Tối ưu điều kiện tách chiết và làm giàu axit béo Omega-3 và Omega-6 từ sinh khối vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium Mangrovei PQ6 của Việt Nam

DANH MỤC BẢNGTrang Bảng 1.1 Hàm lượng các axít béo omega-3 và omega-6 có trong một số loại Bảng 1.3 Một số sản phẩm thương mại có chứa EPA và DHA có nguồn gốc từ Bảng 3.3 Một số tính ch

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

***********************

LÊ THỊ THƠM

Đề tài: “TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT VÀ LÀM GIÀU AXIT BÉO OMEGA-3 VÀ OMEGA-6 TỪ SINH

KHỐI VI TẢO BIỂN DỊ DƢỠNG SCHIZOCHYTRIUM

MANGROVEI PQ6 CỦA VIỆT NAM”

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2014

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

***********************

Lê Thị Thơm

Đề tài: “TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT VÀ LÀM GIÀU AXIT BÉO OMEGA-3 VÀ OMEGA-6 TỪ SINH

KHỐI VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG SCHIZOCHYTRIUM

MANGROVEI PQ6 CỦA VIỆT NAM”

Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm

Mã số: 60.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS Đặng Diễm Hồng

Hà Nội, 2014

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đặng Diễm Hồng, Trưởng Phòng Công nghệ Tảo - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian qua Tôi xin chân thành biết ơn sự giúp đỡ to lớn và quý báu đó

Tôi muốn gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Ban lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Ban giám hiệu Trường Đại học Thái Nguyên, cùng các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã tạo mọi điều kiện giúp

đỡ, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn các anh chị, các bạn đồng nghiệp của phòng Công nghệ Tảo đã đóng góp ý kiến và giúp đỡ tôi hoàn chỉnh số liệu trong luận văn này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn

ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn của mình

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Học viên cao học

Lê Thị Thơm

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Học viên cao học

Lê Thị Thơm

MỤC LỤC

MỤC LỤC ……… … i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT……… …… iv

DANH MỤC BẢNG……….… v

DANH MỤC HÌNH……… …vi

MỞ ĐẦU………1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 3

1.1 Giới thiệu về PUFA……….………3

1.2 Vai trò và ứng dụng của PUFA……… ………… … 4

1.2.1 Vai trò của PUFAs đối với sức khoẻ con người 4

1.2.2 Vai trò của PUFAs đối với nuôi trồng thủy sản 6

1.3 Nguồn cung cấp PUFA 7

1.3.1 Nguồn gốc từ thực vật 7

1.3.2 Nguồn gốc từ động vật 8

1.3.3 Nguồn gốc từ vi tảo 9

1.4 Các nghiên cứu về PUFA từ vi tảo biển ……….…11

1.4.1 Con đường tổng hợp PUFA trong vi tảo……….…11

1.4.2 PUFAs từ các VTB quang tự dưỡng……… …13

1.4.3 PUFAs từ các vi tảo biển dị dưỡng……….…….…14

1.5 Vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium……… …15

1.5.1 Giới thiệu chung về tảo di dưỡng Schizochytrium……….….15

1.5.1.1 Vị trí phân loại 15

1.5.1.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc của Schizochytrium mangrovei 15

1.5.1.3 Sản xuất DHA và PUFAs từ vi tảo Schizochytrium khác… …16

1.6 Các phương pháp tách chiết và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết PUFA ……… … 17

1.6.1 Các phương pháp tách chiết và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết lipit tổng số (dầu thô) từ sinh khối tảo……… 17

1.6.2 Các phương pháp tách chiết và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết FFA từ dầu thô……….…… …… 19

1.6.3 Các phương pháp tách chiết và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và làm giàu axit béo omega-3 và omega-6 từ hỗn hợp axit béo tự do……… …19

1.7 Tình hình nghiên cứu PUFA trong nước và trên thế giới……… 21

1.7.1 Tình hình nghiên cứu PUFA trên thế giới………….…….…………21

1.7.2 Tình hình nghiên cứu PUFA ở Việt Nam……… 22

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… ………25

2.1 Vật liệu ……… … 25

2.1.1 Chủng tảo và điều kiện nuôi cấy…… ……… …25

2.1.2 Hóa chất và thiết bị……… 25

2.2 Phương pháp……… … 26

2.2.1.Tách chiết lipit 26

2.2.2 Tối ưu các thông số của quá trình tách chiết lipit……….………….27

2.2.3 Tối ưu hóa qui trình tách chiết FFA từ dầu thô ……….… 27

2.2.3.1 Tối ưu nồng độ NaOH trong phản ứng thủy phân dầu thô… 27

2.2.3.2 Nghiên cứu làm giàu hỗn hợp dầu sinh học giàu axít béo omega-3 và omega-6 từ hỗn hợp FFA bằng phương pháp tạo phức với urê…… 28

2.2.4 Xác định chỉ số axit của hỗn hợp FFA và hỗn hợp axít béo omega-3 và omega-6……… 29

2.2.5 Xác định chỉ số peroxyt của hỗn hợp FFA và hỗn hợp axít béo omega-3 và omega-6……… ……….30

2.2.6 Phương pháp xác định thành phần axit béo……… 30

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……….32

3.1 Thành phần và hàm lượng axít béo trong sinh khối chủng S mangrovei PQ6 nuôi cấy ở bình lên men 30 lít……… ….32

3.2 Ảnh hưởng của các tác nhân khác nhau lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh khối chủng PQ6……… 33

3.2.1 Ảnh hưởng của một số yếu tố khác nhau đến quá trình tách chiết lipit……… ……… 34

3.2.1.1 Ảnh hưởng của dung môi tách chiết……… 34

3.2.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ……… … 34

3.2.1.3 Ảnh hưởng của thời gian khuấy……… 36

3.2.1.4 Ảnh hưởng của chế độ khuấy……….……… 36

3.2.1.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi và sinh khối……….36

3.2.1.6 Ảnh hưởng của số lần trích ly……… ……37

3.2.1.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy sinh khối……….37

3.2.1.8 Ảnh hưởng của độ ẩm sinh khối……… 38

3.2.2 Thành phần và hàm lượng axít béo có trong lipit tổng số …… ….40

3.3 Tối ưu điều kiện thủy phân dầu thô tảo bằng phương pháp hóa học….41 3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaOH trong phản ứng xà phòng hóa……….……… 41

3.3.2 Các tính chất của hỗn hợp axit béo tự do………… ……… 42

3.3.3 Thành phần axit béo của hỗn hợp axit béo tự do thu được sau phản

ứng thủy phân dầu tảo thô……… ……… …43

3.4 Tối ưu quá trình làm giàu hỗn hợp axít béo omega-3 và omega-6 từ hỗn hợp FFA……… …46

3.4.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp FFA: urê lên hiệu suất tạo phức à hiệu suất tách PUFAs……… 46

3.4.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ urê:cồn lên hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFAs……… 47

3.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ kết tinh lên hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFAs……… 48

3.5 Thành phần axít béo của hỗn hợp axit béo omega 3 và omega 6 thu được từ dầu thô của chủng PQ6……… ………49

3.6 Bước đầu kiểm tra chất lượng của dầu sinh học giàu axit béo omega-3 và omega-6 thu được sau quá trình làm giàu……….… … ….51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……….……… 55

KẾT LUẬN……… 55

KIẾN NGHỊ……….………56

TÀI LIỆU THAM KHẢO……….….57

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

(axit béo không bão hòa đa nối đôi)

(axit béo không bão hòa một nối đôi)

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Hàm lượng các axít béo omega-3 và omega-6 có trong một số loại

Bảng 1.3 Một số sản phẩm thương mại có chứa EPA và DHA có nguồn gốc từ

Bảng 3.3 Một số tính chất của dầu tảo sau phản ứng thủy phân bằng phương

Bảng 3.4 Thành phần axit béo của hỗn hợp FFA thu nhận được sau phản ứng

Bảng 3.5 Thành phần axít béo của hỗn hợp axit béo omega 3 và omega 6 thu

Bảng 3.6 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa lý của sản phẩm dầu sinh học giàu

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.2 Sơ đồ tách chiết PUFA từ vi tảo và lợi ích của nó đối với con

