giai đoạn ủ chín

1.2.3 Mục đích và ứng dụng của quá trình lên men malolactic [1]

1.2.3.1 Mục đích

Lên men malolactic là một quá trình rất quan trọng trong sản xuất các loại rượu vang đỏ hoặc các loại rượu vang có độ chua cao Quá trình này hoàn toàn không gây nguy hiểm đối với chất lượng vang vì quá trình lên men vi khuẩn lactic chỉ sử dụng acid malic là chính mà không tác động gì tới các cấu tử và thành phần có trong rượu vang E Peymand (2002) đã xếp mức độ nguy hiểm cho chất lượng rượu vang do tác động của vi khuẩn lactic theo chiều tăng dần lên như sau:

‒ Lên men đường arabinose, acid citric và đường xylose tạo thành một lượng không lớn lắm các acid bay hơi và làm giảm chất lượng rượu vang không đáng kể

‒ Lên men acid tartaric, glycerin, glucose, fructose làm thay đổi khá rõ các hợp phần có trong vang và làm giảm chất lượng của vang

Mức độ gây xấu hay ảnh hưởng không tốt chất lượng rượu vang phụ thuộc và đặc tính của chủng vi khuẩn lactic và đặc điểm của vang Quá trình lên men malolactic

có ba ý nghĩa quan trọng với rượu vang:

a Làm giảm độ acid của dịch vang lên men

Trước hết, về mặt hóa học, quá trình lên men malolactic làm cho pH của môi trường lên men tăng lên khoảng từ 0,1- 0,3 đơn vị và làm giảm độ acid tổng xuống

khoảng 0,01 đến 0,03 g/L (tính theo acid tartaric) bởi quá trình decarboxyl hóa một gốc acid và chuyển acid malic thành acid lactic có độ acid yếu hơn Tuy nhiên, không phải tất cả các acid malic đều được chuyển hóa thành acid lactic mà chỉ 2/3 chúng

b Điều chỉnh hương vị đặc trưng cho vang

Sự chuyển hóa acid malic thường đi kèm với quá trình lên men các loại đường còn lại để tạo ra rất nhiều sản phẩm là những hợp chất dễ bay hơi như acetandehyde, diacetyl, acetoin, acid acetic, 2-3 butadiol, ethyl lactate và các rượu bậc cao… Tất cả các hợp chất này tạo nên một tổ hợp các hương vị đặc trưng góp phần tạo nên chất lượng của rượu vang thành phẩm

c Làm ổn định về mặt vi sinh cho rượu vang thành phẩm

Cuối cùng, về mặt bảo quản, quá trình lên men malolactic góp phần tạo nên tính

ổn định về chất lượng cảm quan và vi sinh Điều này có ý nghĩa là sự hiện diện của quá trình lên men malolactic có khả năng ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh vật khác Sự ức chế này được giải thích bởi các nguyên nhân sau:

‒ Một số vi khuẩn không mong muốn có khả năng sử dụng acid malic làm nguồn chất dinh dưỡng Vì thế, việc giảm hàm lượng acid malic trong dịch lên men

sẽ đem lại kết quả tốt để giảm thiểu rủi ro về mặt vi sinh

‒ Vi khuẩn lactic sinh trưởng trước trong môi trường pH thấp và chúng sử dụng các chất dinh dưỡng như: amino acid, các base nitơ, vitamin làm cho môi trường ngày càng nghèo nàn những chất này Từ đó giới hạn được sự sinh trưởng và phát triển của các vi sinh vật khác

‒ Một số vi khẩn malolactic có thể sản sinh ra độc tố (bacteriocin) có thể ức chế sinh trưởng của những vi sinh vật khác mà không gây ảnh hưởng gì về mặt cảm quan và sức khỏe con người

Người ta nhận thấy rằng những loại rượu vang không có quá trình lên men malolactic hay quá trình này không được kiểm soát chặt chẽ thì sau một thời gian đóng chai và bảo quản thường xảy ra hiện tượng bị đục dịch vang hay đôi khi hình thành nên cặn lắng hay sủi bọt nhẹ và có khi kèm theo mùi lạ gần giống với mùi món

