phân lập và chọn môi trường nhân sinh khỏi 3 loại nấm ký sinh côn trùng

báo cáo về phân lập và chọn môi trường nhân sinh khỏi 3 loại nấm ký sinh côn trùng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ TNTN

BỘ MÔN KHOA HỌC CÂY TRỒNG

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

PHÂN LẬP VÀ CHỌN MÔI TRƯỜNG NHÂN SINH KHỐI BA LOÀI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG

Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok, Beauveria bassiana (Bals.) Vuill VÀ Paecilomyces spp TRÊN NHÓM

RAU ĂN LÁ Ở ĐỒNG BẰNG

SÔNG CỬU LONG

Chủ nhiệm đề tài: LÊ HỮU PHƯỚC

Long Xuyên, tháng 8 năm 2009

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

PHÂN LẬP VÀ CHỌN MÔI TRƯỜNG NHÂN SINH KHỐI BA LOÀI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG

Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok (Ma), Beauveria bassiana (Bals.) Vuill (Bb) VÀ Paecilomyces spp (Pae) TRÊN NHÓM

RAU ĂN LÁ Ở ĐỒNG BẰNG

SÔNG CỬU LONG

Lê Hòa Lợi

LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành cảm ơn

PGS Trần Văn Hai và Ks Trịnh Thị Lan – Khoa Nông Nghiệp – Đại hoc Cần Thơ đã hướng dẫn và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cô Võ Thị Hướng Dương – Khoa Nông Nghiệp và TNTN – Đại học AN Giang đã sát cánh cùng tôi trong suốt quá trình làm đề tài này

Cô Nguyễn Thị Diệu Hương, Phòng Thí Nghiệp NEDO – Bộ môn BVTV (hợp tác với Chính Phủ Nhật Bản) đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi thực hiện đề tài này

Cùng các bạn sinh viên Nông học, Trồng trọt, Bảo vệ thực vật Khóa 31 đã giúp đở tôi ghi nhận, đo đếm các chỉ tiêu

TÓM LƯỢC

Nhằm mục đích thu thập, phân lập và định danh 3 loài nấm ký sinh côn trùng

Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Paecilomyces spp ở một số tỉnh

Đồng bằng sông Cửu Long để nghiên cứu chọn ra dòng nấm tốt phục vụ cho việc nghiên cứu chế phẩm thuốc trừ sâu vi sinh, đề tài: “Phân lập và chọn môi trường nhân

sinh khối ba loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok,

Beauveria bassiana (Bals.) Vuill và Paecilomyces spp trên nhóm rau ăn lá ở Đồng

bằng sông Cửu Long” được thực hiện

Kết quả đã thu thập được tổng cộng 288 dòng nấm từ 6 tỉnh An Giang, Tiền Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Sóc Trăng, và Hậu Giang, bao gồm 3 loài nấm ký sinh

côn trùng Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Paecilomyces spp Trong

đó, quá trình phân lập, tách ròng và định danh (trong môi trường PDA) đã thu được 51 dòng

Thí nghiệm trên sâu ăn tạp trong điều kiện phòng thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design) và 5 lần lặp lại và 52 nghiệm thức (51 dòng nấm và 1 đối chứng), đã chọn ra 10 dòng nấm có hiệu quả tốt nhất M2-AG, M5-AG, M1-CT, M3-VL, M1-ST, B2-AG, B2-TG, B1 –VL, P2-AG và P3-

TG Môi trường SDAY3 là môi trường cho mật số bào tử (bào tử.ml-1) cao nhất trong

4 loại môi trường lỏng (không chứa agar) CDA, CAM, SDAY1 và SDAY3 Chín ngày

sau khi lắc (NSKL) là thời điểm tối ưu đối với nấm Metarhizium anisoplia Trong khi

đó, sáu đến chín NSKL, mật số bào tử được tạo ra cao nhất đối với nấm Beauveria

bassiana và 6 NSKL đối với nấm Paecilomyces spp

MỤC LỤC

Trang

CHƯƠNG I MỞ ĐẦU 1

A MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2

I MỤC TIÊU 2

II NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2

B ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2

I ĐỐI TƯỢNG 2

II PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2

C CƠ SỞ LÝ LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2

I CƠ SỞ LÝ LUẬN 2

1 Phân loại 2

2 Sự phân bố 3

3 Đặc điểm hình thái, sinh học và khả năng gây hại 4

3.1 Metarhizium anisopliae 4

3.2 Beauveria bassiana 4

3.3 Paecilomyces spp .5

4 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 6

4.1 Metarhizium anisopliae 6

4.2 Beauveria bassiana 6

4.3 Paecilomyces spp .6

5 Khả năng sinh độc tố diệt côn trùng và các sản phẩm trao đổi chất 7

5.1 Metarhizium anisopliae 7

5.2 Beauveria bassiana 7

5.3 Paecilomyces spp .8

6 Cơ chế tác động của nấm lên côn trùng 8

6.1 Metarhizium anisopliae 8

6.2 Beauveria bassiana 8

6.3 Paecilomyces spp .8

7 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự phát triển của bào tử nấm 9

7.1 Metarhizium anisopliae 9

7.2 Beauveria bassiana 9

7.3 Paecilomyces spp .9

8 Ảnh hưởng của một số môi trường nhân sinh khối lên các loài nấm ký sinh côn trùng 9

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

1 Phương tiện thí nghiệm 11

2 Phương pháp thí nghiệm 11

2.1 Thu thập mẫu côn trùng bị nhiễm nấm và phân lập 3 loài nấm ký sinh côn trùng Beauveria bassiana (Bals.) Vuill, Metarhizium anisopilae (Metsch.) Sorok và Paecilomyces spp ở 6 tỉnh An Giang, Cần Thơ, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Hậu Giang và Tiền Giang 11

2.2 Phân lập, tách ròng, định danh và tồn trữ các mẫu nấm thu được trong môi trường PDA (Potato Destrose Agar) 12

2.3 Thử nghiệm hoạt lực sinh học của các mẫu nấm thu thập được trên sâu ăn tạp trong điều kiện phòng thí nghiệm 13 2.4 Khảo sát ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng lên sự hình thành

và phát triển bào tử của các loại nấm xanh Metarhizium anisopliae (Ma), nấm

trắng Beauveria bassiana (Bb), nấm tím Paecilomyces spp (Pae) trong môi

trường lỏng .14

2.4.1 Nguồn nấm 14

2.4.2 Bố trí thí nghiệm 14

2 4.3 Chỉ tiêu đánh giá 16

2.4.4 Thống kê: Tổng hợp số liệu và phân tích thống kê bằng phần mềm MSTATC 16

CHƯƠNG II KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

I Thu thập mẫu côn trùng bị nhiễm nấm và phân lập 3 loài nấm ký sinh côn trùng Beauveria bassiana (Bals.) Vuill, Metarhizium anisopilae (Metsch.) Sorok và Paecilomyces spp ở 6 tỉnh An Giang, Cần Thơ, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Hậu Giang và Tiền Giang 17

II Phân lập, định danh và tồn trữ các mẫu nấm thu được trong môi trường PDA (Potato Destrose Agar) 18

III Thử nghiệm hoạt lực sinh học của các mẫu nấm thu thập được trên sâu ăn tạp trong điều kiện phòng thí nghiệm 20

IV Khảo sát ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng lên sự hình thành và phát triển bào tử của các dòng nấm Metarhizium anisopliae, nấm Beauveria bassiana và nấm Paecilomyces spp trong 4 môi trường dinh dưỡng (môi trường lỏng) 23

1 Khả năng sinh bào tử của nấm Metarhizium anisopliae M2-AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng 23

2 Khả năng sinh bào tử của nấm Metarhizium anisopliae M5-AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng 24

3 Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M1 - CT trên 4 loại môi trường dinh dưỡng 25

4 Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M3 - VL trên 4 loại môi trường dinh dưỡng 26

5 Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M1-ST trên 4 loại môi trường dinh dưỡng 26

6 Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B2-AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng 27

7 Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B2-TG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng 28

8 Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B1–VL trên 4 loại môi trường dinh dưỡng 29

9 Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Paecilomyces spp Pae2 - AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng 30

10 Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Paecilomyces spp Pae3 - TG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng 30

CHƯƠNG III KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34

I Kết luận 34

II Kiến nghị 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ CHƯƠNG

DANH SÁCH BẢNG

1 Thành phần các nguyên vật liệu dùng để nuôi sâu ăn tạp 13

3 Tỷ lệ khoáng chất của các loại môi trường lỏng 16

4 Số mẫu sâu hại bị nhiễm nấm ký sinh thu thập được ở một số tỉnh Đồng

Bằng Sông Cửu Long, tháng 8-9 năm 2008 17

5

Danh sách các dòng nấm phân lập được trong môi trường PDA tại

phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ thực vật, Đại học Cần Thơ, tháng

9-11 năm 2008

18

6 Hiệu lực (%) của các dòng nấm đối với sâu ăn tạp trong điều kiện

phòng thí nghiệm, bộ môn BVTV, ĐHCT, tháng 12 năm 2008 21

7 Danh sách mười dòng nấm có hiệu quả cao được chọn qua thí nghiệm

trong phòng, được trữ đông để tiếp tục các thí nghiệm sau 23

8 Số lượng bào tử của nấm M2-AG ở thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày

16 Số lượng bào tử của nấm Pae2 - AG ở thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14

17 Số lượng bào tử của nấm Pae3 - TG ở thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày

DANH SÁCH HÌNH

1 Nuôi cấy nấm theo phương pháp Slide Culture 12

2 Thu thập nấm Metarhizium anisopliae 32

5 Màu sắc tơ nấm trong môi trường nhân tạo PDA 33

6 Thực hiện tiêu bản, đếm mật số bào tử nấm trong phòng thí nghiệm 33

7 Sâu ăn tạp bị nhiễm nấm trong phòng thí nghiệm 33

8 Nấm sau khi lắc trong các môi trường dinh dưỡng 33

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

Phòng trừ sâu hại là một trong những khó khăn lớn nhất trong nghề trồng rau

và là mối quan tâm lo lắng hàng đầu của nông dân Biện pháp phòng trừ của nông dân chủ yếu dựa vào việc phun thuốc hóa học là chính mà rất ít biết đến các biện pháp khác Nông dân đã sử dụng tới hơn 30 loại thuốc trừ sâu trên rau, trong đó có nhiều

loại đã bị cấm sử dụng (Nguyễn Quí Hùng và ctv.,1999) Sâu ăn tạp (Spodoptera

litura Fabricius), sâu ăn đọt cải (Hellula undalis Fabricius và Crocidolomia binotalis