Hình 3.3 Ảnh minh họa quá trình tách lipit từ SKK chủng PQ6 đạt hiệu

Hình 3.6 Sắc ký đồ axít béo có trong hỗn hợp FFA sau phản ứng thủy

Hình 3.7 Quá trình thích hợp cho thủy phân dầu tảo thô trong điều kiện

khác nhau

MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển mạnh mẽ về kinh tế, đời sống con người ngày càng được cải thiện và nâng cao Con người luôn tìm kiếm nguồn dinh dưỡng ―sạch‖ để cung cấp cho cơ thể Protein, glucid, lipit, vitamin và khoáng chất là những nhóm chất dinh dưỡng cần thiết đối với con người Những thập niên gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện ra tầm quan trọng của axit béo không bão hòa đa nối đôi omega-3 như axit eicosapentaenoic (EPA); axít docosahexaenoic (DHA); docosapentaenoic (DPA) và omega-6 (axít arachidonic (ARA) đối với sức khỏe con người Cơ thể người và động vật bậc cao thiếu các enzym cần thiết để tổng hợp được cả 2 loại axit béo nêu trên, nên phải bổ sung vào cơ thể bằng đường thực phẩm Vì vậy, một vấn đề đặt ra cần tìm các nguồn giàu 2 loại axit béo này, tách chiết, tinh sạch và bổ sung vào nguồn thực phẩm cung cấp cho con người

Việt Nam có chiều dài bờ biển hơn 3000 km, và đang sở hữu một khu hệ động thực vật biển rất đa dạng và giàu các hợp chất tự nhiên có thể sử dụng trong công nghiệp, thực phẩm, nông nghiệp, y dược trong đó có vi tảo Nhiều loài vi tảo biển (VTB) có chứa hàm lượng protein, lipit, carbohydrates rất cao, đặc biệt trong sinh khối tảo còn có chứa một số chất có đặc tính sinh học như EPA, DHA, DPA Ngoài ra vi tảo cũng rất giàu các vitamin A, B, C, chất khoáng đa và vi lượng cũng như các chất có hoạt tính sinh học như các chất chống oxy hóa, kháng u, chống ung thư, chất kháng viêm, kháng sinh… Chính vì vậy, việc nuôi cấy các loài VTB được các nhà khoa học trên thế giới cũng như ở Việt Nam quan tâm đầu tư từ nhiều năm gần đây VTB được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau: khai thác các chất có hoạt tính; để xử lý môi trường; làm phân bón; nhiên liệu sinh học và được ứng dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản (NTTS) trên các đối tượng truyền thống như

Nannochloropsis, Isochrysis, Chaetoceros Tuy nhiên, việc nuôi trồng VTB quang

tự dưỡng có chi phí cao làm cho giá thành sản xuất các sản phẩm đi từ sinh khối tảo

có giá thành đắt, gây hạn chế cho việc thương mại hóa trên quy mô lớn Để khắc phục những nhược điểm nêu trên, việc tìm kiếm, khai thác và ứng dụng các loài

VTB dị dưỡng trong đó có chi Schizochytrium đang thu hút nhiều sự quan tâm

nghiên cứu cả trong và ngoài nước nhưng vẫn còn rất mới mẻ và hứa hẹn sẽ mang đến nhiều lợi ích thực tiễn cho đời sống con người

Loài VTB dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 đóng vai trò là những

sinh vật phân huỷ, mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn ở những hệ sinh thái biển Loại vi tảo này có khả năng tích lũy hàm lượng lipit cao, có thể lên tới 70% sinh khối khô (SKK) và các axít béo không bão hòa đa nối đôi nhóm omega-3 (-3 PUFA) như EPA (C20: 5-3), DHA (C22: 6-3) chiếm 30-50% so với axit béo tổng số (Total fatty acids - TFA) Vai trò của các -3 PUFA nêu trên đã được chứng minh ở nhiều khía cạnh như sự phát triển toàn diện của trẻ nhỏ, sức khỏe đối với hệ tim mạch, hệ thần kinh, và trong nhiều liệu pháp điều trị các bệnh ung thư, mất trí nhớ, trầm cảm

Hiện nay, loài VTB dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 được coi là

một trong các ứng cử viên tiềm năng thay thế nguồn sản xuất -3 PUFA truyền thống từ dầu cá Để có thể tách chiết được dầu sinh học giàu omega-3 và omega-6

từ VTB có 3 giai đoạn cần phải tiến hành nghiên cứu như: tách chiết lipit tổng số (dầu thô) từ sinh khối tảo; tách chiết axit béo tự do (Free fatty acids -FFA) từ dầu thô; tách chiết và làm giàu axit béo omega-3 và omega-6 từ hỗn hợp FFA sao cho

có hiệu xuất cao, đơn giản và dễ thực hiện và có giá thành thấp trong điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam Do vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài nghiên cứu

“Tối ƣu hóa điều kiện tách chiết và làm giàu axit béo omega-3 và omega-6 từ

sinh khối vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 của Việt Nam”

Trong nghiên cứu này chúng tôi bước đầu tìm ra các điều kiện thích hợp (hệ dung môi, thời gian, chế độ khuấy, nhiệt độ phản ứng, nồng độ và tỉ lệ của các chất tham gia phản ứng…) cho từng giai đoạn của quá trình tách chiết và làm giàu axit béo omega-3 và omega-6 Các kết quả nghiên cứu của đề tài nêu trên là một phần trong

hướng nghiên cứu của đề tài: ―Nghiên cứu quy trình tách chiết dầu sinh học giàu axít béo omega-3 và omega-6 (EPA, DHA, DPA) từ sinh khối vi tảo biển dị dƣỡng” của Bộ Công Thương thuộc Đề án Phát triển và ứng dụng công nghệ sinh

học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến cho đến năm 2020 cho Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trong tự nhiên, vi tảo là thành phần cơ bản của chuỗi thức ăn của thuỷ vực Với hàm lượng protein, cacbonhydrate, lipit, PUFAs và các sắc tố (carotenoit, astaxanthin)… tương đối cao trong cơ thể nên vi tảo từ lâu đã trở thành nguồn thức

ăn quan trọng cho con người và động vật nuôi

Vài ba thập kỷ trở lại đây, công nghệ sinh học vi tảo với những bước tiến bộ đáng kể, đang dần mở ra nhiều lĩnh vực nghiên cứu mới Mặc dù đang trong giai đoạn đầu nhưng nó được coi là ngành công nghiệp mang lại hàng tỉ đô la hàng năm Những ứng dụng của công nghệ sinh học vi tảo có thể đơn giản bắt đầu từ việc sử dụng sinh khối tảo cho đến việc khai thác các chất có hoạt tính sinh học như chất chống oxi hoá, kháng vi rút, chất chống viêm, các chất kháng sinh và chất chống

ung thư…

Hiện nay, khi nhu cầu cuộc sống cũng như những đòi hỏi cao hơn về giá trị dinh dưỡng thì con người không chỉ sử dụng các loại dầu ăn thông dụng mà còn cả các loại dầu có giá trị cao như dầu salad, dầu cá hồi… để phục vụ cho món ăn cao cấp, nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm chức năng, dược phẩm Dầu sinh học giàu PUFAs nhóm omega-3 và omega-6 được sản xuất từ một số loài vi tảo đang thu hút được sự quan tâm nghiên cứu và dần có một vị trí đáng kể, không ngừng được mở rộng và phát triển mạnh mẽ trong thị trường thực phẩm chức năng, dược phẩm trên thế giới cũng như ở Việt Nam

1.1 Giới thiệu về PUFA

Công thức tổng quát của axit béo: CH3 - (CH2)n - COOH

Số nguyên tử carbon trong axít béo thường là chẵn (14-22C) Các axít béo thường gặp có số carbon từ 16-18 PUFAs là các axít béo mạch dài (18 - 22 nguyên

tử cacbon) có chứa hai hoặc nhiều hơn các liên kết đôi Mạch hydrocarbon có 2 đầu: một đầu là nhóm methyl và một đầu là nhóm cacboxyl Chúng được phân loại theo

vị trí của liên kết đôi đầu tiên tính từ gốc methyl hay gốc cacboxyl Để chỉ vị trí nối đôi đầu tiên trên mạch cacbon được tính từ đầu methyl người ta có thể sử dụng ký hiệu ―n‖ hoặc ―ω‖ Các liên kết đôi trong PUFA cũng có thể được tính từ gốc

carboxyl và được ký hiệu ―Δ‖ Những nhóm ω-3, ω-6 hay ω-9 PUFA có liên kết đôi đầu tiên tương ứng tại vị trí cacbon số 3, 6 hay 9

