NGHIÊN CỨU NẤM PHYTOPHTHORA INFESTANS GÂY BỆNH MỐC SƯƠNG HẠI CÀ CHUA, KHOAI TÂY VỤ ĐÔNG XUÂN NĂM 2008-2009 TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM

Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.), khoai tây (Solanum tuberosum L.) là hai loại cây họ cà được trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới nói chung

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

- -Trần yến chi

NGHIÊN CỨU NẤM PHYTOPHTHORA INFESTANS GÂY BỆNH

MỐC SƯƠNG HẠI CÀ CHUA, KHOAI TÂY VỤ ĐÔNG XUÂN NĂM 2008-2009 TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM

Luận văn thạc sĩ nông nghiệp

Chuyên ngành: bảo vệ thực vật

Mã số: 60.62.10

Người hướng dẫn khoa học: ts ngô thị xuyên

HÀ NỘI - 2009

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này làtrung thực và chưa hề được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đãđược cảm ơn và các thông tin trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Ngô Thị Xuyên, người

đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thựchiện đề tài và hoàn chỉnh luận văn của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong Bộ môn Bệnhcây, các thầy cô trong Khoa Nông học, Khoa Sau đại học, Trường Đạihọc Nông nghiệp Hà Nội, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôitrong suốt thời gian thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn thạc sĩ Lê Hồng Vĩnh, ViệnNghiên cứu Sinh học Nauy, đã giúp đỡ hướng dẫn tận tình trong quátrình thực hiện đề tài cũng như hoàn chình luận văn

Để hoàn thành luận văn, tôi còn nhận được sự động viên, khích lệcủa bạn bè và những người thân trong gia đình Tôi xin chân thành cảm

ơn tất cả những tình cảm cao quý đó

Hà Nội, ngày 22 tháng 09 năm 2009

Tác giả luận văn

Trần Yến Chi

MỤC LỤC

Lời cam đoan 1

Lời cảm ơn 2

Mục lục 3

Danh mục bảng 4

Danh mục hình 7

1.2 Mục đích, yêu cầu nghiên cứu của đề tài 3

2 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU TRONG VÀ

3 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

4.1 Tình hình bệnh mốc sương P infestans hại khoai tây, cà chua các

tỉnh phía bắc vụ đông xuân 2008-2009 37 4.2 Xác định chủng nấm của các isolate thu thập được 40 4.3 Ảnh hưởng của ánh sáng tới khả năng tồn tại nảy mầm của bào tử

4.4 Nghiên cứu thời gian tiềm dục của bệnh trên một số giống cà

4.5 Nghiên cứu tốc độ phát triển của vết bệnh 514.6 Khả năng hình thành bào tử và số lượng bào tử hình thành trên

4.10 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản tới thành phần

nấm hại trên mắt củ khoai tây giống 674.11 Nghiên cứu tính kháng Metalaxyl và Metalaxyl M của các mẫu

nấm P infestans thu thập được trong vụ đông xuân 2008-2009. 704.11.1 Xác định tính kháng thuốc trên đĩa củ: 71

4.12 Nghiên cứu tính kháng Mancozeb của các mẫu nấm P infestans

thu thập trong vụ đông xuân 2008-2009 754.13 Phương pháp nghiên cứu tính kháng nhiễm trên củ khoai tây đối

4.14 Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo trong nhà lưới 78

DANH MỤC BẢNG

3.1 Các isolate nấm thu thập được trong vụ đông xuân 2008-2009 tại

4.1 Tình hình bệnh mốc sương hại cà chua, khoai tây tại các tỉnh phía

bắc Việt Nam vụ đông xuân năm 2008-2009 38

4.2 Chủng nấm của các isolate nấm P.infestans thu thập được trong vụ

đông xuân 2008-2009 tại các tỉnh phía bắc Việt Nam 404.3 Ảnh hưởng của ánh sáng đối với khả năng nảy mầm của

P.infestans trong các điều kiện khác nhau trong những thời điểm

4.4 Ảnh hưởng của ánh sáng tới khả năng nảy mầm của bào tử nấm

mốc sương trong khoảng thời gian từ 12-13 giờ trong ngày 46

4.5 Thời kì tiềm dục (ngày) của các isolate nấm P.infestans trên một

4.9 Số lượng bào tử phân sinh nấm P.infestans/cm2 vết bệnh trên các

4.10a Ngưỡng xâm nhiễm của bào tử P.infestans trong thí nghiệm đĩa lá

4.10b.Ngưỡng xâm nhiễm của bào tử P.infestans trong thí nghiệm đĩa lá

4.11 Khả năng tồn tại của bào tử mốc sương P.infestans trong đất canh tác

634.12 Thành phần tác nhân gây bệnh trên củ khoai tây giống và khoai

4.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản tới sự xuất hiện của các tác

nhân gây bệnh hại trên mắt củ khoai tây giống 68

4.14 Tính kháng thuốc metalaxyl của nấm P infestans trong thí nghiệm

4.15 Tính kháng thuốc metalaxyl và metalaxyl M của nấm P infestans

4.16 Tính kháng thuốc metalaxyl và metalaxyl M của nấm P infestans

4.17 Tính kháng nhiễm toàn củ của một số giống khoai tây đối với nâm

4.18 Tính kháng nhiễm trên khoanh củ của một số giống khoai tây đối

4.19 Khả năng kháng nhiễm của một số giống khoai tây, cà chua trong

DANH MỤC HÌNH

4.1 Một số ảnh triệu chứng bệnh mốc sương trên cà chua, khoai tây

Error! Bookmark not defined.

4.2 Ảnh hưởng của ánh sáng đối với khả năng nảy mầm của

P.infestans trong các điều kiện khác nhau trong những thời điểm

khác nhau trong ngày với điều kiện thời tiết khác nhau 444.3 Ảnh hưởng của ánh sáng tới khả năng nảy mầm của bào tử nấm

trong khoảng thời gian từ 12-13 giờ trong ngày 464.4 Sự nảy mầm của bào tử phân sinh nấm mốc sương trên môi

trường WA trong thí nghiệm ảnh hưởng của ánh sáng tới sự nảy

4.10 Một số ảnh ttrong thí nghiệm độc tính của nấm P.infestans trên

4.11 Ngưỡng xâm nhiễm của bào tử P.infestans trong thí nghiệm đĩa

canh tác 644.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản tới sự xuất hiện của các tác nhân

gây bệnh hại trên mắt củ khoai tây giống 694.14 Thí nghiệm bệnh trên mắt củ khoai tây giông 70

4.15 Tính kháng thuốc metalaxyl của nấm P.infestans trong thí

4.16 Tính kháng thuốc metalaxyl và metalaxyl M của nấm P.

4.17 Một số ảnh trong thí nghiệm kháng thuốc metalaxyl và metalaxyl

M của nấm P.infestans Error! Bookmark not defined.

4.18 Tính kháng nhiễm toàn củ của một số giống khoai tây đối với

4.19 Tính kháng nhiễm trên khoanh củ của một số giống khoai tây đối

4.20 Một số ảnh thí nghiệm kháng nhiễm nấm P.infestans trên củ

4.21 Một số ảnh của thí nghiệm lây bệnh nhân tạo nấm P.infestans

trên một số giống khoai tây, cà chua Error! Bookmark not defined.

1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.), khoai tây (Solanum

tuberosum L.) là hai loại cây họ cà được trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế

giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng Trên thế giới khoai tây là loại câylương thực có diện tích trồng đứng thứ 4 sau lúa nước, lúa mì và ngô [51]vớidiện tích hơn 18 triệu ha vào năm 2007 Khoai tây, cà chua là hai loại câyngắn ngày, năng suất cao có vai trò quan trọng trong hệ thống luân canh câytrồng nhất là tại miền Bắc Việt Nam nơi có một mùa đông lạnh Hiện nayngành nông nhiệp Việt Nam mới cung cấp được 80% nhu cầu tiêu dùng khoaitây trong nước hiện chúng ta vẫn phải nhập khẩu gần 100.000 tấn khoaitây/năm Hiện nay sản xuất khoai tây ở nước ta chủ yếu phục vụ nhu cầutrong nước, số lượng xuất khẩu không nhiều, thị trường trong nước của khoaitây là khá rộng lớn.Đặc biệt một số nước lân cận như Lào, Campuchia,Malaysia, Singapore lại không có khả năng sản xuất khoai tây vì vậy tiềmnăng suất khẩu của khoai tây Việt Nam là rất lớn

Diện tích trồng cà chua của nước ta năm 2001 khoảng 12 - 14 ngàn ha,khoai tây khoảng 32 - 40 ngàn ha (Tạ Thu Cúc, 2001) [1] và tiếp tục tăngthêm Trong những năm gần đây các vùng chuyên canh rau ngày càng mởrộng thêm về diện tích và được chú ý đầu tư công nghệ cao tuy vậy sản lượngkhoai tây chỉ đạt 10-11 tấn/ha thấp hơn so với năng suất trung bình trên thếgiới (16.8 tấn/ha) và khu vực (15.7 tấn/ha), năng suất cà chua đạt 30-40 tấn/haxấp xỉ với mức trung bình chung của thế giới và khu vực (30 tấn/ha) Có điềunày là do sản xuất khoai tây, cà chua ở nước ta còn có nhiều yếu tố bất lợikìm hãm năng suất như: bệnh hại, sâu hại, trình độ canh tác của người nông

dân Trong các yếu tố hạn chế năng suất của sản xuất khoai tây cà chua bệnhhại là một trong những yếu tố quan trọng và nguy hiểm bậc nhất.