Zeller), sâu tơ (Plutela xylostella), rầy phấn trắng (Bemiscia tabaci), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) và bọ nhảy (Phyllostreta striolata) là những đối tượng gây hại

quan trọng và phổ biến nhất trên nhóm rau ăn lá tại Đồng bằng sông Cửu Long (Trần Thị Ba, 1999) Sự phát triển tính kháng thuốc của sâu hại cũng như ảnh hưởng của thuốc hóa học lên sức khỏe con người và môi trường đã tạo áp lực mạnh cho sự phát triển của các tác nhân sinh học trong phòng trừ tổng hợp côn trùng gây hại

Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu ở các nước trên thế giới như

Úc, Brazil, Mỹ, Pháp, Colombia, Venezuela đã cho thấy việc sử dụng các loại nấm ký sinh côn trùng trong phòng trừ tổng hợp các loài sâu gây hại một cách hợp lý đã mang lại hiệu quả khá cao (Burges H D., 1998; Butt T M and Copping L., 2000) Ở Châu

Á, tại Malaysia, đã nghiên cứu nấm Metarhizium anisopliae để phòng trừ mối đất đạt

hiệu quả 64,57% sau 14 ngày Tại Philippines, đã nghiên cứu sử dụng nấm

Metarhizium anisopliae để diệt rầy nâu hại lúa, hiệu lực đạt 60% sau 10 ngày Tại Úc,

năm 1991 Milner đã nghiên cứu nấm Metarhizium anisopliae để phòng trừ bọ hung

hại mía đạt hiệu quả 68% Tại Nhật Bản, năm 1988 một số nhà khoa học đã sử dụng

nấm Beauveria bassiana để phòng trừ dòi hại rễ củ cải đạt hiệu quả trên 70% sau 10 ngày Tại Trung Quốc, Am và Wu đã sử dụng dòng nấm Paecilomyces spp và

Beauveria bassiana để phòng trừ sâu róm thông qua đông đạt hiệu quả cao

Ở trong nước, đã có một số nghiên cứu của Viện Bảo vệ thực vật phân lập được các dòng nấm ký sinh trên rầy nâu hại lúa, châu chấu hại bắp, sâu đo xanh hại đay, bọ hại dừa, sùng đất hại đậu phộng và sử dụng đạt được hiệu quả rất cao Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long cũng sử dụng các dòng nấm trên rầy nâu đạt hiệu quả rất tốt, hơn 67% sau 10 ngày

Tuy nhiên, việc sử dụng các dòng nấm này trong quá trình quản lý và phòng trừ tổng hợp còn hạn chế do các dòng nấm giảm dần độc tính qua một thời gian sử dụng Ngoài ra, việc thu thập, phân lập và thử nghiệm các dòng nấm có khả năng diệt sâu cao là yêu cầu thường xuyên và cấp thiết Từ đó, đưa đến yêu cầu cần phải tiến hành nghiên cứu bổ sung thêm các chất khoáng dinh dưỡng để tăng cường khả năng tạo mật số bào tử trên môi trường giống cấp 1 (nấm nguồn) là việc làm rất quan trọng, tiến tới nghiên cứu môi trường sản xuất chế phẩm sinh học có chất lượng tốt phục vụ cho việc thử nghiệm và đưa ra ứng dụng đạt hiệu quả cao hơn Đề tài: “Phân lập và

chọn môi trường nhân sinh khối ba loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium

anisopliae (Metsch.) Sorok, Beauveria bassiana (Bals.) Vuill và Paecilomyces spp

trên nhóm rau ăn lá ở Đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện đáp ứng các yêu cầu trên

A MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

I MỤC TIÊU

1 Phân lập được ba loài nấm ký sinh chuyên biệt từ 6 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long và bước đầu chọn ra những dòng nấm có hiệu quả trong phòng thí nghiệm

qua thử nghiệm hiệu quả đối với sâu ăn tạp (Spodoptera litura Fab.)

2 Nghiên cứu môi trường dinh dưỡng thích hợp để nhân nhanh sinh khối 3

loại nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và

Paecilomyces spp., làm cơ sở cho việc nghiên cứu, sản xuất chế phẩm phòng trừ sâu

hại

II NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1 Thu thập các loài nấm ký sinh côn trùng trên các loài rau ăn lá như sâu ăn tạp, sâu ăn đọt cải, sâu xanh da láng, sâu tơ, bọ nhảy, rầy mềm,… tại những vùng sản xuất rau có diện tích tương đối lớn Phân lập và tách ròng các dòng nấm này trên đĩa

pêtri (invitro) trong môi trường PDA (Potato Destrose Agar)

2 Khảo sát hiệu lực của các dòng nấm đã phân lập được đối với sâu ăn tạp

(Spodoptera litura) trong điều kiện phòng thí nghiệm

3 Khảo sát ảnh hưởng của bốn loại môi trường dinh dưỡng CDA, CAM, SDAY1, SDAY3 lên sự hình thành và phát triển bào tử của 3 loài nấm Metarhizium

anisopliae, Beauveria bassiana, và Paecilomyces spp

B ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

I ĐỐI TƯỢNG

Phân lập, định danh và ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng CAM, CDA, SDAY1 và SDAY3 đối với 3 loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium

anisopliae, Beauveria bassiana và Paecilomyces spp được thu thập và phân lập ở 6

tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long trong điều kiện invitro

II PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Phân lập các dòng nấm nấm ký sinh côn trùng trên rau thu thập từ 6 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang, Tiền Giang

và Sóc Trăng

Bố trí thí nghiệm về hiệu quả của các dòng nấm đã phân lập được đối với sâu

ăn tạp trong phòng thí nghiệm và ảnh hưởng của các loại môi trường dinh dưỡng lên

sự hình thành và phát triển của bào tử các dòng nấm này

C CƠ SỞ LÝ LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I CƠ SỞ LÝ LUẬN

1 Phân loại

Theo hệ thống phân loại nấm của Ainsworth, G C (1996), ba loài nấm ký

sinh côn trùng Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Paecilomyces spp đã

được phân loại như sau:

Nấm Metarhizium anisopliae thuộc ngành phụ lớp nấm bất toàn Deuteromycetes, giống Một số tác giả khác lại cho rằng nấm Metarhizium anisopliae thuộc ngành phụ lớp nấm túi Asscomycotia, lớp Pletomyces và giống Metarhizium

Tuy nhiên, phân loại theo Ainsworth được nhiều tác giả chấp nhận hơn cả

Nấm Beauveria bassiana thuộc ngành phụ lớp nấm bất toàn Deuteromycetes, giống Beauveria Theo Macleod, H L (1954), loài Beauveria

bassiana là loài điển hình trong chi nấm bạch cương Beauveria

Nấm Paecilomyces spp có rất nhiều loài trên thế giới, khoảng 31 loài và phân bố trên diện rộng trong đó có thể kể đến là Paecilomyces farinosus,

Paecilomyces fumosoroseus, Paecilomyces amoeneroseus, Paecilomyces javanicus, Paecilomyces tenuipes, Paecilomyces cicadae, Paecilomyces lilacinus (Dilip K

Arora, P D Bridge, Deepak Bhatnagar, 2004)

2 Sự phân bố

Nấm Metarhizium anisopliae được tìm thấy trên khắp các châu lục với hơn

200 loài côn trùng khác nhau như rầy lá, rầy mềm, bọ xít đen và rất nhiều loài sâu hại khác Sau khi xâm nhiễm, chúng hình thành trên bề mặt côn trùng một lớp phấn màu xanh vàng đến màu xanh đậm, trên mạng sợi nấm chằng chịt màu trắng (Ferron L K, 1978)

Nấm Metarhizium anisopliae là nấm hại côn trùng, xuất hiện phổ biến trong

tự nhiên, có thể phân lập từ xác côn trùng chết hay được phân lập từ trong đất Ở

những nơi không có côn trùng, người ta cũng phân lập được Metarhizium anisopliae

ngay cả trong điều kiện thời tiết rất khắc nghiệt (như ở Đức), trên những khu đất ở rừng sâu khi bị đốt cháy, cả trong những chất thải hữu cơ (chuẩn bị ô nhiễm) hoặc trong trầm tích ở sông chứa đất đầm lầy trồng những loại cây đước, hoặc trong tổ của một số loài chim và cả trong rễ của cây dâu tây cũng có thể phân lập được nấm

Metarhizium anisopliae (Phạm Thị Thùy, 2004)

Nấm Beauveria bassiana phân bố rộng rãi trên khắp thế giới, được tìm thấy

trên và trong đất cũng như ký sinh trên rất nhiều loài côn trùng hại bông, khoai tây, lúa mì, đậu và ngô ở Mỹ (Alaoui Abdelaziz và Elmeziane Abdellatif, 2008) Nấm

Beauveria bassiana (hay còn gọi là nấm bạch cương) là loại nấm hại côn trùng phân

bố trên khắp thế giới, xuất hiện phổ biến trong tự nhiên, có thể phân lập dễ dàng từ xác côn trùng chết hay được phân lập từ trong đất (James R Fuxa và Yoshinori Tanada 1993.)