Có hai nhóm axít béo không thay thế quan trọng là omega-3 và omega-6 [50] Các axít béo omega-3 quan trọng nhất là:

+/ Axít α-linolenic (ALA);

+/ Axít eicosapentaenoic (EPA);

+/ Axít docosahexaenoic (DHA);

+/ Axít docosapentaenoic (DPA)

Các axít béo chính trong họ omega-6 là:

+/ Axít linoleic (AL);

+/ Axít gama linoleic (AGL);

+/ Axít eicosadienoic;

+/ A xít dihomo-gamma-linoleic (DGLA);

+/ Axít arachidonic (ARA);

+/ Axít docosapentaenoic (DPA)

1.2 Vai trò và ứng dụng của PUFA

Hiện nay, PUFAs như ALA (18: 3ω-3), EPA (20: 5ω-3) và DHA (22: 6ω-3) đang được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất bởi chúng có ảnh hưởng tích cực đến sức khỏe con người và động vật

1.2.1 Vai trò của PUFAs đối với sức khoẻ con người

PUFAs là thành phần quan trọng của sinh vật nhân chuẩn bậc cao Các PUFA này có ba vai trò sinh học chủ yếu Đầu tiên phải kể tới việc tham gia vào sự điều hòa quá trình trao đổi lipit, vận chuyển và hướng tới các mô Ví dụ, các hoạt động bao gồm sự ức chế quá trình sinh tổng hợp triacylglycerol (TAG) ở gan bởi

thành tế bào Sự có mặt của chúng trong thành phần phospholipit góp phần tạo nên tính linh động của màng Điều này góp phần quan trọng trong việc điều chỉnh hoạt động của các protein màng Màng phospholipit cũng là nguồn các phân tử thông tin thứ hai như diacylglycerol, phosphatidic, inositol–1, 4, 5- trisphosphate, ceramide

và axít ARA - những phân tử chịu trách nhiệm cho các hoạt động tín hiệu của màng

tới vùng nguyên sinh chất và nhân để điều chỉnh các phản ứng đáp lại tương ứng;

và các phân tử tín hiệu ngoại bào như yếu tố hoạt hoá tiểu cầu [15]

PUFA tiếp tục chuyển hóa trong cơ thể bằng cách bổ sung các nguyên tử cacbon và giảm độ bão hòa (chiết xuất hydro) Động vật có vú chỉ có khả năng loại

bỏ hydro từ các nguyên tử carbon có chứa liên kết đôi và nhóm carboxyl (hình 1) Quá trình oxy hóa các axit béo có thể diễn ra trong ty thể hoặc peroxisome [66]

PUFAs có nhiều vai trò và lợi ích đặc biệt quan trọng cho cơ thể, trong đó nhiều lợi ích đã được chứng minh và được công nhận Một số các lợi ích đó như sau: Cải thiện hiệu quả bệnh tim mạch; giảm nguy cơ loạn nhịp tim (có thể dẫn tới đột tử); Có hiệu quả rõ rệt trong điều trị suy nhược; giảm nguy cơ hình thành khối u tuyến tiền liệt (có thể dẩn đến đau tim và đột quỵ); Giảm chất béo trung tính và mức

độ lipoprotein còn lại; làm chậm tốc độ tăng trưởng của mảng xơ vữa động mạch;

Axit béo-6 EnZyme Axit béo -3

thành phần quan trọng cấu tạo nên tế bào não, đặc biệt đối với trẻ nhỏ từ 0-2 tuổi [59] Cơ thể trẻ không thể tổng hợp DHA đủ nhanh để đáp ứng cho sự phát triển nhanh của não và võng mạc Cho nên, chúng phải thu nhận những hợp chất này từ chế độ ăn [21] Do đó, khẩu phần dinh dưỡng có vai trò quan trọng trong việc đảm bảo đầy đủ PUFA cho trẻ nhỏ Tuy nhiên, trong khẩu phần ăn, nếu tỷ lệ nhóm axit béo ω-6 quá cao so với nhóm axit béo ω-3 (lên đến 10:1) thì không có lợi cho sức khỏe

Axit béo omega-3 cũng đã được điều tra tính hiệu quả trong rất nhiều các nghiên cứu về sức khỏe con người bao gồm các loại ung thư khác nhau bao gồm: đại tràng, vú, và tuyến tiền liệt Nhiều kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy việc

sử dụng các axit béo omega-3 để cải thiện tình trạng bệnh tiểu đường hoặc để điều trị về rối loạn nhận thức ở trẻ em Axit béo này cũng có ảnh hưởng quan trọng theo hướng tích cực đến hoạt động hệ thống thần kinh trung ương, cần thiết cho sự phát triển chức năng não bộ và thị giác ở trẻ nhỏ, não bộ không thể duy trì hoạt động nếu như không có những axit béo quan trọng này [59]

Mức độ thu nhận DHA hàng ngày được khuyến cáo là 120 mg/ngày đối với nam giới và 100 mg/ngày đối với phụ nữ và người cao tuổi Tuy nhiên ở các nước phương Tây, hàm lượng axit béo omega - 3 trong khẩu phần ăn vẫn không đầy đủ

Để ngăn ngừa các loại bệnh khác nhau mà chủ yếu là các bệnh tim mạch và các rối loạn tâm thần thì hàm lượng axit béo omega - 3 thích hợp trong khẩu phần ăn là hết sức cần thiết Một phương pháp để đảm bảo hàm lượng axit béo omega - 3 trong khẩu phần ăn là làm tăng hàm lượng các axit béo này trong các sản phẩm thức ăn như thịt, bơ, sữa, pho mát, trứng… [12] Để bảo đảm khẩu phần thức ăn hợp lý, có ảnh hưởng tốt cho sức khỏe con người thì cần thiết phải tăng hàm lượng ω-3 PUFA

và giảm ω-6 PUFA Quỹ tài trợ Dinh dưỡng của Anh đã đưa ra khuyến cáo tỷ lệ giữa ω-6 và ω-3 PUFA nên nằm giữa 5:1 và 3:1 [13]

1.2.2 Vai trò của PUFAs đối với nuôi trồng thủy sản

Để có thể được sử dụng trong NTTS, các loài vi tảo phải đáp ứng nhiều điều kiện như dễ dàng nuôi cấy, không độc, có kích thước vừa với miệng của đối tượng nuôi, dễ tiêu hóa và có hàm lượng dinh dưỡng cao Hàm lượng protein là một yếu tố chính để xác định giá trị dinh dưỡng của vi tảo Song bên cạnh đó, PUFAs như axit

EPA, ARA, và DHA cũng là thành phần rất quan trọng bởi nó cần thiết cho sự phát triển và biến thái của ấu trùng [8, 10].

Tuy nhiên, cần chú ý là tỷ lệ giữa DHA, EPA và ARA có thể còn quan trọng hơn rất nhiều so với hàm lượng của chúng Hàm lượng vitamin có trong vi tảo cũng

có một vai trò quan trọng Để cung cấp đủ dinh dưỡng một cách cân bằng và cải thiện được sự phát triển của động vật nuôi, rất nhiều công bố khoa học đã khuyên cáo nên sử dụng hỗn hợp các loài Điều này sẽ mang tới một thành phần dinh dưỡng thức ăn cho kết quả tốt hơn so với chế độ ăn chỉ có một loài [41]

Trong một số nghiên cứu về làm giàu luân trùng Brachionus plicatilis và được sử dụng làm thức ăn cho ấu trùng Artemia salina trong trại sản xuất giống thủy sản ở Ai Cập đã cho thấy khi sử dụng tảo Tetraselmis chuii có các PUFAs với

hàm lượng ARA đạt 5,5% ; EPA - 4,8% và DHA - 5,0% so với TFA đã làm tăng tốc độ sinh trưởng và khả năng sống sót, nâng cao giá trị dinh dưỡng của luân trùng

Do đó đã làm tăng khả năng sống sót và giúp cho ấu trùng nuôi phát triển tốt nhất [44]

