Phân lập một số chủng nấm sợ có khả năng chuyển hoá rơm dạ

Phân lập một số chủng nấm sợ có khả năng chuyển hoá rơm dạ từ lúa làm phân hữu cơ trồng trọt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG

Ths KHƯU PHƯƠNG YẾN ANH

Long Xuyên, tháng 9 năm 2010

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG

TÓM LƯỢC

Ô nhiễm môi trường trong sản xuất nông nghiệp hiện nay đang là vấn đề cấp bách cần giải quyết Các chế phẩm sinh học thân thiện với môi trường được sử dụng ngày càng rộng rãi và trở thành một giải pháp tối ưu trong nông nghiệp Các chủng vi sinh vật như nấm sợi có khả năng sinh enzym ngoại bào phân giải các thành phần hữu

cơ trong các phế thải nông nghiệp, đặc biệt là cellulose khó phân hủy, để làm phân bón

hữu cơ là hướng nghiên cứu đang rất được quan tâm Từ đó đề tài : “Phân lập một số chủng nấm sợi có khả năng chuyển hóa rơm rạ từ lúa làm phân hữu cơ trồng trọt”

nhằm nghiên cứu về vấn đề này

Đề tài sử dụng các phương pháp nghiên cứu vi sinh thông dụng như: phân lập các chủng nấm sợi từ rơm rạ theo phương pháp phân lập trực tiếp của Uyenco, xác định hoạt tính cellulase bằng phương pháp khuếch tán trên thạch, xác định hoạt độ enzym cellulase theo phương pháp định lượng đường khử bằng 3,5-dinitrosalysilic (DNS), định danh nấm sợi theo phương pháp hình thái

Kết quả nghiên cứu đã đạt được:

1 Đã phân lập được 54 chủng nấm sợi khác nhau từ rơm rạ ở các ruộng lúa

thuộc 6 xã huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang

2 Đã xác định được 100% chủng nấm sợi đều có khả năng sinh enzym cellulase

Đ4 : Trichoderma harzianum Rifai

4 Đã xác định được điều kiện MT tối ưu cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của ba chủng nấm sợi Đ1, Đ2, Đ4 là:

- Thời gian thu nhận enzym tốt nhất là 3-4 ngày

5 Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của ba chủng nấm sợi Đ1, Đ2, Đ4 cho thấy chúng đều có khả năng sinh cả 4 loại enzym là cellulase, protease, amylase, kitinase và sinh kháng sinh kháng lại một số VSV gây bệnh

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa Tóm lược Mục lục Danh mục các bảng Danh mục hình Danh mục các chữ viết tắt Chương I : MỞ ĐẦU 1

1.1 Lí do chọn đề tài 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài 2

Chương II : TỔNG QUAN 3

2.1 Rơm rạ lúa ở Việt Nam 3

2.1.1 Thành phần, ứng dụng và tình hình sử dụng rơm rạ 3

2.1.2 Sản xuất phân hữu cơ từ rơm rạ 4

2.2 Nấm sợi sinh enzym phân hủy rơm rạ 5

2.2.1 Đặc điểm hình thái nấm sợi 5

2.2.2 Đặc điểm phân loại nấm sợi 7

2.2.3 Khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học của nấm sợi 7

2.3 Enzym cellulase từ nấm sợi 9

2.3.1 Khái quát về enzym 9

2.3.2 Cellulose và enzym cellulase 9

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tạo thành enzym cellulase của nấm sợi trên MT lên men bán rắn 13

2.3.4 Ứng dụng và sản xuất enzym cellulase 14

Chương III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Vật liệu 17

3.2 Phương pháp nghiên cứu 20

3.2.1 Phương pháp phân lập mẫu theo Uyenco, 1988 20

3.2.2 Phương pháp bảo quản nấm sợi trên MT thạch có lớp dầu khoáng … 21

3.2.3 Phương pháp quan sát đại thể nấm sợi 21

3.2.4 Phương pháp quan sát vi thể nấm sợi 21

3.2.5 Phương pháp xác định hoạt độ enzym ngoại bào của nấm sợi

bằng phương pháp khuếch tán trên thạch……….…22

3.2.6 Phương pháp xác định hoạt độ enzym cellulase bằng phương pháp định lượng đường khử bằng 3,5- Dinitrosalycylic acid………23

3.2.7 Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận enzym cellulase ……… … 24

3.2.8 Phương pháp ly trích enzym cellulase ……… 25

3.2.9 Phương pháp xác định các yếu tố ảnh hưởng của MT đến khả năng sinh enzym cellulase của nấm sợi……… 25

3.2.10 Phương pháp kiểm tra hoạt tính kháng sinh ……… 26

3.2.11 Phương pháp sử dụng phần mềm thống kê để xử lý số liệu thực nghiệm

……… ………26

Chương IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

4.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase từ rơm, rạ lúa 27

4.1.1 Phân lập các chủng nấm sợi từ rơm, rạ lúa 27

4.1.2 Tuyển chọn những chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase 27

4.2 Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và phân loại bảy chủng nấm sợi 31

4.3 Khảo sát một số yếu tố MT ảnh hưởng đến hoạt độ cellulase của ba chủng nấm sợi 35

4.4 Nghiên cứu đặc tính sinh học khác của ba chủng nấm sợi 42

Chương V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

5.1 Kết luận 46

5.2 Kiến nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

trang

Bảng 1 : Khả năng sinh enzym celllase của 54 chủng nấm sợi phân lập 28

Bảng 2 : 7 chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase cao 29

Bảng 3 : Hoạt độ cellulase của 7 chủng nấm sợi (đơn vị mg/ml) 30

Bảng 4 : Đặc điểm hình thái và phân loại của 7 chủng nấm 31

Bảng 5 : Ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ enzym cellulase của 3 chủng nấm 35

Bảng 6 : Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt độ cellulase của 3 chủng nấm 37

Bảng 7 : Ảnh hưởng độ pH đến hoạt độ cellulase của 3 chủng nấm 38

Bảng 8 : Ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt độ cellulase của 3 chủng nấm 40

Bảng 9 : Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ cellulase của 3 chủng nấm 41

Bảng 10: Khả năng tạo enzym ngoại bào của ba chủng nấm sợi 42

Bảng 11: Khả năng sinh kháng sinh của ba chủng nấm sợi 44

DANH MỤC CÁC HÌNH

trang

Hình 1 : Bào tử mọc ra khuẩn ty 6

Hình 2 : KL nấm 6

Hình 3 : Các dạng bào tử trần của nấm sợi 6

Hình 4 : Sự tiếp hợp của nấm sợi 6

Hình 5 : Hoạt tính enzym của nấm sợi trên MT thạch 8

Hình 6 : Cấu trúc đơn vị cellulose 10

Hình 7 : Liên kết hydro trong cấu trúc phân tử của cellulose 10

Hình 8 : Cấu tạo của phân tử cellulose trong không gian 10

Hình 9 : Cấu trúc enzym cellulase trong không gian 11

Hình 10 : Cấu trúc tinh thể của endoglucanase 11

Hình 11 : Cấu trúc CBH 12

Hình 12 : Vị trí cắt exoglucanase 12

Hình 13 : Cơ chế tác động của enzym cellulase 12

Hình 14 : Vị trí lấy mẫu ở các xã thuộc huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang 20

Hình 15 : Đồ thị hoạt độ cellulase của 7 chủng nấm sợi …… 30

Hình 16 : Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ1 33

Hình 17 : Hệ sợi nấm và cuống sinh bào tử chủng Đ1(x40) 33

Hình 18 : Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ2 33

Hình 19 : Hình dạng hệ sợi nấm và cuống sinh bào tử chủng Đ2 (x40) 33

Hình 20 : Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ4 33

Hình 21 : Hình dạng sợi nấm và cuống sinh bào tử chủng Đ4 (x40) 33

Hình 22 : Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ5 34

Hình 23 : Hình dạng sợi nấm và cuống sinh bào tử chủng Đ5 (x40) 34

Hình 24 : Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ8 34

Hình 25 : Hình dạng sợi nấm và đầu bông cúc chủng Đ8 (x40) 34

Hình 26 : Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ9 34

Hình 27 : Hình dạng sợi nấm và cuống sinh bào tử chủng Đ9 (x40) 34

Hình 28 : Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ11 35

Hình 29 : Hình dạng sợi nấm và cuống sinh bào tử chủng Đ11 (x40) 35

Hình 30 : Đồ thị ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ cellulase của ba chủng nấm sợi 36

Hình 31 : Đồ thị ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt độ cellulase của

ba chủng nấm sợi 38

Hình 32 : Đồ thị ảnh hưởng độ pH đến hoạt độ cellulase của ba chủng nấm sợi 39

Hình 33 : Đồ thị ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt độ cellulase của ba chủng nấm sợi 40

Hình 34 : Đồ thị ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ cellulase của ba chủng nấm sợi 41

Hình 35 : Đồ thị khả năng tạo enzym ngoại bào của ba chủng nấm sợi 43

Hình 36 : Hoạt tính cellulase của ba chủng nấm 43

Hình 37 : Hoạt tính amylase của ba chủng nấm 43

Hình 38 : Hoạt tính protease của ba chủng nấm 43

Hình 39 : Hoạt tính kitinase của ba chủng nấm 44

Hình 40 : Hoạt tính kháng E coli của ba chủng nấm 44

Hình 41 : Hoạt tính kháng B subtilis của ba chủng nấm 45

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CHƯƠNG I MỞ ĐẦU

1.1 Lí do chọn đề tài

Nấm sợi là vi sinh vật (VSV) rất đa dạng, phong phú và thích hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam Nấm sợi có tiềm năng lớn nhất sinh các loại enzym thủy phân ngoại bào mạnh, phân giải các hợp chất hữu cơ, vô cơ khó tan trong tự nhiên, cung cấp chất dinh dưỡng và năng lượng cho toàn bộ hệ sinh thái Nghiên cứu các loại nấm sợi có khả năng sinh enzym phân hủy rác thải, phế phụ phẩm nông nghiệp thành phân bón hữu cơ sinh học là góp phần xây dựng một nền nông nghiệp sinh thái phát triển bền vững, năng suất cao và thân thiện với môi trường