Nấm Paecilomyces spp có rất nhiều loài, có phổ ký sinh côn trùng rất rộng,

cả ở vùng nhiệt đới và ôn đới (Trần Văn Mão, 2002) Nấm Paecilomyces spp dễ dàng

tìm thấy ở đất tơi xốp, phân hữu cơ và thức ăn, xác bã hữu cơ, dư thừa thực vật Chúng hiện diện ở những nơi ẩm ướt cả trong phòng và ngoài tự nhiên Một số loài quan trọng trong phòng trừ sinh học như:

- Paecilomyces carneus: phân lập từ đất và xác chết côn trùng

- Paecilomyces farinosus: phân lập từ đất

- Paecilomyces fumosoroseus: phân lập từ đất, bơ, gelatin, côn trùng

- Paecilomyces lilacinus phân lập từ xác bã hữu cơ, đôi khi ở côn trùng chết, rừng

cao su (Crop Protection Compennium, 2002)

3 Đặc điểm hình thái, sinh học và khả năng gây hại

3.1 Metarhizium anisopliae

Nấm Metarhizium anisopliae có dạng sợi phân nhánh, có vách ngăn ngang,

đường kính 3 – 4 µm (Trần Thị Thanh, 2004) Sợi nấm phát triển trên bề mặt côn trùng có màu từ trắng đến hồng, cuống sinh bào tử ngắn mọc tỏa tròn trên đám sợi nấm dày đặc Bào tử trần hình que có kích thước 3,5 x 6,4 x 7,2 µm, màu từ lục xám đến ôliu - lục, bào tử xếp thành chuỗi khá chặt chẽ và nhìn bằng mắt thường có thể thấy bào tử được tạo ra trên bề mặt cơ thể côn trùng một lớp phấn khá rõ màu xanh lục Sợi nấm khi phát triển bên trong côn trùng có chiều rộng khoảng 3 - 4 µm, dài khoảng 20 µm, chia thành nhiều tế bào ngắn, trong tế bào có thể thấy rõ nhiều giọt mỡ (Phạm Thị Thùy, 2004)

Nấm Metarhizium anisopliae có bào tử dạng hình trụ, hình hạt đậu, khuẩn lạc có màu xanh, thỉnh thoảng có màu tối hoặc màu hồng vỏ quế Loài Metarhizium

anisopliae có 2 dạng bào tử nhỏ và lớn, dạng bào tử nhỏ Metarhizium anisopliae var

có kích thước bào tử 3,5 - 5,0 x 2,5 - 4,5 µm, dạng bào tử lớn là Metarhizium

anisopliae var major có kích thước bào tử 10,0 - 14,0 µm

Để phân biệt 2 loài trên, Tsai K và ctv., (2006) đã nghiên cứu đặc tính huyết thanh khác nhau của 2 loài này và xác định rằng loài Metarhizium anisopliae là chủng

gây bệnh mạnh nhất trên côn trùng thuộc bộ cánh cứng Coleoptera Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và tìm thấy có khoảng 204 loài côn trùng thuộc họ Elaridae và

Curculionidae dễ bị nhiễm bệnh bởi nấm Metarhizium anisopliae (Phạm Thị Thùy,

2004)

Nấm Metarhizium anisopliae là loài nấm ký sinh rất rộng trên các đối tượng

gây hại nông lâm nghiệp trên khắp thế giới như bộ cánh cứng, cánh đều, cánh nửa cứng, cánh vẩy,… Cho đến nay các nhà khoa học trên thế giới vẫn chưa xác định được

một loại vi nấm nào có hiệu lực cao và phổ tác dụng rộng rãi như chủng M

anisopliae Tại Úc năm 1995, Richard Miller đã tách được vài trăm dòng nấm Metarhizium anisopliae từ một nhóm côn trùng sống trong đất dưới gốc mía Trong số

95 chủng thử nghiệm trực tiếp, tác giả chỉ chọn được hai chủng có khả năng diệt sâu là

Lepidota frenchi và L consobrina hại rễ mía và một chủng diệt sâu Antitrogus parvulus với LD50 là 1 - 5 x 104 bào tử.g-1 Henel đã chọn từ 22 chủng vi nấm, chỉ có 1

chủng Metarhizium anisopliae là phù hợp cho phương pháp phòng trừ sinh học đối với loài mối Masutiesrmes exitiosus (Hill K L, 1999, trích dẫn bởi Phạm Thị Thùy,

2004)

Nhiều loài nấm trong chi Metarhizium có khả năng diệt côn trùng thuộc họ Elalerdae và Curculionidae thuộc bộ cánh cứng Coleoptera, ấu trùng muỗi Aedes

aegypti, Anopheles setphensi, Clexpipiens thuộc bộ hai cánh Diptera, bọ xít đen hại

lúa mì Scotiphora coarctata thuộc bộ cánh nửa cứng Hemiptera, châu chấu sống lưng vàng Patanga sucincta, châu chấu mía Heiroglyphus tonkinensis thuộc bộ cánh thẳng Orthopterra, mối hại đất Masutitermes extiosus thuộc bộ cánh bằng Isoptera

3.2 Beauveria bassiana

Nấm có sợi từ màu trắng đến màu kem có pha một ít màu đỏ, da cam, đôi khi pha một ít màu lục, có thể tiết vào môi trường sắc tố màu vàng, màu đỏ nhạt hoặc màu xanh da trời Sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn ngang, có chiều dài khoảng 3 - 5µm phát triển dày đặc trên môi trường, về sau xuất hiện chi chít các cuống sinh bào tử

Đặc điểm của loại nấm này là có sợi xốp, cuống bào tử trần đứng riêng rẽ hay tụ lại thành từng đám, không phân nhánh hoặc phân nhánh, hình ống hoặc hình bình với chiều dài không đều nhau Trên cuống có những nhánh nhỏ mang bào tử trần (Phạm Thị Thùy, 2004)

Nấm Beauveria bassiana sinh ra những bào tử trần đơn bào (chỉ gồm một tế

bào) không màu, trong suốt, không vách ngăn từ hình cầu (đường kính 1 – 4 µm) đến hình trứng (kích thước 1,5 - 5,5 µm) Bào tử trần mọc trong vòng xoắn, phát sinh từ sợi sinh dưỡng mọc thành từng đám, có cuống phình ra Tế bào sinh bào tử trần có cuống dạng hình cầu hoặc elip, hình thoi trụ, hình cổ chai Cuống tế bào sinh bào tử trần có hình ziczag nhưng là mấu dạng răng nhỏ phát sinh bởi sự kéo dài của gốc ghép (Phạm Thị Thùy, 2004)

Nấm Beauveria bassiana xâm nhiễm nhiều loài côn trùng gây hại cho nông

nghiệp thuộc bộ cánh vẩy Lepidoptera, bộ cánh cứng Coleoptera, bộ cánh màng Hymenoptera, và cả bộ cánh nửa cứng Hemiptera, bộ hai cánh Diptera (Yoshinori

Tanada và Harry K Kaya, 1993) Clark G H và ctv., (1986) cho biết có thể sử dụng nấm Beauveria bassiana để diệt muỗi

3.3 Paecilomyces spp

Khuẩn lạc của nấm Paecilomyces spp có thể là dạng thảm nhung, dạng bó

sợi, màu trắng, hồng nhạt hoặc tím (nên thường được gọi là nấm tím), nâu vàng và nâu xám, thỉnh thoảng có màu lục nhạt Cuống bào tử phân sinh phân nhánh, mức độ phân

nhánh của nấm Paecilomyces spp thường lớn hơn nấm mốc xanh Penicillium, gốc

cuống dạng bình phình to, phía trên nhỏ và uốn cong Cuống bình thường sắp xếp dạng vòng hoặc không đồng đều Bào tử phân sinh đơn bào, không màu, mọc thành chuỗi, hình bầu dục, bề mặt nhẵn hoặc có gai (Trần Văn Mão, 2002)

Julio J D và ctv (2004) đã chứng minh rằng rất ít hoặc không có bào tử nấm được tạo nên ở các nhiệt độ 12, 16, và 30o

C Ánh sáng cũng rất cần thiết cho quá trình

sinh bào tử của nấm Paecilomyces spp Nếu thiếu ánh sáng thì nấm Paecilomyces spp

sẽ không tạo nhiều bào tử Các nhà khoa học cũng cho biết rằng nấm Paecilomyces spp khi tấn công vào cơ thể côn trùng nếu gặp những điều kiện không thích hợp về

nhiệt độ và ẩm độ, ánh sáng thì nấm sẽ tạo nên những thể chịu đựng (resistant structures) để đối phó lại với môi trường (Penland, 1982)

Nấm Paecilomyces spp gây bệnh cho các loài côn trùng thuộc bộ cánh vẩy thường gây ra dịch bệnh trên ruộng đậu Nấm Paecilomyces spp còn được sử dụng để diệt sâu đo Trichoplusia ni, sâu xanh Spodoptera frugiperda, sâu ăn tạp Spodoptera

litura (Yoshinori Tanada và Harry K Kaya, 1993) Nấm Paecilomyces spp có hiệu

quả cao đối với việc phòng trị sâu do có độc tố gọi là Mycotoxin Ở Ấn Độ, các nhà

khoa học đã chứng minh được nếu sử dụng nấm Paecilomyces spp với nồng độ 108

bào tử.ml-1 chủng vào sâu non, sâu non sẽ chết sau 6-8 ngày Khi chết xác sâu sẽ bị khô lại, sau đó nấm sẽ phát triển và cơ thể của sâu sẽ bị bao phủ bởi lớp nấm màu

xanh (Vimala Devi, P.S 1994) Ngoài ra, người ta còn sử dụng nấm Paecilomyces spp để phòng trừ sâu hại bông, ngài đêm vân lệch, sâu cuốn lá lúa, sâu đục thân bắp

(Trần Văn Mão, 2002),

4 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa

4.1 Metarhizium anisopliae

Nấm Metarhizium anisopliae không thể sinh trưởng tốt trên nền cơ chất

không có kitin, chúng sống được ở nhiệt độ thấp 80C, có biên độ về độ ẩm rộng, ở nơi tích lũy nhiều CO2 và thiếu O2 chúng có thể sống tới 445 ngày

Ở nhiệt độ dưới 100

C và trên 450C thì nấm thường không hình thành bào tử Nhiệt độ thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử là từ 25 - 300C và sẽ bị chết ở 49 -