1.3 Nguồn cung cấp PUFA

1.3.1 Nguồn gốc từ thực vật

Các loại dầu từ thực vật chỉ chứa các axít béo không bão hòa có mạch cácbon ≤18 Trong đó các loại dầu thực vật như dầu lanh, dầu đậu nành, dầu cải… chứa PUFA ω-3 chủ yếu là axít ALA (18:3 ω-3) và các loại dầu khác như dầu bắp, dầu hạt bông vải, dầu nho…lại chứa chủ yếu là các PUFA ω-6 (18:2 ω-6) như trong nghiên cứu của Tsamouris và cộng sự (2002) [75] được thể hiện ở bảng 1.1

Ngoài ra còn một số nghiên cứu khác trên hạt tía tô cho thấy dầu hạt tía tô có chứa các PUFAs với tỷ lệ cao bao gồm chủ yếu là ω-3 α-linolenic (C18: 3), ω-6 linoleic (C18: 2) và ω-9 oleic (C18: 1) axit [60] Hàm lượng lipit tổng số đạt 33,25-42,58% SKK, trong đó, axit ω-3 α-linolenic chiếm 52,58-61,98% và axit ω-6 linoleic chiếm 10,54-15,87% Tỷ lệ axit béo ω-6/ω-3 là thấp 0,2-0,26 trong hạt tía tô của Trung Quốc đã được công bố [24]

Bảng 1.1 Hàm lƣợng các axít béo omega-3 và omega-6 có trong một số loại dầu

thực vật [75]

TFA có trong dầu thực vật)

Một số các axit béo omega-3 cần thiết cho sức khỏe con người có nguồn gốc

từ các loại cá biển như công bố của Patterson năm 2008 trên các đối tượng cá ngừ,

cá hồi, cá thu, cá mòi và cá trích ở biển sâu có hàm lượng EPA và DHA cao trong dầu cá được thể hiện trong bảng 1.2 [59]

Bảng 1.2 Hàm lƣợng DHA và EPA của một số loại cá [59]

(ALA, 18:03 ω-3) là 15,86%; 1,38 % và 0,85%, tương ứng

Trong 10 năm trở lại đây, nhu cầu PUFAs ω-3 ngày càng tăng do sự gia tăng

sử dụng chúng trong NTTS, làm thực phẩm chức năng và dược phẩm Do vậy, những nguồn nguyên liệu chính không đáp ứng đủ cho việc mở rộng kinh doanh sản xuất Để đáp ứng nhu cầu cao và hạn chế những nhược điểm của dầu cá, việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu mới cho sản xuất PUFA hiện nay đang được quan tâm nghiên cứu và phát triển [81] trong đó khai thác những nguồn PUFA từ VSV [23]

để bảo đảm bảo các nguồn PUFA ω-3 sản xuất đã được chấp nhận rộng rãi

1.3.3 Nguồn gốc từ vi tảo

Cá và dầu cá là nguồn chủ yếu cung cấp PUFAs nhưng những vấn đề về an toàn đang được đặt ra bởi khả năng tích lũy các PCBs hoặc dioxin, kim loại nặng Hơn thế nữa ứng dụng của dầu cá ở dạng thực phẩm bổ sung bị giới hạn bởi những vấn đề liên quan tới mùi vị khó chịu, tính kém ổn định về mặt oxi hóa Đối với những ứng dụng nhất định, dầu cá lại không phù hợp vì sự hiện diện của hỗn hợp nhiều loại axit béo Vì PUFAs được tìm thấy trong cá ăn vi tảo ở đại dương nên theo một cách logic vi tảo được coi là nguồn tiềm năng để sản xuất PUFAs

VTB có thể là nguồn cung cấp ω-3 PUFA với một số ưu điểm như sau: nuôi

cấy VTB dị dưỡng một cách dễ dàng trong các hệ thống lên men nên có thể sản

xuất dầu quanh năm, không phụ thuộc vào mùa vụ, nhiệt độ vì không sử dụng ánh

sáng mặt trời, có thể kiểm soát tốt mọi thông số cần thiết trong suốt quá trình nuôi

cấy, hàm lượng axit béo đơn giản và tốc độ tăng trưởng cao hơn; còn nuôi trồng

VTB quang tự dưỡng trong các hệ thống bể hở có thể sử dụng đất phi nông nghiệp

và nguồn nước thải không phù hợp cho sản xuất nông nghiệp [14]

Vi tảo cung cấp một nguồn tài nguyên không ô nhiễm đầy hứa hẹn cho công nghệ sinh học và công nghệ sinh học sản xuất LC-PUFA (long chain – PUFAs) (hình 2) để thay thế cho các loại dầu cá truyền thống [46]

Theo những nghiên cứu gần đây về tách chiết lipit tổng số của vi tảo cho thấy Bacillariophyceae (tảo silic) và các loài Chrysophyceae có thể là nguồn phong phú cung cấp EPA và DHA; Cryptophyceae, Prasinophyceae, Rhodophyceae, Xanthophyceae, Glaucophyceae và Eustigmatophyceae - chủ yếu cung cấp EPA, trong khi DHA được tìm thấy một lượng đáng kể chủ yếu là trong Dinophyceae, Prymnesiophyceae, và Euglenophyceae [39, 48]

Sự phát triển của quá trình thương mại để sản xuất dầu vi tảo, đặc biệt là các loại dầu giàu DHA đã thu được từ một số sinh vật có thể tích lũy hàm lượng lipit

cao trong sinh khối (lên đến 50% SKK), trong đó có 30% -70% DHA [78] Hướng

nghiên cứu nêu trên đã được mở rộng đáng kể trong những năm gần đây với các sản

Tách chiết

Chất kháng viêm Chất kháng sinh Giảm ung thư Giảm rối loạn nhịp tim Giảm khối huyết

Giảm xơ vữa động mạch

phẩm rất đa dạng, đặc biệt là các sản phẩm từ dầu tảo có hàm lượng EPA và DHA cao được thể hiện ở bảng 1.3

Bảng 1.3 Một số sản phẩm thương mại có chứa EPA và DHA có nguồn gốc từ

vi tảo [51]

dầu thương mại)

DHA™

cohnii Javornicky

Lên men dị dưỡng DSM-NP life’s DHA

dưỡng Source-Omega

Source Oil™

Goldstein and Belsky

Lên men dị dưỡng GCI Nutrients DHA

Algae 35% Oil

cohnii Javornicky

Lên men dị dưỡng

1.4 Các nghiên cứu về PUFA từ vi tảo biển

1.4.1 Con đường tổng hợp PUFA trong vi tảo

LC-PUFA sinh tổng hợp từ các axit béo C18, AL và axit ALA bằng con đường kéo dài chuỗi và khử bão hòa là phổ biến ở vi tảo Đây thường là con đường ω-6 và ω-3 bao gồm một bước khử bão hòa bởi Δ6-desaturase, một bước kéo dài và khử bão hòa hơn nữa bằng Δ5-desaturase, tạo ra AA và EPA (hình 1.3) Như nhận xét của Khozin-Goldberg và các cộng sự (2011) [46], trong một số loài, có thể lựa chọn một trong hai con đường sinh tổng hợp AA và EPA, bao gồm quá trình kéo dài của các tiền chất C18, tiếp theo là khử bão hòa của Δ8 và Δ5-desaturase hoặc thông qua các con đường tổng hợp polyketide (PKS) kỵ khí như đã được đưa ra giả thuyết cho thraustochytrids [55]

Trong vi tảo, DHA thu được thông qua EPA kéo dài thành axit DPA và tiếp theo khử độ bão hòa bằng Δ4-desaturase - đây là con đường tổng hợp DHA trong

thraustochytrids, được biết đến với khả năng tích lũy một lượng PUFA quan trọng

của chúng [55, 61, 67, 68] Không giống như động vật có vú, tảo rất ít khi tích lũy axit AA ở mức độ cao do sự có mặt khử độ bão hòa của ω-3/Δ17 trong mạng lưới nội chất của các tế bào chuyển đổi AA thành EPA [19, 33, 46, 73]

Một số loài vi tảo có chứa hàm lượng lipit ít nhất 20% SKK, và đạt tối đa 70% SKK, trong đó TAG chiếm trên 90% so với TFA [39, 79] Một số loài có thể

có hàm lượng cao LC-PUFA như DHA trong Thraustochytrium aureum Goldstein [40], AA và EPA trong tảo đỏ Porphyridium cruentum Nägeli [20] Điều kiện nuôi

cấy các chủng sử dụng và giai đoạn tăng trưởng là yếu tố quyết định quan trọng cho