Bệnh hại trên cà chua khoai tây rất đa dạng về thành phần và nguyênnhân gây bệnh Cà chua, khoai tây bị rất nhiều loại dịch hại tấn công như:nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng Thành phần bệnh trên cây khoai tây và càchua cũng khá đa dạng: bệnh mốc sương, bệnh héo rũ gốc mốc trắng, bệnhhéo vàng, bệnh đốm lá, bệnh héo rũ vi khuẩn, bệnh xoăn lá do virus, bệnhsưng rễ do tuyến trùng nốt sưng Trong đó bệnh mốc sương do nấm

Phytophthora infestans gây ra là bệnh gây hại nghiêm trọng bậc nhất, đặc biệt

bệnh nếu bùng phát thành dịch sẽ rất nguy hiểm ở các vùng chuyên canh

Các nghiên cứu về phân bố cũng như tác hại của bệnh cũng đã đượctiến hành từ rất sớm Theo đánh giá tác hại của bệnh mốc sương gây hại ởvùng ngoại thành Hà Nội những năm 1965 thiệt hại trung bình từ 30-70%, ởmức độ cao có thể gây mất năng suất hoàn toàn.Trong những năm gần đâymức độ bệnh hại vẫn ở mức khá cao Vụ xuân 1996 tỉ lệ bệnh tại Hà Nội là40-60% Vụ đông xuân 1996-1997 tại vùng Gia Lâm, Đông Anh- Hà Nội vàogiai đoạn cuối tháng 3 đầu tháng 4 tỉ lệ bệnh lên tới 51% với chỉ số bệnh28,6% và thiệt hại tới 60% năng suất Phân bố của bệnh mốc sương cũng khárộng theo các nghiên cứu cho thấy bệnh phổ biến ở các vùng Hà Nội, LàoCai, Bắc Giang, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hải Phòng, Lâm Đồng (Vũ Hoan,1973; Nguyễn Văn Viên, 1998)

Nhiều biện pháp đã được đưa ra để hạn chế tác hại của bệnh mốc sươnggây ra như sử dụng tập đoàn giống mới cho các vùng nhiễm bệnh, sử dụngcác thuốc hoá học nhưng chưa đem lại kết quả như mong đợi Bên cạnh đó doviệc sử dụng thuốc hoá học để phòng hay trừ bệnh lại thường hay không đúngcách người nông dân tăng nồng độ thuốc lên nhiều lần gia tăng áp lực củathuốc làm cho tính kháng thuốc đã bắt đầu xuất hiện ở loài nấm này

Hơn nữa do tình hình biến động về chủng quần, điều kiện sống tự nhiênloài nấm này đã hình thành các chủng nấm khác nhau A1và A2 Theo cácnghiên cứu gần đây về sự phân bố của các chủng nấm, chủng quần mới A2 đãxuất hiện ở các nước lân cận như: Hàn Quốc, Indonesia, Thái Lan, TrungQuốc và gây hại nghiêm trọng trong sản xuất (Nishimura et all, 1999).Chủng quần mốc sương cuả Việt Nam là chủng quần cũ (chủng nấm A1) nếu

có sự biến đổi chủng quần hoặc có thêm chủng quần mới chủng nấm A2 sẽgây tổn thất rất lớn tới sản xuất khoai tây cà chua nước ta Trước những nguy

cơ về tính kháng thuốc cũng như sự thay đổi về chủng quần nấm mốc sương

P infestans chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu nấm Phytophthora infestans gây bệnh mốc sương hại

cà chua, khoai tây vụ đông xuân năm 2008-2009 tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam”

1.2 Mục đích, yêu cầu nghiên cứu của đề tài.

1.2.1 Mục đích

Tìm hiểu một số đặc điểm sinh học của nấm mốc sương P infestans

như khả năng tồn tại trong đất, trong điều kiện ánh nắng trực xạ…; khả nănglây nhiễm của nấm trên một số giống khoai tây, cà chua từ đó đưa ra các biệnpháp phòng chống thích hợp

- Nghiên cứu các đặc tính về khả năng lây nhiễm của nấm P infestans

trên một số giống khoai tây, cà chua

- Nghiên cứu về sự tồn tại nguồn bệnh mốc sương trong đất tại cácvùng trồng cà chua khoai tây, vùng Hà Nội và phụ cận.

- Nghiên cứu sự tồn tại của bệnh mốc sương cũng như các bệnh hạikhác trên củ (thương phẩm và giống) khoai tây

- Nghiên cứu khả năng kháng thuốc Metalaxyl, Metalaxyl M,Mancozeb của các mẫu nấm phân lập được

2 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU TRONG

VÀ NGOÀI NƯỚC

2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Bệnh mốc sương cà chua, khoai tây do nấm P infestans là một trong

những bệnh được nghiên cứu nhiều nhất, lịch sử nghiên cứu lâu dài nhất,tuy vậy bệnh vẫn là một trong những bệnh hại nguy hiểm nhất trong lịch sửnhân loại

Có nhiều tác giả nghiên cứu về trung tâm phát sinh của nấm P.

infestans nhưng vẫn chưa có kết luận chính xác về trung tâm phát sinh của

nấm này Theo những nghiên cứu của những nhà khoa học đầu tiên nghiêncứu về bệnh này là Berkelay và De Bary thì trung tâm phát sinh của bệnh làdãy Andes Nam Mỹ cũng là trung tâm phát sinh của khoai tây kí chủ chínhcủa nấm mốc sương Reddick (1939) cho rằng nấm mốc sương có trung tâmphát sinh ở cao nguyên miền trung Mexico Các nghiên cứu gần đây về trungtâm phát sinh của bệnh này cho rằng Mexico là trung tâm đa dạng sinh học

của loài nấm P infestans nhưng vẫn chưa kết luận rằng Mexico hay dãy

Andes là trung tâm phát sinh của nấm này (Abad, 1998) [21] Mizubuti và Fry(2006) cũng kết luận rằng Mexico là trung tâm đa dạng sinh học của loài nấmnày Mexico cũng là nơi đầu tiên phát hiện ra chủng nấm A2 Chủng quần ởhầu hết các nước trên thế giới là vô tính, phần lớn thuộc vào chủng nấm A1(Goodwin et all, 1994) trong khi đó tại trung tâm đa dạng sinh học này xuấthiện hai loại chủng nấm A1 và A2 với tỉ lệ ngang bằng nhau (Gallegly vàGanlido, 1958;Tooley et all, 1985; Nierderhauster,1991) tạo ra một quần thểnấm hữu tính (Tooley et all, 1985; Fernandez-pavia, 2004) hoàn toàn khácbiệt với các quần thể nấm khác trên thế giới (B M Cooke, D Gareth Jones,

B Kaye, 2006)

Cùng với cây khoai tây bệnh mốc sương từ trung tâm đa dạng sinh học

ở Mexico đã lan truyền ra khắp các vùng trồng khoai trên thế giới Có nhiềugiả thiết khác nhau về con đường phát tán của bệnh ra các vùng trồng khoaitây ở Mỹ và Châu Âu vào thập niên 40 thế kỉ 19 Giả thiết thứ nhất là bệnhlan truyền từ Mexico tới Mỹ sau đó lan truyền tới châu Âu (Fry, 1993); giảthiết thứ 2 là bệnh lan truyền từ dãy Andes tới Mỹ và Châu Âu (Tooley,1989); giả thiết thứ 3 là bệnh lan truyền từ trung Mexico tới Andes sau đó lantruyền tới Mỹ và châu Âu (Andrivon, 1996) [22] Bệnh xuất hiện đầu tiên ởphía đông nước Mỹ (Fry et all, 2002) [39] Có những bằng chứng về sự xuấthiện của bệnh ở phía nam nước Mỹ vào năm 1842 trong củ khoai tây dại,cùng thời điểm này cũng có nhiều ghi nhận bệnh mốc sương trên khoai tây tạicác nước châu Âu Năm 1841 bệnh được ghi nhận tại một số vùng ở Nauy(Westrern), Bỉ Năm 1842 Bệnh xuất hiện ở 6 nước thuộc châu Âu là: Bỉ, HàLan, Đức, Đan Mạch, Ireland, Anh, Scotland Con đường lan truyền sangChâu Âu được cho là thông qua củ khoai tây bị bệnh vì các vật liệu mangbệnh khác như lá, thân rất nhanh bị mục nát do vận chuyển Nguồn mốcsương lan truyền chủ yếu là từ Mỹ vì Mexico vào thế kỉ 19 khoai tây khôngphải loại lương thực được trồng rộng rãi Cùng với sự phát tán của khoai tâytới các vùng trồng trọt ở châu Âu và châu Mỹ một thời gian ngắn sau bệnhmốc sương cũng nhanh chóng lan truyền và gây hại nặng ở các vùng trồngtrọt này Bệnh mốc sương đã gây ra mất mùa khoai tây ở vụ đông năm 1845

và năm 1846 tại Ireland làm hơn 1.5 triệu người chết đói và gần 1 triệu ngườichết trong khi di cư sang Mỹ để tránh nạn đói này Bệnh mốc sương cũng gâynạn đói thứ 2 xảy ra ở nước Đức năm 1919

Nấm P infestans thuộc lớp nấm trứng (Oomycetes), bộ nấm sương mai

(Peronosporales) lớp nấm này thuộc một giới (Kingdom) khác hẳn với nấm(true fungi), thực vật, động vật và procaryote Một số tác giả cho rằng lớp

nấm trứng thuộc về giới Protoctista một số khác thì cho rằng nó thuộc giớiChromista.

Nấm gây hại trên khoai tây cà chua tạo ra các triệu chứng đa dạng tuỳthuộc vào giống và điều kiện thời tiết Trên lá bệnh lúc đầu chỉ là những điểmnhỏ màu xanh tái hình dạng không đều sau biến thành màu nâu và xanh nhạtvết bệnh không có giới hạn rõ rệt (Stevenson, 1993) Lúc đầu bệnh thườngxuất hiện ở mép lá, cuống lá sau đó lan rộng vào phiến lá tạo thành nhữngđám mô bị thối nâu, khi trời ẩm ướt mặt dưới lá chỗ có vết bệnh xuất hiện lớpnấm trắng xốp như sương muối (Drenth, Janssen và Govers ,1995) đó là đámcành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh của nấm gây bệnh Còn ở trên thân,

bị bệnh từng đoạn dài, vỏ và ruột phần thân thối ướt màu nâu đen Chỗ bịbệnh nhỏ tóp lại có khi chỉ một phía thân bị thối Khi ẩm ướt, trên vết bệnh cólớp nấm trắng như sương muối bao phủ khi thời tiết khô vết bệnh tóp lại.Cành thân bị bệnh rễ gãy gục làm tan cây xơ xác

Trên củ khoai tây bị bệnh, vết bệnh thường bị nhầm lẫn với một số bệnhthối củ do vi khuẩn, mặt củ có vết màu nâu lõm xuống, to nhỏ khác nhau Khicắt ngang củ ở chỗ bị bệnh, từ ngoài vỏ vào trong ruột có thấy màu nâu xám lanrộng vào phía trong Để trong điều kiện 200C và ẩm độ bão hoà sẽ thấy xuất hiệnlớp nấm trắng mịn trên phần bị bệnh Theo Vander Zaag (1994) sự lây nhiễmtrên củ thường ở các vết sần, mắt củ, khe nứt trên vỏ củ Sự lây nhiễm có thể xảy

ra ở giai đoạn trồng hay thu hoạch củ

Nấm có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 4-260C nhưng tối thích ởkhoảng 16-200C, ẩm độ thích hợp là từ 91-100% (Jean, 1985) Bào tử nấm cókích thước trung bình khoảng 36 x 22 µm - 29 x 19 µm (Erwin và Ribeiro,1996)[39] đường kính sợi nấm từ 3,5 - 4,0 µm, khi nuôi cấy trên môi trườngnhân tạo có thể đạt kích thước từ 7,0 - 16 µm Trên mô bệnh nấm hình thànhcác bào tử phân sinh hình ôvan, elíp hoặc hình quả chanh yên, bào tử ngắn,

đỉnh bào tử có núm nhỏ, kích thước bào tử khoảng 29 - 36 µm x 19 - 22 µm(Stevenson, 1993)

Nấm kí sinh chuyên tính nhưng vẫn có khả năng sống trên môi trườngdinh dưỡng nhân tạo như : Soybean agar, carrot agar, rye agar, PDA, Beanagar, V8, CMA, Lima bean agar, Pea agar (Sato &Kato, 1993; Erwin &Ribeiro, 1996; Hartman, 1995) Nghiên cứu của các tác giả trên cũng cho rằngnấm phát triển mạnh nhất là trên môi trường Pea-agar (Hartman, 1995; Vinh,2003) và Rye agar (Hartman, 1995) Trên môi trường nhân tạo nấm có khảnăng sinh bào tử trứng, thành phần môi trường có ảnh hưởng lớn tới sự hìnhthành bào tử trứng của nấm và khả năng sinh sản hữu tính Theo nghiên cứucủa Fry (2000) trong 116 isolate thu thập được ở Bỉ, Belorussia, Nga, Canada,Ecuador, Israel, Nhật Bản, Mexico, Peru, Phillipin, Ba Lan, Hàn Quốc,Uganda, Anh và Mỹ trong thời kì từ năm 1980-1997 các isolate thuộc chủngnấm A2 có khả năng sinh sản hữu tính trên môi trường hỗn hợp giữa ryeB/V8 với tỉ lệ 50:50, các isolate thuộc chủng nấm A1 không có khả năng sinhbào tử trứng trên môi trường này Thử nghiệm trên môi trường Rye B cácisolate đều không sản sinh bào tử trứng Cũng trong nghiên cứu này tác giảcũng cho rằng các môi trường khác như oatmeat agar, tomato juice agar, V8juice agar cũng làm cho A2 sản sinh bào tử trứng, còn A1 thì không Cácnhân tố khác như pH, CaCO3 cũng không làm thay đổi khả năng sinh bào tửtrứng của các isolate thu thập được Thử nghiệm trên lá cà chua, khoai tâytrong điều kiện invivo cũng cho thấy ngay cả thuốc trừ bệnh cũng không làmthay đổi khả năng này (Fry, 2000) [43]

Nấm mốc sương có chu kì phát triển hoàn toàn với hai giai đoạn sinhsản vô tính và sinh sản hữu tính Sinh sản vô tính bằng bào tử phân sinh(Croisier, 1934), dưới hai hình thức nảy mầm trực tiếp và gián tiếp nảy mầmthông qua bào tử động (hình thành trong điều kiện lạnh, có giọt nước) Nấm

mốc sương có 2 chủng nấm A1, A2 và một dạng hữu tính Sinh sản hữu tínhphần lớn sảy ra ở các vùng lạnh ẩm và phải có đủ cả 2 chủng nấm A1, A2hoặc có dạng hữu tính lúc này sẽ sinh ra bào tử trứng Bào tử trứng được hìnhthành khi có sự kết hợp giữa A1 và A2 ở cạnh nhau, cơ quan sinh sản trên sợinấm là bao trứng (Oogonium), và bao đực (Antheridium) Sau khi phối giaonhân của bao đực dồn sang bao trứng thụ tinh hình thành bào tử trứng lưỡngbội (Oospore) với kích thước khoảng 31 x 50 m (Erwin và Ribeiro, 1996).Khi ở vùng khí hậu không thuận lợi cho sự hình thành bào tử trứng hoặc chỉ

có 1 trong 2 chủng nấm thì nấm mốc sương chỉ sinh sản theo kiểu vô tính

Khả năng tồn tại của bào tử vô tính cũng đã được nhiều tác giả nghiêncứu Bào tử và sợi nấm gần như không có khả năng qua đông Bào tử có thểtồn tại từ vài ngày tới vài tuần trong đất ẩm (Adrivon, 1995) [24] nhưngkhông có khả năng tồn tại trong thời gian rất dài đặc biệt là không có khảnăng sống sót trong đất khô (Fernandez, 2004) Tuy vậy khi bào tử hoặc sợinấm nếu đã tấn công và kí sinh vào củ khoai tây thì lại có khả năng qua đôngcao Khoai tây bị bệnh ở trong điều kiện kho chứa có khống chế nhiệt độ,trong các điều kiện bảo quản thông thường hay các củ khoai tây nằm trongvùng đất không bị đóng băng đều là nguồn bệnh cho mùa vụ sau (Kirk, 2001)[42] theo nghiên cứu của Kirk (2003)[43]ợi nấm và bào tử khi được nuôi cấy

và bảo quản trong môi trường nhân tạo vẫn có khả năng chịu được nhiệt độthấp Khi nhiệt độ môi trường -20 tới -100C sợi nấm chỉ có khả năng tồn tạitrong 1 giờ Khi nhiệt độ môi trường -5 đến -30C trong 24 giờ nấm vẫn cònkhả năng lây nhiễm Sau khi đặt ở nhiệt độ 00C khả năng gây bệnh của nấmkhông bị ảnh hưởng Nấm có thể tồn tại ở nhiệt độ -30C trong vòng 3 ngàynhưng ở nhiệt độ -50C chỉ trong 1 ngày

Bào tử ít có khả năng tồn tại trong không khí (Mizubuti, 2000; Sunseri,2001) Trong không khí có rất nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng tới khả năng

sống sót của bào tử như độ ẩm, nhiệt độ và ánh sáng mặt trời Theo nghiêncứu của Fry bào tử nấm có khả năng tồn tại ở ẩm độ cao tốt hơn ở ẩm độ thấp,nhiệt độ từ 15-200C khả năng tồn tại tốt hơn ở 300C Bào tử có thể tồn tại từ 2đến 6 giờ ở nhiệt độ từ 15-300C độ ẩm tương ứng từ 40-88% (Fry, 1981) Ảnhhưởng của ánh sáng mặt trời tới sự nảy mầm của bào từ khá rõ ràng Khi bào

tử chịu ảnh hưởng của trực xạ trong 1 giờ ngày nắng tỉ lệ nảy mầm có thểgiảm 70-3%

Bào tử có thời gian tồn tại trong nước khá lâu Khi bào tử ở bề mặt đấtbão hoà nước trong điều kiện trực xạ có thể tồn tại tới 16 ngày, trong điềukiện bóng râm có thể tồn tại tới 20 ngày Nếu trong điều kiện chỉ có nướckhông có đất khả năng sống của bào tử giảm rõ rệt chỉ từ 2-6 ngày (Porter vàJohnson, 2004)

Chủng nấm A1 phân bố khá rộng rãi Theo thống kê của Cabi 1982 trênthế giới đã có 121 quốc gia và vùng lãnh thổ có xuất hiện chủng nấm này.Đây là chủng nấm đầu tiên phát tán ra khỏi vùng đa dạng sinh học của nó ởMexico Chủng nấm A2 được coi là chủng quần mới do tính chất mới xuấthiện của chủng quần này trên các vùng trông khoai tây và cà chua trên thếgiới Chủng quần A2 được coi là xuất phát từ trung tâm đa dạng sinh học củanấm mốc sương ở Mexico Nhưng theo nghiên cứu của Ko thì A2 có thể hìnhthành do sự thay đổi để thích nghi với điều kiện khí hậu thời tiết của nấm mốcsương Chủng nấm A2 theo thống kê của Cabi (1996) đã xuất hiên ở 21 quốcgia và vùng lãnh thổ trong đó phần lớn các nước ở châu Mỹ, châu Âu tuy vậy

ở một số nước châu Á như Ấn Độ, Hàn Quốc, Nhật Bản đã xuất hiện cả 2chủng nấm bao gồm A1, A2 Trong những nghiên cứu sau này chủng quầnbao gồm cả A1 và A2 còn đuợc phát hiện thêm ở Thái Lan, Nepal và TrungQuốc (Koh, 1999; Nishimura, 1999) Ở một số nước tây Âu, Mỹ, Canada đãphát hiện giai đoạn sinh sản hữu tính (Drenth, 1996)

Vì nấm mốc sương có tốc độ phát triển nhanh và có ảnh hưởng lớn tớinăng suất nên việc phòng chống bệnh là hết sức cần thiết Hiện nay phuơngpháp phòng bệnh thường được bà con nông dân sử dụng là phòng trừ bằngthuốc hoá học Thuốc hoá học đầu tiên được sử dụng phòng chống bệnh làcác thuốc có chứa đồng như Boocdo Sau này các thuốc hoá học khác đượctổng hợp như manconeb có tác dụng ức chế sự phóng bào tử ra khỏi bọc bào

tử làm giảm sự xâm nhiễm ban đầu của nấm Hoạt chất metalaxyl có khả năng

ức chế sự hình thành vòi hút cũng như sự phát triển của sợi nấm trong lá Cáchoạt chất này đã mang lại hiệu quả phòng trừ bệnh tương đối cao như ở miềntrung của Đài Loan thuốc metalaxyl được sử dụng 1-2 lần/tuần làm giảm tỉ lệbệnh hại và đồng thời tăng năng suất (Hartman&Huang, 1995) Metalaxylcũng mang lại hiệu quả cao khi phòng trừ bệnh mốc sương khoai tây, cà chua

ở Hà Lan (Erwin, 1987)

Do sự bùng nổ của bệnh dịch mốc sương nên thuốc hoá học được sửdụng với số lượng lớn, thời gian phun cách nhau ngắn điều đó đã gia tăng áplực trong quần thể mốc sương và làm cho tính kháng của nấm đối với thuốchoá học tăng cao Trong những năm 1989-1990 tại vùng đông bắcWashington đã có những ruộng xuất hiện tính kháng thuốc metalaxyl sau 2-4

vụ phun thuốc này Trong 73 isolate thu thập được thử nghiệm tính khángmetalaxyl trong phòng thí nghiệm tỉ lệ kháng cao lên tới 81% số isolate cònmức kháng thuốc của quần thể đồng ruộng trung bình là 19% 40 isolate thuthập được trên cà chua tỉ lệ kháng cũng đạt trên 60% số isolate

Nghiên cứu tính kháng của P infestans tại Estonia với 138 isolate

thu thập được từ năm 2003-2005 các tác giả nhận thấy tính kháng tăng dầntheo năm, và đặc biệt là ở các vùng sử dụng nhiều metalaxyl Tỉ lệ isolatekháng lên tới 66.7% số isolate thu thập được vào hai năm 2004 và 2005(Runno, 2006) [45]

Tại Hàn Quốc chủng quần bao gồm cả hai loại chủng nấm A1 và A2nghiên cứu trên 260 isolate thu thập trong từ năm 2000-2003 nhận thấy sốisolate có tính kháng đối với metalaxyl khá cao chiếm tới hơn 70% tuy vậytính kháng không tăng lên (Zhang ,2005) Tính kháng thuốc metalaxyl cũng

đã xuất hiện tại các vùng trồng cà chua của Israel (Cohen, 1982)

Ngoài biện pháp hoá học để phòng chống bệnh mốc sương biện phápgiống chống cũng đã được nghiên cứu và tìm hiểu nhằm tạo ra các giống cógen kháng đối với bệnh này

Các nghiên cứu và lai tạo giống của trường đại học Cornell (Mỹ) đãđưa ra giống khoai tây NewYork 128 có khả năng kháng bệnh mốc sương vàcòn có khả năng kháng tuyến trùng ánh vàng hại khoai tây cung cấp chongành nông nghiệp nước Nga Một số giống cà chua như Legend cũng đượccông bố có khả năng kháng mốc sương nhưng các thử nghiệm đồng ruộng đãcho thấy giống kháng kém khi áp lực bệnh lên quá cao Một số giống cà chua

bi như sweetie, red cherry có khả năng chịu bệnh tốt

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nấm P infestans trong giai đoạn đầu có tên là bênh dịch muộn bệnh hại

trên lá, thân, quả cà chua vào các tháng 1-4, 6,7,11,12 trong năm tại các tỉnh BắcThái, Hà Giang, Hà Nội, Hà Tây, Hải Hưng, Hải Phòng, Hoà Bình, Lào Cai,Nam Hà ; trên khoai tây bệnh hại trên lá, thân, củ vào các tháng từ 1-3 và tháng

12 trong năm bệnh gây hại ở các tỉnh Hà Nội, Hà Tây, Hải Phòng (Kết quả điềutra bệnh cây, 1967-1968) [19] Bệnh cũng xuất hiện ở miền Nam với tên gọicháy lá và quả trên cà chua với tỉ lệ không cao gặp vào mùa lạnh; bệnh hại trênkhoai tây với tên gọi bệnh úa muộn với tỉ lệ hại rất nặng (Hoàng Thị Mỹ, 1959)[9] Theo điều tra cơ bản bệnh hại cây trồng tại các tỉnh nam bộ 1977-1978 [20]bệnh mốc sương cà chua hại trên lá, thân quả khoai tây hại trên lá, thân Bệnhgây hại chủ yếu ở vùng Lâm Đồng với thời gian gây hại trong năm từ tháng 5đến tháng 10 đối với cà chua, từ tháng 5 đến tháng 11 đối với khoai tây

Theo nghiên cứu của Vũ Hoan (1973) và Nguyễn Văn Viên 1998) bệnh xuất hiện ở cả hai vụ động và đông xuân của các tỉnh Hà Nội,Hưng Yên, Bắc Ninh và Hải Phòng với tỉ lệ bệnh trung bình là 40,6%, riêngvùng Hà Nội tỉ lệ bệnh đạt 40% (Nguyễn Kim Vân, 1997) [4,5,8] Bệnh xuấthiện vào tháng 12 vụ đông năm trước và có thể kéo dài tới tháng 4 của vụxuân năm sau (Nguyễn Văn Viên, 1998) Bệnh có nhiều đợt phát sinh, cácnhà nghiên cứu cho rằng bệnh có 4 đợt phát sinh: đợt 1 xuất hiện vào giữatháng 12 đầu tháng 1; đợt 2 xuất hiện vào đầu cho đến cuối tháng 1; đợt 3 từđầu tháng đến giữa tháng 2; đợt 4 từ cuối tháng 2 đến đầu tháng 3 Trong cácđợt phát sinh này chủ yếu trên cà chua, đợt 2 và 3 hại nặng trên cà chua chính

(1995-vụ (Nguyễn Duy Nghi, Trương Quang Tám,1975)

Những năm gần đây bệnh xuất hiện và gây hại nặng ở một số vùngtrồng rau chuyên canh như Lâm Đồng, Bắc Giang, Bắc Ninh Trong cácvùng trồng khoai tây vùng Thường Tín (Hà Nội) bệnh không xuất hiện ở vụđông xuân chính và vụ đông xuân muộn Tỉ lệ bệnh của Hải Phòng vào vụxuân 2002 khá cao nhưng tới vụ đông 2002 bệnh chỉ xuất hiện gây hại nhẹ ởvùng An Hải còn vùng Tiên Lãng bệnh không gây hại trên khoai tây Bệnhgây hại nặng tại các vùng như Đông Anh-Hà Nội, Cam Đường và thị xã LàoCai-Lào Cai, Đức Trọng-Lâm Đồng với tỉ lệ bệnh có thể lên tới 70% Cácvùng trồng cà chua khoai tây tại các tỉnh Hưng Yên, Hà Tây, Bắc Ninh, BắcGiang tỉ lệ nhiễm ở mức trung bình 20,5-34,7% Bệnh chủ yếu xuất hiện chủyếu vào vụ đông và đông xuân ở các tỉnh phía Bắc, riêng tại cao nguyên DiLinh- Lâm Đồng bệnh xuất hiện quanh năm trên hầu hết các giống khoai tây,

cà chua trên đồng ruộng Bệnh gây thiệt hại nặng tới sản lượng, năng suấtcũng như phẩm chất của sản phẩm, thiệt hại về năng suất có thể lên tới 40%,

có khi đạt tới 90% (Viện khoa học kĩ thuật nông nghiệp Việt Nam,1990)

Bệnh phát triển mạnh trong điều kiện độ ẩm cao nhiệt độ ban đêm

tương đối thấp, độ nhiệt ban ngày tương đối cao (Đường Hồng Dật, 1976).Nhiệt độ thích hợp cho bệnh phát sinh ban đầu vào khoảng 18 - 22°C, nếutrong điều kiện ẩm độ cao nhưng nhiệt độ lại thấp hơn 10°C hoặc lớn hơn28°C thì khó có khả năng xuất hiện bệnh trên đồng ruộng, ẩm độ thích hợp

nhất cho bào tử P infestans nảy mầm và xâm nhập vào cây phải đạt từ 90%

cho đến độ ẩm bão hoà, ẩm độ thích hợp nhất cho sự phát triển bệnh là 76%,đặc biệt nếu thời tiết có thêm mưa phùn và sương mù thì bệnh sẽ phát triển rấtnhanh, cây có thể bị tàn lụi trong vòng 7 - 10 ngày (Nguyễn Duy Nghi, 1975;Nguyễn Kim Vân, 1997; Vũ Triệu Mân & Lê Lương Tề, 2001) Ở điều kiện11-18°C bào tử phân sinh nảy mần gián tiếp hình thành bọc bào tử động, giảiphóng bào tử động và hình thành sợi nấm khi nhiệt độ > 18°C một bào tử nấm

có thể nảy mần trực tiếp thành ống mầm phát triển thành sợi nấm

Nấm mốc sương có khả năng gây hại trên nhiều giống khoai tây, càchua với các tỉ lệ hại khác nhau.Nghiên cứu của Đào Mạnh Hùng và CTV(1995) thì trên các giống Ba Lan, giống Hồng Lan bị bệnh mốc sương phá hạinặng, giống HP1, HP5 có khả năng chống chịu bệnh khá lớn Còn theo VũTuyên Hoàng và CTV (1982) [6] các giống nhập nội từ châu Âu như:Hungari, Bungari, Liên Xô cũ thường bị nặng và tốc độ phát triển bệnh cũngkhá nhanh, một số giống khoai tây Đức nhập nội như: Cardia, Mariella, Giống khoai tây Pháp(Ackesergen), giống Thường Tín…đều là những giống nhiễm bệnh nặng Một số giốngkhoai tây nhập nội từ trung tâm khoai tây quốc tế (CIP) bao gồm: LBR1-2, LBR1-5, LBR1-9,LBR1-12, LBR1-13,và LBR1-14 là những giống chống bệnh mốc sương (Vũ Triệu Mân, LêLương Tề, 1998)[9]

Đặc điểm nấm P infestans tác giả Nguyễn Kim Vân(1997) cho rằng nấm

có thể phất triển trên môi trường nhân tạo PDA và kích thước của cành bào tửphân sinh biến động trong khoảng 137,8 – 389,6µm x 5,67 - 7,83 µm Nấm cókhả năng phát triển tốt trên môi trường Pea agar nhưng trên môi trường V8 nấm

có khả năng sinh bào tử cao hơn (Hoàng Văn Thọ, Ngô Thị Xuyên, 2003) [17]

Nghiên cứu về đặc tính sinh học của quần thể nấm vào năm 2003 trongtoàn bộ 130 isolate nấm thu thập được trên cà chua và khoai tây đều thuộcchủng nấm A1 Tính kháng thuốc đã xuất hiện trong quần thể và ở mức trungbình, 4% các isolate thu được trên cà chua biểu hiện tính kháng cao đối vớimetalaxyl (Ngô Thị Xuyên, Lê Hồng Vĩnh, 2003) [18] 254 isolate thu đượctrong năm 2005 cũng thuộc chủng nấm A1, thử nghiệm tính kháng vớimetalaxyl trên 126 isolate thu được thì 11% kháng ít, 85,8% kháng trung bình

và 4,2% kháng cao Các isolate có tính kháng từ trung bình tới cao phần lớnthu thập được trên cà chua Tính kháng xuất hiện ở hầu hết các isolate thuthập được từ Lâm Đồng nơi có áp lực sử dụng thuốc hoá học là cao nhất trongcác vùng trồng cà chua, khoai tây thu thập mẫu (Ngô Thị Xuyên, Lê HồngVĩnh, 2005) [18] Nghiên cứu về cấu trúc gen của quần thể nấm P infestans

tại Việt Nam bằng mt-DNA haplotype và nhận dạng vùng GR57 cũng khẳngđịnh rằng chủng quần nấm tại Việt Nam vẫn là chủng quần cũ (Ngô ThịXuyên, Lê Hồng Vĩnh, 2003) [17]

Biện pháp hữu hiệu nhất để phòng chống bệnh mốc sương cho tới thờiđiểm hiện tại là biện pháp hoá học Trước khi bệnh xuất hiện có thể phunphòng bằng các loại thuốc như zineb 80WP nồng độ 0,2-0,3%; thuốc Alliet,Boocdo với nồng độ 1% (Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề, 2001) Nếu bệnh đãxuất hiện trên đồng ruộng và trong điều kiện thời tiết thuận lợi cho sự pháttriển của bệnh nên phun các thuốc trừ nấm như Ridomil 5G, RidomilMZ72 để diệt trừ nấm bệnh Phun thuốc clorua đồng với lượng 2,5kg/haphun 5 lần với khoảng cách 5 ngày/lần hoặc Zineb với lượng 3,0kg/ha phun 3lần với khoảng cách 8 ngày/lần kể từ khi xuất hiện bệnh cho hiệu quả tốt đốivới việc phòng bệnh trong tháng 3-4 (Nguyễn Văn Viên,1998) [15]

2.3 Cơ sở lý luận và thực tiễn

cà chua lại kháng mẫn cảm với các loại bệnh hại Đây cũng là nguyên nhânchính dẫn tới sự giảm sút chất lượng cũng như sản lượng hai loại cây trồngnày Trong các đối tượng gây hại nặng trên cà chua, khoai tây bệnh mốc sương

do nấm P infestans là một trong những bệnh hại nặng nhất, bệnh có khả năng

bùng phát thành dịch gây giảm trầm trọng năng suất đôi khi mất mùa, nấm gâybệnh còn có khả năng tồn dư trong đất trong nhiều năm Chủng quần nấm cókhả năng thay đổi như thêm mới chủng nấm hoặc thay đổi tính kháng thuốchoá học làm cho việc phòng trừ bệnh càng thêm khó khăn Bệnh có quan hệchặt chẽ với thời tiết nên việc tìm hiểu các yếu tố thời tiết ảnh hưởng trực tớikhả năng tồn dư, khả năng lan truyền cũng như tồn tại của nấm bệnh cũng gópphần phòng chống bệnh có hiệu quả và tiết kiệm hơn Trong khuôn khổ này

chúng tôi nghiên cứu một số đặc tính sinh học của nấm P infestans.

2.3.2 Lịch sử phát hiện.

Bệnh mốc sương cà chua khoai tây lần đầu tiên ghi nhận tại Mêxicôđây cũng được coi là trung tâm đa dạng sinh học của nấm mốc sương Triệuchứng bệnh được mô tả chi tiết năm 1845 trên cây khoai tây, trên cây cà chuabệnh được mô tả vào năm 1847 Bệnh được xác định nguyên nhân là do nấm,

ban đầu Montagne đặt tên nấm là Botrytis infestans (1845) tới năm 1854 nấm được đổi tên thành Peronospora infestans cho đến năm 1876 nấm được Montagne và Anton de Bary đặt lại là Phytophthora infestans và tên gọi này

được tiếp tục gọi tới ngày nay Sự phát tán của nấm ra thế giới được chia làmhai giai đoạn giai đoạn giữa thế kỉ 19 và giai đoạn thế kỉ 20 cho đến nay Giaiđoạn giữa thế kỉ 19 lúc này khoai tây bắt đầu xuất hiện và được phổ biến rộngrãi trên các nước bắc Mỹ và châu Âu Cùng với sự phổ biến của khoai tâynấm mốc sương cũng phát tán ra các vùng trồng đầu tiên là Mỹ theo nguồnbệnh trên khoai tây dại sau đó từ Mỹ lan sang châu Âu theo đường củ giống.Giai đoạn thứ 2 vào thế kỉ 20 lúc này do toàn cầu hoá về thương mại cũngnhư vận chuyển hàng hoá bệnh mốc sương theo củ khoai tây phát tán ra hầunhư tất cả các vùng có xuất hiện cây khoai tây và cà chua Bệnh hại nặng cóthể mất mùa và dẫn tới nạn đói như ở Ireland năm 1845-1846 và ở Đức năm

1919 Bệnh mốc sương có thể coi là một trong những căn bệnh có sức tàn phálớn nhất trong lịch sử con người

2.3.3 Phạm vi phân bố

Bệnh phân bố ở hầu hết các nước trên thế giới nơi có điều kiện lạnh đủ

để trồng khoai tây Theo thống kê của CABI 1982 nấm P infestans đã xuất

hiện trên hầu hết các châu lục Tại châu Á bệnh xuất hiện tại 26 nước trong đó

có những nước lân cận và láng giềng nước ta như Trung Quốc, Lào, Thái Lan,Phillipin, Hàn Quốc, Nhật, Ấn Độ và bao gồm cả Việt Nam Do tính chất

phức tạp của giai đoạn phát tán thứ 2 của nấm P infestans không chỉ chủng

quần cũ mang chủng nấm A1 phát tán mà cả chủng quần mới A2 cũng pháttán đi toàn thế giới CABI năm 1996 cũng đưa ra thống kê các nước đã xuấthiện chủng quần mới này Theo kết quả trên chủng nấm A2 đã xuất hiện ở 26nước và vùng lãnh thổ trong đó châu Á có 5 nước là Ấn Độ, Indonesia, HànQuốc, Nhật, Israel Quần thể ở Hàn Quốc, Nhật, Ấn Độ đã xuất hiện cả hailoại chủng nấm Theo những công bố mới đây có thể chủng nấm A2 đã xuấthiện ở một số tỉnh phía nam Trung Quốc giáp với biên giới nước ta

Ở nước ta bệnh phân bố trên hầu hết các vùng trồng khoai tây và cà

chua Bệnh gây hại mạnh và quanh năm ở các vùng có khí hậu mát mẻ nhưLâm Đồng, Lào Cai; gây hại vào vụ đông và đông xuân ở các tỉnh đồng bằngbắc bộ và bắc trung bộ nơi có 1 mùa đông lạnh.

2.3.4 Triệu chứng

Bệnh gây hại toàn cây Đối với cà chua bệnh hại trên thân, lá, quả;khoai tây bệnh hại trên thân, lá, củ (Kết quả điều tra bệnh hại 1967-1968,Viện Bảo vệ Thực vật) Triệu chứng của bệnh rất đa dạng tuỳ thuộc vào điềukiện thời tiết

Triệu chứng bệnh trên lá: Vết bệnh ban đầu là những điểm nhỏ màuxanh thẩm sau đó lan rộng ra có màu nâu thẫm, ranh giới giữa mô bệnh và môkhoẻ không rõ ràng Bệnh thường xuất hiện đầu tiên ở mép chóp lá sau đó lanrộng vào phiến lá (Stevenson, 1993) Phần giữa vết bệnh hoá nâu đen do cácđám mô bị chết hoá nâu, xung quanh vết bệnh thường có đám cành bào tư vàbào tử phân sinh màu trắng Khi thời tiết ẩm ướt hoặc buổi sáng sớm cósương các đám bào tử phân sinh này dày và xốp tạo ra một lớp trắng nhưsương muối ở mặt dưới lá bệnh (Drenth et all, 1996)

Triệu chứng trên cuống lá, cành và thân cây Các vết bệnh lúc dầu nâuhoặc thâm đen sau đó lan rộng ra xung quanh kết hợp với nhau tạo thành đoạndài Trên thân vết bệnh kéo dài thành từng đoạn vỏ và thân cây thâm đen thốiướt Khi điều kiện ẩm độ xuống thấp vết bệnh chết tóp lại , khi độ ẩm cao trênvết bệnh có lớp cành bào tử và bào tử phân sinh trắng như sương muối baophủ Bệnh làm cho thân cành bị thối, mềm có mùi mốc

Triệu chứng trên củ khoai tây: Triệu chứng bệnh mốc sương có thểnhầm lẫn với một số bệnh thối củ do vi khuẩn vì có chung các đặc điểm như

có vết màu nâu lõm xuống Tuy vậy khi cắt ngang củ sẽ thấy các mô bệnh cómàu nâu xám lan rộng vào phía trong đôi khi còn ăn sâu vào trong lõi củ Các

củ bị bệnh hoặc các lát củ này khi đặt ở nhiệt độ <200C và ẩm độ bão hoà có

thể quan sát thấy một lớp nấm trắng và cành bào tử phân sinh cũng như bào tửphân sinh trên bề mặt của củ (Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề, 2001).

Triệu chứng trên quả cà chua: quả cà chua bị bệnh tạo thành các vếtbệnh thâm đen, cứng, bề mặt không bằng phẳng, quả không chín được

Bệnh lan truyền trong cây có thể từ lá tới thân rồi quả,củ Nhưng cũng

có thể lan truyền từ củ, hạt nhiễm bệnh lên hệ thân lá Khi bệnh xuất hiện nếugặp điều kiện thời tiết phù hợp như nhiệt độ <200C, ẩm độ cao >80% cây sẽnhanh chóng tàn lụi có thể gây thành dịch làm giảm năng suất nghiêm trọng

2.3.5 Nguyên nhân gây bệnh.

Bệnh mốc sương cà chua khoai tây được Anton de Bary cà Montagne

xác định là do nấm Phytophthora infestans thuộc lớp nấm trứng (Oomycetes),

bộ nấm sương mai (Peronosporales)

Nấm có cấu tạo dạng sợi đơn bào.Sinh sản theo hai phương thức vôtính và hữu tính

Phương thức sinh sản vô tính là phương thức sinh sản quan trọng nhấttrong việc phát tán tạo thành dịch bệnh trên đồng ruộng Nấm sinh sản vô tínhbằng bào tử phân sinh tạo ra bởi các cành bào tử phân sinh nằm lộ trên bề mặtvết bệnh đặc biệt là dưới vết bệnh Cành bào tử phân sinh không màu phânnhiều nhánh cấp 1 sole với nhau, trên mỗi đỉnh nhánh có nhiều chỗ phình lồi

lõm, đây chính là đặc điểm riêng biệt của cành bào tử nấm P infestans so với

các loài Phytophthora khác Bào tử phân sinh hình quả chanh yên kích thướctrung bình là 22-23x16-2µm Bào tử có 2 kiểu nảy mầm trực tiếp và gián tiếp.Nếu nhiệt độ môi trường trong khoảng 20-240C bào tử phân sinh sẽ trực tiếphình thành ống mầm sau đó tạo thành sợi nấm xâm nhập vào tế bào mô cây kíchủ Nếu nhiệt độ môi trường từ 12-180C trong điều kiện ẩm cao hoặc có giọtnước bào tử phân sinh sẽ giải phóng các du động bào tử (zoospore) có 2 roi.Các du động bào tử này có khả năng chuyển động nhờ có giọt nước sẽ tìm tới

các lỗ khí khổng nảy mầm tạo ra các sợi nấm và xâm nhập vào cây kí chủ.

Dù là phương thức nảy mầm trực tiếp hay gián tiếp nhưng khi khi xâm nhậpsợi nấm đều dùng phương pháp cơ học là hình thành các vòi hút hình trụ hoặchình cầu để xâm nhập vào mô lá

Bệnh lan truyền từ cây này sang cây khác do gió lan truyền bào tử phânsinh, có thể do nước rửa trôi bào tử Bào tử vô tính có khả năng tồn tại trongđất ẩm từ vài ngày tới vài tuần tuy vậy trong đất khô khả năng này khá hạnchế Trong điều kiện tồn tại trên bề mặt nước có đất bào tử cũng có thể tồn tạitới vài tuần nhưng trong điều kiện không có đất bào tử chỉ tồn tại được vàingày Khả năng qua đông của bào tử trong đất là hạn chế nhất là các tầng đất

có phủ băng giá Khả năng chịu lạnh của bào tử vô tính khá tốt khi nuôi cấytrong môi trường nhân tạo bào tử nấm có thể chịu được nhiệt độ tới -50Ctrong vòng 1 ngày Nếu bào tử nấm có khả năng nảy mầm và xâm nhập vào

củ khoai tây thì khả năng qua đông của nấm lại rất cao, bào tử cũng có thểsống sót qua đông nếu nằm trên đất bám vào bề mặt củ trong quá trình bảoquản qua đông và là mầm bệnh cho vụ sau

Phương thức sinh sản hữu tính có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong sựtồn dư của bệnh Bào tử trứng hình thành khi có sự kết hợp giữa A1 và A2 ởcạnh nhau, cơ quan sinh sản trên sợi nấm là bao trứng (Oogonium), và bao đực(Antheridium) Sau khi phối giao nhân của bao đực dồn sang bao trứng thụ tinhhình thành bào tử trứng lưỡng bội (Oospore) với kích thước khoảng 31x50 m(Erwin và Ribeiro, 1996) Bào tử trứng có khả năng tồn tại lâu trong đất màkhông mất đi khả năng nảy mầm và độc tính Đặc biệt oospore có khả năng tồntại trong hạt cà chua là nguồn bệnh đặc biệt nguy hiểm cho vụ sau Tuy vậy chỉkhi đủ cả 2 chủng nấm cùng với điều kiện lạnh ẩm mới sảy ra hiện tượng sinhsản hữu tính Hiện tượng này chưa tìm thấy sảy ra ở nước ta

P infestans có khả năng hình thành nhiều chủng khác nhau tuỳ thuộc

vào vùng sinh thái cũng như chế độ phòng trừ của từng vùng Mỗi chủng khácnhau có độc tính khác nhau và khả năng xâm nhiễm trên mỗi giống cà chua,khoai tây là khác nhau chính vì vậy việc xác định chủng nấm tại các vùngsinh thái sẽ đưa ra cơ cấu giống cây trồng thích hợp để giảm tối đa tác hạicủa bệnh.

2.4 Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Nghiên cứu một cách có hệ thống về nấm P infestans gây bệnh mốc

sương hại cà chua, khoai tây ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố khí tượng, kí chủ đối vớinấm mốc sương góp phần nâng cao hiểu biết về thời điểm phòng trừ bệnh,giảm chi phí bảo vệ thực vật

3 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Nấm mốc sương hại cà chua khoai tây (P infestans) hại cà chua khoai

tây tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam vụ đông xuân 2008-2009

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Điều tra thu thập lấy mẫu của một số tỉnh phía Bắc Việt Nam : Lào Cai,Lạng Sơn, Bắc Giang, Hà Nội

Nghiên cứu trong phòng và nhà lưới tại khu thí nghiệm bộ môn Bệnhcây, khoa Nông học trường Đại Học Nông nghiệp Hà Nội

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Các giống cà chua, khoai tây

Các giống cà chua : Money maker, Santa clara, UC 82b (Trung tâmnghiên cứu cây trồng chuyển gen; University of California Riverside, Mỹ) ;

TL 10, T620, TL 19, T6 (Bộ môn di truyền giống), Rachal, VL 2500, CNL

Các giống khoai tây : Diamant, Belarosa, Solara, Marlan, Provento,Esprit, Jerry, Sinora, Marabel (Viện cây lương thực), PO3, Taurus,Atlantic(Viện nghiên cứu rau khoai tây và hoa Đà Lạt)

3.2.2.3 Thuốc trừ nấm Ridomil Gold 68PW

Tên hoạt chất : metalaxyl M

3.2.3 Các loại vật liệu nhân nuôi nấm P infestans

Các môi trường nuôi cấy nhân tạo :

Môi trường Pea-agar

Môi trường Rye B

Môi trường Mix RyeB: Pea-agar

Môi trường tự nhiên:

Củ khoai tây sạch bệnh, lá khoai tây sạch bệnh được thu thập từ nhữngcây sạch bệnh trồng trong nhà lưới

Lá cà chua sạch bệnh thu thập từ cây sạch bệnh trồng trong nhà lưới

3.2.4 Các dụng cụ, vật tư hoá chất sử dụng trong nghiên cứu trong phòng

và nhà lưới

Các thí nghiệm trong phòng, các bước nhân nuôi, phân lập nấm đượcbảo quản trong phòng định ôn 180C

Các thí nghiệm trong nhà lưới, nhân nuôi lá, củ sạch bệnh phục vụ nhân

nuôi và phân lập nấm P.infestans được thực hiện trong nhà lưới Jica khoa

Nông Học

Các dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu : kính hiển vi, tủ sấy, nồi hấp,bình định mức, đĩa peptri, que cấy, panh, bếp điện, ống đong, cốc thuỷ tinh, tủcấy vô trùng, kéo, dầm, túi nilon, giấy lọc Filter, túi lấy mẫu, Membran filterpore size 0,2, cồn, nước cất, nước javen,

3.2.5 Các mẫu bệnh.

Các mẫu bệnh thu thập được trên cà chua, tại các vùng điều tra tại LàoCai, Lạng Sơn và Hà Nội :

Bảng 3.1 Các isolate nấm thu thập được trong vụ đông xuân 2008-2009

tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam.

thập

Mẫu nấm

1 Pot 01-09 Khoai tây, Atlantic Lạng Sơn

Ghi chú : Pot : khoai tây Tom : cà chua Mix hỗn hợp

Trong một số thí nghiệm như chủng nấm các isolate sẽ được thửnghiệm riêng rẽ nhưng với một số thí nghiệm khác các isolate sẽ được trộnlẫn với nhau như trong bảng

3.3 Nội dung nghiên cứu

- Thu thập các mẫu nấm P infestans thuần từ các vùng điều tra trong

vụ đông và đông xuân 2008-2009

- Nghiên cứu khả năng tồn tại dưới ánh nắng trực xạ của bào tử phânsinh nấm mốc sương

- Nghiên cứu đặc tính kháng thuốc metalaxyl, metalaxyl M, mancozeb

của các mẫu nấm P infestans thu thập đuợc

- Nghiên cứu về sự tồn khả năng tồn tại của của nấm P infestans trong

các mẫu đất của các vùng trồng khoai tây cà chua thu thập được

- Xác định các loại bệnh hại xuất hiện trên củ khoai tây thương phẩm

và củ khoai tây giống

- Tìm hiểu khả năng kháng và nhiễm nấm P infestans của một số

giống khoai tây, cà chua có tiềm năng

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp điều tra đồng ruộng

Điều tra theo phương pháp của viện bảo vệ thực vật 1997

Trên ruộng đại trà tiến hành điều tra 5 điểm chéo góc, định kì 7 ngày 1 lần

Mỗi điểm điều tra 1m2, số cây tuỳ thuộc vào mật độ gieo trồng của từngđiểm điều tra

3.4.2 Phương pháp thu thập mẫu

Mẫu bệnh được thu thập tại các điểm điều tra, lấy mẫu theo phươngpháp ngẫu nhiên

Mẫu lá bệnh được thu thập ở các lá bánh tẻ, không dính thuốc bảo vệthực vật Các mẫu lá sau khi thu thập ghi địa điểm điều tra, cây kí chủ, nếu cóthể tìm hiểu thêm về giống, chế độ chăm sóc Mẫu bệnh được bảo quản trongthùng xốp có lót đá khô để bảo đảm nhiệt độ thấp, không để lá bệnh sát vớitúi đá khô, không để mẫu bệnh bị nóng vì khi nóng lá rất nhanh mủn nát vàxuất hiện nhiều vi khuẩn hoại sinh

Lá bệnh sau khi thu thập về phòng thí nghiệm được đặt trong môitrường ẩm bão hoà (thường là trong hộp petri có lót giấy lọc ẩm) trong vòng12-24 tiếng ở điều kiện tối thích 16-180C

3.4.3 Các thí nghiệm trong phòng.

3.4.3.1 Phương pháp phân lập mẫu bệnh (Caten và Jinks, 1968).

Chuẩn bị mẫu bệnh : các mẫu bệnh thu ngoài đồng ruộng chọn nhữngmẫu điển hình, mới, còn tươi, không dính thuốc bảo vệ thực vật phân lập ngayhoặc có thể đặt trong môi trường ẩm bão hoà với điều kiện nhiệt độ 16-180Ctrong vòng từ 12-24 tiếng để mô bệnh hồi phục và cành bào tử phân sinh vàbào tử phân sinh phát triển thành 1 lớp trắng xốp Lúc này có thể kiểm tra

xem có đúng là cành bào tử và bào tử phân sinh của P infestans hay không.

Chuẩn bị các vật liệu dùng trong phân lập :

- Nếu phân lập bằng khoai tây Củ khoai tây sạch thuộc các giốngnhiễm bệnh như Diamant được thu từ cây trồng trong nhà lưới hoặc các củkhoai tây thương phẩm sạch bệnh và không sử dụng các loại thuốc nội hấpchống bệnh mốc sương Củ được rửa sạch đất trên bề mặt bằng nước máy, đểráo Khử trùng bề mặt củ bằng Sodium hypochloride 1% trong 3 phút hoặcnhúng vào cồn 700 sau đó đốt trên ngọn lửa đèn cồn, chú ý khi đốt đảo đềutránh củ bị quá nóng gây chết mô Các củ sau đó được cắt thành các lát cókích thước 5-7mm.

- Nếu phân lập bằng quả cà chua Quả cà chua xanh, sạch bệnh thuộccác giống mẫn cảm như HT7, HT9 được thu từ những cây sạch bệnh trồngtrong nhà lưới, hoặc cây sạch bệnh trên ruộng sản xuất không phun các loạithuốc nội hấp cũng như tiếp xúc để trừ bệnh mốc sương Rửa sạch quả bằngnước máy, để ráo, khử trùng quả bằng Sodium hypochloride 1% trong 3 phút,

để ráo Cắt ngang quả thành những lát từ 5-7mm

Phân lập : các mô bệnh được cắt thành các miếng nhỏ kích thướckhoảng 1cm2 chứa ½ mô bệnh ½ mô khoẻ, nếu mô bệnh bị hoại sinh quánhiều có thể lấy miếng to hơn nhưng khả năng tạp nhiễm nấm hoại sinh khác

sẽ cao hơn Các mảnh mô được khử trùng nhanh qua Sodium hypochloride1% trong 3 phút hoặc bằng cồn 700 trong 1 phút, mảnh mô sau đó đượcnhúng qua nước cất vô trùng, để khô hoặc thấm nước bằng giấy thấm sạch.Các mảnh mô bệnh sau đó được đặt úp xuống sau đó đặt một lát càchua hoặc khoai tây đã được chuẩn bị như bước trên đậy nắp hộp petri Chú ýkhông để lát khoai tây hoặc cà chua bị quá khô bề mặt vì có thể sẽ tạo ra lớpmàng tế bào chết làm cho nấm không xâm nhập được Các đĩa phân lập đượcđặt trong điều kiện 180C trong điều kiện tối hoàn toàn Thường xuyên kiểmtra sự hình thành sợi nấm, cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh ở mặttrên lát cắt khoai tây hay cà chua Kiểm tra dưới kính lúp soi nổi, nếu đúng là

sợi hoặc cành bào tử phân sinh, bào tử phân sinh của nấm mốc sương thìdùng que cấy khêu nhẹ sợi nấm hoặc cành bào tử phân sinh đặt lên môitrường Pea-agar Tuỳ thuộc vào giống khoai tây và cà chua mà thời gian xuấthiện sợi nấm, cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh nhanh hay chậm,nếu thấy dấu hiện vùng đặt mô bệnh thâm đen thì có thể kết luận nấm đã xâmnhập vào mô thực vật.

Sau khi chuyển nấm trên môi trường 3-4 ngày kiểm tra sợi nấm có pháttriển hay không, và nấm đã thuần hay chưa Nếu mẫu đã thuần có thể cấychuyển sau 7-9 ngày trên môi trường Pea (môi trường phát triển hệ sợi vàbào tử vô tính) hoặc môi trường Rye để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo

3.4.3.2 Phương pháp điều chế môi trường.

3.4.3.2.1 Môi trường Pea-agar (Corbiere R Andrivon D., 2000)

Công thức nấu cho 1 lit môi trường

Thành phần bao gồm:

+ Đậu Hà Lan : 125g+ Agar: 15g

+ Nước cất: 1200ml

Cách điều chế môi trường: Cho 125g đậu + 1,2l nước cất vào nồi sạch.

Đun sôi, sau đó nhỏ lửa trong vòng 45phút, lọc bằng vải lọc 4 lớp Sau đó chovào bình định mức 1l Hoà tan 15g agar vào bình và hấp khử trùng ở 121°C,1.5 atm trong 30 phút Sau đó để nguội môi trường đến 60 - 70°C rồi đem đổ

ra các đĩa peptri đã được khử trùng và sử dụng để cấy nấm

3.4.3.2.2 Môi trường Rye A (Caten và Jinks)

Cách nấu cho 1l môi trường:

1.Ngâm 60g hạt lúa mạch đen trong nước cất trong vòng 36 giờ

2 Đổ nước ngâm rye trong bước 1 vào cốc đong và thêm vào 20gđường sucrose

3 Đặt hạt rye đã được ngâm vào trong máy trộn và nhào trong vòng

10 giây

4 Đặt hạt vụn đã trộn ngâm trong nước 490 trong vòng 3 giờ

5 Sau 3 giờ lọc lấy phần nước ngâm vắt kĩ phần hạt bằng vải lọc Phầnnước được thêm vào phần nước đã có ở bước 2

6 Điều chỉnh pH bằng NaOH cho đến khi pH là 7

7 Thêm vào lượng nước cất cho vừa đủ 1l

8 Thêm 15 g agar

9 Hấp tiệt trùng trong vòng 15 phút ở 1200C

10 Để nguội tới 45-500C

3.4.2.3.Môi trường Mix (Công thức nấu cho 1 lit môt trường)

50% môi trường Pea Agar + 50% môi trường Rye Agar, cả 2 loại như

mô tả bên trên

3.4.3.3 Phương pháp nhân nuôi nấm, thu bào tử phân sinh và đếm bào tử.

Phương pháp nhân nuôi nấm tạo bào tử phân sinh: Nhân nuôi nấm tạo bào

tử phân sinh nhằm mục đích tạo ra một số lượng lớn bào tử để dùng trong các thínghiệm về độc tính, kháng thuốc, khả năng tồn tại của bào tử trong ánh nắngtrực xạ… Có thể nhân nuôi nấm tạo bào tử phân sinh bằng những cách sau:

Nhân trên môi trường nhân tạo: Nấm được cấy trên môi trường agar, khi tản nấm mọc hết đĩa môi trường kiểm tra sự tồn tại của bào tử nấm

Pea-Nhân trên lá cà chua, khoai tây: lá cà chua khoai tây thuộc các giốngmẫn cảm sạch bệnh trồng trong nhà lưới cách ly Các lá đơn sạch không bámđất, không quá già, úa được đặt úp mặt trên xuống trong các khay có lót giấythấm đã thấm nước có thể phun trực tiếp dung dịch nước có chứa bào tử lênmặt dưới lá hoặc nhỏ các giọt bào tử lên mặt dưới lá Bọc các khay lại đểđảm bảo ẩm độ thích hợp để trong điều kiện 12 giờ sáng 12 giờ tối

Nhân trên củ khoai tây: củ khoai tây sạch bệnh, thuộc các giống nhiễm

mốc sương, trồng trong nhà lưới hoặc củ thương phẩm (với điều kiện cây sạchbệnh và không phun các loại thuốc nội hấp trừ bệnh mốc sương) rửa sạch khửtrùng bằng cách nhúng cồn sau đó đốt trên ngọn lửa Củ khoai sạch được cắtthành từng khoanh xếp trong khay lót giấy thấm đã thấm nước, phun hoặc nhỏtrực tiếp dịch nước chứa bào tử lên trên, bọc kín khay để trong tối hoàn toàn.

Tất cả các phương pháp nhân nuôi nấm tạo bào tử đều được thực hiệntrong tủ định ôn 180C

Phương pháp thu bào tử: Các bào tử sau khi nhân nuôi có thể thu đểtiếp tục tiến hành các thí nghiệm khác

Thu bào tử nhân trên môi trường nhân tạo: Cho vào đĩa petri từ 1-3mlnước cất vô trùng dùng bàn trang thuỷ tinh di nhẹ trên bề mặt của môi trườngnhân tạo cho bào tử rời ra khỏi sợi nấm sau đó chắt nước bào tử ra cốc hoặcbình định mức

Thu bào tử nhân trên lá khoai tây, cà chua: lá đã nhiễm bệnh được bỏvào túi nilon cùng với 10-20ml nước cất vô trùng tùy thuộc theo kích thước lálắc đều, nếu lá còn nguyên nhặt lá bỏ ra ngoài chắt nước vào bình hay cốcđong, nếu lá bị nát có thể lọc qua vải màn để tránh các mô tế bào làm tắc bìnhphun hoặc làm sai lệch thể tích

Thu bào tử trên khoanh củ: tương tự với trên lá nhưng khoanh củ chọnnhững khoanh khô không bị thối ướt, sau khi lắc đều nhặt bỏ các khoanh củlọc dịch bào tử qua vải màn để loại bỏ các mảnh mô lớn

Phương pháp nhân bào tử và thu bào tử trên môi trường nhân tạo chokết quả tốt nhất về độ thuần cũng như độ sạch tuy vậy số lượng bào tử nhânlên không được nhiều

Phương pháp đếm bào tử: Sử dụng phương pháp đếm trên lam kínhBucker có sẵn các ô đếm, đếm ngẫu nhiên theo một số ô Mỗi ống eppendotđược lắc mạnh cho bào tử phân bố đều trong ống, dùng pipet hút 10µl bào

tử rồi nhỏ lên trên lam kính mỗi mẫu được đếm lại 2 lần.

3.4.3.4 Xác định chủng nấm của các isolate thu thập được.

Tất cả các isolate thu thập được đều được sử dụng trong thí nghiệmnày Sử dụng bào tử động của các isolate nấm, nhỏ 30μl nước chứa bào tửl nước chứa bào tửnấm chưa xác định chủng nấm lên mép lá cà chua hay khoai tây mép lá cònlại nhỏ 30μl nước chứa bào tửl nước chứa bào tử của A1 hoặc A2 nuôi cấy ở nhiệt độ 180C vớiđiều kiện 12 giờ sáng 12 giờ tối Quan sát sự hình thành bào tử trứng sau khi

2 vết bệnh đã đan xen vào nhau lắc đều lá cho tan trong cồn và kiểm tra dướikính hiểm vi

3.4.3.5 Ảnh hưởng của ánh sáng trực xạ tới khả năng tồn tại nảy mầm của bào tử mốc sương.

Thử khả năng nảy mầm của bào tử nấm P infestans sau khi tiếp xúc

trực tiếp với ánh sáng trực xạ hay được che bóng

Bào tử mốc sương thu được từ các lá khoai tây hay cà chua được nhiễmbệnh nhân tạo trước đó 7 ngày Thí nghiệm bao gồm 3 công thức lớn :

+ Đặt dưới ánh nắng trực xạ

+ Đặt dưới mái che

+ Đặt trong điều kiện tối thích (đối chứng)

* Thí nghiệm xác định khả năng nảy mầm của bào tử sau các khoảngthời gian 0,60,120 phút với 3 công thức trên.Thí nghiệm này được tiến hànhvào các mốc thời gian : 9-11am,10-12 am, 11-13am, 12-14pm trong cùngngày Thí nghiệm được tiến hành trong 2 kiểu thời tiết ngày nắng(600W/m2)

và ngày mù Chỉ tiêu theo dõi là ti lệ số bào tử nảy mầm trên môi trườngnhân tạo (đếm đại diện 300 bào tử) ghi nhận số bào tử nảy mầm và không nảymầm ở mỗi thí nghiệm

* Thí nghiệm xác định khả năng nảy mầm của bào tử nấm mốc sươngsau khoảng thời gian 0,10,20, 30,40,50,60 phút với mốc thời gian 12-13 giờtrong điều kiện ngày nắng và ngày có mây.

Chỉ tiêu theo dõi là tỉ lệ nảy mầm của bào tử nấm trên môi trường nhân tạo

3.4.3.6 Phương pháp nghiên cứu thời gian tiềm dục của bệnh trên một số giống cà chua, khoai tây

Lá chét cà chua hoặc khoai tây lá đơn được đặt úp để lên đĩa peptrisạch, trong đĩa có 1 lớp giấy lọc ẩm với 5ml nước cất, nhắc lại 10 lần với 5 lá

cà chua và 5 lá khoai tây/1 isolate/1giống

Thí nghiệm tiến hành trên 10 giống cà chua (Money maker, Santa clara,

UC 82b, TL 10, T620, TL 19, T6, Rachal, VL 2500, CNL) và 6 giống khoaitây (Diamant, Solara, PO3, Taurus, Atlantic, TFL 1867) giống khoai tây đốivới các mẫu bệnh mix 1, mix2, mix 3, tom 09

Pha dung dịch bào tử đã nhân nuôi ở nồng độ 104 bào tử/ml lây nhiễm bào

tử bằng cách nhỏ 10µl (100 bào tử/ lá) vào chính giữa

Sau đó đặt trong tủ định ôn ở điều kiện 12h sáng/tối và 180C Quan sát

sự hình thành bào tử, cành bào tử và sợi nấm Mỗi ngày quan sát 2 lần cáchnhau 12 giờ

Chỉ tiêu theo dõi : thời gian xuất hiện bào tử của các isolate khác nhautrên các giống khoai tây, cà chua khác nhau

3.4.3.7 Phương pháp nghiên cứu tốc độ phát triển của vết bệnh

Sau mỗi 24h quan sát sự lan rộng của cành bào tử phân sinh và bào tửtrên các lá chét trong thí nghiệm đã nêu ở mục 3.4.3.6 Đo đường kính bào tửnấm phát triển bằng thước đo mm Sử dụng các ký hiệu khác nhau cho từngngày đo để biết được sự phát triển của tản nấm

Chỉ tiêu theo dõi : kích thước của vết bệnh trong mỗi ngày cho tới ngàythứ 7 sau lây nhiễm, từ đó tính tốc độ phát triển vết bệnh theo chỉ tiêuRAUDPC