550C, nhiệt độ cho nấm phát triển tốt nhất là 250C pH thích hợp là 6,0 và có thể dao

động trong khoảng 3,3 - 8,5 Nấm Metarhizium anisopliae có khả năng phân giải tinh

bột, xenlulose và kitin (lông và da côn trùng)

Nấm Metarhizium anisopliae có thể đồng hóa nhiều nguồn thức ăn carbon

khác nhau Chúng phát triển tốt trên môi trường có chứa glucose hay lipid Muốn tạo

thành bào tử, nấm Metarhizium anisopliae đòi hỏi phải có ẩm độ không khí khá cao

Sản phẩm trao đổi chất có thể làm tê liệt ấu trùng của sâu loài Galleria,

Mellonela và Bombyx mori Trong dịch nuôi cấy người ta đã tách được dung dịch

toxin và xác định bản chất hóa học của chúng là peptid vòng destruxin A, B, C và D (Phạm Thị Thùy, 2004)

trong khoảng 3 - 8,5 Nấm Beauveria bassiana có khả năng phân giải tinh bột, xeluloza và kitin (lông và da côn trùng) Chase A R và ctv., sử dụng môi trường chứa nguồn tinh bột tự nhiên (bột yến mạch) để phân lập nấm Beauveria bassiana

Nấm Beauveria bassiana có thể đồng hóa nhiều nguồn thức ăn carbon khác

nhau Chúng phát triển tốt trên môi trường có thể chứa glucose hay lipid Muốn tạo

thành bào tử, nấm Beauveria bassiana đòi hỏi phải có ẩm độ không khí cao, tuy nhiên

ẩm độ dưới 50% vẫn kích thích nấm sinh bào tử (Gottwald G L, H L Tedders, 1982)

4.3 Paecilomyces spp

Trong quá trình phát triển, nấm Paecilomyces spp cần nhiều dưỡng chất, nếu

thiếu chất dinh dưỡng sẽ làm hạn chế khả năng gây bệnh của nấm đối với côn trùng (Trần Văn Mão, 2002)

Nhiệt độ và ẩm độ cũng ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển của bào

tử nấm Paecilomyces spp., Khi nuôi nấm Paecilomyces farinosus ở các điều kiện nhiệt

độ khác nhau cho thấy nhiệt độ 150

C có lợi cho sự hình thành bào tử hơn là nhiệt độ

240C Khi nuôi nấm Paecilomyces papillata, nhiệt độ thích hợp nhất là 24 - 260C, nhưng ở nhiệt độ 180C tỷ lệ ký sinh cao hơn 18% so với nhiệt độ 250C Nguyên nhân

có thể là do dưới nhiệt độ thấp sẽ làm giảm quá trình dị hóa, làm tăng quá trình đồng hóa, từ đó làm tăng hoạt chất cho cá thể (Trần Văn Mão, 2002)

Gần đây Stathers, T E., D Moore và C Prior (2004) đã cho công bố những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm

Paecilomyces spp và xác định nấm Paecilomyces spp thích hợp ở nhiệt độ 280C và

Nấm côn trùng nói chung rất cần ánh sáng cho sự phát triển và nấm

Paecilomyces spp cũng không ngoại lệ Vì vậy ánh sáng là nhân tố không thể thiếu

trong sự hình thành bào tử của nấm Paecilomyces spp (Trần Văn Mão, 2002)

5 Khả năng sinh độc tố diệt côn trùng và các sản phẩm trao đổi chất

5.1 Metarhizium anisopliae

Độc tố của nấm M anisopliae gồm một số ngoại độc tố có tên là Destruxin

A, B, C hay D Các ngoại độc tố đó là các sản phẩm thứ cấp vòng peptit, prolyu, leucine, anhydride và Desmethyl Destruxin B Cấu trúc cơ bản của chúng gồm 5 aminoacid và α-hytroxy acid Destruxin gây chán ăn và gây độc cho côn trùng khi

L-chúng hấp thu vào da, một số Destruxin gây tê liệt côn trùng (Amiri, B L và ctv., 1999; Dumas, C K và ctv., 1996) Một số Destruxin khác ức chế miễn dịch rất mạnh

mẽ (Cerenius, L và ctv., 1990)

Các sản phẩm thứ cấp đó thường được tích lũy vào cuối giai đoạn sinh trưởng của nấm, khi các nguồn thức ăn và năng lượng cạn kiệt (Phạm Thị Thùy, 2004)

Theo Suziki, K Kawakami và ctv., (1998):

Destruxin A có công thức nguyên là: C29H47 N5O7, có điểm sôi là 188 0C Destruxin B có công thức nguyên là: C30H51O7N5, có điểm sôi là 2340C Gần đây, Alexandr Jegorov, Petr Sedmera, Vladimr Havlek and Vladimr Mat'ha (1998) đã ly trích thành công được độc tố có tên là Destruxin Ed1, một Cyclopeptide từ nấm này

Năm 1969, Hamill, R L đã xác định được độc tố diệt côn trùng của nấm

bạch cương Beauveria bassiana và đặt tên cho độc tố này là Beauvericin Dombrink

Kurtzman M.A (2003) đã xác định bản chất của độc tố sinh ra trong quá trình trao đổi chất là vòng peptit có sắc tố màu vàng là tenelin và basianin, những sắc tố này có thể

là do hydroxylat progesteron và những phần nhỏ tách ra từ testosteron (C19H28O2) sinh

ra

5.2 Beauveria bassiana

Độc tố của nấm Beauveria bassiana là Beuvericin Về mặt hoá học,

Beuvericin có danh pháp là xyclo (N-metyl L-phenylalanin-D-α-hydroxy- izovaleryl)

3 Đó là một loại depxipeptid vòng, có điểm sôi khoảng 93-940C Từ 1 lít môi trường

nuôi cấy nấm bạch cương Beauveria bassiana các nhà khoa học Trung Quốc ở trường

Đại học tổng hợp Nam Khai (Thiên Tân) đã tách ra được 1,5 g độc tố Beauvericin và

từ 1 kg môi trường đặc các tác giả đã chiết tách ra được 3,8 g Beauvericin (Phạm Thị Thùy, 2004)

Thành phần của môi trường sẽ gây ảnh hưởng đến sự sản sinh độc tố của

nấm Beauveria bassiana Theo Fang W, Bidochka MJ (2006), sự hiện diện của

đường fructose trong môi trường nuôi cấy sẽ làm gia tăng đáng kể độc tố Beauvericin

của nấm Beauveria bassiana

Theo Bidochka M J và J J Khachatourians (2001) thì sản phẩm của nấm

Beauveria bassiana là 2 axit hữu cơ, đó là axit oxalic và axit citric, khi nuôi cấy trên

môi trường có chứa kitin Các tác giả đã chứng minh được chính hai axit trên đã tham gia vào trong quá trình hòa tan protein biểu bì của côn trùng (Phạm Thị Thuỳ, 2004)

5.3 Paecilomyces spp

Độc tố của nấm Paecilomyces là Paecilotoxin, cấu trúc cực kỳ phức tạp, có pháp danh hóa học là (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[2-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[2-[2-(3-arbamoylpropylcarbamoyl)propan-2-ylcarbamoyl] propan-2-ylcarbamoyl]-3-methyl butyl] carbamoyl] -3-methyl-butyl]carbamoyl]propan-2-ylcarbamoyl]-2-hydroxy-3-methyl-butyl] carbamoyl]-5-hydroxy-3-methyl-7-oxo-nonyl]-4-methyl-1-[(E,4S)-4-methylhex - 2 - enoyl] pyrrolidine - 2 - carboxamide (Nevalainen Helena, 1977)

6 Cơ chế tác động của nấm lên côn trùng

6.1 Metarhizium anisopliae

Khi bào tử nấm Metarhizium anisopliae bám trên bề mặt côn trùng sẽ nảy

mầm tạo thành ống mầm xuyên qua biểu bì bên ngoài Bào tử bám chặt vào da và tấn công theo cơ chế bám dính không chuyên biệt thông qua tính kỵ nước của vách tế bào (Bocias, H I; Bandan, A R., 1988; 1991) Khi tiếp xúc với da côn trùng và với điều kiện thích hợp bào tử sẽ mọc mầm có thể tạo ra các cấu trúc xâm nhiễm như tạo ra các ống mầm, túi ngoại bào hoặc túi áp suất, từ đó xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp chitin Sự xâm nhập của nấm vào trong biểu bì thường là do sự phối hợp của enzyme và cơ chế cơ học Nấm tiết ra các loại men làm mềm lớp vỏ chitin và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mọc mầm, qua lổ thủng đó mầm của bào tử nấm xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng Các enzyme đó là exoproteases, endoproteases,

esterases, lipases, chitinases và chitobiases (Leger St và ctv., 1996; Butt và ctv.,

1998)

6.2 Beauveria bassiana

Những bào tử nấm Beauveria bassiana thường bay trong không khí khi dính

vào côn trùng, gặp điều kiện thích hợp sẽ nảy mầm và mọc thành sợi nấm đâm xuyên qua vỏ kitin Chúng phát triển ngay trong cơ thể côn trùng cho đến khi xuất hiện các tế bào nấm đầu tiên (có dạng chuỗi ngắn như nấm men), côn trùng đã phải huy động hết các tế bào bạch huyết (lympho-cyte) để chống đỡ nhưng nấm bạch cương đã sử dụng những vũ khí hóa học rất lợi hại là độc tố Beauvericin, proteaza và một số chất khác làm cho tế bào bạch huyết của tằm không chống đỡ nổi nên lần lượt bị huỷ diệt Khi độc tố nấm đã tiêu diệt hết các tế bào bạch huyết cũng là lúc côn trùng bị chết, cơ thể côn trùng bị cứng lại là do các sợi nấm đan xen lại với nhau; bào tử của nấm bạch cương đã được sử dụng một cách có hiệu quả để phòng trừ nhiều loại côn trùng hại cây trồng (Phạm Thị Thùy, 2004)