Hình 1.3 Con đường tổng hợp PUFA trong vi tảo Thraustochytrids và

Coccolithophores [19, 33, 46, 73]

quá trình sản xuất LC-PUFA Tonon và cộng sự (2002) [74], đã mô tả ảnh hưởng của các giai đoạn phát triển lên tích lũy EPA và DHA trong TAG của một số loài vi

tảo Họ tìm thấy tỷ lệ phần trăm EPA cao hơn trong TAG ở Nannochloropsis

oculata Hibberd, và sự có mặt của cả EPA và DHA trong TAG của Thalassiosira pseudonana Hasle và Heimdal, tảo lục Pavlova lutheri trong các giai đoạn phát

triển ổn định Để tăng việc sử dụng vi tảo cho sản xuất thương mại của các loại dầu giàu LC-PUFA, các nghiên cứu gần đây đang hướng đến việc sàng lọc và lựa chọn các loài vi tảo có dầu với khả năng tích lũy LC-PUFA trong TAG cao, điều này sẽ

cho phép tiết kiệm chi phí sản xuất cũng như tách chiết lipit

1.4.2 PUFAs từ các VTB quang tự dƣỡng

VTB quang tự dưỡng thường được sử dụng làm giàu thức ăn sống (ví dụ luân trùng) trong các ngành công nghiệp NTTS do có hàm lượng dinh dưỡng cao Trong

đó, với nhiều công trình công bố đã đưa ra hàm lượng PUFAs khác nhau trong một

số loài tảo quang tự dưỡng Nannochloropsis oculata, Phaeodactylum sp., Nitzschia

sp và Porphyridium sp có chứa hàm lượng (%) EPA cao trong TFA lần lượt là

38-39% [18], 40-57% [26], 25-33% [16], 41% [45] Trong khi đó, EPA của Odontella

aurita Agardh - 26% so với TFA [31], Pavlova lutheri Green là 22-29% so với

TFA [30], Cyclotella cryptica Lewin và Guillard - 17-23% so với TFA [58],

Cylindrotheca sp Rabenhorst - 24-25% so với TFA [72]

Trong một báo cáo gần đây, hàm lượng EPA trong Nannochloropsis khoảng

11 -39% so với TFA [36], hàm lượng này có sự khác nhau chủ yếu phụ thuộc vào

điều kiện nuôi cấy [29] Tích lũy EPA trong Nannochloropsis thích hợp khi độ mặn thấp [38] Trong thực tế, chi Nannochloropsis là nguồn tiềm năng cho sản xuất các

loại dầu trên thị trường do tiềm năng sản xuất chất béo EPA cao và hàm lượng DHA và AA rất thấp, đó là thuận lợi cho việc sản xuất các sản phẩm thương mại

Một nghiên cứu khác trên tảo silic Phaeodactylum tricornutum Bohlin cho

thấy chúng có hàm lượng EPA trong tảo cao hơn đạt 40-57% so với TFA [26], trên

tảo đỏ Porphyridium cruentum có EPA là 41% so với TFA [45] Trong TFA tảo

silic Odontella aurita Agardh, có thể chứa khoảng 26% EPA, hiện đang được chấp

thuận sử dụng như một thực phẩm bổ sung có mặt trên thi trường [34]

Nhiều nghiên cứu về tối ưu hóa sản xuất EPA và lipit đã được tiến hành ở mật độ tế bào tương đối thấp, trái ngược với những điều cần thiết để hỗ trợ sản xuất kinh tế Như đã đề cập trước đây, nuôi cấy hàng loạt của các loài tảo quang tự dưỡng trong các hệ thống bể hở có chi phí tương đối thấp so với các nuôi cấy trong các bể phản ứng quang sinh Tuy nhiên, tốc độ tăng trưởng cụ thể trong các hệ thống bể hở lại tương đối thấp, thu hoạch có thể tốn kém, và những rủi ro của biến động độ mặn và ô nhiễm có thể dẫn đến làm giảm chất lượng và số lượng của sản phẩm cuối cùng Nhìn chung, ứng dụng của các loài VTB quang hợp tự dưỡng để sản xuất thương mại của các loại dầu đòi hỏi những tiến bộ trong nghiên cứu kỹ thuật sinh lý và di truyền để nâng cao tốc độ tăng trưởng và tích lũy chất béo, tối ưu hóa các thành phần axit béo, cải tiến công nghệ sinh học liên quan đến phản ứng sáng trong quang hợp; giảm ô nhiễm, và giảm các chi phí liên quan đến việc sản xuất sinh khối và thu hoạch

1.4.3 PUFAs từ các vi tảo biển dị dƣỡng

Một số VTB dị dưỡng được coi là nguồn cung cấp DHA rất tốt Chúng bao

gồm thraustochytrids từ các chi Thraustochytrium Sparrow và Schizochytrium Goldstein và Belsky, và tảo Crypthecodinium cohnii Javornicky Các loài này đại

diện cung cấp các loại dầu giàu DHA ưu việt nhất cho các ngành công nghiệp, chúng được sử dụng trong thực phẩm, đặc biệt là trong sữa bột công thức cho trẻ sơ

sinh (Raghukumar, 2008), kể từ khi chúng được xem là nguồn không gây bệnh và

không gây độc [25]

Theo nghiên cứu của Ward và Singh đã cho thấy Schizochytrium sp có một

số đặc điểm thuận lợi cho sản xuất thương mại bao gồm hàm lượng lipit cao, sức sản xuất DHA cao, tăng trưởng tốt trong nuôi cấy với mật độ tế bào cao Một số

chủng Schizochytrium nhất định có thể cung cấp DHA cao đạt 94% tổng số axit béo ω-3 [78] Nakahara và cộng sự (1996) [56] đã kết luận rằng trong Schizochytrium

sp hàm lượng lipit chiếm 50% SKK, và DHA chiếm 57% của các TAG, chiếm 34%

so với TFA Trong tảo Crypthecodinium cohnii hàm lượng DHA lên đến 63% so

với TFA khi nuôi cấy trong môi trường có sử dụng carbon dạng bột xi-rô và cao nấm men như nguồn cacbon và nitơ, tương ứng [54] Theo nghiên cứu của Huang

và cộng sự (2001) [37], đã cho thấy Thraustochytrium sp có chứa 52% DHA so với

TFA, tổng các axit béo mạch dài như DHA, AA, EPA, ω-6 DPA chiếm 76% so với TFA

Tảo Crypthecodinium cohnii đã được sử dụng trong sản xuất thương mại dầu

giàu DHA, đặc biệt để đưa vào sữa bột công thức cho trẻ sơ sinh do hàm lượng EPA thấp, mà ở mức độ cao có thể gây ra chảy máu trong ở cả trẻ sơ sinh và phụ nữ cho con bú [78]

Dưới điều kiện lên men, sản xuất sinh khối, thành phần lipit và năng suất DHA thường bị ảnh hưởng bởi thành phần môi trường nuôi cấy và các yếu tố khác như nhiệt độ và độ mặn [71] Tuy nhiên, việc sử dụng phương thức lên men để nuôi trồng đã cho phép kiểm soát chặt chẽ hơn các thông số, không cần ánh sáng, cho phép sản xuất các loại dầu thương mại chất lượng cao và đảm bảo có thể đưa ra thị

trường hơn so với các quá trình nuôi tảo quang tự dưỡng [65]

1.5 Vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium

1.5.1 Giới thiệu chung về tảo di dƣỡng Schizochytrium

1.5.1.1 Vị trí phân loại

Theo khoá phân loại của Porter (1990) [62], giới Chromista (còn được gọi là

Stramenopilia) gồm tảo vàng, tảo khuê, tảo lục, Haptophyte, Cryptophyte, Oomycetes, Thraustochytrids Schizochytrium là một chi thuộc họ Thraustochytrid Các tế bào Schizochytrium có dạng hình cầu, có mạng lưới ngoại chất xuất phát từ

bề mặt tế bào

Giới: Chromista (Stramenopilia)

Ngành: Heterokontta

Lớp: Labyrinthulea Bộ: Thraustochytriales

Họ: Thraustochytridae (thraustochytrid)

Chi: Schizochytrium

1.5.1.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc của Schizochytrium mangrovei

Schizochytrium là VTB dị dưỡng, có thể phân lập từ rất nhiều vùng sinh thái

khác nhau: ở các vùng cửa sông, các nơi lắng đọng gồm cả đáy biển sâu và vùng biển trên khắp thế giới Chúng thường tập trung nhiều trên các xác của thực vật bản

sinh vật phân hủy nhờ tác dụng của việc sản xuất ra các enzym ngoại bào và sự biến