Việt Nam là một nước nhiệt đới có nền nông nghiệp rất phong phú, đa dạng và đang trên đà phát triển, vì vậy, lượng phế thải nông nghiệp rất dồi dào Xã hội ngày càng phát triển, việc sử dụng rơm, rạ làm chất đốt phục vụ sinh hoạt gia đình không còn phát huy tác dụng như trước đây Sau khi thu hoạch lúa, người nông dân thường đốt hết rơm rạ ngay tại ruộng hoặc vứt bừa bãi trên các đường giao thông nội đồng, kênh

mương gây ô nhiễm môi trường và làm ách tắc dòng chảy, rơm rạ trở thành nguồn phế

thải rất lớn Rơm của các vùng đồng bằng sản xuất lúa gạo ở Việt Nam rất nhiều, thông thường để sản xuất một tấn hạt lúa, cây lúa phải có 6 tấn rơm Do đó, hiện nay vấn đề sử dụng nguốn phế thải nông nghiệp này như thế nào để mang lại lợi ích kinh tế cho xã hội

là rất cần thiết và giảm thiểu các vấn đề ô nhiễm môi trường đã và đang xảy ra Nhất là trong các vụ hè thu và vụ thu đông Hiện nay sử dụng lại nguồn rơm này rất nhỏ so với

lượng rơm phải bỏ đi Thông thường nông dân phải đốt bỏ, chỉ một số ít được sử dụng

lại cho việc sản xuất nấm rơm, hoặc dùng cho che phủ đất cho cây trồng cạn, cho chăn nuôi đại gia súc Cùng với sự công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước, ô nhiễm môi trường đang trở thành nguy cơ thật sự Thành phần chính trong phế thải rắn trong sinh hoạt công, nông, lâm nghiệp là cellulose, sản phẩm của quá trình phân hủy chất hữu cơ trong phế thải là mùn có thể làm phân bón rất tốt cho cây trồng Do đó, xử lý chất thải bằng vi sinh vật, đặc biệt là các chủng nấm sợi có khả năng sinh các loại enzym, là hướng tích cực có nhiều ưu điểm so với các phương pháp lí, hóa, cơ học, đang rất được quan tâm khai thác (Nguyễn Thị Kim Cúc, 2001)

Phân bón hóa học lâu ngày sẽ làm cho đất canh tác bị chai sạn, thoái hóa, các loại giun đất không phát triển được, làm hạn chế độ xốp, lượng không khí cần thiết cho

bộ rễ cây thiếu hụt Ngoài ra nếu sử dụng thêm các loại thuốc trừ sâu hóa học độc hại, thì các sinh vật, VSV hữu ích cũng bị tiêu diệt theo, gây ô nhiễm cho môi trường, làm ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của người trồng trọt và người tiêu thụ Vì vậy, các nước có nền nông nghiệp phát triển trên thế giới có xu hướng sử dụng các phân bón hữu cơ sinh học, đặc biệt là phân bón vi sinh và thuốc trừ sâu vi sinh có tác dụng tăng cường dinh dưỡng, độ xốp cho đất, cây trồng đồng thời có tác dụng phòng trừ các loại bệnh có hại

cho cây và đảm bảo an toàn cho môi trường (theo http://www.khoamt-cnsh.co.nr)

Xử lý chất thải hữu cơ bằng vi sinh vật để làm phân bón hữu cơ là hướng nghiên cứu đang rất được các nhà khoa học quan tâm vì tính ứng dụng thực tiễn rất cao Từ cơ

sở khoa học và thực tiễn trên gợi ý cho tôi chọn đề tài : “Phân lập một số chủng nấm sợi có khả năng chuyển hóa rơm rạ từ lúa làm phân hữu cơ trồng trọt”, nhằm tận

dụng nguồn phế thải nông nghiệp sản xuất phân bón cho cây trồng, góp phần xây dựng một nền nông nghiệp sạch và bền vững, giảm thiểu sự ô nhiễm môi trường

1.2 Mục tiêu của đề tài

- Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase từ nguồn rơm rạ lúa

- Xác định thành phần môi trường tối ưu sinh tổng hợp enzym cellulase

1.3 Nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài

- Phân lập các chủng nấm sợi từ rơm rạ lúa ở các xã thuộc huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang

- Tuyển chọn một số chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase cao

- Nghiên cứu các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase của các chủng nấm sợi được chọn

- Định danh các chủng nấm sợi được chọn

CHƯƠNG II TỔNG QUAN

2.1 Rơm rạ lúa ở Việt Nam

2.1.1 Thành phần, ứng dụng và tình hình sử dụng rơm, rạ

Cây lúa luôn giữ vị trí trung tâm trong nông nghiệp và kinh tế Việt Nam Hình ảnh đất Việt thường được mô tả như một chiếc đòn gánh khổng lồ với hai đầu là hai vựa lúa lớn là Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) và Đồng bằng sông Hồng (ĐBSH) Khoảng 80% trong tổng số 11 triệu hộ nông dân tham gia sản xuất lúa gạo, chủ yếu dựa vào phương thức canh tác thủ công truyền thống Việc sản xuất lúa gạo đã tạo ra một lượng lớn phế phẩm từ cây lúa bao gồm rơm rạ và trấu Rơm và trấu là hai trong số nhiều nguồn biomass phổ biến và có nhiều tiềm năng ở Việt Nam, chiếm 62,6% trong tổng khối lượng biomass ở Việt Nam năm 2000 (Trần Diệu Lý, 2008)

Theo Hồ Sĩ Tráng (2004) các thành phần chính của rơm, rạ là những hydratcacbon gồm: Cellulose (34% – 38%), hemicellulose (32% – 40%), lignin (12%), tro (14% – 18%) Rơm rạ thô chứa 44% cellulose, 22% hemicellulose, cả hai polysaccharide này đều là nguồn nguyên liệu khó phân hủy sinh học, nhưng nếu sử dụng VSV phân giải thích hợp sẽ tạo nguồn phân hữu cơ sinh học rất tốt

Rơm ở Việt Nam được sử dụng với rất nhiều mục đích Ví dụ rơm được sử dụng trong công nghệ phân bón Vì trong rơm có chứa rất nhiều kali nên rơm thường được dùng để ủ phân chuồng Bón phân chuồng ủ rơm vừa làm tăng kali cho đất và giảm chi phí vào phân bón Bón phân hữu cơ rất tốt cho đất, giúp phục hồi đất và chống khô cằn đất Ngoài ra, trong chăn nuôi, rơm được dùng để lót chuồng cho vật nuôi (ví dụ như bò sữa) Lót chuồng bằng rơm rất sạch sẽ và tránh đươc phần nào dịch bệnh cho vật nuôi Rơm sẽ thấm nước tiểu của vật và sau đó được ủ, cuối cùng sẽ mang đi bón cây Dùng rơm lót chuồng để bón ruộng chúng ta sẽ tận dụng được nitơ trong nước tiểu của vật nuôi và làm giàu nitơ cho đất Rơm còn được dùng để trồng nấm rơm sử dụng làm chất đốt cho các hộ nhà nông, chất đống trồng nấm rơm, làm thức ăn cho gia súc, dùng làm vật liệu xây dựng, làm bê tông siêu nhẹ, dùng sản xuất điện, làm đệm lót vận chuyển

hàng hóa dễ vỡ, vận chuyển hoa quả, v.v…(http//www.khoahoc.com)

Mặc dù rơm rạ là một nguồn năng lượng lớn nhưng không được sử dụng một cách hiệu quả ở Việt Nam Sau khi thu hoạch, phần lớn rơm rạ được nông dân đốt gây ô nhiễm môi trường ảnh hưởng đến người – gia súc, gia cầm – các loại cây trồng khác, làm mất đi vĩnh viễn nhiều nguyên tố quan trọng mà cây trồng đã lấy đi từ đất Đặc biệt

là cacbon Các nhà khoa học cho biết thành phần các chất gây ô nhiễm không khí do đốt rơm, rạ, tác động đến sức khỏe con người là hydrocacbon thơm đa vòng (viết tắt là PAH); dibenzo-p-dioxin clo hoá (PCDDs), và dibenzofuran clo hoá (PCDFs), là các dẫn xuất của dioxin rất độc hại, có thể là tiềm ẩn gây ung thư

(http://vietnamnet.vn/khoahoc/)

Việc đốt rơm, rạ trực tiếp ngay trên đồng ruộng gây bất lợi cho đồng ruộng lớn hơn nhiều lần so với việc làm phân bón Các chất hữu cơ trong rơm rạ và trong đất biến thành các chất vô cơ do nhiệt độ cao Đồng ruộng bị khô, chai cứng, một lượng lớn nước bị bốc hơi do nhiệt độ hun đốt trong quá trình cháy rơm, rạ Quá trình đốt rơm, rạ ngoài trời không kiểm soát được, lượng dioxit cacbon CO2, phát thải vào khí quyển cùng với cacbon monoxit CO; khí metan CH4; các oxit nitơ NOx; và một ít dioxit sunfua SO2.

Phần rơm, rạ sót thường được cày lấp vào trong đất làm phân bón cho mùa vụ sau Việc phân hủy gốc rạ và rơm phụ thuộc vào độ ẩm của đất, nó ảnh hưởng trực tiếp đến khối lượng khí metan CH4 được giải phóng trong khi ủ Tuy có cung cấp cho đồng ruộng một chút dinh dưỡng cho vụ tiếp theo, nhưng rất có thể chứa mầm sâu bệnh cho cây trồng, ảnh hưởng đến sản lượng do tác động bất lợi ngắn hạn bởi bất ổn định hàm lượng nitơ

Nếu tình trạng này cứ tiếp tục tiếp diễn thì cùng với sự lạm dụng phân hóa học đất sẽ càng ngày càng cằn cỗi và chai cứng Hậu quả lâu dài sẽ không lường trước được Trả lại cho đất những gì đã lấy đi của nó là việc làm cần thiết cấp bách của con người Làm được việc này chúng ta sẽ hạn chế được việc lạm dụng phân hóa học và thuốc hóa học trên đồng ruộng mà vẫn đảm bảo được năng suất và ngày nâng cao chất lượng nông sản Dần dần chúng ta sẽ lấy lại được độ phì nhiêu cho đất – làm tăng hàm lượng các chất khoáng – tăng độ tơi xốp của đất – tăng hàm lượng VSV hữu hiệutrong đất (vi sinh

là yếu tố vô cùng quan trọng trong việc chuyển hóa phân bón thành thức ăn cho cây trồng) - giảm tối thiểu các loại vi khuẩn có hại các loại mầm mống sâu và nấm gây hại cho cây Đây cũng là giải pháp quan trọng tạo nên một nền nông nghiệp sinh thái sạch,

an toàn và bền vững (nguồn từhttp://www.khoamt-cnsh.co.nr)