6.3 Paecilomyces spp

Côn trùng khi bị nấm Paecilomyces spp tấn công thì ở chỗ bào tử bám vào

sẽ sản sinh ra enzyme phân hủy vỏ chitin của côn trùng Nấm sẽ phát triển bên trong thân của sâu non tạo nên một vệt đen không có hình thù nhất định Côn trùng chết đi thường có màu trắng, đôi khi màu tím nhạt, thân hơi cứng lại (Phạm Thị Thùy, 2004)

7 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự phát triển của bào tử nấm

Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng cho nấm sinh trưởng và phát triển, nếu môi trường không tốt nấm mọc yếu hoặc không mọc

7.1 Metarhizium anisopliae

Trong quá trình nảy mầm để hình thành bào tử, nấm M anisopliae cần các

nguồn C, N Sự phát triển của nấm phụ thuộc vào các chất ức chế khác nhau Môi

trường thích hợp nhất cho nấm M anisopliae là môi trường có chứa kitin làm nguồn cacbon, nếu bổ sung thêm chất kitin và glucoza thì trong quá trình nuôi cấy nấm M

anisopliae sẽ thu được số lượng bào tử cao, bởi vì thành phần kitin trong môi trường

nuôi cấy là rất cần thiết đối với các loại nấm, nó giúp cho sự phát triển và hình thành bào tử đính (Conidiospore) và bào tử trần (Blastospore) Ngoài nguồn nitơ vô cơ ra,

nấm M anisopliae còn sử dụng tốt nguồn hữu cơ như protein, pepton, các axit amim

trong đó có axit glutamic là axit thích hợp cho nấm phát triển Các nguyên tố vi lượng như C++, Zn++ có tác dụng kích thích cho sự phát triển của nấm (Leger St, et al.,

1996)

7.2 Beauveria bassiana

Nấm Beauveria bassiana khi nảy mầm cần rất nhiều chất dinh dưỡng, nếu để

trong nước cất thì chúng nảy mầm rất ít hoặc nảy mầm rất chậm Nấm bạch cương nảy mầm tốt trong môi trường có đường mía và peptone (Trần Văn Mão, 2002)

Cũng như nấm Metarhizium anisopliae, nấm Beauveria bassiana cần các

nguồn C, kitin và glucoza

Trong các loại đường nói chung, đường glucoza luôn là nguồn carbon khá tốt

cho các loài nấm Nấm Beauveria bassiana sử dụng glucoza trong đường đơn khá tốt,

nhưng xyloza lại rất kém; trong đường đôi chúng sử dụng đường mía và đường maltoza khá tốt nhưng đường lactoza lại rất kém; trong đường đa chúng sử dụng tinh bột rất tốt, nhưng đường đơn lại rất kém; đối với xenluloza hầu như chúng không sử dụng Trong axit chúng sử dụng axit hữu cơ (lactic) rất kém, nhưng glycerin (3 cacbon

và 6 cacbon) lại rất tốt (Trần Văn Mão, 2002)

Không những yêu cầu về nguồn cacbon, nấm Beauveria bassiana còn yêu cầu nitơ hữu cơ và vô cơ, trong nitơ vô cơ nấm Beauveria bassiana sử dụng tốt NO3-tốt hơn là NH4+ P là nhân tố quan trọng làm tăng sản lượng nấm bạch cương, trong

giai đoạn sinh trưởng hàng loạt sợi nấm, Beauveria bassiana rất cần C, N, nhưng đến

khi sợi nấm đứt ra thì nhu cầu C, N giảm dần, nhu cầu đối với P tăng lên (Trần Văn Mão, 2002)

7.3 Paecilomyces spp

Trong quá trình phát triển, nấm Paecilomyces spp cần nhiều dưỡng chất, nếu

thiếu chất dinh dưỡng sẽ làm hạn chế khả năng gây bệnh của nấm đối với côn trùng

Liang, K (1981) đã cho biết nấm Paecilomyces tenuipes khi thiếu nguồn nitơ động

vật tính gây bệnh giảm xuống rõ rệt (Hill, K L, 1999, trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002)

8 Ảnh hưởng của một số môi trường nhân sinh khối lên các loài nấm ký sinh côn trùng

Nấm Metarhizium anisopliae phát triển chậm trên môi trường không có pepton

(ví dụ như môi trường PDA, Czapek – Dox), thích hợp trên môi trường có pepton cụ

thể trên môi trường Sabouraud nấm phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ 250C sau 7 -

10 ngày nuôi cấy thì khuẩn lạc có đường kính 4 - 6cm Loài nấm Metarhizium

anisopliae có hai loài dạng bào tử nhỏ và lớn, dạng bào tử nhỏ Metarhizium anisopliae var anisopliae có kích thước 3,5 - 5,0 x 2,5 - 4,5µm, dạng bào tử lớn là

Metarhizium anisopliae var major có kích thước bào tử 10,0 - 14,0µm (Stathers, T E, 2004)

Các loại nấm bất toàn như nấm bạch cương, nấm lục cương khi nảy mầm lại cần chất dinh dưỡng, nếu để trong nước cất thì chúng nảy mầm rất ít hoặc nảy mầm rất chậm Nấm bạch cương nảy mầm rất tốt trong môi trường có đường mía và peptone, nấm lục cương lại nảy mầm tốt trong môi trường có peptone, dấm dầu, nước chiết rau cải, nước phân bón lót (Phạm Thị Thùy, 2004)

Tamura, K và ctv., (2008) đã tiến hành nuôi cấy nấm M anisopliae cũng đã tách

được những độc tố trên từ môi trường Czapek – Dox có chứa 0,5% pepton Từ 1 lít dung dịch nuôi cấy người ta có thể thu nhận được 13 - 15mg độc tố Destruxin A và B, dịch lọc được xử lý bằng than hoạt tính rồi được phản hấp thụ bằng N – butanol, sau

đó được tách bằng benzen và được làm sạch trên cột nhôm oxit trung tính

Môi trường nuôi cấy là yêu tố quan trọng cho nấm sinh trưởng và phát triển, nếu

môi trường không tốt, nấm mọc yếu hoặc không mọc Nấm bạch cương Beauveria

bassiana khi nảy mầm cần rất nhiều chất dinh dưỡng, nếu để trong nước cất thì chúng

nảy mầm rất ít hoặc nảy mầm rất chậm Nấm bạch cương nảy mầm tốt trong môi trường có đường mía và peptone Ngoài ra, nấm còn cần nguồn C, N Nếu bổ sung

thêm chất kitin và glucoza thì trong quá trình nuôi cấy, nấm Beauveria bassiana sẽ thu

được số lượng bào tử cao, bởi vì thành phần kitin trong môi trường nuôi cấy là rất cần thiết đối với các loài nấm (Trần Văn Mão, 2002)

Trong các loại đường nói chung, đường glucoza luôn là nguồn carbon khá tốt

cho các loài nấm Nấm Beauveria bassiana sử dụng glucoza trong đường đơn khá tốt,

nhưng xyloza lại rất kém Trong đường đôi chúng sử dụng đường mía và đường maltoza khá tốt nhưng đường lactoza lại rất kém Trong đường đa, chúng sử dụng tinh bột rất tốt, nhưng đường cục lại rất kém; đối với xenluloza hầu như chúng không lợi dụng Trong axit chúng lợi dụng axit hữu cơ (lactic) rất kém, nhưng lợi dụng glycerin (3 cacbon và 6 cacbon) lại rất Không những yêu cầu về nguồn cacbon, nấm

Beauveria bassiana còn yêu cầu nitơ hữu cơ và vô cơ, trong nitơ vô cơ nấm Beauveria bassiana sử dụng tốt NO3_ tốt hơn là NH4+ P là nhân tố quan trọng làm tăng sản

lượng nấm bạch cương, trong giai đoạn sinh trưởng hàng loạt sợi nấm, Beauveria

bassiana rất cần C, N, nhưng đến khi sợi nấm đứt ra thì nhu cầu C, N giảm dần, nhu

cầu đối với P tăng lên (Trần Văn Mão, 2002)

Nấm Paecilomyces spp là một loài nấm ký sinh côn trùng thuộc ngành phụ lớp

nấm bất toàn Deuteromycetes, có đặc tính sử dụng các loại chất dinh dưỡng tương tự như nấm xanh hay nấm lục cương, nếu được bổ dung pepton và yeast extract thì phát triển rất tốt trên môi trường lỏng (Trần Văn Mão, 2002)

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Phương tiện thí nghiệm

1.1 Vật liệu, dụng cụ và thiết bị

- Các dòng nấm diệt côn trùng Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana,

Paecilomyces spp được phân lập từ các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long

- Đĩa pêtri, Beaker, bình tam giác, nước cất, cồn 70%, cồn 99%

- Gòn không thấm, gòn thấm, giấy thấm, giấy kissme, kẹp inox, cọ lông, kéo, keo dán, bút lông, bọc nylon,

- Chai thủy tinh, hóa chất để nấu môi trường nuôi cấy nấm

- Kính hiển vi chụp ảnh, lame đếm hiệu Thoma (Nhật sản xuất), micropipette, cân điện tử

- Tủ cấy, tủ úm, nồi khử trùng áp suất (autoclave), micropipet, lò viba, đũa cấy,

1.2 Hóa chất

Các loại hóa chất cung cấp nguồn dinh dưỡng thêm vào môi trường: NaNO3,

KH2PO4, MgSO4.7H2O, MgSO4, KCl, FeSO4.7H2O, Na2HPO4, NH4NO3, Glucose, Pepton, Yeast extract

2 Phương pháp thí nghiệm

2.1 Thu thập mẫu côn trùng bị nhiễm nấm và phân lập 3 loài nấm ký sinh

côn trùng Beauveria bassiana (Bals.) Vuill, Metarhizium anisopilae (Metsch.) Sorok và Paecilomyces spp ở 6 tỉnh: An Giang, Cần Thơ, Sóc Trăng, Vĩnh Long,