đổi hóa học của các mảnh vụn Các thử nghiệm với Schizochytrium mangrovei trên

mảnh vụn lá cây đước cho thấy rằng loài này sản xuất ra enzym xenluloza, amylaza, xylanaza, proteaza và pectinaza [63]

Schizochytrium là những sinh vật có cấu trúc tản (thalli) đơn tâm [43] Chúng

có những đặc điểm đặc trưng như: ty thể có dạng hình lược ống và sản sinh ra động bào tử có 2 lông roi phía trước Thành tế bào có chứa sulphate polyxacarit mà chủ yếu là galactose hoặc fructose và protein [17]

1.5.1.3 Sản xuất DHA và PUFAs từ vi tảo Schizochytrium khác

Một số loài thuộc chi Thraustochytrium (Labyrinturomycota) có hàm lượng cao DHA, cũng như có hàm lượng thấp các axit béo không bão hòa đa nối đôi có cấu trúc tương tự như DHA và hi vọng sẽ là nguồn sản xuất DHA tiềm năng [83] Hơn nữa, các loài vi tảo thích hợp chỉ chứa một PUFA cụ thể, chứ không phải là một hỗn hợp của các PUFA Sự phát triển của quá trình sản xuất PUFA đòi hỏi việc lựa chọn các chủng thích hợp và kỹ thuật nuôi cấy tối ưu Năm 1997, theo công trình công bố của Yaguchi và cộng sự, (1997) [80] hàm lượng TFA khi nuôi cấy

theo mẻ Schizochytrium sp đạt ít nhất 45% SKK Theo công bố của Yokochi và cộng sự (1998) [82], hàm lượng DHA trong VTB dị dưỡng Schizochytrium sp đạt

30-40% so với TFA Khi nuôi cấy liên tục Schizochytrium G13/2S hàm lượng TFA

đạt 35% SKK; tỷ lệ của các axit béo chính (%TFA) là: axit myristic (14:00) 5-7%, acid palmitic (16:00) 32-33%, axit stearic (18:00) 2%, axit DHA (22:5 ω-6) 10-12%

và DHA (22:6 ω-3) 43-47% [27] Theo báo cáo tổng hợp của Jasuja và cộng sự năm (2010) [42], cho thấy một số chủng vi tảo tiềm năng cho sản xuất DHA đã thu được

trong các năm từ 1991 đến 2008 (bảng 1.4) Hiệu suất DHA rất cao đạt từ 0,3 đến

13,3 g/l tùy thuộc vào các chủng khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau được thể hiện ở bảng 1.4

Bảng 1.4 Sinh khối, lipit và hàm lượng DHA trong thraustochytrids khác

Thraustochytrium aureum ATCC 34304 4,9 20,3 51,0 0,5

từ hỗn hợp FFA Do đó, để thu được hiệu suất tách chiết dầu sinh học giàu axit béo omega-3 và omega-6 cao thì hiệu suất tách chiết ở mỗi giai đoạn trên phải hiệu quả cao Chính vì vậy, các yếu tố ảnh hưởng đến từng giai đoạn cũng chính là các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất dầu Sản xuất dầu bị ảnh hưởng bởi các yếu tố sau:

1.6.1 Các phương pháp tách chiết và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết lipit tổng số (dầu thô) từ sinh khối tảo

Có nhiều phương pháp tách chiết dầu khác nhau như:

- Phương pháp ép dầu: Dưới tác động của lực nén cơ học, các phần tử chứa dầu bắt đầu biến dạng Các khoảng trống chứa dầu bị hẹp dần và đến khi lớp dầu dồn lại có chiều dày không đổi thì bắt đầu dầu thoát ra Do vậy, quá trình ép dầu (hiệu suất ép) phụ thuộc vào các yếu tố chính sau:

+/ Loại thiết bị ép: ép thủ công, ép thủy lực hay máy ép vít liên tục

+/ Phương thức ép: ép kiệt 1 lần hay ép kiệt 2 lần

+/ Đặc tính cơ học của nguyên liệu ép như: kích thước hạt, nhiệt độ, độ ẩm, tính dẻo, tính đàn hồi thích hợp cho quá trình thoát dầu

- Phương pháp enzym: Một số enzym được sử dụng để tăng hiệu suất tách dầu

ra khỏi nguyên liệu có dầu như: amylase, glucanase, protease, pectinase Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử lý enzym để tách dầu ra khỏi nguyên liệu như nhiệt độ, pH, tỷ lệ enzym/nguyên liệu, thời gian,

- Phương pháp hóa học: Sử dụng các dung môi hòa tan dầu để tách dầu ra khỏi nguyên liệu

Theo PGS.TS Bùi Quang Thuật [6], nhiệt độ sấy và thời gian sấy có ảnh hưởng đáng kể tới chất lượng sản phẩm sau này Vì vậy, cần xác định thời gian và nhiệt độ sấy thích hợp để tránh gây tổn thất cũng như tránh làm biến đổi các thành phần trong nguyên liệu Để trích ly tốt sản phẩm dầu, cần phải lựa chọn dung môi thích hợp và phương pháp trích ly cũng như cần xác định được các yếu tố công nghệ ảnh hưởng tới quá trình trích ly như nhiệt độ, thời gian, số lần trích ly, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi,

Phương pháp trích ly được phân loại theo nhiều cách:

+ Trích ly tĩnh (ngâm chiết): ngâm nguyên liệu trong dung môi cho tới khi đạt nồng

độ chất hoà tan bão hoà; trong suốt quá trình này, nguyên liệu và dung môi không được đảo trộn

+ Trích ly động: nguyên liệu và dung môi được đảo trộn nhờ cánh khuấy làm tăng

sự tiếp xúc giữa hai pha, để tăng hiệu suất và giảm thời gian trích ly

Vấn đề lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình trích ly một loại nguyên liệu nhất định là công việc cần thiết và hết sức quan trọng Tính chất căn bản và không thể thiếu được của dung môi trích ly là tính chất hoà tan chọn lọc, nghĩa là dung môi phải hoà tan tốt chất cần tách mà không hoà tan hoặc hoà tan rất ít các cấu tử khác không mong muốn [6]

1.6.2 Các phương pháp tách chiết và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết FFA từ dầu thô

Công đoạn thuỷ phân dầu nhằm giải phóng các axít béo ra ở dạng tự do Quá trình thuỷ phân dầu có thể được thực hiện theo phương pháp hoá học hoặc phương pháp enzym

- Thủy phân dầu bằng phương pháp hóa học: Dầu thực vật được xà phòng hoá với dung dịch kiềm trên thiết bị khuấy có gia nhiệt trong khoảng thời gian thích hợp Thêm dung dịch muối vào hỗn hợp xà phòng hoá và các chất không xà phòng hóa được tách ra khỏi hỗn hợp bằng cách lọc hoặc li tâm hoặc chiết ra bằng dung môi n-hexan Phần xà phòng được axít hoá sau đó các axít béo được tách ra bằng dung môi n-hexan Lớp dung môi n-hexan có chứa các axít béo tự do được loại nước bằng muối Na2SO4 và dung môi n-hexan được thu hồi bằng cô quay chân

không

- Thủy phân dầu bằng phương pháp enzym: Cho dầu thực vật và dung dịch đệm photphat vào bình thuỷ tinh Thêm vào enzim lipase cố định Enzym lipase được trộn đều trong dung dịch đệm photphat Đậy bình bằng nắp cao su, bọc

C, trong quá trình ủ ấm phải có khuấy từ Sau 24 giờ thuỷ phân hỗn hợp dịch được lọc tách enzym và chuyển đến phễu chiết

và trích ly triệt để bằng n-hexan Sau đó cô quay dung dịch để thu hồi dung môi Phần tách ra được bảo quản cho đến khi tiến hành tinh chế hỗn hợp axít béo [22]

Thực tế sản xuất cho thấy phương pháp thủy phân dầu thực vật bằng phương pháp hóa học (xà phòng hóa) phù hợp với điều kiện sản xuất hơn và thường được sử dụng nhiều hơn Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp hơn nhiều so với phương pháp thủy phân bằng enzym Hiệu suất thủy phân của phương pháp này vẫn đạt yêu cầu của thực tế sản xuất [47]