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT

Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 9 Khoa Hóa học & CNTP

dưa cải bắp truyền thống của Đức Dù ít hay nhiều thì điều này cũng làm ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng của rượu vang thành phẩm Vì vậy, nếu quá trình lên men malolactic được thực hiện một các có kiểm soát thì những rủi ro này có thể bị loại trừ

1.2.3.2 Ứng dụng

Hiện nay, quá trình lên men malolactic được xem như một công nghệ quan trọng nhằm cải thiện chất lượng của rượu vang Người ta cho rằng, hầu hết các loại rượu vang đỏ và khoảng 20% rượu vang trắng trên thế giới đều trải qua quá trình lên men này

Đứng trên phương diện thành phần hóa học, lên men malolactic chỉ thích hợp cho sản xuất các loại rượu vang có độ pH thấp, tức là có hàm lượng acid cao Hầu hết các loại rượu vang đỏ trên thế giới đều được nâng cao chất lượng thông qua quá trình

lên men malolactic Ví dụ các loại rượu vang đỏ: Pinot Noir, Merlot và Cabernet đều

được tiến hành lên men malolactic gần như hoàn toàn Quá trình lên men malolactic xảy ra hầu hết ở vang đỏ bởi vì ở các vang này có hàm lượng acid malic khá cao Acid malic có thể bị phân giải bởi vi khuẩn lactic thành acid lactic làm giảm vị chua gắt khó chịu cho vang Hàm lượng acid malic trong dịch quả còn tùy thuộc vào từng loại quả, điều kiện trồng trọt và thời tiết Đối với những loại rượu vang được sản xuất

ở vùng khí hậu lạnh, đặc biệt là Đức, Pháp và miền đông nước Mỹ, thường có hàm lượng acid malic khá cao nên cần thực hiện quá trình lên men malolactic Ở vùng có khí hậu ấm áp hơn thì ngược lại Hầu như hàm lượng acid malic sẽ giảm cùng với quá trình chín của quả Do đó, thông thường, ở các vùng này, không cần quá trình lên men malolactic

1.2.4 Các kiểu lên men malolactic [2]

1.2.4.1 Lên men tự nhiên

Sản xuất rượu vang theo truyền thống thì lên men malolactic diễn ra tự phát trong suốt quá trình bảo quản vang non trong vài tháng hoặc vài năm Vi khuẩn có nguồn gốc trên vỏ quả nho hoặc thùng gỗ Tuy nhiên trong công nghệ sản xuất vang hiện đại với quá trình chế biến sạch hơn và thời gian bảo quản cần giảm thối thiểu thì

quá trình lên men như vậy là quá chậm và không đủ độ tin cậy Leuconostoc oenos

sinh trưởng cực kì chậm chạp và đôi khi không phát triển ở vang có pH từ 3.0 – 3.8;

men malolactic tự phát ngoài tác nhân là vi khuẩn Leuconostoc oenos còn rất nhiều

vi khuẩn lactic khác vì thế luôn có nhửng rủi ro do việc trao đổi không hoàn toàn của acid malic hay các sản phẩm có mùi lạ hoặc sự hình thành các amin do vi khuẩn lactic

decarboxyl hóa các amino acid Đặc biệt Pediococcus được coi là yếu tố quan trọng

nhất sinh ra hitsamine Do đó vang có độ pH cao thúc đẩy sự sinh trưởng của các giống này trong quá trình lên men malolactic thì chắc chắn chứa lượng hitsamine không mong muốn

Biện pháp lên men tự nhiên cũng có những ưu điểm là thuận lợi và không đắt tiền, nó được áp dụng khá rộng rãi ở Pháp Nhiều năm kinh nghiệm đã chỉ ra rằng

thành phần vang và điều kiện môi trường đã thúc đẩy sự sinh trưởng của Leuconostoc

oenos có mặt tự nhiên trong vang vùng Bordeaux của Pháp và thông thường lên men

malolactic bắt đầu trong vòng 1 – 4 tuần sau khi lên men rượu kết thúc Thành phần

sinh trưởng của vi khuẩn tự nhiên để lên men malolactic thành công hoàn toàn không phải luôn luôn xảy ra và các phương pháp khác để thúc đẩy lên men malolactic trở nên cần thiết