Hậu Giang và Tiền Giang

- Thời gian thu mẫu: tháng 08 – 11/2008, có thể thu vào mọi thời điểm trong ngày nhưng tốt nhất là vào buổi sáng sớm hay chiều mát vì lúc đó ẩm độ cao, sợi nấm mọc trương nước, khả năng sinh trưởng mạnh, thu về phân lập sẽ dễ hơn Lịch thu mẫu theo từng địa phương, đi hết tỉnh này đến tỉnh khác, nếu các lần đi thu mẫu không

đủ sâu bị nhiễm nấm thì có thể đi bổ sung vào những ngày khác Nói chung, thời gian lấy mẫu không quan trọng bằng địa điểm phân lập các isolates và khả năng phát triển

của nguồn nấm

- Chọn điểm thu thập những mẫu sâu hại: ở mỗi tỉnh chọn 1 huyện nơi có diện

tích trồng rau tập trung Mỗi huyện chọn 4 xã để thu mẫu Mỗi ruộng rau thu ít nhất 4

mẫu cho mỗi loại nấm

4 mẫu/ruộng x 3 loại nấm x 4 xã x 6 tỉnh = 288 mẫu

- Cách lấy mẫu sâu nhiễm nấm: Dùng kẹp inox đặt các mẫu sâu nhiễm nấm ngoài tự nhiên (quan sát được bằng mắt thường) vào trong tuýp có sẵn bông gòn thấm ướt để tạo ẩm độ, ghi nhãn nơi thu thập

- Nhận biết mẫu sâu bị nhiễm nấm ngoài tự nhiên: Quan sát bằng mắt thường, nhận diện hình thái bên ngoài nấm trên cơ thể côn trùng:

+ Nấm Metarhizium anisopilae: có màu lục hoặc xanh lục (là nấm lục cương)

Sợi nấm phát triển trên bề mặt côn trùng ban đầu màu trắng sau chuyển sang màu xanh nhạt Trên bề mặt cơ thể côn trùng có một lớp phấn khá rõ màu xanh lục, các sợi nấm khá mịn (hình 2)

+ Nấm Beauveria bassiana (nấm bạch cương): đặc điểm của loại nấm này là sợi

nấm mọc xốp, trông như những sợi nấm trắng mịn mọc xốp bao phủ bề mặt côn trùng

(hình 3)

+ Nấm Paecilomyces: các sợi nấm mọc mịn bao phủ côn trùng, ban đầu có màu

tím rất nhạt sau đó sợi nấm chuyển sang màu tím nhạt (hình 4)

Sâu bị nhiễm nấm có tơ nấm xuất hiện trên cơ thể Bị nhiễm vi khuẩn không có

tơ nấm và thường nhũn nước, có mùi rất hôi Sâu bị nhiễm virus thường nứt bụng hoặc khi chết treo ngược cành cây Sâu bị chết do thuốc sâu cũng không có tơ nấm trên thân hoặc màu sắc, hình dạng nấm không đặc trưng

2.2 Phân lập, tách ròng, định danh và tồn trữ các mẫu nấm thu được trong môi trường PDA (Potato Destrose Agar)

- Phương pháp phân lập: Mẫu thu về được trữ trong đĩa pêtri có lót giấy thấm

và bông gòn ẩm để tạo ẩm độ cho nấm phát triển, quan sát thấy tơ nấm xuất hiện tiến hành nuôi cấy nấm trong môi trường PDA Nuôi cấy theo phương pháp Slide culture (Harris J L, 1986) để quan sát bào tử và cành bào đài Tiến hành theo các bước sau:

- Chuẩn bị một miếng môi trường Agar đặt trên dĩa petri, có diện tích 5 mm2, cao 2 mm

- Đặt miếng môi trường Agar trên lam, trong dĩa petri có để giấy thấm nước tạo ẩm độ

- Cấy một ít bào tử nấm vào miếng Agar Sau đó dùng lame đậy lên trên miếng Agar

- Ủ dĩa Petri với nhiệt độ 250C trong 3 – 5 ngày Sau đó chuyển lame trên miếng Agar đặt lên một lam mới và đem quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, quan sát nhận diện, mô tả và chụp hình dạng bào tử, cành bào đài của các dòng nấm này

- Tiến hành định danh theo hệ thống phân loại của H L Barnett and Barry,

B Hunter (1998) và G C Ainsworth (1971) sau khi đã có dạng bào tử và cành bào

đài của các dòng nấm

- Các mẫu nấm một phần nhân nuôi ra làm thí nghiệm, phần còn lại mang đi trữ nguồn trong các tuýp Glycerol 10% ở điều kiện -800C đã thanh trùng (D Smith, 2002)

Quan sát, ghi nhận một số đặc điểm sinh học trong quá trình phân lập để bước đầu ghi nhận những dòng nấm sinh trưởng mạnh, dễ nhân sinh khối như màu sắc, hình dạng, đặc điểm của bào tử, khuẩn lạc trên đĩa petri

2.3 Thử nghiệm hoạt lực sinh học của các mẫu nấm thu thập được trên sâu ăn tạp trong điều kiện phòng thí nghiệm

Nuôi nhân sâu ăn tạp trong phòng thí nghiệm: nuôi sâu ăn tạp đến tuổi 2, chọn sâu đồng cở để làm thí nghiệm

- Nguồn sâu ăn tạp được thu thập từ ngoài đồng đem về nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm bằng thức ăn nhân tạo nấu sẵn

- Khi ở giai đoạn nhộng, chọn ra những nhộng đực và nhộng cái khỏe cho vào bọc giấy (mỗi bọc giấy một cặp nhộng)

- Sau khi nhộng vũ hoá, thường xuyên cho bướm uống nước đường glucose 10%

- Sau khi thấy những ổ trứng xuất hiện (3 - 4 ổ trứng), kiểm tra bướm để thu bướm sạch Cách thực hiện như sau:

+ Cho cả cặp bướm bố mẹ vào cối nghiền có sẵn nước cất (khoảng 1 ml) + Dùng ống nhỏ giọt hút lấy một phần mẫu nghiền trong cối nghiền ở trên và nhỏ lên lam, đậy lame rồi đem quan sát dưới kính hiển vi phản pha

+ Khi quan sát mẫu nghiền, nếu không thấy sự hiện diện của virus NPV, protozoa hoặc mật số vi khuẩn rất thấp thì có thể sử dụng ổ trứng của cặp bướm bố mẹ

đó

- Thu những ổ trứng sạch cho vào dung dịch Formaline 10%, ngâm trong thời gian 25 phút để khử bỏ những vi sinh vật bám bên ngoài vỏ trứng Sau đó vớt ổ trứng

ra và rửa lại bằng nước cất

- Cho ổ trứng vào hộp nhựa có sẵn thức ăn chờ trứng nở

- Sau khi trứng đã nở, thu ấu trùng sâu non và tiếp tục nuôi bằng thức ăn nhân tạo cho đến khi ấu trùng đạt tuổi 2 thì tiến hành thí nghiệm

- Ấu trùng sâu ăn tạp được nuôi liên tục trong điều kiện phòng thí nghiệm để thực hiện thí nghiệm

Bảng 1 Thành phần các nguyên vật liệu dùng để nuôi sâu ăn tạp (Nguyễn Thị Ngọc

Tuyền, 2003)

Chuẩn bị huyền phù dung dịch nấm

Sử dụng các dòng nấm được phân lập và tách ròng từ các mẫu sâu bị ký sinh ngoài tự nhiên, cấy nguồn nấm sang môi trường PDA khoảng 7-10 ngày cho sợi nấm phát triển và sinh một lượng bào tử nhất định Sau đó tiến hành cạo nấm thu lấy bào

tử, đếm mật số bào tử và pha loãng huyền phù bào tử đến mật số 108 bào tử.ml-1

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 52 nghiệm thức (51 dòng nấm và 1 đối chứng), 5 lần lặp lại, mỗi lặp lại là 20 cá thể sâu đồng cở Nghiệm thức đối chứng sử dụng nước cất thanh trùng Mỗi cá thể sâu nuôi riêng trong các cốc nhỏ có nắp đậy để tránh bị nhiễm sang các con sâu khác

Mỗi cốc nhựa nhỏ có đường kính khoảng 5 cm x cao 6 cm, dưới đáy cốc có lót giấy thấm để dễ vệ sinh Chủng vào mỗi cốc 20µl dung dịch huyền phù bào tử nấm

và cho thức ăn nhân tạo vào, đậy cốc lại tránh lây nhiễm

Lấy chỉ tiêu

Ghi nhận số sâu chết sau 4, 6, 8, 10 ngày sau khi xử lý đối với cả 3 loại nấm

Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Paecilomyces spp Mỗi lần lấy chỉ

tiêu đều đo nhiệt độ và ẩm độ Tính độ hữu hiệu (%) bằng công thức Abbott (Trần Văn Hai, 1998) Số liệu được phân tích thống kê với phần mềm MSTATC

2.4 Khảo sát ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng lên sự hình

thành và phát triển bào tử của 3 loại nấm Metarhizium anisopliae, nấm Beauveria

bassiana và nấm Paecilomyces spp trong môi trường lỏng

2.4.1 Nguồn nấm

Sử dụng 10 dòng nấm Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và

Paecilomyces spp đã được phân lập và thử độ hữu hiệu trên sâu ăn tạp trong phòng

thí nghiệm Cấy nguồn nấm vào đĩa petri có chứa 10 ml môi trường cơ bản PDA đối với cả 3 loại nấm từ 10 đến 14 ngày cho nấm phát triển và sinh ra một số lượng bào tử nhất định Sau đó, cho 10ml nước cất vào mỗi đĩa dùng lame cạo nhẹ vào mặt môi trường để thu lấy bào tử và đếm mật số bào tử ban đầu

2.4.2 Bố trí thí nghiệm

Bố trí thí nghiệm theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức tương ứng với 4 loại môi trường CDA, CAM, SDAY1, SDAY3 và 5 lần lặp lại Mỗi đơn vị thí nghiệm tương ứng với 1 bình tam giác 400ml (chứa 100ml môi trường thử nghiệm như trong hình 7) Các bình tam giác chứa môi trường này đã được thanh trùng bằng autoclave ở 1210C trong 30 phút Ở mỗi bình tam giác, chủng 1ml huyền phù bào tử nấm có mật số 107 bào tử.ml-1