2.1.2 Sản xuất phân hữu cơ từ rơm rạ

Hàng năm, nông dân đổ xuống đồng ruộng lượng lớn phân hoá học, thuốc bảo vệ thực vật làm cho cấu trúc đất bị thay đổi Nếu cứ tiếp tục như vậy, đồng ruộng sẽ mất dần độ phì nhiêu, môi trường ô nhiễm, sức khoẻ con người bị ảnh hưởng Do vậy, việc

sử dụng rơm, rạ làm phân bón hữu cơ có ý nghĩa rất lớn về mặt kinh tế, xã hội Phân hữu cơ sinh học là sản phẩm tạo ra thông qua quá trình lên men vi sinh vật, qua đó các

hợp chất giàu cellulose được phân huỷ, trở thành mùn Sử dụng rơm rạ đúng mục đích,

không chỉ giúp cải tạo đất, nâng cao hiệu quả kinh tế trong sản xuất nông nghiệp mà còn hạn chế ô nhiễm môi trường Phân bón hữu cơ từ rơm, rạ góp phần gia tăng độ mùn, bổ sung chất dinh dưỡng, nâng cao chất lượng cây trồng Việc sản xuất phân hữu cơ từ rơm

rạ đã được triển khai nghiên cứu và sử dụng ở một số nơi và hiệu quả rất cao như: Đề tài

“Dự án xây dựng mô hình xử lý rơm rạ làm phân ủ hữu cơ vi sinh phục vụ sản xuất lúa gạo an toàn và góp phần giảm ô nhiễm môi trường trên địa bàn”, đã được UBND huyện

Bình Giang (Hải Dương) thực hiện thành công (http://www.haiduongdost.gov.vn./) Hội

làm vườn tỉnh Vĩnh Phúc phối hợp với công ty TNHH Thái Việt Mỹ sản xuất và ứng dụng thành công loại phân bón hữu cơ vi sinh học từ các phế thải nông nghiệp, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng, giảm thiểu ô nhiễm môi trường nông thôn Ứng dụng này được triển khai tại 150 hộ của huyện Mê Linh, Tam Dương, Tam Đảo đại diện cho ba vùng đồng bằng, trung du và miền núi… (http://www.kinhtenongthon.com.vn./)

Dùng phân hữu cơ vi sinh có thể thay thế được từ 50% - 100% lượng phân đạm hóa học (tùy từng loại cây trồng bón phân vi sinh có thể tiết kiệm được nhiều chi phí do giá phân hạ, giảm lượng phân bón, giảm số lần phun và lượng thuốc BVTV)…Do bón vi sinh nên sản phẩm rất an toàn, lượng nitrat giảm đáng kể, đất không bị ô nhiễm, khả năng giữ ẩm tốt hơn, tăng cường khả năng cải tạo đất do các hệ sinh vật có ích hoạt động mạnh làm cho đất tơi xốp hơn, cây dễ hấp thu dinh dưỡng hơn

Rơm rạ sau thu hoạch được các hộ nông dân thu gom tập kết vào một địa điểm thuận lợi cho việc ủ hoặc thu gom về tại các gia đình Trước khi rơm rạ đưa vào ủ, tiến hành dùng máy vò đập có gia cố thêm phần băm chặt để rơm rạ được vò nát và nhỏ rồi đánh đống và ủ Để xử lý rơm rạ trước hết phải tưới nước để rơm rạ đạt độ ẩm từ 80%

đến 90% rồi rải rơm theo từng lớp, mỗi lớp dầy khoảng 30cm đến 40cm và tưới men vi sinh đều khắp trên mặt đống Ngoài ra cần bổ sung mỗi tấn rơm rạ thêm 0,1kg phân đạm urê + 1 kg super lân, cứ như vậy cho đến khi đạt độ cao khoảng từ 1,5m đến 1,6 m, chiều rộng và chiều dài thì tùy điều kiện cụ thể ủ theo quy mô gia đình hay quy mô liên gia với số lượng nhiều hay ít để đánh đống Sau 10 ngày thì tiến hành kiểm tra và đảo trộn để làm cho rơm rạ vụn ra; vi sinh phân bố đều hơn và tưới bổ sung kịp thời những chỗ chưa thối Sau 45 ngày đến 50 ngày rơm rạ phân hủy thành phân ủ hữu cơ thì có thể

sử dụng đem bón lót cho cây trồng.Việc dùng men vi sinh xử lý rơm ra làm phân hữu cơ phục vụ cho sản xuất lúa gạo an toàn đã tận dụng toàn bộ lượng rơm rạ của nông nghiệp sau mỗi vụ thu hoạch lúa cùng với chế phẩm sinh học tạo ra nguồn phân ủ bón lót cho cây trồng, cải tạo đất, đảm bảo năng suất cây trồng, tạo ra sản phẩm lúa an toàn ít tồn dư hoặc không còn tồn dư các hóa chất độc hại trong sản phẩm lúa, góp phần bảo vệ môi trường, bảo vệ sức khỏe cộng đồng

Theo nghiên cứu, rơm rạ từ lúa có thành phần NPK như sau (g/kg trọng lượng khô):

2.2 Nấm sợi sinh enzym phân hủy rơm, rạ

Cellulose là một trong những thành phần chủ yếu của tổ chức rơm, rạ Cellulose

là hợp chất rất vững bền, đó là loại polysaccharide cao phân tử Trong tự nhiên có nhiều loại VSV có khả năng sinh ra các men làm xúc tác trong quá trình phân giải cellulose Chúng có ý nghĩa rất lớn đối với việc thực hiện vòng tuần hoàn cacbon trong tự nhiên, góp phần quan trọng trong việc nâng cao độ phì nhiêu của đất Trong điều kiện tự thoáng khí cellulose có thể bị phân giải dưới tác dụng của nhiều VSV hiếu khí Ngoài

ra, còn có một số vi khuẩn kỵ khí có khả năng tham gia tích cực vào quá trình phân giải

cellulose Các loài vi sinh vật như: Cytophaga, Cellulomonas, giống Bacillus, giống

Clostridium, Aspergillus, Penicillium …(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.2.1 Đặc điểm hình thái của nấm sợi

Nấm sợi là VSV có nhân chuẩn Thành tế bào nấm chủ yếu cấu tạo từ

kitin-glucan, kitozan Hệ nấm sợi được cấu tạo bởi các sợi nấm (hypha) không vách ngang hoặc có vách ngang (septum) Các sợi nấm vừa phát triển theo chiều dài do tăng trưởng

ở ngọn, vừa phân nhánh tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) hay còn gọi là khuẩn ty thể

(hình 2.1) Hệ sợi nấm phát triển thành các dạng khuẩn lạc (KL) khác nhau tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm (hình 2.2) KL nấm sợi thường có dạng hình tròn, hoặc gần tròn

Bề mặt KL có thể mượt, nhẳn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp, phẳng, có những vết khía xuyên tâm, hoặc lồi lõm không đều Mép KL trơn, răng cưa (Nguyễn

Lân Dũng, 2001)

Hình 1 Bào tử mọc ra khuẩn ty Hình 2 KL nấm (nguồn: internet)

Một số sợi nấm có thể tiết sắc tố vào môi trường (MT) hoặc tiết chất hữu cơ kết

tinh trên bề mặt sợi nấm

Các đặc điểm hình thái khác như có bó sợi, bó giá, thể quả, hạch nấm, giọt tiết,

sắc tố hòa tan…, làm KL nấm sợi có tính đặc trưng loài (Bùi Xuân Đồng, 2000)

Phương thức dinh dưỡng của nấm là hấp phụ qua màng, không có cơ quan tiêu

hóa, không có khả năng quang hợp Đa phần là các cơ thể hoại sinh, một số kí sinh, một

số gây bệnh trên người và động thực vật

Nấm sợi sinh sản chủ yếu bằng bào tử, bào tử có thể hình thành theo kiểu vô tính

hoặc hữu tính (Bùi Xuân Đồng, 2000)

Bào tử vô tính Bao gồm các động bào tử, bào tử trần, bào tử kín Bào tử trần là

dạng bào tử phổ biến nhất

Hình 3 Các dạng bào tử trần của nấm sợi (nguồn: internet)

Sinh sản hữu tính Nấm sợi có các hình thức sinh sản hữu tính như: đẳng giao,

dị giao, và tiếp hợp Ngoài ra, lớp nấm Túi và nấm Đảm sinh sản hữu tính bằng bào tử

túi (ascospores) và bào tử đảm (basidiospores)

Hình 4 Sự tiếp hợp của nấm sợi (nguồn: internet)

2.2.2 Đặc điểm phân loại của nấm sợi

Trong tự nhiên có khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu loài nấm nhưng mới định tên

được khoảng 10.000 chi và 70.000 loài Trung Quốc đã điều tra được 40.000 loài Phân

loại vi nấm vẫn đang ở thời kỳ phân loại học hình thái (Phenetic classifications) dựa vào

đặc điểm hình thái, nuôi cấy, một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa và phương thức sinh

sản Trong những năm gần đây, tiến bộ của sinh học phân tử và kỹ thuật kính hiển vi

điện tử đã đem lại một diện mạo mới cho việc nghiên cứu phân loại học và sinh lý học

nấm (Nguyễn Lân Dũng, 2001)

Hiện nay, tồn tại các hệ thống phân loại nấm không thống nhất với nhau, chủ yếu là các hệ thống phân loại theo Ainsworth và cộng sự (1973), V.Arx (1981), Ainsworth & Bisby (1983), Kendrick (1992), Ainsworth & Bisby (1995), Alexopoulos

& Mins (1996), Robert A samson (1989), Saccardo P.A (1880- 1886), Barron G.L (1968), Ellis M.B (1971), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984), Barnett H.L và cộng sự (1972)

Trong đề tài này, chúng tôi dựa vào đặc điểm mô tả trong các khóa phân loại: Ainsworth G.C (1973), Saccardo P.A (cải tiến), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984), Đặng Hồng Miên, Nguyễn Đức Lượng (2003), Nguyễn Lân Dũng (2006) để phân loại

2.2.3 Khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học của nấm sợi

Nấm sợi được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhiều do khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học được ứng dụng rộng rãi, lợi ích kinh tế cao như: nguồn enzym, các chất kháng sinh, các axit hữu cơ, các chất có khả năng phân giải nguồn cacbonhydro, ứng dụng trong xử lý ô nhiễm MT do tràn dầu, khai thác các mỏ dầu trong lòng đất … (Nguyễn Lân Dũng, 1973; Nguyễn Xuân Thành, 2000)

- Hoạt tính enzym thủy phân ngoại bào

Enzym là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học trong và ngoài cơ thể Đến nay, các nhà khoa học đã tìm được khoảng 3.500 loại enzym, trong

đó phần lớn là enzym từ thực vật và VSV Nấm sợi có tiềm năng lớn nhất sinh các loại enzym ngoại bào mạnh, phân giải và chuyển hoá các hợp chất hữu cơ, vô cơ khó tan trong tự nhiên Một số enzym đã được tinh sạch, nghiên cứu kỹ và ứng dụng phổ biến như: cellulase, protease, amylase, pectinase và kitinase (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Enzym cellulase Xúc tác phân giải các hợp chất ligno - cellulose thành

glucose Ligno-cellulose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật gồm cellulose

(30%-40%), hemi-cellulose và lignin (15%-30%) Các chủng nấm sợi Trichoderma, Penicillium, Aspergillus….có khả năng sinh enzym cellulase được sử dụng trong sản

xuất thực phẩm, làm phân bón, xử lý chất thải hữu cơ chứa cellulose…(Hoàng Quốc Khánh, 2003)

Enzym protease Protein là các polyme cấu tạo từ các axit amin liên kết nhau

bằng liên kết peptid rất dễ bị cắt đứt tạo thành các chuỗi polypeptid ngắn Nấm sợi có

khả năng phân giải mạnh protein thường gặp thuộc các chi Aspergillus, Penicillium,…

Được sử dụng nhiều nhất trong công nghiệp bột giặt, sữa, bia, các lĩnh vực khác như

công nghiệp dược, công nghiệp thuộc da, công nghiệp thực phẩm, xử lý chất thải…(Đồng Thị Thanh Thu, 2004)

Enzym amylase Xúc tác quá trình thủy phân tinh bột, chất dự trữ chủ yếu của

thực vật thành đường glucose Tổ hợp phức hệ enzym amylase (α-amylase, β-amylase

và glucoamylase) sẽ cắt đứt các liên kết α-1,4-glucoside và α-1,6-glucoside trong phân

tử tinh bột để tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose Nấm sợi có khả năng phân giải tinh

bột nhanh chóng như Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Rhizopus, Mucor… được

ứng dụng trong sản xuất sirô, sản xuất bia, bánh mì, cồn, nước tương, nước chấm, trong chế biến thực phẩm gia súc, trong công nghiệp dệt…(Võ Thị Hạnh, 2004)

Enzym kitinase Kitin là các biopolyme chứa các gốc N-acetyl-glucozamin liên

kết với nhau bởi mối liên kết β-1,4-glucoside Trong đồng ruộng, lượng kitin trong xác,

vỏ tôm, cua, ốc…rất nhiều Nấm sợi Trichoderma, Glycladium, Chaetomium,… sinh

enzym kitinase phân giải kitin, đồng thời tăng cường hiệu quả tiêu diệt các loài nấm gây bệnh có thành tế bào là kitin, chống các loài côn trùng có vỏ kitin Như vậy, nấm sợi còn

có vai trò làm tác nhân kiểm soát sinh học chống các VSV gây bệnh và côn trùng có hại trong nông-lâm- ngư nghiệp (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Các chủng nấm sợi Acremonium, Aspergillus, Penicillium còn có khả năng sinh

enzym phân giải dầu mỏ và khí đốt là hợp chất có cấu tạo phức tạp và khó phân giải,

góp phần xử lý ô nhiễm dầu do các tai nạn chìm tàu dầu

Hình 5 Hoạt tính enzym của nấm sợi trên MT thạch

- Khả năng sinh kháng sinh của nấm sợi

Kháng sinh là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện tượng một VSV với sản phẩm trao đổi chất của mình có tác dụng kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của VSV khác.Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ nấm sợi chiếm tỉ lệ khá lớn, đa

số thuộc lớp nấm bất toàn Chất kháng sinh được sử dụng chủ yếu trong y học như: Cephaco-sporin-C, Griseofluvin, Penicillin là một thứ vũ khí chống lại các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não, bệnh viêm màng phổi, bạch cầu, uốn ván Trong phẫu thuật chữa các bệnh nhiễm trùng vết thương Chất kháng sinh được sinh ra nếu kết hợp với các enzym thủy phân protein là một trong những phương thức có nhiều triển vọng nâng cao hiệu quả điều trị của kháng sinh Những vấn đề về chất kháng sinh được sinh ra từ VSV đang là vấn đề quan tâm hàng đầu và phát triển mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực cuộc sống ngày nay (Nguyễn Thành Đạt, 2005)

- Khả năng sinh các axit hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng

Ngày nay, nhu cầu sử dụng axit hữu cơ ngày càng nhiều Các axit hữu cơ như axit axetic, axit lactic và một số axit hữu cơ khác được ứng dụng nhiều trong công nghệ chế biến mủ cao su, trong công nghiệp nhẹ và cả trong y học Năm 2004, Võ Thị Hạnh

đã nghiên cứu sản xuất axit xitric bằng nấm sợi A niger từ rỉ đường mía và bã khoai mì

Ngoài ra, các nhà khoa học Nhật Bản tổng hợp được chất kích thích sinh trưởng

Giberrelin từ hai chủng nấm sợi F monoforme và F oxysporum

Tuy nhiên, có rất nhiều loài nấm sợi mọc trên các nguyên vật liệu, đồ dùng, thực

phẩm, phá hỏng hoặc làm giảm chất lượng của chúng Một số nấm sợi tiết độc tố gây

ngộ độc hoặc có thể gây ung thư Ví dụ: A flavus sinh độc tố Aflatoxin gây ung thư

gan Một số gây bệnh cho người và động vật như hen suyễn, bạch huyết, nấm tay chân…, bệnh nấm rỉ sắt ở thực vật, bệnh vàng lùn, thối cổ bông ở lúa…

2.3 Enzym cellulase từ nấm sợi

Ngày nay, nguồn enzym từ VSV như amylase, cellulase, protease, kitinase…được chú ý nhiều nhất do có những ưu điểm: Có hoạt tính cao; khối lượng enzym thu được nhiều do tốc độ sinh sản của VSV nhanh; nguyên liệu rẻ tiền; có thể sản xuất theo quy mô công nghiệp….(Nguyễn Đức Lượng, 2000)

2.3.1 Khái quát về enzym

- Cấu trúc

Enzym là một loại protein được sinh vật tổng hợp nên và tham gia vào các phản

ứng sinh học Enzym có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 Dalton, được cấu tạo từ

L-axit amin liên kết nhau bởi liên kết peptid Bộ phận đặc hiệu tham gia phản ứng gọi là

trung tâm hoạt động của enzym

Enzym gồm 2 nhóm: Nhóm enzym một cấu tử gồm những enzym có thành phần

hóa học duy nhất là protein và nhóm enzym hai cấu tử gồm những enzym có hai thành phần: phần protein thuần gọi là apoenzym có vai trò xúc tác, phần thứ hai là coenzym

gồm những chất hữu cơ đặc hiệu có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác Ngoài ra, có một

số kim loại như Fe, Cu, Zn, Mn, …đóng vai trò liên kết giữa enzym và cơ chất, liên kết giữa apoenzym và coenzym, tham gia trực tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

- Cơ chế hoạt động

Hoạt động của phân tử enzym được biểu hiện trong trung tâm hoạt động Trung tâm hoạt động của enzym (E) có cấu trúc không gian tương ứng với cơ chất (S) mà chúng tham gia Phản ứng không có sẳn mà được hình thành trong quá trình enzym tiếp xúc với cơ chất giống như chìa khóa vào ổ khóa tạo thành enzym - cơ chất (E-S)

Cơ chế tác động của enzym vào cơ chất qua ba giai đoạn:

Giai đoạn 1: Enzym (E) tương tác với cơ chất (S) bằng những liên kết yếu tạo

Giai đoạn 2: Khi cơ chất (S) tạo phức với enzym (E) sẽ bị thay đổi cấu hình

không gian và mức độ bền vững các liên kết Các liên kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm

Giai đoạn 3: Enzym sẽ được giải phóng, cơ chất sẽ chuyển thành sản phẩm và

tách khỏi enzym

Phản ứng tổng quát:

E + S ←→ E-S → E + P

E- enzym (enzyme) ; S- cơ chất (substracte) ; P- sản phẩm (Products)

2.3.2 Cellulose và enzym cellulase

Trong số này có đến 30% là màng tế bào thực vật mà thành phần chủ yếu là cellulose Cellulose chiếm đến 89% trong bông và 40%-50% trong gỗ Cellulose là

polymer mạch thẳng, mỗi đơn vị là một disaccharit gọi là cellobiose có cấu trúc từ hai

phân tử D-glucose được nối với nhau qua liên kết β-D-1,4-glucoside Cellulose cấu tạo dạng sợi, các sợi liên kết lại tạo thành những bó nhỏ gọi là các micrôfibrin có cấu trúc không đồng nhất Có những phần đặc gọi là phần kết tinh và phần xốp hơn gọi là phần

vô định hình

Hình 6 Cấu trúc đơn vị cellulose (nguồn: http://www.Cellulose.mht)

Hình 7 Liên kết hydro trong cấu trúc phân tử của cellulose (nguồn:

enzym gọi là Citolase Cellulase là một phức hệ enzym bao gồm các enzym C1, Cx và

β-glucosidase tham gia những phản ứng kế tiếp nhau khi phân hủy cellulose tạo thành

glucose (Warzywoda, M.Lacbre, E.Pourqui, E.J 1992)

Hình 9 Cấu trúc enzym cellulase trong không gian

(nguồn: : http://www CAT INIST.mht.)

+ Enzym C1: Có tác dụng cắt đứt liên kết hydro biến cellulose tự nhiên thành

cellulose phản ứng (cellulose vô định hình)

+ Enzym Cx: Còn gọi là enzym β-1,4 glucanase, thuỷ phân cellulose phản ứng

thành cellobiose Enzym này được chia thành hai loại:

Endocellulase hay Endoglucanase (EG) (EC.3.2.1.4): Có tác dụng thủy phân liên kết β-1,4-glucozit tại các điểm bất kỳ trên mạch phân tử cellulose Được chia làm

hai loại EGI, EGII Cả hai loại enzym này có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao

Hình 10 Cấu trúc tinh thể của endoglucanase (nguồn: http://bioenergy.ornl.gov/99summaries/dbw3@cornell.edu)

Exocellulase hay exoglucanase (CBH) (EC.3.2.1.91): Phân giải chuỗi trên thành

disaccarit gọi là cellobiose từ đầu không khử Bao gồm hai loại CBHI và CBHII:

* CBHI có trọng lượng phân tử khoảng 65KD, chứa khoảng 496 axit amin

Enzym này tác động lên cellulose vô định hình, ưu tiên liên kết với vùng tinh thể của cellulose, không tác động lên cellulose biến tính như CMC

* CBHII có trọng lượng phân tử là 53KD, chứa khoảng 471 axit amin CBHII

liên kết với cả vùng tinh thể và vùng vô định hình, không tác động lên cellulose biến tính [52]

Hình 11 Cấu trúc CBH Hình 12 Vị trí cắt exoglucanase

(nguồn: http://www.nrel.gov/) + β-glucosidase hay cellobiase (EC.3.2.1.21): Thủy phân cellobiose thành

glucose Là nhóm enzym khá phức tạp, có khả năng hoạt động ở pH rất rộng từ 4,4 đến

8,4 Trọng lượng phân tử 50- 95 KD, có thể hoạt động ở nhiệt độ cao

Cơ chế hoạt động :

Cellulose phản ứng

Glucose Cellobiose

Cellulose

Hình 13 Cơ chế tác động của enzym cellulase (Lương Đức Phẩm, 1978)

Theo Mandels và Reese (1964), đầu tiên, enzym C1 phá vỡ liên kết hydrogen trong phân tử cellulose tạo thành cellulose phản ứng Sau đó Cx tiếp tục thủy phân cellulose phản ứng thành các phân tử cellobiose Cuối cùng, β-glucosidase phân cắt

cellobiose thành glucose

- Điều hoà sinh tổng hợp enzym cellulase

Khả năng sinh tổng hợp cellulase trong các loài nấm sợi được điều hòa ở mức độ phiên mã, mức độ mRNA mã hóa cho CBHI luôn cao nhất (Pettila, 1993) Tỷ lệ enzym

CBHI cao nhất chiếm khoảng 50% trong hổn hợp cellulase được tiết ra bởi T.reesei

(theo Gritzali và Brown, 1979), mức độ mã hóa các thành phần khác của enzym cellulase luôn ở trạng thái ổn định (Trần Thạnh Phong, 2004)

Quá trình sản sinh enzym cellulase được kiểm soát theo cơ chế cảm ứng và ức chế bởi glucose Cellulase được sinh ra khi nấm sợi sinh trưởng trên MT có chứa cellulose, dẫn xuất của cellulose, lactose, còn trên MT có chứa glucose, fructose hoặc glycerol thì cellulase không tạo thành enzym cellulase (Biaria và Mishra, 1989)

Hơn nữa, hoạt tính cellulase còn phụ thuộc vào sự có mặt của các chất ức chế trong MT nuôi cấy Nhiều hợp chất phenol đã được chứng minh là có tác dụng kìm hãm

sự phát sinh cellulase ở S commune (Hồ Sĩ Tráng, 2004)

Khi nuôi cấy nấm cũng xảy ra hiện tượng hoạt hóa cellulase Chẳng hạn, hai loại proteaza axit được tạo ra trong điều kiện phân hủy cellulose có khả năng làm tăng 10

lần hoạt tính endoglucanase của P chrysosporium (Hồ Sĩ Tráng, 2004)

Quá trình tổng hợp enzym cellulase cảm ứng còn chịu tác động của AMP vòng (AMPv) có tác dụng kích thích quá trình sao chép mã của các operon phân giải nhờ một

loại protein đặc biệt làm trung gian gọi là protein nhận AMPv (CAP) Khi AMPv kết

hợp với CAP tạo thành phức hợp có tác dụng hoạt hóa gen operator làm cho polymerase dễ dàng kết hợp với chúng để bắt đầu sao chép mã (Nguyễn Đức Lượng, 2001)

RNA-Nấm sợi chịu tác động trực tiếp của các yếu tố bên ngoài rất mạnh và phản ứng lại với tác động đó rất nhanh Vì thế, có thể sử dụng pH, nhiệt độ và đặc biệt là cơ chất

mà chúng tham gia phân hủy để điều khiển tổng hợp enzym Khi ta cho cơ chất với liều lượng tăng dần thì khả năng tổng hợp enzym cảm ứng sẽ tăng dần Nếu cứ tiếp tục tăng liều lượng cơ chất thì sẽ đến một mức nào đó quá trình này sẽ chựng lại và giảm do tăng

áp suất thẩm thấu bởi cơ chất (Nguyễn Đức Lượng, 2001)

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tạo thành enzym của nấm sợi trên MT lên men bán rắn

- Nguồn dinh dưỡng cacbon

Trong MT nuôi cấy nấm sợi sinh enzym cellulase nhất thiết phải có cellulose là chất cảm ứng và nguồn cacbon Nấm sợi có khả năng đồng hóa rất nhiều nguồn cacbon khác nhau Glucose là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào phản ứng trong ba chu trình

chuyển hóa: con đường Embden Meyerhof (1930), Pentose và Entner Doudoroff Cơ chất dùng để cảm ứng nấm sợi sinh enzym cellulase thường là giấy lọc, bông, bột cellulose, cám, lõi ngô, mùn cưa, bã mía, trấu, rơm, than bùn, CMC, …các chủng

Trichoderma nuôi trên MT có nguồn cacbon là giấy lọc cho hoạt tính enzym cao nhất

- Nguồn dinh dưỡng nitơ

Các nguồn nitơ thích hợp nhất đối với các VSV sinh cellulase là muối nitrat

Natri nirat làm cho MT kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp cellulase tùy vào đặc tính sinh lý của từng chủng Cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase, cao ngô

có khả năng sinh tổng hợp exoglucanase và endoglucanase mạnh hơn nấm men Nước chiết nấm men chủ yếu kích thích sự tạo thành endoglucanase, còn cao ngô kích thích CHBI và CBHII Tác dụng kích thích của các hợp chất này là do sự có mặt của các axit amin, các nguyên tố khoáng và những nhân tố kích thích sinh trưởng (Trần Thạnh

- Nguồn dinh dưỡng khoáng

Các chất khoáng như Fe, Mn, Zn, Mo, Cu… có vai trò quan trọng như tham gia

vào quá trình chuyển hóa vật chất qua màng và thành tế bào nấm sợi, tham gia vào thành phần cấu tạo prôtêin, enzym, điều hòa pH MT nuôi cấy nên ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp cellulase Nồng độ tối thích của Zn là 0,11- 2,2 (mg/l), Fe 2 - 10 (mg/l),

Mn 3,4 - 27,2 (mg/l) Biotin và Tiamin không có ảnh hưởng đến sự tổng hợp enzym này (Châu Hoàng Vũ, 2003)

- Ảnh hưởng của độ ẩm

Độ ẩm trong MT lên men bán rắn là hàm lượng nước có trong cơ chất rắn Các

cơ chất khác nhau có khả năng giữ nước khác nhau từ 30%- 80% (Moo-Young, 1983) Trong quá trình nuôi cấy nấm sợi thu enzym cellulase độ ẩm có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh enzym và hoạt tính của enzym Độ ẩm tối ưu để nuôi cấy nấm sợi là 50%-60%, nếu độ ẩm vượt quá 60% tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển, nếu độ ẩm

<60% gây hiện tượng tạo nhiều bào tử ở nấm sợi, hoạt tính của enzym sẽ giảm Kim

(1985) cho biết tốc độ sinh trưởng tối ưu của T reesei ở độ ẩm 60%, nhưng khả năng

sinh tổng hợp cellulase ở độ ẩm xấp xỉ 65% (Lê Thị Hồng Nga, 2005)

chủng nấm sợi khác nhau Nấm sợi Aspergillus, Penicillium và Rhizopus có thể giảm

pH của MT xuống dưới 3, Đối với các chủng nấm Trichoderma, Sporotrichum, Pleurotus, pH ổn định hơn ở khoảng 4 và 5 (Trần Thạnh Phong, 2004) Trong suốt quá

trình nuôi cấy nấm sợi ta có thể điều chỉnh pH của MT bằng axit HCl, H2SO4, NaOH,

KOH Durand (1988) đã điều chỉnh pH trong nuôi cấy T viride ở qui mô pilot trên MT

hạt cà phê-đường bằng cách phun dung dịch urea, do hoạt động của urease của nấm sợi làm tăng pH qua việc tạo ammonia (Phạm Ngọc Lan, 2005) Ngoài ra, việc điều chỉnh

pH thích hợp trong quá trình nuôi cấy nấm sợi hạn chế sự tạp nhiễm vi khuẩn làm ảnh hưởng đến hoạt tính enzym

- Ảnh hưởng nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh enzym cellulase Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của đa số nấm sợi từ 280C-320C, tối đa dưới 500C Nếu nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp có thể kìm hãm sự sinh trưởng thậm chí có thể giết chết sợi nấm, quá trình tổng hợp enzym sẽ bị ức chế Theo Raimbaut

& Alazard (1989) cho biết nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của A niger trên MT

bột khoai mì là 350C- 400C, ngược lại ở 450C, sự nảy mầm của sợi nấm bị ức chế, khả năng sinh enzym giảm (Trần Thạnh Phong, 2004)

- Ảnh hưởng của MT khí

MT không khí quan trọng nhất là khoảng không gian giữa các tiểu phần cơ chất,

vì đây là nơi mà sinh khối nấm sợi sinh trưởng Trong nuôi cấy nấm sợi sinh enzym cellulase, để tạo khả năng thoáng khí tốt hơn, người ta thường cho thêm trấu với lượng khoảng 20%- 25% sẽ làm tăng độ xốp của MT, tạo nên những khoảng trống để không khí có thể lưu thông trong lòng MT, đồng thời trấu còn là cơ chất cảm ứng cho sự tổng hợp của enzym cellulase (Lương Bảo Uyên, 2002)

- Ảnh hưởng của cơ chất và các chất kìm hãm

Ở giai đoạn đầu, khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng sẽ tăng, nhưng khi tốc độ phản ứng đạt cực đại, dù ta có tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng cũng sẽ hoàn toàn không có khả năng tăng theo Nguồn cacbon và nitrogen ảnh hưởng mạnh đến tốc độ sinh trưởng và hoạt tính enzym

Các chất kìm hãm là những chất hóa học có thể làm giảm hoặc mất hoạt tính

enzym, thường là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ… Các chất kìm hãm cạnh tranh

có cấu trúc không gian tương tự cấu trúc không gian của cơ chất nên sẽ kết hợp với enzym ở trung tâm hoạt động, kết quả là enzym không thể kết hợp được với cơ chất

Các chất kìm hãm không cạnh tranh kết hợp với enzym ở vị trí ngoài trung tâm hoạt

động của enzym làm giảm tốc độ phản ứng của enzym (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.3.4 Ứng dụng và sản xuất enzym cellulase

Enzym cellulase thu hút được sự chú ý của các nhà công nghệ vì chúng có thể được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực sau:

Ứng dụng trong xử lý chất thải hữu cơ chứa cellulose:

Các chất thải hữu cơ chứa cellulose thường là những chất rất khó phân hủy Trong điều kiện tự nhiên thời gian phân hủy rất lâu (trên 8 tháng), ở điều kiện khí hậu nhiệt đới Thời gian phân hủy các chất thải này càng lâu càng gây ô nhiễm đất, nước, không khí Các chất thải này cũng khó tham gia vào dây chuyền chuyển hoá vật chất của thiên nhiên, gây mất cân bằng sinh thái Để khắc phục tình trạng này, các nhà khoa học đã đưa vào khối ủ chế phẩm VSV giàu cellulase, kết quả là các chất thải bị phân hủy trong thời gian dưới 1 tháng, góp phần hạn chế MT (Lê Thị Thanh Thủy, 2001)

Ứng dụng trong sản xuất sản phẩm thực phẩm, thực phẩm gia súc:

Các sản phẩm thực phẩm được sản xuất từ các nguyên liệu thực vật chứa nhiều cellulose gây ra hiện tượng khó tiêu hóa ở người Người và những động vật không nhai lại thường thiếu VSV phân giải cellulose trong đường tiêu hóa Do đó, việc chế biến thực phẩm nhất là một số sản phẩm đồ hộp bằng chế phẩm cellulase có ý nghĩa làm tăng hiệu suất sử dụng thức ăn Nhiều nghiên cứu cho thấy việc thêm chế phẩm cellulase vào thực phẩm gia súc làm tăng trọng đàn lợn và tăng chất lượng thịt (Nguyễn Đức Lượng,

2004)

Ứng dụng làm phân bón VSV:

Các chế phẩm VSV có khả năng tổng hợp cellulase mạnh, khi được bón vào đất trồng có nhiều chất hữu cơ chứa cellulose sẽ phân hủy nhanh các chất hữu cơ tạo thành

mùn, giúp cây trồng phát triển nhanh (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Ứng dụng trong kỹ thuật di truyền:

Enzym cellulase sẽ phá vỡ thành tế bào thực vật để tạo tế bào trần, rất cần thiết trong quá trình chuyển gen của tế bào thực vật (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Ứng dụng trong công nghệ bột cellulose và giấy, công nghệ sợi dệt, công nghiệp chất tẩy rửa:

Đây là hướng được các nhà sản xuất quan tâm nhiều trong những năm gần đây

Sử dụng enzym cellulase để tách mực khỏi giấy báo và tạp chí cũ, cải thiện tính chất quang học cũng như độ bền cơ lý của giấy sản xuất từ bột khử mực Ở Mỹ, hơn 40% tổng lượng giấy sử dụng là bắt nguồn từ giấy loại, ở Nhật Bản khoảng 55%

Trong công nghệ sợi dệt, enzym này được sử dụng để xử lý quần áo bò, làm bóng vải bông, vải sợi nhân tạo giúp vải mềm mại hơn, độ hút ẩm tăng lên, bề mặt vải đẹp hơn

Trong công nghiệp chất tẩy rửa, các chất tẩy rửa chứa enzym cellulase làm sạch các chất bẩn trong lòng xơ bông tốt hơn sử dụng phương pháp tẩy rửa thông thường (Hồ

Sĩ Tráng, 2004)

Một số chế phẩm enzym cellulase trên thế giới và Việt Nam:

Ngày nay, trên thế giới và cả Việt Nam, các chế phẩm sinh học chứa các VSV

có khả năng sinh các loại enzym được sản xuất và sử dụng ngày càng rộng rãi và phổ biến trong các lĩnh vực chăn nuôi, trồng trọt,… Điều này giúp giảm bớt giá thành sản xuất, hạn chế được tình trạng ô nhiễm MT

Enzym cellulase kỹ thuật chủ yếu được thu nhận từ Trichoderma reesei, Aspergillus niger…và gần đây là các chủng vi khuẩn

Ở Đan Mạch, hãng Novo Nordisk có chế phẩm “Celluclast” dùng trong thức ăn gia súc

Ở Pháp, hãng Lyven dùng “Cellulases” từ T reesei và từ A niger trong công

nghiệp thực phẩm

Ở Nhật, hãng Amano hàng năm đã sản xuất trên 8000 tấn chế phẩm enzym các loại để dùng trong nông nghiệp Enzym “Panxenlase” chứa cellulase, hemicellulase, protease và amylase, hoạt tính dùng trong chăn nuôi Chế phẩm “Cellubrix”,

“Cellusoft”, “Onozuka” dùng trong công nghiệp làm mềm vải, trong thức ăn gia súc

Ở Canada, hãng Logen sử dụng “Cellulase” trong thức ăn gia súc, công nghiệp giấy, chế biến hạt, sản xuất ethanol

Ở Liên Xô (cũ), chế phẩm “Cellolignorin” được sử dụng trong chăn nuôi, hoạt tính 1-50 đơn vị/g, chứa cellulase, hemicellulase, pectinase

Ngoài ra, còn có các chế phẩm cellulase khác được tạo ra bởi các nhà sản xuất: Cellulaset và Novozyme 234 [NO], Econase C15 [AO], Rohament CT [RM], Avizyme [FR], Sumizyme c [SN], Meicelase MC [MJ], Cellulase TAP [AM], Cytolase [GR] (Lê Đức Mạnh, 2001)

Ở Việt Nam, Viện Sinh học nhiệt đới đã sản xuất các chế phẩm BioI, BioII, BioIII … có dạng bột, chứa các enzym amylase, protease, cellulase và các VSV dùng bổ

sung vào thức ăn cho bò, heo, cá Chế phẩm có tác dụng phòng chống các chứng rối loạn tiêu hóa, kích thích tăng trọng, giảm tiêu hao thức ăn, phân hủy những thức ăn thừa

và khí thải ở đáy ao…

Trung tâm Công nghệ sinh học Tp Hồ Chí Minh sản xuất chế phẩm Trichotech chứa vi nấm Trichoderma, chế phẩm này có dạng rắn, tơi xốp, nhẹ, màu xám nâu đậm,

giúp cây trồng chống được các loại nấm bệnh…

Công ty TNHH TM và sản xuất Mai Xuân (TP Hồ Chí Minh) sản xuất chế

phẩm TRICHO-MX chứa vi nấm Trichoderma, có dạng bột Có tác dụng hạn chế nấm

hại, cải tạo đất, ủ phân bón cho cây trồng

Công ty TNHH TM và sản xuất thuốc thú y- thuốc thủy sản Minh Dũng (Bình

Dương) đã sản xuất nhiều chế phẩm chứa vi nấm Aspergillus sinh enzym cellulase, dùng xử lý nước ao nuôi tôm cá, kích thích tiêu hóa, ở gia súc…như: MD-Bio-Zemix, Biofat, Bio vitamin, Biolaczym…(http//www.khoahoc.com)

CHƯƠNG III

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu

Đối tượng nghiên cứu:

- Các chủng nấm sợi được phân lập từ rơm, rạ ở các xã thuộc huyện Thoại Sơn:

xã Vĩnh Khánh, xã Vĩnh Trạch, xã Định Thành, xã Định Mỹ, xã Vĩnh Phú, xã Vĩnh Chánh Các điểm lấy mẫu cách nhau khoảng 200m

Hoá chất:

- Các hóa chất có nguồn gốc từ Việt Nam: Glucose, pepton, cazêin, kitin, tinh bột tan, agar, cồn đốt, nước cất

- Các hóa chất có nguồn gốc từ Trung Quốc: K2HPO4 , KH2PO4., KCl, NaCl,

lactophenol,xanh metylen Loeffler…

- Hóa chất có nguồn gốc từ Đức: thuốc thử DNS, Yeast extract, Malt extract…

- Hóa chất có nguồn gốc từ Nhật Bản: CMC, muối Seignet…

Thiết bị, dụng cụ

- Các thiết bị:

Nồi hấp vô trùng Huxlex (Đài Loan)

Tủ cấy vô trùng (Việt Nam)

Tủ sấy Memmert (Đức)

Tủ ấm Binder (Đức)

Tủ lạnh Hitachi (Tokyo, Nhật Bản) Máy đo pH Hana (Nhật) Máy li tâm Heraeus (Đức)

Cân phân tích điện tử Scientech (Mỹ) Máy chụp ảnh kỹ thuật số Olympus (Trung Quốc) Máy nghiền mẫu (Đức)

Máy đo độ ẩm Startrious (Đức) Máy đo quang phổ UV

- Các dụng cụ thí nghiệm: thước đo KL, lò điện, bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, diêm quẹt, que trang, que cấy, giấy quỳ, giấy lọc, giấy báo cũ, lame, lammel, bông mỡ, bông thấm nước…

Môi trường:

MT phân lập, nuôi cấy và giữ giống, định danh nấm sợi

MT1: MT Czapek- Dox cải tiến (Nguyễn Đức Lượng, 2003)

MT 2: MT Potato glucose agar (PGA) (Nguyễn Đức Lượng, 2003)

- Nước chiết khoai tây : 200 ml

- pH = 5,5- 6,0 Khử trùng 1atm trong 30 phút

* Cách chế nước chiết khoai tây

Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch Cân 200g, xắt lát, thêm 1 lít nước cất, đun sôi trong

30 phút Lọc lấy dịch trong

MT thử hoạt tính enzym bằng phương pháp khuếch tán trên thạch

MT 3: MT thử hoạt tính cellulase (Trần Thanh Thủy, 1999)

* Cách chiết kitin từ vỏ, đầu tôm

- Vỏ, đầu tôm rửa sạch, sấy khô

- Xử lý tách protein bằng dung dịch NaOH 4% ở 700C-750C/ 4 giờ, sau đó rửa sạch bằng nước cất

- Tách khoáng bằng dung dịch HCl 8% ở 260C- 300C/ 16 giờ, rửa sạch

- Sấy khô, xay nhuyễn thành dạng bột, bảo quản trong lọ thủy tinh

MT nuôi cấy nấm sợi tạo enzym

MT 7: MT xốp cơ sở (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

- Cám : 60%

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp phân lập mẫu theo Uyenco, 1988

a- Lấy mẫu và pha loãng mẫu

Tiến hành lấy mẫu ở các xã thuộc huyện Thoại Sơn: xã Vĩnh Khánh, xã Vĩnh Trạch, xã Định Thành, xã Định Mỹ, xã Vĩnh Phú, xã Vĩnh Chánh Các điểm lấy mẫu cách nhau khoảng 200m

Lấy các mẫu đất mặt, rơm vừa thu hoạch và rơm rạ đang bị phân hủy trên mặt đất

Hình 14 Vị trí lấy mẫu ở các xã thuộc huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang

(nguồn: internet)

Cách lấy: Dùng dao, kéo vô trùng cắt khoảng 20g mẫu cho vào túi nilon vô

trùng buộc kín, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu, ngày tháng, bảo quản trong thùng nước

đá vận chuyển về PTN và giữ ở tủ giống 40C Các mẫu được phân lập ngay không giữ quá 24 giờ

Lấy 10g mẫu rơm, đất, cho vào ống nghiệm, thêm 90ml nước cất vô trùng, lắc đều, mạnh ta được dung dịch pha loãng 10-1

Lắc đều, rồi hút 1 ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng ta được dung dịch pha loãng nồng độ 10-2

Tiếp tục pha loãng như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3, 10-4, 10-5

b- Cấy mẫu

Nhỏ 2 giọt dung dịch ở mỗi nồng độ lên đĩa petri chứa môi trường Czapek-dox Dùng que trang trải đều khắp mặt thạch Sau đó sử dụng que trang đó trải tiếp hai đĩa tiếp theo

c- Ủ mẫu

Lật ngược đĩa petri, gói vào giấy báo cũ, ủ ở nhiệt độ phòng từ 3 – 7 ngày Chọn

KL riêng rẽ cấy truyền sang ống nghiệm thạch nghiêng

d- Làm thuần

Lấy một khuẩn lạc riêng rẽ trong ống thạch nghiêng, hòa vào nước cất vô trùng, trải lên đĩa lần hai Nếu các dạng KL đồng đều, có màu sắc giống nhau, soi dưới kính hiển vi đều có một dạng tế bào chứng tỏ giống phân lập thuần khiết

Sau đó chọn KL riêng rẽ cấy truyền sang 3 ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm hình thái sinh lí, sinh hóa

3.2.2 Phương pháp bảo quản nấm sợi trên MT thạch có lớp dầu khoáng

Dầu khoáng là parafin hay vaselin, hấp vô trùng ở 1210C trong 2 giờ rồi sấy khô

ở 1700C trong 1- 2 giờ, để nguội

Chuẩn bị 3 ống giống đã nuôi ở nhiệt độ phòng và thời gian thích hợp Đổ lớp dầu khoáng đã vô trùng lên bề mặt Hàn kín ống nghiệm bằng parafin bảo quản ở nhiệt

độ 40C

3.2.3 Phương pháp quan sát đại thể nấm sợi

Nấm sợi sau khi cấy truyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo KL khổng lồ theo các bước sau:

- Cho vào ống nghiệm 5 ml nước cất vô trùng

- Dùng que cấy lấy một ít bào tử từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm Lắc đều tạo dung dịch huyền phù

- Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm điểm vào mặt thạch ở giữa hộp petri Làm 2,3 hộp

- Ủ ấm trong một tuần để tạo KL Hàng ngày lấy ra quan sát

Dùng kính lúp ba chiều soi mô tả các đặc điểm:

+ Kích thước KL để biết tốc độ phát triển của nó

+ Màu sắc KL mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc

+ Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên MT

+ Đặc điểm của mép KL

+ Giọt nước đọng, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt KL……

3.2.4 Phương pháp quan sát vi thể nấm sợi

- Chuẩn bị MT thích hợp, đổ một lớp thật mỏng (khoảng 1mm) trong các đĩa

petri

- Dùng khoan nút chai vô trùng có d = 8 mm, khoan các khối thạch

- Chuẩn bị các đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bông thấm nước, nước cất vô trùng

- Đặt 1 hoặc 2 khối thạch trên mỗi phiến kính Cấy một ít bào tử lên bề xung quanh khối thạch Đặt lá kính vô trùng lên trên bề mặt các khối thạch

- Các phiến kính có khối thạch cấy nấm sợi nghiên cứu được đặt trong các hộp petri có sẳn một ít bông thấm nước được làm ẩm bằng nước cất vô trùng Giữ các hộp

- Khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch có một giọt thuốc nhuộm lactophenol, ta được tiêu bản thứ nhất

- Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lá kính lên trên là ta được tiêu bản thứ hai

- Dùng kính hiển vi quan sát và vẽ mô tả các đặc điểm:

+ Hình dạng cuống sinh bào tử

+ Hình dạng thể bình

+ Hình dạng các thể bọng

+ Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn

+ Đặc điểm bào tử đính

+ Màu sắc, kích thước bào tử…

- Chụp hình trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400-1000 lần

3.2.5 Phương pháp xác định hoạt độ enzym ngoại bào của nấm sợi bằng phương pháp khuếch tán trên thạch

a Nguyên tắc

Cho enzym tác dụng lên cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân hủy, độ đục MT giảm, MT trở nên trong suốt Độ lớn của phần MT trong suốt phản ánh hoạt động của enzym Phương pháp này chỉ định tính enzym, chỉ đánh giá sơ bộ chứ chưa nghiên cứu sâu

b Tiến hành thí nghiệm

* Phương pháp khuếch tán trên MT thạch

- Thu dịch nuôi cấy: Lấy 10g MT nuôi cấy nấm sợi trên môi trường xốp đã ủ 3 ngày trong tủ ấm, sấy khô, nghiền với 100ml nước cất, ly tâm 10 phút, tốc độ quay 5000 vòng/ phút Thu được dịch enzym thô

- Dùng khoan nút chai vô trùng, khoan các lỗ thạch trên MT thử hoạt tính các enzym cellulase, protease, amylase, kitinase trên các đĩa petri Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch enzym vào các lỗ khoan Giữ các hộp petri ở tủ lạnh 40C trong 1- 2 giờ, sau

đó chuyển sang giữ trong tủ ấm trong 24 giờ Sau 24 giờ dùng thuốc thử lugol, HgCl2

nhỏ lên bề mặt thạch và đo đường kính vòng phân giải bằng thước đo khuẩn lạc

Bố trí thí nghiệm với 3 lần lặp lại

c Kiểm tra kết quả

- Kiểm tra hoạt tính cellulase, amylase, kitinase: Cả ba loại enzym này đều

dùng thuốc thử lugol nhỏ lên bề mặt thạch:

y Nếu nấm sợi có hoạt tính cellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL hoặc lỗ khoan chứa dịch enzym do cellulose bị phân giải.Vùng cellulose chưa bị phân giải có

màu tím hồng nhạt

y Nếu nấm sợi có hoạt tính amylase sẽ tạo vòng trong suốt xung quanh KL

hoặc lỗ khoan có chứa dịch enzym.Vùng tinh bột chưa bị phân giải có màu xanh tím đậm

y Nếu nấm sợi có hoạt tính kitinase, vùng kitin chưa bị phân giải có màu nâu

đỏ nhạt

- Kiểm tra hoạt tính protease: Dùng HgCl2 nhỏ lên bề mặt thạch Nếu nấm sợi sinh ra protease, sẽ có một vòng trong suốt quanh KL hoặc quanh lỗ khoan, do các phân tử protein bị phân giải không còn phản ứng với HgCl2 Vùng chứa protein chưa bị

phân giải có màu trắng đục do khi phản ứng vớI HgCl2 protein bị kết tủa

d Đánh giá khả năng tạo enzym

Đặt sấp hộp petri Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính KL (d), hoặc đường kính lỗ thạch (d=8mm)

Dựa vào kết quả (D-d, mm) để đánh giá hoạt tính enzym của các chủng nấm sợi Nếu giá trị (D-d) càng lớn thì khả năng sinh enzym của nấm sợi càng cao

Theo Mai Thị Hằng (2002) quy ước:

3.2.6 Phương pháp xác định hoạt độ enzym cellulase dựa vào lượng đường khử được tạo thành (định lượng đường khử bằng 3,5- Dinitrosalicylic acid) (Nguyễn Đức Lượng, 2003)

a Nguyên tắc

Hoạt động enzym được tính bằng đơn vị/ml môi trường Đơn vị hoạt động là lượng enzym mà ở điều kiện xác định 40 0 C, pH 5,0, sau 1 giờ phân giải cơ chất tạo thành 1mg glucoza

Phương pháp này dựa trên việc đo mật độ quang của phức màu đỏ cam đặc trưng tạo ra giữa đường khử và thuốc thử DNS ở dước sóng 540nm

- Dung dịch acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS): hòa tan 10g DNS vào 200ml dung dịch NaOH 2M (1)

- Sodium potassium tartrate: hòa tan 300g muối này vào 500ml nước (2)

- Dinitrosalicylic dùng cho phản ứng: trộn (1) vào (2), thêm nước cất cho đủ 1 lít

* Dựng đường glucose chuẩn

Hòa tan 100 mg glucose với 80 ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100

ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều, ta được dung dịch glucose nồng độ 1mg/ml Thực hiện một loạt 7 ống nghiệm theo bảng sau đây:

* Tiến hành phản ứng

- Hút 1ml dung dịch enzym cho vào ống nghiệm thử thật (ống TN), thay 1 ml

dung dịch đệm Na-acetate 50mM, pH 5 đối với ống đối chứng (ĐC)

- Đặt vào bể ổn nhiệt 400C/5 phút Đồng thời ta cũng để chai chứa lượng dung dịch CMC 1% thích hợp ở 400C/5 phút

đều Để phản ứng ở 400C chính xác 10 phút

- Thêm 2 ml dung dịch DNS, lắc đều để phản ứng enzym

- Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát

- So màu ở bước sóng 540nm, dựa theo đường glucose chuẩn tính được nồng độ glucose của mẫu thí nghiệm Đo 3 lần lặp lại thí nghiệm

3.2.7 Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận enzym cellulase

a Nguyên tắc:

Nấm sợi sử dụng chất dinh dưỡng có sẳn trong MT để sinh trưởng tạo thành một lượng lớn enzym ngoại bào lẫn trong MT, ta thu được sinh khối nấm sợi lẫn enzym thô

Nấm sợi được nuôi cấy trong ống nghiệm thạch nghiêng chứa MT PGA ủ trong

tủ ấm trong thời gian 4-5 ngày Rửa bào tử từ bề mặt thạch nghiêng với dung dịch chứa Tween 80 0,1%, thu được huyền phù bào tử của từng chủng

Cho vào bình tam giác chứa 30g MT xốp đã làm ẩm và hấp khử trùng ở 1atm trong 60 phút Nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong 3- 4 ngày

Sau khi nuôi đủ thời gian, thu lấy MT đem sấy nhẹ, có quạt gió ở nhiệt độ 400C

để đạt độ ẩm 8%- 12%, nghiền nhỏ, bảo quản trong chai, lọ sứ thuỷ tinh Chế phẩm này gọi là chế phẩm enzym thô (Nguyễn Đức Lượng, 2003)

3.2.8 Phương pháp ly trích enzym cellulase

Để giảm ảnh hưởng của đường tự do có trong môi trường lên men, đem tủa dịch lọc bằng cồn 960 đã làm lạnh theo tỉ lệ (1:3) Thu tủa và hòa lại bằng dung dịch đệm Na-acetate 50mM, pH5, ta được dịch enzym sử dụng trong các thí nghiệm

3.2.9 Phương pháp xác định các yếu tố ảnh hưởng của MT đến khả năng sinh enzym cellulase của nấm sợi

* Ảnh hưởng thời gian

Để xác định ảnh hưởng thời gian ta nuôi 3 chủng nấm sợi trên MT xốp cơ sở ở các thời gian khác nhau 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày Sau khi nuôi cấy, ly trích enzym và xác định hoạt độ cellulase theo phương pháp định lượng đường khử bằng 3,5- dinitrosalycylic

Bố trí thí nghiệm với 3 lần lặp lại

* Ảnh hưởng nguồn cacbon

Để xác định ảnh hưởng các nguồn cacbon khác nhau đóng vai trò là chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase, ta tiến hành nuôi các chủng nấm sợi trên MT bán rắn với tỉ lệ cacbon khác nhau như sau:

Bố trí thí nghiệm với 3 lần lặp lại Mẫu đối chứng là MT xốp cơ sở, pH5,5

* Ảnh hưởng độ ẩm

Để xác định ảnh hưởng độ ẩm đến sinh tổng hợp enzym cellulase ta cũng nuôi trên MT có nguồn cacbon và pH tốt nhất ở 2 thí nghiệm trên, điều chỉnh độ ẩm bằng nước biển vô trùng về các độ ẩm 50%, 55%, 60%, 65%, 70%

Bố trí thí nghiệm với 3 lần lặp lại Mẫu đối chứng là MT xốp cơ sở, độ ẩm 60

* Ảnh hưởng nhiệt độ

Để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ ta cũng nuôi trên MT có nguồn cacbon,

pH, độ ẩm tốt nhất ở 3 thí nghiệm trên và ủ ở các nhiệt độ khác nhau 250C, 300C, 500C,

- Dùng khoan nút chai khoan các khối thạch của MT có chứa VSV kiểm định

(E.coli, Bacillus subtilis)

- Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch kháng sinh vào các lỗ khoan

- Để trong tủ lạnh 40C trong 8 giờ để dịch kháng sinh khuếch tán vào trong thạch Sau đó chuyển sang tủ ấm 300C Kiểm tra vòng ức chế sau 24h

c Kiểm tra kết quả

Nếu nấm nghiên cứu sinh ra chất kháng sinh sẽ có một vòng trong suốt xung quanh khối thạch do các chất kháng sinh đã ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng tròn trong suốt (vòng vô khuẩn) xung quanh lỗ khoan Khả năng sinh kháng sinh được đáng giá bằng hiệu số (D-d, mm)

ý nghĩa 0,05

CHƯƠNG IV

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase từ rơm, rạ lúa

4.1.1 Phân lập các chủng nấm sợi từ rơm, rạ lúa

Tiến hành lấy mẫu từ đất mặt, rơm rạ vừa thu hoạch và đang bị phân hủy trên

mặt đất, đã phân lập được 54 chủng nấm sợi khác nhau Trong đó 28 chủng phân lập từ

đất mặt ruộng có rơm rạ đang phân hủy, 26 chủng phân lập được từ rơm, rạ chưa phân

hủy

Từ kết quả trên cho thấy ở đất ruộng sau khi thu hoạch với phần rơm, rạ lúa thải ra

bỏ lại trên đồng, chứa hệ nấm sợi vô cùng phong phú Chúng phân bố rộng rãi trên tất

cả các cơ chất như trên rơm, rạ tươi, đang phân hủy và cả trong đất Trong đó, các chủng nấm sợi có trong MT đất nhiều hơn trong rơm, rạ Điều này có thể giải thích do nấm sợi là VSV hiếu khí, do đó lớp đất mặt là nơi có nguồn O2 và nguồn thức ăn là xác

bã rơm, rạ, động vật, vỏ xác tôm cua, cá…đang bị phân hủy Đồng thời, với điều kiện đất ruộng có lượng nước ra vào thường xuyên, lớp đất mặt luôn giữ được độ ẩm thích hợp cho các chủng nấm sợi sinh trưởng phát triển Số chủng nấm sợi trên rơm, rạ ít hơn trong đất Do thức ăn chủ yếu là hợp chất hữu cơ giàu cellulose, không đủ các nguồn dinh dưỡng như trong đất Đồng thời, nước mưa sẽ làm rửa trôi lượng lớn bào tử nấm sợi Đặc biệt, trên rơm, rạ đang phân hủy số lượng nấm sợi nhiều hơn Vì đây là những

nguồn hữu cơ đang bị phân hủy, một phần đã phân giải thành glucose là nguồn cacbon

mà nấm dễ hấp thụ nhất

Do đó, nguồn rơm rạ sau thu hoạch với thành phần cellulose trên 40% rất khó phân hủy với điều kiện bình thường, nếu được sử dụng làm nguồn cơ chất cho VSV có mặt trong rơm, rạ và trong đất thì sẽ được phân hủy rất nhanh và trở thành nguồn phân bón rất tốt cho cây trồng đồng thời trả lại cho đất chất dinh dưỡng bị mất đi, hạn chế được tình trạng đất bạc màu, cằn cỗi Ngày nay xu hướng ủ rơm rạ tại ruộng sau khi thu hoạch, có bổ sung thêm các chế phẩm vi sinh được nông dân rất ưa chuộng và triển khai thực hiện ngày càng nhiều, điều này thể hiện sự tiến bộ của công nghệ sinh học được ứng dụng vào thực tiễn ngày càng rộng rãi

Như vậy, MT sống ở ruộng lúa có đầy đủ các yếu tố cần thiết cho nấm sợi sinh

trưởng và phát triển Chúng sử dụng các chất hữu cơ sẳn có để tồn tại, đồng thời tham gia phân hủy các chất thải, giúp giảm bớt ô nhiễm MT trong sản xuất nông nghiệp

Từ các chủng thuần khiết phân lập được nói trên, chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng nấm dựa trên khả năng sinh enzym cellulase của chúng

4.1.2 Tuyển chọn những chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase Tuyển chọn lần 1

Kiểm tra khả năng sinh enzym cellulase của 54 chủng nấm sợi theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch

Kết quả trình bày ở bảng 1

STT Kí hiệu

chủng

D-d (mm)

STT Kí hiệu

chủng

D-d (mm)

(Ghi chú : Số liệu là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm)

Phân tích số liệu từ bảng 1 dựa theo quy ước của Mai Thị Hằng (2002) cho thấy:

- Tổng số chủng có enzym : 54/54 chiếm 100%

+ Chủng sinh enzym mạnh : 7/54 chủng chiếm 12,9% + Chủng sinh enzym trung bình : 19/54 chủng chiếm 35,2% + Chủng sinh enzym yếu : 28/54 chủng chiếm 51,9%

Qua phân tích có thể kết luận các chủng nấm sợi từ rơm rạ lúa đều có khả năng sinh enzym cellulase Do nguồn thức ăn chủ yếu của nấm sợi sống trong rơm, rạ lúa là các hợp chất cellulose, hemicellulose nên chúng phải có khả năng tổng hợp enzym cellulase để phân giải các hợp chất cellulose khó phân hủy

Trong lớp đất mặt, hoạt tính enzym cellulase của các chủng nấm sợi cao hơn ở trên rơm, rạ lúa Ta thấy trên đất ngoài thức ăn là rơm, rạ mục còn có nhiều thành phần khó phân giải như rác rưởi, vỏ tôm, cua, ốc xác động vật….Nấm sợi phải cùng lúc tổng hợp nhiều loại enzym khác như protease, amylase, kitinase để phân hủy các thành phần này Do đó, nhờ tác động bổ trợ qua lại của các loại enzym mà làm tăng hoạt tính của enzym cellulase

Tuy nhiên, số chủng có hoạt tính enzym cellulase yếu khá lớn (28/54), chiếm 51,9%, trong khi số chủng có hoạt tính mạnh (7/54) chỉ chiếm 12,9% Thực tế, quá trình phân giải các hợp chất chứa cellulose trong tự nhiên diễn ra rất chậm, không chỉ dựa vào hệ nấm sợi mà phải có sự tham gia của các VSV khác như vi khuẩn, xạ khuẩn…để

Trong 54 chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase, chúng tôi bước đầu chọn 7 chủng có hiệu số D-d (mm) cao nhất để tiếp tục nghiên cứu (xem bảng 2)

Bảng 2 7 chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase cao