Như vậy lên men malolactic tự nhiên tuy có những ưu điểm là thuận lợi và rẻ nhưng nhược điểm cũng rất nhiều đó là khó khởi động, diễn ra rất chậm chạm và khó kiểm soát được các chủng vi khuẩn tham gia vào quá trình dẫn đến tạo các sản phẩm phụ không mong muốn Để khắc phục các nhược điểm này, hiện nay, người ra thường

áp dụng phương pháp chủ động đưa vi khuẩn Leuconostoc oenos thuẩn chủng vào

môi trường để thực hiện lên men malolactic Việc cấy vi khuẩn có thể diễn trong quá trình lên men rượu hoặc sau khi hoàn thành quá trình lên men rượu

1.2.4.2 Lên men một giai đoạn

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT

Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 11 Khoa Hóa học & CNTP

Lên men một giai đoạn có nghĩa là người ta cấy nấm men và vi khuẩn đồng thời trong quá trình lên men rượu Phương pháp này có những ưu điểm là vi khuẩn sẽ có điều kiện sinh trưởng tốt hơn trong môi trường có nồng độ cồn thấp và khi hàm lượng cồn tăng dần trong suốt quá trình lên men rượu thì vi khuẩn sẽ dần thích nghi được với môi trường chứa rượu chứ không bị sốc khi đột ngột gặp môi trường có nồng độ cồn cao Hơn nữa khi môi trường còn đang giàu chất dinh dưỡng nên thuận lợi cho

sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Nuôi cấy hỗn hợp còn tạo điều kiện cho sự lên men malolactic xảy ra đồng thời với lên men rượu, nếu lên men maloatic không xảy ra tức thời thì có thể do tỷ lệ vi khuẩn trong dịch lên men quá ít hoặc do hàm

Nhưng phương pháp này còn có những hạn chế như cạnh tranh nguồn dinh dưỡng và sự tương tác giữa các chủng vi khuẩn vi sinh vật Sự chuyển hóa đường của

vi khuẩn lactic để sinh ra acid lactic và acid axetic gây ảnh hưởng đến hiệu suất quá trình lên men rượu và chất lượng vang Phương pháp này chỉ nên thực hiện khi các chủng vi sinh vật đã được lựa chọn kĩ, không tính đối kháng và lượng tế bào cần có của mỗi chủng đã được xác định

1.2.4.3 Lên men hai giai đoạn tách riêng

Lên men hai giai đoạn tách riêng là tiến hành lên men rượu và lên men malolactic riêng biệt Sau khi lên men rượu bởi nấm men kết thúc, tiến hành lắng gạn cặn và xác nấm men ra khỏi dịch vang non, sau đó đưa vi khuẩn vào thực hiện giai đoạn lên men malolactic

Phương pháp này có rất nhiều những ưu điểm như sau:

‒ Cho phép điều chỉnh dễ dàng các yếu tố môi trường phù hợp cho từng loài Điều này giúp có thể rút ngắn thời gian lên men mỗi giai đoạn

‒ Không ảnh hưởng đến hiệu suất sinh cồn vì nuôi cấy hai chủng ở hai giai đoạn riêng biệt

‒ Cuối quá trình lên men do nồng độ đường còn rất thấp nên lúc này vi khuẩn lactic buộc phải sử dụng các acid hữu cơ làm nguồn cơ chất chính để sinh tồn pH dịch lên men sẽ giảm đến mức thích hợp cho việc chuyển hóa acid malic

nuôi cấy giống vi khuẩn này rất khó khăn vì chúng đòi hỏi môi trường nuôi cấy cần vài chất dinh dưỡng đặc biệt như β-D-glucopyranosyl- D- pantothenic, nguồn acid béo sử dụng là Tween 80 và chất ức chế nấm men cycloheximide Người ta có thể nuôi cấy chúng trong dịch ép cà chua, táo hoặc nho Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu

cho thấy rằng chỉ có một loài của Leuconostoc được tìm thấy và phân lập từ vang nho, đó là Leuconostoc oenos

1.2.5.2 Sơ lược về vi khuẩn Leuconostoc oenos

Năm 1995 một số nhà phân loại vi sinh vật học đã đề xuất và thống nhất đặt

chủng Leuconostoc oenos với tên mới là Oenococcus oeni Cho đến nay, cách phân loại này được nhiều nhà khoa học chấp nhận và Oenococcus oeni đã trở thành cái tên chính thức cho loài vi khuẩn này Leuconostoc oenos có hình cầu dài, nối với nhau

thành chuỗi Loài này có đặc điểm hoàn toàn khác với những loài vi khuẩn khác thuộc nhóm này là chúng có thể phát triển ở nồng độ ethanol cao (> 10%) và pH thấp (<4,2)

Qua rất nhiều nghiên cứu người ta thấy rằng vi khuẩn Leuconostoc oenos là loài

có khả năng sinh trưởng mạnh mẽ nhất (chịu đựng và thích nghi tốt nhất trong môi trường rượu vang) Đồng thời chúng còn có khả năng cải thiện hương và vị làm tăng chất lượng cho sản phẩm Các chủng vi khuẩn còn lại tuy vẫn có khả năng chuyển hóa acid malic, làm giảm vị chua cho rượu vang nhưng chúng không có khả năng điều chỉnh hương vị, thậm chí có thể là nguyên nhân gây ra các biến đổi không mong muốn trong giai đoạn tàng trữ và bảo quản sản phẩm Vì thế, trong công nghiệp sản

xuất rượu vang Leuconostoc oenos là loài mang lại nhiều đặc tính mong muốn nhất

cho chất lượng rượu vang

a Đặc tính sinh học [2]

Leuconostoc oenos là một loại liên cầu khẩu Gram dương (Gr+) nằm trong hệ

vi khuẩn sinh acid lactic chịu được độ cồn và acid tương đối cao như ở rượu vang và

sâm – panh Có nhiều loại Leuconostoc nhưng chỉ có Leuconostoc oenos mới có giá

trị ứng dụng trong công nghiệp, đặc biệt là trong công nghiệp sản xuất rượu vang

Leuconostoc oenos có kích thước nhỏ nhất trong các loại vi khuẩn lactic có

trong rượu vang, đường kính tế bào của chúng thường nhỏ hơn 0.7 micromet

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT

Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 15 Khoa Hóa học & CNTP

Leuconostoc oenos tạo ra các khuẩn lạc rất bé màu trong mờ sau 2 – 3 ngày nuôi cấy

trên môi trường đặc Các tế bào vi khuẩn có thể đứng riêng lẻ hoặc kết thành chùm

2, 3 tế bào hoặc kết thành chuỗi, các tế bào đều là vi khuẩn Gram dương, không

chuyển động, không sinh bào tử Leuconostoc oenos thường phát triển thích hợp trên

các môi trường acid nhưng rất khó nuôi cấy trên các môi trường nhân tạo

Trong cùng loài Leuconostoc oenos khả năng lên men đường của mỗi chủng

cũng khác nhau Có chủng lên men được hoàn toàn L – arabinoza và D – fructose ở các pH 4,5,7 nhưng có chủng lại không lên men được L – arabinoza và chỉ lên men

yếu ớt D – fructose Đối với các loại đường khác thì tác dụng của Leuconostoc oenos

rất yếu hoặc không xác định được Nhìn chung, người ta sẽ dựa vào khả năng lên mên

D – glucose và sự tạo thành acid D – lactic để phân biệt Leuconostoc với các loài

khác Trong khi trên môi trường thực nghiệm dùng D – glucose không chứa fructose

và acid malic thì Leuconostoc onenos cần có khoảng thời gian 15 ngày để chuyển hóa

glucose rồi ngừng phát triển còn các loại vi khuẩn lactic khác chỉ cần có 2 ngày mà

thôi Ở đây lượng acid D – lactic tạo thành so với lượng lactic tổng ở loài Leuconostoc

oenos đạt tỉ lệ 95% trở lên, còn các loài khác chỉ từ 25 – 44%

Sơ đồ chuyển hóa glucose ở Leuconostoc oenos như sau:

b Enzym trong Leuconostoc oenos [2]

Leuconostoc oenos có nhiều loại enzym Hoạt tính enzym của loài này gần như

hoạt tính enzym của trực khuẩn và cầu khuẩn Thế nhưng hoạt tính một số loại enzym

của các chủng trong loại Leuconostoc oenos có sự khác nhau khá rõ Người ta nhận thấy khoạt lực enzym glucosidaza ở các chủng thuộc loài Leuconostoc oenos đều rất

mạnh, đặc biệt là α – D- galactosidaza, α – D- arabinoza α và β – D- glucosidaza, β – D- xylosidaza Các β- glucpsidaza tác dụng ngược lên trên các cơ chất và thủy phân các antocyamin có trong nước ép nho hoặc trong vang đỏ Do vậy vang đỏ thường bị giảm màu và có sự tích lũy không ổn định glucose và fructose trong quá trình lên men malolactic [2], [5]

Các enzym esteraza ở loài Leuconostoc oenos thủy phân được các este của acid

ức chế quá trình sinh trưởng và hoạt động của Leuconostoc oenos [2] Leuconostoc

oenos có khả năng chống chịu tốt đối với một số loại kháng sinh như streptomycin, gentamycin, lyncomycin và neomycin Đối với các loại kháng sinh khác thì khả năng

chống chịu không rõ ràng Đáng chú ý là vi khuẩn Leuconostoc oenos chống chịu

được các chất kháng sinh rất đặc trưng đối với vi khuẩn yếm khí tuyệt đối hay yếm khí tùy tiện

Tất cả các vi khuẩn thuộc loài Leuconostoc oenos đều không có khả năng tạo

dextran do vậy không làm nhớt môi trường vì thế rượu vang lắng được một các dễ dàng

Hoạt độ enzym malolactic của Leuconostoc oenos có một ý nghĩa cực kì quan

trọng vì nó có vai trò lớn trong việc tạo nên chất lượng cảm quan trong rượu vang

có độ chua thích hợp cũng như có vị đắng dịu Mặt khác cũng nhờ enzym này mà acid citric được chuyển hóa thành các chất khác có vai trò tổng hợp nên mùi thơm

đặc trưng cho vang Hoạt độ malolactic của Leuconostoc oenos có giá trị cao nhất ở

pH = 3 và thấp dần theo chiều tăng của pH Hoạt độ này phụ thuộc rất nhiều vào nồng

độ acid malic vì acid malic là chất cảm ứng cho sự hình thành enzym malolactic Khi

nồng độ acid malic ≥ 10mg/l thì hoạt độ enzym malolactic của Leuconostoc oenos là

cao nhất Ngược lại khi nồng độ acid malic nhỏ hơn 10mg/l thì hoạt độ enzym malolactic thấp dần

1.2.6 Các biến đổi diễn ra trong quá trình lên men malolactic

1.2.6.1 Sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn malolactic trong quá trình lên men malolactic

Vi khuẩn malolactic có mặt trong tất cả các nước cacao và rượu vang Tùy thuộc vào giai đoạn của quá trình làm rượu vang, điều kiện môi trường mà chúng sẽ xác định khả năng sinh sản của chính mình Khi phát triển, chúng chuyển hóa một số lượng lớn các chất Vì thế mà vi khuẩn malolactic đóng một vai trò quan trọng trong

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT

Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 18 Khoa Hóa học & CNTP

giai đoạn này chất dinh dưỡng đã bị nấm men sử dụng gần như cạn kiệt để tạo ra ethanol, vì thế mà lượng ethanol này có thể gây ức chế và kìm hãm sự trao đổi chất của vi khuẩn malolactic Sự thích nghi của vi khuẩn malolactic phụ thuộc vào quá trình xử lí nguyên liệu

‒ Pha tăng trưởng (pha log): trong pha này hầu hết các vi khuẩn malolactic

đã thích nghi và sẽ tăng trưởng với tốc độ sinh trưởng cực đại Các tế bào còn sống

sẽ bắt đầu nhân lên đến khi sinh khối đạt ổn định và acid malic bắt đầu suy giảm trong pha này, chất dinh dưỡng chủ yếu được sử dụng để xây dựng vật chất tế bào và sinh sản

‒ Pha cân bằng: trong pha này số lượng tế bào sống là ổn định, acid malic

hầu như được phân giải hoàn toàn

‒ Pha suy vong: các tế bào sống bắt đầu già đi, giảm dần và tế bào chết tăng

lên, xuất hiện hiện tượng tự phân do các enzyme protease nội bào

Trong những ngày đầu của quá trình lên men rượu, vi khuẩn và nấm men đều sinh sản Sau đó, chúng bắt đầu thích nghi hơn với môi trường và nhanh chóng tăng

số lượng Trong suốt thời gian này, vi khuẩn vẫn tiếp tục sinh sản để tăng số lượng

phụ thuộc vào pH môi trường Vi khuẩn malolactic đóng vai trò quan trọng trong lên men malolactic, chúng thường diễn ra sau khi nấm men đã hoàn tất quá trình lên men

2000; Versari et al., 1999) [8]

suy vong, nhường chỗ cho vi khuẩn malolactic phát triển Một phần nấm men chết đi

có thể bị tự phân Hiện tượng tự phân của nấm men là hiện tượng các thành phần của xác tế bào nấm men bị phân giải dưới tác dụng của enzyme thủy phân (hydrolase) của chính bản thân tế bào Trong quá trình này, hầu hết các protein, acid nucleic, lipid

và các vật chất của tế bào đều bị phân giải thành những chất có phân tử lượng thấp hơn và hòa tan vào môi trường Điều kiện để hiện tượng tự phân của tế bào xảy ra là

tế bào đã chết nhưng vẫn còn giữ được hoạt tính của các enzyme hydrolase Trong sản xuất rượu vang truyền thống, người ta có thể tận dụng xác nấm men tự phân làm nguồn cung cấp một số chất dinh dưỡng cần thiết cho vi khuẩn lên men malolactic phát triển

1.2.6.3 Sự tương tác giữa vi khuẩn malolactic và nấm men

Sự tương tác giữa nấm men và vi khuẩn malolactic có ý nghĩa quan trọng trong sản xuất rượu vang Bên cạnh việc nghiên cứu, tuyển chọn những giống vi khuẩn malolactic có khả năng thích nghi cao và lên men malolactic tốt, ta còn phải nghiên cứu những tương tác có lợi giữa nấm men và vi khuẩn nhằm mục đích tăng cường khảnăng chống chịu của vi khuẩn trước những ảnh hưởng bất lợi của môi trường Đã

có khá nhiều nghiên cứu về vấn đề tương tác giữa nấm men và vi khuẩn malolactic Những nghiên cứu trên đều chỉ ra được các loại tương tác khác nhau (kích thích, kìm hãm, trung lập) giữa vi khuẩn malolactic và nấm men

Mức độ của những tương tác này còn tùy thuộc vào nhiều yếu tố bao gồm sự tương tác của từng tổ hợp chủng nấm men vi khuẩn malolactic cụ thể, sự hấp thụ và giải phóng các chất dinh dưỡng bởi nấm men, sự tạo thành các sản phẩm trao đổi chất ngoại bào có khả năng kích thích hoặc gây độc đối với vi khuẩn malolactic

Khi xét ảnh hưởng tương tác giữa nấm men và vi khuẩn malolactic ta thường

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT

Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 22 Khoa Hóa học & CNTP

Một vài loài nấm men có khả năng góp phần vào quá trình lên men malolactic, nhưng vai trò này đã bị phủ định bởi chức năng chính của nấm men là chuyển hóa chất dinh dưỡng thành cồn Cơ chế tương tác mang tính chất ức chế của nấm men đến

vi khuẩn malolactic vẫn chưa được hiểu một cách rõ ràng Tuy nhiên đã có nghiên cứu cho thấy rằng những ảnh hưởng của nấm men lên vi khuẩn là hạn chế sự phát triển và tồn tại do sản phẩm tạo ra hay sự cạnh tranh chất dinh dưỡng của nấm men Những nghiên cứu của Lallemand ở phòng thí nghiệm cho biết nấm men tạo chất

kháng khuẩn làm hạn chế sự phát triển của Leuconostoc oenos và các vi khuẩn lactic

khác Chất kháng khuẩn này là các sản phẩm trao đổi chất ngoại bào của nấm men

hóa dịch nho ban đầu là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến sự ức chế vi khuẩn malolactic và kéo dài thời gian lên men Người ta thấy rằng, hầu hết các chủng

‒ Các acid béo mạch trung bình như acid decanoic, dodecanoic, hexanoic, octanoic… cũng có khả năng ức chế sinh trưởng và khả năng lên men malolactic vi khuẩn lactic, cụ thể: acid decanoic có khả năng ức chế cả nấm men lẫn vi khuẩn malolactic (Edwards và Beelman, 1987; Edwards và cộng sự, 1990; Lonvaud-Funel

và cộng sự, 1988) Đối với hỗn hợp acid decanoic và dodecanoic, Capucho và San Ronao(1994) đã chứng minh rằng, hàm lượng thấp của các acid này (12,5mg/l decanoic và 2,5 mg/l dodecanoic) kích thích khả năng lên men malolactic của vi

khuẩn nhưng ở hàm lượng cao hơn thì xảy ra theo chiều hướng ngược lại Sự có mặt đồng thời của các acid hexanoic, octanoic và decanoic có thể gây tác động ức chế đến sinh trưởng và lên men malolactic mạnh hơn so với khi chỉ tồn tại riêng lẻ từng loại acid béo (Lonvaud-Funel và cộng sự, 1988)

‒ Sự tạo thành các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn cũng đã được nghiên cứu Theo nghiên cứu của Dick và cộng sự (1992), các hợp chất này có bản chất là protein tích điện âm Tuy nhiên khả năng này cũng phụ thuộc vào từng chủng và có

ít những nghiên cứu sâu về lĩnh vực này đối với các chủng nấm men khác nhau trong sản xuất rượu vang (H.Alexandre và cộng sự, 2004)

‒ Bên cạnh khả năng ức chế bởi các chất có hoạt tính sinh học và các chất kháng khuẩn tự nhiên, sự ức chế vi khuẩn malolactic bởi nấm men còn do sự cạn kiệt

về nguồn chất dinh dưỡng Các chất này được nấm men sử dụng trong giai đoạn sinh trưởng và lên men ethanol Kết quả là sau khi kết thúc quá trình lên men ethanol và bắt đầu lên men malolactic, các chất sinh trưởng như amino acid, vitamin hầu như không còn đủ cho vi khuẩn malolactic phát triển

b Kích thích vi khuẩn malolactic sinh trưởng bởi nấm men

Tác động kích thích lên vi khuẩn malolactic của nấm men ít được nghiên cứu hơn Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Fornachon (1968), sự kích thích khả năng lên men malolactic của vi khuẩn có liên quan đến hiện tượng tự phân của nấm men Khi nấm men tự phân sẽ giải phóng vào dịch lên men một lượng các hợp chất nitơ gồm các acid amin, peptide, protein và vitamin Ngoài ra những phân tử lớn khác như glucan, mannoprotein cũng được giải phóng trong quá trình tự phân nấm men và kích thích sự phát triển của vi khuẩn Các hợp chất này rất cần thiết cho sự sinh trưởng và trao đổi chất của vi khuẩn malolactic trong vang, cụ thể:

‒ Các phân đoạn nitơ khác nhau sinh trưởng vi khuẩn malolactic: Hiện nay vẫn chưa có một kết luận chính thức nào về khả năng sử dụng và chuyển hóa các loại peptide ở các vi khuẩn malolactic Tuy nhiên, đã có nhiều nghiên cứu cho thấy sự ảnh hưởng của các phân đoạn protein từ dịch tự phân nấm men trong môi trường vang đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn malolactic Các nghiên cứu trên đều