Các đơn vị thí nghiệm (bình chứa môi trường) được đặt trên máy lắc tốc độ

120 vòng.phút-1 ở nhiệt độ và ánh sáng phòng thí nghiệm

10 dòng nấm x 4 môi trường x 5 lặp lại = 200 đơn vị thí nghiệm

Bảng 2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

I, II, III, IV, V: Năm lần lặp lại

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10: mười dòng nấm chọn ra từ thí nghiệm trong phòng

Bảng 3 Tỷ lệ khoáng chất của các loại môi trường lỏng

Môi trường

Khoáng chất

CDA (Czapek - Dox)

CAM (Complete Media)

SDAY1 (Sabouraud dextrose Yeast)

SDAY3 (Sabouraud dextrose Yeast)

có thêm khoáng chất

Số liệu mật số bào tử.ml-1 được đổi sang logarit thập phân

2.4.4 Thống kê: Tổng hợp số liệu và phân tích thống kê bằng phần mềm

MSTATC

CHƯƠNG 2 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

I Thu thập mẫu côn trùng bị nhiễm 3 loài nấm ký sinh côn trùng Beauveria

bassiana (Bals.) Vuill, Metarhizium anisopilae (Metsch.) Sorok và Paecilomyces

spp ở 6 tỉnh An Giang, Cần Thơ, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Hậu Giang và Tiền Giang

Qua quá trình đi thu thập các mẫu côn trùng bị nhiễm vi nấm ngoài tự nhiên trên đồng ruộng, chúng tôi nhận định rằng côn trùng bị nhiễm các loài nấm ký sinh khi chúng hiện diện với mật số cao, gây thành dịch và ít sử dụng thuốc bảo vệ thực vật

Hai trăm tám mươi tám dòng nấm Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và

Paecilomyces spp được thu thập từ những ruộng sản xuất rau của nông dân hoặc vườn

rau gia đình tại 6 tỉnh An Giang, Cần Thơ, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Hậu Giang và Tiền Giang (Bảng 4).Các dòng nấm chủ yếu thu thập trên các đối tượng như gây hại như:

sâu ăn tạp (Spodoptera litura), sâu ăn đọt (Crocidolomia binotalis), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua), rầy phấn trắng (Aleurodicus dispersus), sâu tơ (Plutella

xylostella), sâu đục trái đậu nành (Etiella zinckenella), rầy mềm (Brevicoryne brassacicae) và bọ nhảy (Phyllotetra striolata)

Bảng 4 Số mẫu sâu hại bị nhiễm nấm ký sinh thu thập được ở một số tỉnh

Đồng bằng sông Cửu Long, tháng 8-9 năm 2008

STT Phường, Xã Quận,

Huyện Tỉnh

Số mẫu

Nhiệt độ / ẩm độ trung bình

1 Kiến An Chợ Mới An Giang 12 29,40C / 70,4%

2 Long Điền A Chợ Mới An Giang 12 30,40C / 68,5%

3 Bình Phước Xuân Chợ Mới An Giang 10 31,10C / 62,5%

4 Mỹ Hiệp Chợ Mới An Giang 12 26,40C / 62,6%

5 Long Tuyền Bình Thủy Cần Thơ 16 30,60C / 70%

6 Long Hòa Bình Thủy Cần Thơ 12 25,80C / 75%

7 Bình Thủy Bình Thủy Cần Thơ 18 31,30C / 69,7%

8 An Thới Bình Thủy Cần Thơ 12 29,90C / 61%

9 Mỹ Hòa Bình Minh Vĩnh Long 14 32,20C / 70%

10 Đông Bình Bình Minh Vĩnh Long 12 28,50C / 66%

11 Đông Thạnh Bình Minh Vĩnh Long 12 30,40C / 69,8%

12 Đông Thành Bình Minh Vĩnh Long 12 27,60C / 71%

13 Tân Phú Long Mỹ Hậu Giang 12 29,9 0C / 70,1%

14 Vĩnh Thuận Đông Long Mỹ Hậu Giang 12 30,80C / 69%

15 Thuận Hòa Long Mỹ Hậu Giang 12 25,90C / 74,8%

16 Thuân Hưng Long Mỹ Hậu Giang 12 32,10C / 69,8%

17 Lai Hòa Vĩnh Châu Sóc Trăng 12 27,60C / 70,3%

18 Vĩnh Tân Vĩnh Châu Sóc Trăng 9 30,40C / 69,6%

19 Vĩnh Phước Vĩnh Châu Sóc Trăng 12 29,60C / 71,2%

20 Vĩnh Hiệp Vĩnh Châu Sóc Trăng 8 30,50C / 74%

21 Phú Kiết Chợ Gạo Tiền Giang 12 31,60C / 74,4%

22 Hòa Tịnh Chợ Gạo Tiền Giang 12 30,00C / 70,1%

23 Mỹ Tịnh An Chợ Gạo Tiền Giang 12 29,60C / 69,7%

24 Trung Hòa Chợ Gạo Tiền Giang 9 29,70C / 70,8%

Các dòng nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana dễ tìm, thường xuyên hiện diện với tỷ lệ trên sâu chết cao hơn so với các dòng nấm Paecilomyces spp Ngoài ra, nấm Paecilomyces spp tồn tại ngoài tự nhiên đôi khi không có màu đặc

trưng (tơ nấm màu tím) như giai đoạn đầu ký sinh trên sâu có màu trắng, sau đó chuyển dần sang hồng nhạt, giai đoạn sau nấm thoái hóa sẽ có màu nâu đen nhạt

II Phân lập, định danh và tồn trữ các mẫu nấm thu được trong môi trường PDA (Potato Destrose Agar)

Các dòng nấm sau khi thu thập được ngoài đồng (trữ trong các tuýp đã chuẩn

bị sẵn, dán nhãn và ghi nơi thu thập, thời gian thu thập) được mang về phòng thí nghiệm để phân lập (hình 5) trong các đĩa petri với môi trường nấm chuẩn là PDA (hình 4 và hình 5)

Kết quả phân lập được 51 dòng nấm (Bảng 5), cụ thể như sau:

- Nấm Metarhizium anisopliae (20 dòng): 5 dòng tại An Giang (M1-AG, M2

-AG, M3-AG, M4-AG, M5-AG), 4 dòng tại Cần Thơ (M1-CT, M2-CT, M3-CT, M4-CT),

3 dòng tại Vĩnh Long (M1-VL, M2-VL, M3-VL), 3 dòng tại Hậu Giang (M1-HG, M2

-HG, M3-HG), 3 dòng tại Sóc Trăng (M1-ST, M2-ST, M3-ST) và 2 dòng tại Tiền Giang (M1-TG, M2-TG)

- Nấm Beauveria bassiana (17 dòng): 4 dòng tại An Giang (B1-AG, B2-AG,

B3-AG, B4-AG), 3 dòng tại Cần Thơ (B1-CT, B2-CT, B3-CT), 3 dòng tại Vĩnh Long (B1 –VL, B2-VL, B3-VL), 2 dòng tại Hậu Giang (B1-HG, B2-HG), 2 dòng tại Sóc Trăng (B1-ST, B2-ST) và 3 dòng tại Tiền Giang (B1-TG, B2-TG, B3-TG)

- Nấm Paecilomyces spp (14 dòng): 3 dòng tại An Giang (P1-AG, P2-AG, P3AG), 2 dòng tại Cần Thơ (P1-CT, P2-CT), 3 dòng tại Vĩnh Long (P1-VL, P2-VL, P3-VL), 2 dòng tại Hậu Giang (P1-HG, P2-HG), 1 dòng tại Sóc Trăng (P1-ST) và 3 dòng tại Tiền Giang (P1-TG, P2-TG, P3-TG)

-Bảng 5 Danh sách các dòng nấm phân lập được trong môi trường PDA tại

phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ thực vật, Đại học Cần Thơ, tháng 9-11 năm 2008

(T0: 25,40C – 27,50C, H%: 65%-75%)

STT Dòng

nấm Ký sinh Ký chủ

Quận, Huyện

Tỉnh, Thành Phố (*)

1 M1-AG Sâu ăn đọt Cải tùa xại Chợ Mới An Giang

2 M2-AG Sâu ăn tạp Cải tùa xại Chợ Mới An Giang

3 M3-AG Sâu ăn tạp Bắp cải Chợ Mới An Giang

4 M4-AG Rầy mềm Xà lách Chợ Mới An Giang

5 M5-AG Sâu ăn tạp Cải xanh Chợ Mới An Giang

6 B1-AG Sâu ăn tạp Cải bắp Chợ Mới An Giang

7 B2-AG Sâu ăn tạp Cải xanh Chợ Mới An Giang

8 B3-AG Sâu ăn tạp Cải xanh Chợ Mới An Giang

9 B4-AG Sâu ăn tạp Bắp cải Chợ Mới An Giang

10 P1-AG Sâu xanh Bắp cải Chợ Mới An Giang

11 P2-AG Sâu ăn tạp Cải tùa xại Chợ Mới An Giang

12 P3-AG Sâu ăn đọt Cải tùa xại Chợ Mới An Giang

13 M1-CT Sâu ăn đọt Cải tùa xại Bình Thủy Cần Thơ

14 M2-CT Sâu ăn tạp Cải tùa xại Bình Thủy Cần Thơ

STT Dòng

nấm Ký sinh Ký chủ

Quận, Huyện

Tỉnh, Thành Phố (*)