1.6.3 Các phương pháp tách chiết và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và làm giàu axit béo omega-3 và omega-6 từ hỗn hợp axit béo tự do

Công đoạn làm giàu hỗn hợp các axít béo omega-3 và omega-6 nhằm tạo sản phẩm có độ tinh khiết cao Hiện tại, công đoạn này được tiến hành theo nhiều phương pháp khác nhau như: tách phân đoạn bằng li tâm phân tử, kết tinh phân

đoạn ở nhiệt độ thấp, chưng cất phân đoạn chân không và tạo phức với urê, nhưng

trong thực tế sản xuất người ta thường sử dụng hai phương pháp chính như sau [76]:

- Phương pháp kết tinh phân đoạn ở nhiệt độ thấp dựa vào sự khác biệt về điểm đông đặc (kết tinh) của các axít béo khi hoà tan trong dung môi phù hợp Phương pháp này thích hợp cho việc tách các axít béo no (saturated fatty acid- SFA) ra khỏi hỗn hợp axít béo không no Tuy nhiên, phương pháp kết tinh phân đoạn ở nhiệt độ thấp không tách được triệt để các SFA cũng như không thể tách được axít béo không no một nối đôi (monounsaturated fatty acids - MUFA) (như axít béo oleic) ra khỏi hỗn hợp axít béo omega-3 và omega-6 Do vậy, hỗn hợp axít béo omega-3 và omega-6 thu được từ phương pháp này có độ tinh sạch không cao (thường chỉ đạt 60-70%)

- Phương pháp tạo phức với urê: Cơ sở của việc sử dụng urê để phân tách SFA

và PUFAs là do các tinh thể urê có cấu trúc tứ giác kín với các rãnh có đường kính 5,67 angtron Khi có mặt các phân tử axit béo không phân nhánh mạch dài, các rãnh của phân tử urê được tạo nên đủ lớn để khớp với chuỗi axit béo và kết tinh trong một cấu trúc lục giác với các rãnh có đường kính 8-12 angtron Sự có mặt của các liên kết đôi trong chuỗi carbon làm tăng kích thước của phân tử và đồng thời lại làm giảm khả năng tạo phức của nó với urê Chính vì vậy, các phân tử SFA hoặc MUFA

có khả năng tạo phức một cách dễ dàng với phân tử urê hơn so với các phân tử axit béo có 2 hoặc 3 nối đôi trở lên Do vậy trong phân đoạn không tạo phức với urê sẽ

chỉ chiếm phần lớn các axit béo không bão hòa có nhiều hơn một nối đôi [53] Đây

là phương pháp đơn giản sử dụng dung môi rẻ tiền (methanol hay ethanol) và chỉ cần thay đổi hàm lượng urê, lượng dung môi sử dụng hay nhiệt độ kết tinh là có thể điều chỉnh được chất lượng sản phẩm tạo thành Dung môi sử dụng trong các phương pháp kết tinh phân đoạn axit béo phải có một số đặc tính nhất định như: phải hòa tan tốt các axit béo, phải có hiệu quả phân tách PUFA tốt và phải không độc hại Đây là phương pháp đơn giản, rẻ tiền và phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Việt Nam Vì vậy, cần phải nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất

và chất lượng sản phẩm tạo thành như: ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp axít béo tự do: urê, tỷ lệ urê: cồn và ảnh hưởng của nhiệt độ kết tinh…

Từ lipit tổng số thu được từ sinh khối tảo khô, tiến hành thủy phân dầu tảo là quá trình nhằm thu được hỗn hợp các FFA Đây là 1 bước trung gian quan trọng để tách các SFA và MUFA ra khỏi hỗn hợp omega-3 và omega-6 Hiện nay, nhiều phương pháp khác nhau có thể áp dụng để làm giàu PUFA từ FFA, trong đó, phương pháp tạo phức với urê được sử dụng nhiều nhất

1.7 Tình hình nghiên cứu PUFA trong nước và trên thế giới

1.7.1 Tình hình nghiên cứu PUFA trên thế giới

Trên thế giới, một vài thập niên gần đây các thực phẩm có chứa các axít béo omega-3 và omega-6 đã được tung ra thị trường bán lẻ rất mạnh và ngày càng được

mở rộng nghiên cứu trên nhiều đối tượng cung cấp dầu giàu các axít béo omega-3

và omega-6 khác nhau

Grima và cộng sự (1995) [28] đã sử dụng phương pháp tạo phức với urê để

cô đặc PUFA từ sinh khối VTB Isochyrysis galbana với tỉ lệ urê: axit béo là 4:1, ở

phân đoạn EPA và DHA đạt độ tinh khiết tương ứng là 96,0 và 94,9%

tinh sạch các axit béo không bão hòa để đạt được cực đại EPA và DHA trong mỡ

cá voi bằng phương pháp cô đặc với việc sử dụng urê Kết quả là các axit béo ω-3 thu được chiếm đến 88,2% so với TFA khi tỉ lệ urê: axit béo là 9:2 và thời gian tinh thể hóa là 24h ở nhiệt độ -10°C

Senanayake và cộng sự (2000) [69] cũng đã sử dụng kỹ thuật tạo phức với

urê để thu DHA từ sinh khối vi tảo Crypthecodinium cohnii Thành phần axít béo

có trong dầu tảo gồm 22:6, 14:0 và 18:1 Với quá trình tạo phức với urê, các axit béo 14:0, 16:0 và 18:1 đã bị loại hầu như hoàn toàn trong khi đó DHA đã được làm giàu từ 47,4 đến 97,1% với hiệu suất của quá trình là 32,5% theo lượng dầu tảo gốc Hiệu quả thu hồi DHA cao hơn và 66,5% DHA tổng số có mặt trong dầu tảo gốc đã được phát hiện nhờ quá trình làm giàu DHA tiếp theo quá trình tạo phức

hợp urê [69] Tảo C cohnii có chứa khoảng 40% DHA (wt/wt) Dầu tảo này có

chứa 95% TAG ở dạng các axít béo tự do hoặc các alkyl ester đơn giản Hầu hết các sản phẩm dầu tảo đều ở dạng TAG [35]

Nghiên cứu của Mendes và cộng sự (2007) [53] đã cho thấy, thành phần axit béo trong phần tạo phức với urê và phần không tạo phức với urê là khác nhau, phụ thuộc vào tỉ lệ urê: axit béo và nhiệt độ kết tinh Quy trình cô đặc và tinh sạch

DHA ở VTB dị dưỡng giàu DHA như Crypthecodinium cohnii đã được thực hiện

với urê: axit béo tối ưu là 7:2; nhệt độ kết tinh là 4 hoặc 8 ºC Khi đó, hàm lượng

DHA tinh sạch chiếm 99,2% so với TFA

Gần đây nhất, Lin và cộng sự (2014) [49], sử dụng phương pháp tạo phức với urê trong điều kiện tối ưu: tỷ lệ urê: este etyl dầu cá mòi là 1,9: 1 và nhiệt độ kết tinh -1°C thì độ tinh khiết và phục hồi hoàn toàn của EPA và DHA là 65,6% và 46,8%, tương ứng

1.7.2 Tình hình nghiên cứu PUFA ở Việt Nam

Trên thị trường Việt Nam đã xuất hiện nhiều sản phẩm thực phẩm chức năng

có chứa omega-3 và omega-6 nhưng hầu hết chúng đều được nhập ngoại và được sản xuất từ cá Đây cũng chính là những khó khăn cho sự phát triển các sản phẩm

có chứa omega của Việt Nam Gần đây đã có những nghiên cứu về tách chiết PUFA trên các đối tượng khác nhau

Mai Thị Diệu Thảo (2006) [5] đã tiến hành hòa tan các axit béo trong mỡ cá basa vào trong dung môi hữu cơ (hexan hoặc aceton), sau đó dung môi này được hạ nhiệt độ xuống -20°C đến -70°C, để kết tinh trong một ngày rồi thu nhận các phân đoạn khác nhau của axit béo Thu được hàm lượng Omega-3 thu được lên tới 24,03% axit béo

