cải tiến quy trình nhân giống gừng bằng phương pháp nuôi cấy mô

báo cáo về cải tiến quy trình nhân giống gừng bằng phương pháp nuôi cấy mô

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

CẢI TIẾN QUI TRÌNH NHÂN GIỐNG GỪNG (Zingiber officinale

Rosc.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

Chủ nhiệm đề tài: ThS HUỲNH TRƯỜNG HUÊ

Long Xuyên, tháng 10 năm 2009

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

CẢI TIẾN QUI TRÌNH NHÂN GIỐNG GỪNG (Zingiber officinale

Rosc.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

Chủ nhiệm đề tài: ThS HUỲNH TRƯỜNG HUÊ

Long Xuyên, tháng 10 năm 2009

CẢI TIẾN QUI TRÌNH NHÂN GIỐNG GỪNG (Zingiber officinale

Rosc.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

TÓM LƯỢC

Đề tài: “Cải tiến qui trình nhân giống gừng (Zingiber officinale Rosc.) bằng phương

pháp nuôi cấy mô” được thực hiện nhằm để tạo nguồn gừng giống in-vitro, khảo sát

nồng độ kích thích tố tối ưu cho việc nhân giống gừng và xây dựng qui trình nhân giống

gừng trong điều kiện in vitro Đề tài được thực hiện với 4 thí nghiệm, kết quả đạt được

Sau đó, cây con được thuần hóa trong điều kiện nhà lưới đạt tỷ lệ sống trên 90%

Từ các kết quả thí nghiệm, xây dựng được quy trình nhân giống gừng bằng phương pháp nuôi cấy mô

i

MỤC LỤC

Nội dung

Tóm lược ………

Mục lục ………

Danh sách bảng ………

Danh sách hình ………

Danh sách phụ chương ………

Chương I MỞ ĐẦU ………

Trang i ii iv v vi 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7 7 8 8 9 10 A MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ………

I MỤC TIÊU ………

II NỘI DUNG ………

B ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU ………

I ĐỐI TƯỢNG ………

II PHẠM VI NGHIÊN CỨU ………

C CƠ SỞ LÝ LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………

I CƠ SỞ LÝ LUẬN ………

1 Phân loại ………

2 Nguồn gốc phân bố ………

3 Đặc tính sinh học ………

4 Bệnh hại trên củ gừng ………

5 Công dụng ………

6 Các phương pháp nhân giống cây gừng ………

7 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật ………

7.1 Chọn lựa mẫu cấy ………

7.2 Khử trùng mẫu cấy ………

7.3 Môi trường nuôi cấy ………

7.4 Chất điều hòa sinh trưởng ………

7.5 Điều kiện nuôi cấy ………

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………

1 Phương tiện nghiên cứu ………

1.1 Vật liệu ………

1.2 Địa điểm thực hiện ………

1.3 Dụng cụ và hóa chất ………

2 Phương pháp nghiên cứu ………

2.1 Môi trường nuôi cấy ………

2.2 Chuẩn bị mẫu cấy ………

2.3 Cách khử mẫu và nuôi cấy ………

2.4 Bố trí thí nghiệm ………

2.4.1 Khử mẫu ………

2.4.2 Nhân chồi ………

2.4.3 Tạo rễ ………

2.4.4 Tạo cây hoàn chỉnh … ………

2.4.5 Chuyển cây ra vườn ươm ………

2.5 Phân tích số liệu ……… 10

11 11 11 12 Chương II KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ ……

I KHỬ MẪU ………

1 Hypocanxiclorua [Ca(OCl)2] ………

2 Hyposodiumchlorua (NaOCl – Javen) ………

II NHÂN CHỒI ………

III TẠO RỄ ………

IV TẠO CÂY ………

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ………

A KẾT LUẬN ………

B ĐẾ NGHỊ ………

Tài liệu tham khảo ………

13

15

19

28

28

29

30

iii

Nồng độ và thời gian của chất khử mẫu Ca(OCl)2 và Javen …………

Nồng độ kích thích tố BA và NAA bổ sung vào môi trường MS ……

Ảnh hưởng của nồng độ Ca(OCl)2 và thời gian khử trùng lên mẫu cấy

Ảnh hưởng của tỷ lệ dung dịch Javen và thời gian khử trùng lên mẫu

cấy ………

Sự tăng trưởng của chồi gừng ở thời điểm 4 và 8 tuần sau khi cấy …

Sự phát triển của rễ ở thời điểm 2 tuần, 4 tuần và 6 tuần sau khi cấy

Ảnh hưởng của kích thích tố BA và NAA lên quá trình sinh trưởng của

chồi gừng ở thời điểm 4 tuần SKC ………

Ảnh hưởng của kích thích tố BA và NAA lên quá trình sinh trưởng của

chồi gừng ở thời điểm 8 tuần SKC ………

Mẫu sống vô trùng sau 2 tuần nuôi cấy ………

Chồi gừng bổ sung BA 2 mg.l-1 giai đoạn 4 tuần sau khi cấy ………

Chồi gừng bổ sung BA 2 mg.l-1 giai đoạn 8 tuần sau khi cấy

Tăng trưởng của rễ ở nghiệm thức đối chứng 4 tuần SKC

Tăng trưởng của rễ bổ sung 0,5 và 1 mg.l-1 NAA ở giai đoạn 4 tuần

Tăng trưởng của rễ bổ sung 4 và 5 mg.l-1 NAA giai đoạn 4 tuần SKC

Chồi gừng bổ sung 1 mg.l-1 NAA giai đoạn 6 tuần SKC ………

Tăng trưởng của chồi gừng giai đoạn 6 tuần SKC ………

Chồi gừng bổ sung 2-0,5 mg.l-1 BA-NAA giai đoạn 4 tuần sau khi

cấy………

Chồi gừng bổ sung 2-05 mg.l-1 BA-NAA giai đoạn 8 tuần sau khi cấy

Chồi gừng bổ sung 2-05 mg.l-1 BA-NAA ở giai đoạn 8 tuần sau khi

cấy so với đối chứng………

Chồi gừng bổ sung 1-1 mg.l-1 BA-NAA giai đoạn 8 tuần sau khi cấy

Cây gừng bổ sung 0,5-1 mg.l-1 BA-NAA giai đoạn 8 tuần sau khi cấy

Cây gừng bổ sung 2-1 mg.l-1 BA-NAA giai đoạn 8 tuần sau khi cấy

Cây gừng in-vitro trồng ươm trong điều kiện nhà lưới ………

Cây gừng sau 2 tuần trồng ươm trong điều kiện nhà lưới ………

Cây gừng sau 2 tuần trồng trong bầu trong điều kiện nhà lưới ………

ANOVA dài rễ của thí nghiệm tạo rễ ở thời điểm 4 tuần SKC

ANOVA dài rễ của thí nghiệm tạo rễ ở thời điểm 6 tuần SKC

ANOVA số chồi của thí nghiệm tạo cây ở thời điểm 4 tuần SKC ………

ANOVA số chồi của thí nghiệm tạo cây ở thời điểm 8 tuần SKC ……… ANOVA số lá của thí nghiệm tạo cây ở thời điểm 4 tuần SKC ANOVA số lá của thí nghiệm tạo cây ở thời điểm 8 tuần SKC ANOVA cao chồi của thí nghiệm tạo cây ở thời điểm 4 tuần SKC ……… ANOVA cao chồi của thí nghiệm tạo cây ở thời điểm 8 tuần SKC ……… ANOVA số rễ của thí nghiệm tạo cây ở thời điểm 4 tuần SKC ANOVA số rễ của thí nghiệm tạo cây ở thời điểm 8 tuần SKC ANOVA dài rễ của thí nghiệm tạo cây ở thời điểm 4 tuần SKC ANOVA dài rễ của thí nghiệm tạo cây ở thời điểm 8 tuần SKC

Chương I

MỞ ĐẦU

Gừng (Zingiber officinale Rosc.) thuộc họ Zingiberaceae là một trong những cây quan

trọng của vùng nhiệt đới Gừng là cây thân thảo, sống lâu năm, thân ngầm phát triển dưới đất còn gọi là củ Củ gừng có hương thơm và vị cay, được sử dụng làm gia vị trong chế biến thức ăn, góp phần tăng thêm hương vị cho một số loại thực phẩm Gừng cũng

là cây thảo dược, có nhiều đặc tính dược liệu quí rất có giá trị trong dược phẩm, được dùng làm thuốc và làm nguồn nguyên liệu bào chế thuốc điều trị một số bệnh như cảm lạnh, ho, nôn, mửa… Ở Ấn Độ và Trung Quốc từ thời cổ xưa đã sử dụng gừng điều trị bệnh trên người và gia súc (Ravindran và Nirmal Babu, 2005)

Gừng cho năng suất rất cao, có thể đạt từ 40-80 tấn.ha-1 (năng suất bình quân 60 tấn.ha

-1) An Giang có diện tích đất trồng gừng trên 60 ha, phân bố ở các huyện như Tri Tôn,

An Phú, Châu Phú và Chợ mới Trong đó, huyện Chợ Mới có diện tích trồng gừng cao nhất, khoảng 53 ha (Số liệu tổng hợp từ phòng Nông Nghiệp các Huyện – Sở Nông Nghiệp An Giang, 2005)

Tuy nhiên, gừng rất dễ bị sâu bệnh tấn công, nhất là bệnh thối củ do nấm Pythium sp và

vi khuẩn Erwinia sp gây ra, làm thiệt hại rất lớn cho gừng giống cũng như gừng thương

phẩm Hơn nữa, cây gừng sinh sản vô tính bằng củ dưới đất, hệ số nhân này thường rất thấp 6-10 lần Do đó, để có được năng suất 15-20 tấn.ha-1 phải cần ít nhất 2-4 tấn gừng giống Cho nên, việc tồn trữ và giữ giống hàng năm gặp nhiều khó khăn và rất tốn kém,

vì cần số lượng lớn và dịch bệnh thường xuyên tấn công gừng giống

Nhân giống gừng bằng phương pháp nuôi cấy mô sẽ tạo ra được sản lượng lớn cây giống sạch bệnh phục vụ cho sản xuất, khắc phục được những khó khăn trong việc lưu giữ và tồn trữ giống, giúp cho nông dân chủ động được mùa vụ một cách dễ dàng,

không tốn kém diện tích cũng như chi phí tồn trữ giống Vì vậy, đề tài “Cải tiến qui

trình nhân giống gừng (Zingiber officinale Rosc.) bằng phương pháp nuôi cấy mô”

được tiến hành để đáp ứng nhu cầu gừng giống cho thị trường, giúp ổn định sản xuất và đời sống của nông dân

A MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

I MỤC TIÊU

- Tạo nguồn gừng giống in-vitro

- Khảo sát nồng độ kích thích tố tối ưu cho việc nhân giống gừng

- Xây dựng qui trình nhân giống gừng trong điều kiện in-vitro

II NỘI DUNG

Thực hiện nuôi cấy và nhân giống gừng trong điều kiện in vitro, gồm các bước sau:

1 Tạo nguồn mẫu in vitro: khảo sát nồng độ và thời gian của các chất khử trùng mẫu (Hypocanxiclorite và Javen)

2 Nhân giống in-vitro: khảo sát nồng độ kích thích tố Auxin, Cytokinin thích hợp cho việc nhân chồi, tạo rễ và tạo cây

3 Chuyển cây ra vườn ươm

B ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

I ĐỐI TƯỢNG

Đề tài được thực hiện trên đối tượng cây gừng (Zingiber officinale Rosc.) được nhân giống trong điều kiện in vitro

II PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Nhân giống cây gừng trong điều kiện in vitro và thuần dưỡng cây con trong nhà lưới

Thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Khoa Nông Nghiệp & TNTN, trường Đại học An Giang, từ tháng 4-2008 đến tháng 2-2009

C CƠ SỞ LÝ LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I CƠ SỞ LÝ LUẬN

1 Phân loại

Gừng (Zingiber officinale Rosc.) được nhà thực vật học người Anh William Roscoe

(1753 - 1831) đặt tên vào năm 1807 Theo phân loại thực vật cây gừng thuộc:

Ở Việt Nam, gừng được trồng từ rất lâu đời, ở khắp mọi nơi trên khắp các địa phương

từ Bắc vào Nam (Lã Đình Mỡi và ctv., 2002) Tuy nhiên, gừng chỉ được trồng rải rác

trong các vườn hộ gia đình (Nguyễn Ngọc Bình và Phạm Đức Tuấn, 2001)

3 Đặc tính sinh học

Gừng là cây thân thảo, đa niên, cao từ 50-100 cm tùy theo đất, có nơi cao hơn 150 cm Gừng phát triển thân ngầm dưới đất, có nhiều đốt, mỗi đốt có mầm ngủ, khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ đâm chồi thành cây Bẹ lá ôm sát nhau phát triển thành thân giả trên mặt đất Lá đơn mọc cách (so le), lá trơn, không có cuống, hình lưỡi mác, mặt bóng nhẵn, mép lá phẳng, gân giữa hơi trắng nhạt Trục hoa mọc từ gốc (củ gừng), dài khoảng 20 cm, hoa tự tạo thành bông, mọc sát nhau, hoa dài khoảng 5 cm, rộng khoảng 2-3 cm, lá bắc hình trứng, mép lưng màu vàng Đài hoa dài khoảng 1 cm, có 3 răng ngắn, có 3 cánh hoa, màu vàng hơi nhạt, mép cánh hoa màu tím, nhị hoa cũng màu tím

2

Tuy nhiên, ở nước ta gừng trồng ít ra hoa hoặc chưa ra hoa đã thu hoạch củ để bán (Mai

Văn Quyền và ctv., 2001)

Cây gừng được trồng phổ biến ở vùng khí hậu nhiệt đới ẩm, có nhiệt độ trung bình hàng năm từ 21-270C, lượng mưa từ 1500-2500 mm.năm-1, từ độ cao vài mét đến 1500 m trên mặt nước biển Ở các vùng núi cao, khí hậu lạnh, nhiều sương không thích hợp đối với cây gừng (Nguyễn Ngọc Bình và Phạm Đức Tuấn, 2001)

4 Bệnh hại trên củ gừng

Bệnh thối củ gừng do vi khuẩn Pseudomonas sp., Ervinia sp gây ra Cây gừng đang

xanh tốt bổng dưng bị héo đột ngột vào giữa trưa, vài ngày sau toàn bộ cây bị vàng, khi nhổ lên thấy đỉnh sinh trưởng của gừng có nhựa đục Phần củ bị nhiễm bệnh nhũn nước,

có màu đen, dịch trắng sữa tiết ra trên bề mặt cắt Đây là bệnh rất nguy hiểm và gây thiệt hại lớn đến năng suất gừng thương phẩm cũng như gừng giống vì vi khuẩn gây bệnh này lưu tồn lâu dài trong đất và là nguồn lây nhiễm giữa các củ gừng (Chi cục bảo

vệ thực vật An Giang, 1998)

Bệnh thối củ do nấm Rhizoctonia solani, Pythium sp., Fusarium sp gây ra Bệnh

thường gây hại ở phần củ dưới đất nên khó phát hiện, trên thân gừng không có biểu hiện

gì khi củ bị thối, chỉ khi củ bị thối nhũn hoàn toàn cây bị gãy gục hoặc bị héo nhẹ khi trời nắng Bệnh thường ít hoặc không gây hại trên thân gừng, chỉ khi bụi gừng nào dày

đặc thì bệnh mới gây hại đến phần thân (Trần Văn Hòa và ctv., 2000)

Theo Nguyễn Bá Linh (2006), Nguyễn Phú Dũng (2008), kết quả điều tra nông dân trồng gừng tại Chợ Mới – An Giang, 100% hộ điều tra đều xuất hiện bệnh thối củ gừng Mức độ gây hại bệnh rất cao và rất nguy hiểm khi gặp điều kiện thời tiết bất lợi, vì tốc

độ lây lan rất nhanh, có thể làm nông dân mất trắng Tuy nhiên, bệnh thối củ hiện nay chưa có thuốc đặc trị, chỉ phòng bệnh là chính

5 Công dụng

Gừng là một trong những loại cây trồng được sử dụng làm nguồn dược liệu phổ biến nhất trong các phương pháp điều trị truyền thống ở Ấn Độ, Trung quốc và Nhật Bản Người Ấn Độ cổ xưa xem gừng là cây dược liệu quí và là nguồn nguyên liệu dùng chế biến nước uống và làm nhiều loại mứt khác nhau Gừng là loại gia vị được sử dụng rất phổ biến trong các món ăn, trong các công nghệ chế biến và còn là nguyên dược liệu quí dùng trong y học Gừng có những tính chất kháng vi trùng mạnh và chống oxy-hóa trong bảo quản thực phẩm

Trong củ gừng có chứa các hợp chất như: gingeron, shogaol và zingerone… làm cho gừng có hương thơm và mùi vị hăng nồng Bên cạnh đó, còn chứa các enzymes và các chất chống oxy hóa (antioxidants) Chất gingeron có nhiều trong gừng tươi và bị biến đổi thành shogaol khi gừng khô Shogaol có mùi hăng nồng và có hiệu quả chống viêm, giảm đau mạnh Gingerol hổ trợ đối kháng độc tố trong gan bằng cách gia tăng bài tiết

ra mật và còn là chất ức chế sinh tổng hợp prostaglandin (Chu Hữu Tín, 2006)

Chất trích từ gừng đã được nghiên cứu rộng rãi trong nhiều hoạt động sinh học gồm có thuốc kháng vi khuẩn (antibacterial), thuốc kháng co giật (anticonvulsant), thuốc giảm đau (analgesic), thuốc chống loét (antiulcer), thuốc chống bài tiết trong dạ dày (gastric antisecretory), thuốc chống khối u (antitumor), thuốc kháng nấm (antifungal), thuốc trị

co thắt (antispasmodic), thuốc chống phát sinh dị ứng (antiallergenic) và những hoạt động khác (Chu Hữu Tín, 2006)

6 Các phương pháp nhân giống cây gừng

Hiện nay, gừng được trồng phổ biến bằng cách tách củ (gừng giống) có chứa chồi ngủ (mắt mầm) và đem giâm xuống đất Sau một thời gian sẽ ra rễ, chồi phát triển sống thành cây độc lập và hoàn chỉnh Tuy nhiên, số lượng chồi ngủ không nhiều, nếu trồng gừng tập trung trên phạm vi lớn thì phải dự trữ lượng gừng giống khá lớn (1 ha cần khoảng 3 tấn củ gừng giống hoặc có thể trữ lại 20-25% sản phẩm thu hoạch để làm giống) Hơn nữa, cây gừng hiếm khi ra hoa, nếu có hoa thì cũng khó có hạt hoặc hạt lép không thể nảy mầm, cho nên không thể nhân giống gừng từ hạt

Nhân giống gừng bằng phương pháp nuôi cấy mô sẽ tạo ra được số lượng lớn cây con đồng nhất và sạch bệnh, ít tốn kém chi phí và không gian tồn trữ giống Nhân giống gừng bằng phương pháp nuôi cấy mô đã được thực hiện bởi Lâm Ngọc Phương (1997),

Lê Trần Như Thảo (2005), Hosoki và Sagawa (1977), Yuji Noguchi và Osamu

Yamakawa (1988), Wang (1989), Balachandran et al (1990), Sharma và Singh (1997), Rout et al (2001a, b), Yongqiang Zheng et al (2008)

Theo kết quả nghiên cứu của Lâm Ngọc Phương (1997), sử dụng môi trường MS có bổ sung kích thích tố BA 1-3 mg.l-1 thì thích hợp cho nhân chồi và khi bổ sung vào môi trường nhân chồi 0,5mg.l-1 NAA để tạo cây hoàn chỉnh có bộ rễ khỏe mạnh Danh Giàu (2003) sử dụng BA trong khoảng 2-2,5 mg.l-1 chồi phát triển tốt

Yuji Noguchi và Osamu Yamakawa (1988), đã sử dụng 1mg.l-1 BA bổ sung vào môi trường MS chồi gừng phát triển tốt, thích hợp cho việc nhân chồi Từ các kết quả nghiên cứu nhận thấy, khi sử dụng nồng độ BA cao sẽ kích thích tạo chồi nhưng ức chế tạo rễ, còn NAA thì không thể hiện sự ảnh hưởng giữa việc tạo chồi và rễ Để gia tăng tần suất nhân nhanh gừng giống sạch bệnh, Sharma và Singh (1997) đã sử dụng môi trường MS kết hợp với 2 mg.l-1 Kn và 2 mg.l-1 NAA Yongqiang Zheng et al (2008), đã khảo sát

sự ảnh hưởng của các kích thích tố Kn, GA và NAA lên việc hình thành củ gừng vitro

in-Rout et al (2001b), đã khảo sát sự ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng và điều

kiện nuôi cấy lên việc nhân chồi và hình thành củ gừng in-vitro Để nhân nhanh chồi gừng sử dụng môi trường MS bổ sung 6 mg.l-1 BA, 1,5 mg.l-1 IAA, 3 mg.l-1Adeninsulfate và 3% (w/v) sucrose Tạo củ gừng in-vitro sử dụng môi trường MS bổ sung 1 mg.l-1 BA, 1 mg.l-1 IAA và từ 3-8% (w/v) sucrose, được nuôi cấy trong 8 tuần

Để kích thích hình thành hệ thống rễ trên chồi gừng, Rout et al (2001a) đã sử dụng kích

thích tố IAA hoặc IBA hoặc NAA Khi sử dụng kích thích tố IAA hoặc IBA ở nồng độ 0,5-1 mg.l-1 bổ sung vào môi trường MS/2, rễ xuất hiện sau 7-9 ngày nuôi cấy Còn khi

sử dụng kích thích tố NAA rễ xuất hiện sau 6-7 ngày nuôi cấy

7 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật

7.1 Chọn lựa mẫu cấy

Sự chọn mẫu cấy là một trong những khâu quan trọng trong nuôi cấy mô, vì nó quyết định đến sự thành công hay thất bại trong việc tạo nguồn mẫu ban đầu Mô non như chồi đỉnh, chồi nách hay chồi bất định sẽ tái sinh tốt hơn mô già của cùng một cây Chồi hoa non hay cụm hoa non cũng thường có khả năng tái sinh rất tốt Để có được kết quả tốt cần chọn mẫu cấy có tỷ lệ mô phân sinh lớn hay các tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn năng (Dương Công Kiên, 2002)

4