15 M3-CT Sâu ăn tạp Cải tùa xại Bình Thủy Cần Thơ

16 M4-CT Sâu ăn tạp Cải tùa xại Bình Thủy Cần Thơ

17 B1-CT Sâu ăn tạp Cải xanh Bình Thủy Cần Thơ

18 B2-CT Sâu ăn đọt Cải ngọt Bình Thủy Cần Thơ

19 B3-CT Sâu ăn tạp Đậu nành Bình Thủy Cần Thơ

20 P1-CT Sâu ăn tạp Cải tùa xại Bình Thủy Cần Thơ

21 P2-CT Sâu ăn tạp Cải tùa xại Bình Thủy Cần Thơ

22 M1-VL Sâu đục trái Đậu xanh Bình Minh Vĩnh Long

23 M2-VL Sâu đục trái Đậu nành Bình Minh Vĩnh Long

24 M3-VL Sâu đục trái Đậu nành Bình Minh Vĩnh Long

25 B1 -VL Sâu ăn tạp Cải tùa xại Bình Minh Vĩnh Long

26 B2-VL Sâu ăn tạp Cải xanh Bình Minh Vĩnh Long

27 B3-VL Sâu ăn tạp Cải xanh Bình Minh Vĩnh Long

28 P1-VL Sâu ăn tạp Cải xanh Bình Minh Vĩnh Long

29 P2-VL Sâu ăn tạp Cải xanh Bình Minh Vĩnh Long

30 P3-VL Sâu ăn tạp Cải xanh Bình Minh Vĩnh Long

31 M1-HG Sâu xanh da láng Hành Long Mỹ Hậu Giang

32 M2-HG Sâu xanh da láng Hành Long Mỹ Hậu Giang

33 M3-HG Sâu xanh da láng Hành Long Mỹ Hậu Giang

34 B1-HG Rầy phấn trắng Đậu nành Long Mỹ Hậu Giang

35 B2-HG Sâu tơ Cải tùa xại Long Mỹ Hậu Giang

36 P1-HG Rầy phấn trắng Đậu nành Long Mỹ Hậu Giang

37 P2-HG Sâu ăn tạp Cải xanh Long Mỹ Hậu Giang

38 M1-ST Sâu ăn tạp Bẹ dún Vĩnh Châu Sóc Trăng

39 M2-ST Bọ nhảy Bẹ dún Vĩnh Châu Sóc Trăng

40 M3-ST Sâu ăn đọt Bẹ dún Vĩnh Châu Sóc Trăng

41 B1-ST Sâu ăn tạp Cải tùa xại Vĩnh Châu Sóc Trăng

42 B2-ST Sâu ăn tạp Cải tùa xại Vĩnh Châu Sóc Trăng

43 P1-ST Sâu ăn tạp Cải tùa xại Vĩnh Châu Sóc Trăng

44 M1-TG Bọ nhảy Bắp cải Chợ Gạo Tiền Giang

45 M2-TG Sâu ăn đọt Bắp cải Chợ Gạo Tiền Giang

46 B1-TG Sâu ăn tạp Xà lách Chợ Gạo Tiền Giang

47 B2-TG Sâu ăn tạp Xà lách Chợ Gạo Tiền Giang

48 B3-TG Sâu ăn tạp Xà lách Chợ Gạo Tiền Giang

49 P1-TG Sâu ăn tạp Xà lách Chợ Gạo Tiền Giang

50 P2-TG Sâu ăn tạp Bắp cải Chợ Gạo Tiền Giang

51 P3-TG Sâu ăn tạp Cải tùa xại Chợ Gạo Tiền Giang

Ghi chú: M: Metarhizium anisopliae, B: Beauveria bassiana, P: Paecilomyces spp Các chỉ số dưới đi kèm theo tương ứng với số mẫu phân lập được tại tỉnh đó Hai ký tự cuối viết tắt tên tỉnh thu thập được.

Khoảng 3-5 ngày đầu các sợi tơ nấm đều có màu trắng nhạt nên dễ nhầm lẫn 3

loại nấm này nếu không quan sát kỹ, tuy nhiên nấm Paecilomyces spp tương đối khó

tìm hơn ngoài tự nhiên với màu sắc đặc trưng Giai đoạn sau khi nấm tấn công vào cơ thể côn trùng, các sợi nấm nẩy chồi và bao phủ cơ thể côn trùng thì các loại nấm có

màu sắc, hình dáng đặc trưng Nấm Metarhizium anisopliae, mặt trên đĩa xuất hiện

các vòng màu xanh sậm, hơi đen (còn gọi là nấm xanh hay nấm lục cương), nấm

Beauveria bassiana mặt trên đĩa petri toàn thể có màu trắng (cả tơ nấm và bào tử nên

còn được gọi là nấm trắng hay nấm bạch cương), còn nấm Paecilomyces spp các tơ

nấm dần chuyển sang màu tím than từ nhạt đến đậm (khoảng từ 5-7 ngày sau khi cấy, nên còn có tên là nấm tím) Màu sắc tơ nấm được ghi nhận trong hình 4 Nhiều loài côn trùng chết có tơ nấm màu đen, nâu nhạt, thậm chí có màu vàng rơm đều là nấm

Paecilomyces spp Sự đa dạng về hình thái bên ngoài này cũng từng được Phạm Thị

Thùy mô tả năm 2001 khi thu thập, phân lập các dòng nấm Paecilomyces spp ngoài

tự nhiên

Đặc điểm của các dòng nấm Metarhizium anisopliae (hình 5a)

Nấm Metarhizium anisopliae trên sâu ăn đọt, sâu tơ:

- Tơ nấm có màu trắng, sau 7-10 ngày hình thành bào tử vòng đồng tâm màu xanh

- Mặt đáy đĩa petri có màu xanh vàng

- Bào tử có hình ovale, màu xanh

Nấm Metarhizium anisopliae trên sâu ăn tạp, sâu xanh da láng:

- Tơ nấm màu trắng, mặt trên có màu vàng nhạt

- Mặt đáy đĩa petri có màu vàng

- Bào tử có hình trụ, màu xanh sậm

Nấm Metarhizium anisopliae trên rầy phấn trắng:

- Tơ nấm có màu trắng

- Mặt đáy đĩa petri có màu trắng đục hoặc có màu trắng ngà

- Bào tử nấm có hình ovale, màu xanh sậm

Nấm Metarhizium anisopliae trên sâu bọ nhảy

- Tơ nấm có màu trắng, mặt trên có màu vàng tươi

- Mặt đáy đĩa petri có màu vàng sậm

- Bào tử có hình trụ, màu xanh đen

Đặc điểm của các dòng nấm Beauveria bassiana (hình 5b)

Nấm Beauveria bassiana trên sâu ăn tạp, sâu xanh, rầy phấn trắng, sâu ăn đọt

- Tơ nấm màu trắng, mặt trên có màu trắng hoặc vàng nhạt

- Mặt đáy đĩa petri có màu trắng ngà hoặc vàng nhạt

Nấm Beauveria bassiana trên bọ nhảy:

Tơ nấm màu trắng nhưng mịn hơn

Mặt đáy đĩa petri màu vàng sậm hơn

Đặc điểm của các dòng nấm Paecilomyces spp (hình 5c)

- Tơ nấm có màu hồng, mặt trên có hồng tím nhạt

- Mặt đáy có nâu trắng sậm

Nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana dễ phân lập hơn nấm

Paecilomyces spp do chúng ít nhiễm, sinh trưởng nhanh và tạo bào tử sớm hơn trong

môi trường nuôi cấy nhân tạo

III Thử nghiệm hoạt lực sinh học của các mẫu nấm thu thập được trên sâu ăn tạp trong điều kiện phòng thí nghiệm

Kết quả thí nghiệm ở bảng 6 cho thấy, các dòng nấm đều tăng hiệu quả dần

từ 4 ngày sau khi cấy (NSKC) đến 8 NSKC và đạt cao nhất ở 10 NSKC, khác biệt có

ý nghĩa thống kê với nghiệm thức đối chứng (chủng nước cất thanh trùng) qua phép

thử Duncan ở mức ý nghĩa 1% Vào 4 NSKC, hầu hết các nghiệm thức đều đạt hiệu quả rất thấp, từ 8,6% (ở dòng nấm P1-VL) và cao nhất là 50,1% (với dòng nấm M1-ST) Đến 8 NSKC, một số dòng nấm đạt hiệu quả gần với 10 NSKC, chẳng hạn như dòng nấm P2-AG (67,4% ở 8NSKC và 69,5% ở 10 NSKC) Đến 10 NSKC, cả 3 loại nấm đã nhiễm mạnh, cho màu sắc đặc trưng, được ghi nhận trong hình 6

Hiệu quả đối với sâu ăn tạp vào thời điểm 10 ngày sau khi dòng nấm đối với

nấm Metarhizium anisopliae từ 75,7% (M5-AG) đến 82,5 % (M1-CT), đối với nấm

Beauveria bassiana từ 67,8% (B2-TG) đến 80,1% (B1-VL) và nấm Paecilomyces spp

69,2% (P3-TG) đến 69,5% (P2-AG) Nấm Metarhizium anisopliae có hiệu quả cao

hơn trong thí nghiệm này

Bảng 6 Hiệu lực (%) của các dòng nấm đối với sâu ăn tạp trong điều kiện phòng thí

nghiệm, bộ môn BVTV, ĐHCT, tháng 12 năm 2008

1 M1-AG 10,2 vx 36,1 f-m 50,7 e-k 59,5 e-j

2 M2-AG 39,2 fg 54,4 bcd 65,5 a-d 77,2 abc

3 M3-AG 8,9 vwx 26,8 l-o 49,7 e-k 60,0 ej

4 M4-AG 12,6 s-w 29,8 i-o 39,9 klm 58,8 e-j

5 M5-AG 36,5 gh 56,8 abc 70,2 ab 75,7 a-d

6 B1-AG 7,9 wx 26,8 l-o 45,8 h-l 50,8 h-l

7 B2-AG 44,6 cde 27,8 k-o 40,5 j-m 70,8 a-e

8 B3-AG 30,2 ij 36,7 f-m 39,6 klm 49,8 h-l

9 B4-AG 9,8 vwx 36,3 f-m 39,8 klm 50,1 h-l

10 P1-AG 18,8 l-r 39,7 e-k 49,4 e-l 60,6 e-i

11 P2-AG 22,1 lm 58,8 ab 67,4 a-d 69,5 a-g

23 M2-VL 26,5 jk 39,6 e-k 55,7 e-k 60,8 e-i

24 M3-VL 49,3 ab 57,6 abc 65,4 a-d 76,9 abc