Trên đối tượng cá Ngừ, Lại Mai Hương (2007) [3] đã kết luận hàm lượng PUFA trong phần không tạo phức tăng khi nhiệt độ giảm, và ngược lại, % SFA và MUFA tăng khi nhiệt độ tăng Ở nhiệt độ 4°C thích hợp cho làm giàu DHA trong giàu cá Ngừ Tỉ lệ FFA: urê là 1:3 (w/w) cho % DHA tăng từ 32% lên 79% tăng 2,46 lần so với tỉ lệ 1:2 Tỉ lệ urê: methanol là 3:16 (w/v) cho hiệu suất PUFA và EPA lớn nhất, trong khi hiệu suất DHA lớn nhất khi tỷ lệ đó là 3:12

Trên đối tượng dầu Hồ Đào, Bùi Quang Thuật (2009) [6] cũng đã làm giàu hỗn hợp axít béo omega-3 và omega-6 bằng phương pháp tạo phức với urê ở nhiệt

độ 5°C, tỉ lệ urê: hỗn hợp axít béo là 2:1; tỉ lệ cồn: hỗn hợp axít béo là 9:1cho hiệu suất thu PUFA có độ tinh khiết cao đạt 92,78 %

Theo công trình nghiên cứu của Hoàng Thị Lan Anh và cộng sự (2009) [1],

trên đối tượng Schizochytrium mangrovei PQ6 tỉ lệ urê: axit béo được sử dụng là

5:2, thời gian tinh thể hóa là 12giờ ở nhiệt độ 4-10°C Khi đó, phần không tạo phức với urê có chứa DHA và DPA chiếm 85,2% và 13,4% so với TFA của pha lỏng, tương ứng Bên cạnh đó, 2 loại axit béo khác là axit linoleic (C18:2 -6) và axit dihomo-γ- linoleic (C20:3-6) chiếm một lượng nhỏ 0,604% và 0,744% so với TFA trong pha lỏng

Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu mới sản xuất dầu sinh học giàu omega–3 và

omega–6 trên đối tượng VTB dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 ứng dụng

làm thực phẩm chức năng vẫn còn là mới mẻ và mới bắt đầu được tiến hành nghiên cứu từ năm 2013 Chính vì vậy, chúng tôi mong muốn thực hiện đề tài nghiên cứu

“Tối ƣu hóa điều kiện tách chiết và làm giàu axit béo omega-3 và omega-6 từ

sinh khối VTB dị dƣỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 của Việt Nam” với hi vọng kết quả thu được sẽ bước đầu cung cấp những cơ sở khoa học cho phép ứng

dụng sản xuất dầu sinh học giàu omega–3 và omega–6 làm thực phẩm chức năng cho con người và động vật nuôi

Mục đích của đề tài nghiên cứu của chúng tôi như sau:

+/ Tìm ra qui trình tối ưu cho tách chiết lipit tổng số từ sinh khối tảo dị dưỡng S

mangrovei PQ6

+/ Tìm ra qui trình tối ưu cho tách chiết FFA từ lipit tổng số (dầu thô) được tách

chiết từ sinh khối tảo dị dưỡng S mangrovei PQ6

+/ Tìm ra được điều kiện thích hợp cho quá trình làm giàu axit béo không bão hòa

đa nối đôi omega-3 và omega-6 ở quy mô phòng thí nghiệm

+/ Đánh giá chất lượng của lipit, FFA thu được sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình làm giàu hỗn hợp axit béo giàu omega–3 và omega–6, đồng thời đánh giá chất

lượng của dầu sinh học giàu axit béo omega-3 và omega-6 từ SKK tảo S mangrovei

PQ6 để có thể làm nguyên liệu cho việc sản xuất viên thực phẩm chức năng cho người

Công việc thí nghiệm được tiến hành tại Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Chủng tảo và điều kiện nuôi cấy

VTB dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 được phòng Công nghệ Tảo

phân lập tại huyện đảo Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang

Chúng được nuôi cấy trong môi trường M12 có thành phần (g/L): glucose -

90, cao nấm men - 10, muối biển nhân tạo - 17,5 Tảo được nuôi trong bình lên men

tự tạo 30 lít ở nhiệt độ 28 - 30°C có sục khí liên tục pH môi trường được duy trì trong khoảng 6,5 -7,5

Sinh khối tảo được thu hoạch khi sinh trưởng của tảo ở pha cân bằng (sau

4-5 ngày nuôi cấy) Đây là giai đoạn sinh khối tảo có hàm lượng lipit đạt cao nhất Sinh khối chủng PQ6 được thu hoạch bằng phương pháp ly tâm ở 4000 v/p trong 10 phút, sau đó được sấy khô ở 80°C đến khối lượng không đổi Để bảo đảm cho nguyên liệu đầu vào là ổn định với tất cả quá trình tách chiết dầu sau này, SKK thu được được trộn đều và cất giữ trong các túi ny lông được hàn kín miệng và giữ trong -20°C cho đến khi sử dụng Sinh khối tảo khô được nghiền thành dạng mịn nhỏ với cát thủy tinh được sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình tách chiết lipit và hỗn hợp axit béo

Hình 2.1 Ảnh tế bào Schizochytrium mangrovei PQ6 và nuôi cấy trong các hệ

thống lên men 30 lít 2.1.2 Hóa chất và thiết bị

Hóa chất:

Các hóa chất vô cơ như: NaOH, KOH, Na2SO4, HCl và các loại dung môi như: n-hexan, ethanol, diethyl ete, cloroform, axit acetic đặc, petroleum ether do Trung Quốc sản xuất

Các hóa chất sử dụng để xác định chỉ số axit và peroxyt của hỗn hợp axit béo

tự do tách được như: thuốc thử phenolphthalein, KI, dung dịch hồ tinh bột 1%,

Na2S203

Các hóa chất sử dụng để xác định chỉ số axit và peroxyt của dầu tảo giàu omega- 3 và omega- 6 tách được như: Thuốc thử phenolphthalein, KI, dung dịch hồ tinh bột 1%, Na2S2O3 do Việt Nam sản xuất

Các dụng cụ và thiết bị sử dụng: Bình cầu các loại gắn với ống sinh hàn hồi

lưu; phễu chiết; phễu lọc; cốc đong; ống đong và bình tam giác các loại; giấy lọc, nhiệt kế; máy ảnh kỹ thuật số Canon IXY Digital 70 (Nhật Bản); máy cô quay chân không (IKA của Đức); cân kỹ thuật Precisa XB 1200C; cân phân tích Shimazu AY120 (Nhật Bản); Máy khuấy từ gia nhiệt Kika Labortechnik (Đức); tủ sấy Cornthem (New Zealand); máy ly tâm Sorvall (R) (Đức); bình lên men 30 lít tự tạo; máy sắc kí khí HP-6890, ghép nối với Mass Selective Detector Agilent 5973; cột HP-5MS; khí mang He; thư viện phổ khối: WILEY275.L và NIST 98.L

2.2 Phương pháp

Quá trình tách chiết dầu sinh học giàu axit béo dạng omega-3 và omega-6 từ VTB bao gồm 3 giai đoạn chính cần phải tiến hành như: tách chiết lipit tổng số (dầu thô) từ sinh khối tảo; tách chiết FFA từ dầu thô; tách chiết và làm giàu axit béo omega-3 và omega-6 từ hỗn hợp FFA Để thực hiện các nội dung nêu trên, một số

phương pháp tiến hành như sau:

2.2.1.Tách chiết lipit [11]

Mười gam SKK chủng PQ6 được chiết với ba loại dung môi là n-hexan, cloroform và petroleum ether trên máy khuấy từ gia nhiệt Nhiệt độ tách chiết thay đổi từ 50 đến 75°C, thời gian tách chiết từ 1 - 5 giờ với chế độ khuấy thay đổi từ để tĩnh đến khuấy liên tục Tỷ lệ dung môi : nguyên liệu từ 8:1 đến 12:1 Số lần trích ly được tiến hành từ 1 đến 3 lần Ngoài ra, ảnh hưởng của chất lượng SKK lên hiệu suất tách chiết dầu cũng được kiểm tra thông qua 2 yếu tố là độ ẩm sinh khối và nhiệt độ sấy sinh khối Phản ứng chiết tiến hành trên máy khuấy từ, ly tâm ở 4000 vòng/ phút trong 10 phút để tách lớp dung môi với bã sinh khối và nước Sau đó, dung môi được loại bỏ khỏi lipit bằng cách sử dụng máy cất quay chân không ở nhiệt độ 70°C Lượng lipit thu được được đựng trong các bình thủy tinh tối màu và cân trọng lượng Phần trăm dầu tách chiết được được tính theo công thức sau: