Đa dạng di truyền tập đoàn vi khuẩn cố định nitơ trong đất vùng rễ lúa ở đồng bằng sông cửu long và tuyển chọn một số dòng có khả năng cố định đạm cao cho canh tác lúa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ PHA ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ TRONG ĐẤT VÙNG RỄ LÚA Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN THỊ PHA

ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN VI KHUẨN

CỐ ĐỊNH NITƠ TRONG ĐẤT VÙNG RỄ LÚA

Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM CAO CHO CANH TÁC LÚA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành VI SINH VẬT HỌC

2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN THỊ PHA

ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN VI KHUẨN

CỐ ĐỊNH NITƠ TRONG ĐẤT VÙNG RỄ LÚA Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM CAO CHO CANH TÁC LÚA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành VI SINH VẬT HỌC

Mã ngành: 62 42 01 07

Người hướng dẫn khoa học PGS TS NGUYỄN HỮU HIỆP

2014

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn thầy PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp, người đã tận tình hướng dẫn khoa học, tư vấn thiết kế các thí nghiệm, hướng dẫn cách tiếp cận các kiến thức khoa học trong lĩnh vực nghiên cứu, từ đó giúp tôi hoàn thành luận án nghiên cứu sinh Xin chân thành cảm ơn và tri ân sâu sắc đến thầy

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cần Thơ, Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Phòng Đào Tạo, Phòng Quản Lý Khoa Học, Khoa Sau Đại Học và các phòng ban chức năng khác của trường Đại Học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi trong thực hiện các thủ tục, hỗ trợ kinh phí, trang thiết bị máy móc,…cho các nghiên cứu của luận

án

Chân thành cảm ơn quý thầy cô, các anh chị, các bạn đồng nghiệp thuộc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu

Xin cảm ơn anh Bùi Xuân Kỹ, Ông Phan Hoàng Nhiệm, anh Hứa Lập Điền đã hỗ trợ đất ruộng để triển khai thực hiện các thí nghiệm ngoài đồng Chân thành cảm ơn các em sinh viên thuộc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã cộng tác trong thời gian thực hiện luận án

Sau cùng xin được cảm ơn cha mẹ, những người thân trong gia đình, chồng

và hai con đã hết lòng động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn!

TÓM TẮT

Sản xuất lúa ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) chủ yếu sử dụng phân bón hóa học làm tăng giá thành sản phẩm và ảnh hưởng xấu đến độ phì của đất Ứng dụng vi khuẩn cố định đạm trên ruộng lúa là giải pháp hữu hiệu cải thiện

vấn đề này Đề tài luận án “Đa dạng di truyền tập đoàn vi khuẩn cố định nitơ trong đất vùng rễ lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long và tuyển chọn một số dòng

có khả năng cố định đạm cao cho canh tác lúa” đã được thực hiện từ tháng 6/2010 đến tháng 3/2014, nhằm mục tiêu i) Phân lập được tập đoàn vi khuẩn cố định đạm ở vùng đất quanh rễ lúa trồng trên 3 loại đất chính ở các tỉnh ĐBSCL (đất phù sa, đất phèn và đất mặn); ii) Khảo sát đa dạng di truyền tập đoàn vi khuẩn cố định đạm thông qua vùng gen 16S rDNA; và iii) Tuyển chọn được 2-

3 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm hữu hiệu, phù hợp với lúa trồng ở từng vùng sinh thái khác nhau

Tập đoàn vi khuẩn từ đất vùng rễ lúa các tỉnh ĐBSCL trên 3 loại đất được phân lập trên môi trường Burk không đạm, sau đó nhân sinh khối và xác định hàm lượng NH4+ bằng phương pháp Indophenol Blue Một trăm hai mươi dòng

vi khuẩn có hàm lượng đạm cao được khảo sát đa dạng di truyền thông qua vùng gen 16S rDNA bằng cặp mồi tổng 27F và 1495R kết hợp với enzyme cắt giới

hạn HaeIII Hai mươi dòng vi khuẩn có hàm lượng đạm cao nhất cho mỗi vùng

sinh thái được sử dụng để tuyển chọn các dòng tốt nhất qua khả năng cung cấp đạm cho cây lúa trong môi trường Yoshida không đạm, trong chậu ở điều kiện nhà lưới và đưa ra ngoài đồng ruộng

Ba trăm tám mươi dòng vi khuẩn đã được phân lập, tất cả đều có khả năng tổng hợp NH4+ Các dòng vi khuẩn phân lập có khuẩn lạc màu trắng trong và trắng đục, một số ít có màu vàng và nâu nhạt, độ nổi mô, bìa nguyên, bề mặt ướt, hình tròn chiếm ưu thế Tế bào vi khuẩn có ba dạng là hình que dài (2,5-3,4 µm), hình que ngắn (1,5-2,4 µm), và hình cầu, trong đó dạng que ngắn chiếm

ưu thế Đa số các dòng vi khuẩn thuộc nhóm Gram âm và đều có khả năng chuyển động Khảo sát đa dạng di truyền 120 dòng vi khuẩn cho thấy, sự tương đồng về vùng gen 16S rDNA được xác định ở mức 75% Các dòng vi khuẩn vùng sinh thái đất phù sa có mức tương đồng (80%) cao hơn so với sinh thái đất nhiễm phèn (77%) và mặn (75%) Kết quả tuyển chọn các dòng vi khuẩn xác định được 10 dòng vi khuẩn phân lập trên đất phèn, 8 dòng vi khuẩn của mỗi vùng đất phù sa và đất mặn, có hàm lượng đạm cố định cao nhất Bốn dòng vi khuẩn trên mỗi vùng sinh thái cung cấp đạm tốt nhất cho cây lúa trong môi trường Yoshida không đạm và 2 dòng vi khuẩn của mỗi vùng sinh thái có khả năng thay thế từ 25-50% phân đạm cho cây lúa trồng trong chậu ở nhà lưới, gồm AM3, TV2B7 (đất mặn), TN20, PH27 (đất phèn), CT1N2 và CTB3 (đất phù sa) Kết hợp định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử với đặc tính sinh lý, sinh hóa, xác định được các dòng vi khuẩn AM3, TV2B7, TN20, PH27, CT1N2

và CTB3 theo thứ tự có quan hệ gần nhất với các loài: Stenotrophomonas

maltophilia, Bacillus megaterium, Burkholderia tropica, Burkholderia sp.,

Ideonella sp và Serratia marcescens Ở điều kiện đồng ruộng, 6 dòng vi khuẩn

này có thể thay thế 25-50% phân đạm mà vẫn cho năng suất tương đương đối

chứng bón đầy đủ đạm Trong đó dòng vi khuẩn AM3 (Stenotrophomonas

maltophilia) chỉ thay thế được 25% phân đạm Các dòng còn lại đều thay thế

được 50% phân đạm, riêng dòng CTB3 (Serratia marcescens) còn cho năng

suất cao hơn đối chứng khi bón 75-100% phân đạm

Từ khóa: cố định đạm sinh học, canh tác lúa, đa dạng di truyền, enzyme cắt giới hạn,

vi khuẩn vùng rễ lúa

GENETIC DIVERSITY OF NITROGEN-FIXING BACTERIA GROUP

IN THE SOIL OF RICE RHIZOSPHERE IN THE MEKONG DELTA AND SELECTION OF SOME BACTERIA STRAINS WITH HIGH NITROGEN -FIXING CAPABILITY FOR RICE CULTIVATION

ABSTRACT

Rice production in the Mekong Delta mainly uses chemical fertilizers, which increases the cost of rice production and decreases the soil fertility Application of nitrogen-fixing bacteria on the rice fields is an effective solution for these problems Research thesis "Genetic Diversity of nitrogen-fixing bacteria group in the soil of rice rhizosphere in the Mekong Delta and selection of some bacteria strains with high nitrogen-fixing capability for rice cultivation" was carried out from June of

2010 to March of 2014, with the aims of: i) Isolation of nitrogen-fixing bacteria in the rice rhizosphere soil from 3 different categories of land in the Mekong Delta provinces (alluvial soil, alum soil and saline soils); ii) Survey of genetic diversity

of nitrogen-fixing bacteria via 16S rDNA region; and iii) Selection of 2-3 bacterial strains with a high nitrogen fixation effectiveness, replacement of as much as possible the chemical nitrogen for growth and grain yield of rice in different ecological areas

Groups of bacteria from rice rhizosphere soil in 3 soil categories of Mekong delta were isolated in the Burk medium without nitrogen supplement The NH4+synthesis of these bacterial strains after biomass multiplication was determined

by Indophenol Blue method One hundred twenty bacterial strains with high NH4+synthesis were used to survey genetic diversity through the 16S rDNA gene by

the general primers pairs 27F and 1495R, cloven by Endonuclease HaeIII

restriction enzymes Twenty bacterial strains having the highest NH4+ synthesis for each ecoregion were used to select the best bacteria strains through nitrogen fixing supply for rice plants in Yoshida medium without nitrogen supplement, in net-house conditions, and in the field experiments

Three hundred eighty bacterial strains were isolated from 3 soil categories of Mekong delta All of them could biosynthesize NH4+ In general, almost of isolated bacterial strains had translucent and opalescent colonies, some of them with yellow and light brown colour, convex elevation, margin of colonies was entire, moist texture, and circular shapes were predominant Bacterial cells had three types of long rods (2.5-3.4µm), short rods (1.5-2.4µm), and spherical shapes, in which the short rod shapes were predominant Almost of bacterial strains belonged to gram-negative group, and motile Survey of the genetic diversity of 120 bacteria strains showed that, the similarity of 16S rDNA gene was identified in 75% The bacterial strains isolated from alluvial soil had higher similarity levels (80%) than those of

the alum soil (77%) and saline soil (75%) Results of nitrogen fixing bacteria selection identified 10 bacterial strains isolated from alum soil and 8 strains of each alluvial soil and saline soil provided the highest NH4+ compounds Four bacterial strains on each ecoregion could replace 25-50% nitrogen supplied, consisted of AM3, TV2B7 (saline soil), TN20, PH27 (acid sulfate soils), and CTB3 and CT1N2 (alluvial soil) Based on the results of molecular biology technique and biochemical tests, strains AM3, TV2B7, TN20, PH27, CT1N2 and CTB3 were closest genetic

relationship with Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus megaterium,

Burkholderia tropica, Burkholderia sp., Ideonella sp and Serratia marcescens,

respectively In the field condition, these 6 bacterial strains could replace 25-50% chemical nitrogen fertilizer with the equivalent grain yield as positive control

(100%N), in which bacterial strain AM3 (Stenotrophomonas maltophilia) could

only replace 25% chemical nitrogen fertilizer The remaining strains could replace

up to 50% nitrogen supplied Especialy, CTB3 bacterial strain (Serratia

marcescens) could support higher grain yields with significant difference than

positive control when applied 75-100% nitrogen fertilizer

Key words: Biological nitrogen fixation, genetics diversity, restriction enzyme, rhizospheric bacteria, rice cultivation

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

CAM KẾT KẾT QUẢ

Tôi xin cam kết luận án “Đa dạng di truyền tập đoàn vi khuẩn cố định nitơ trong đất vùng rễ lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long và tuyển chọn một số dòng có khả năng cố định đạm cao cho canh tác lúa” này được hoàn thành

dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nào khác

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Pha

MỤC LỤC

TÓM TẮT i

ABSTRACT iv

CHƯƠNG I MỞ ĐẦU – TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu 2

1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.2.2 Nhiệm vụ nghiên cứu 3

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3

1.5 Những đóng góp của luận án 4

1.5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án 4

CHƯƠNG II TỔNG QUAN 6

2.1 Diện tích đất trồng lúa và hiện trạng sử dụng phân bón cho lúa ở ĐBSCL 6

2.1.1 Đặc tính nhóm đất phèn 6

2.1.2 Đặc tính nhóm đất mặn 9

2.1.3 Đặc tính nhóm đất phù sa 10

2.2 Hiện trạng sử dụng phân bón cho lúa ở ĐBSCL 12

2.2.1 Phân bón vô cơ 12

2.2.2 Phân bón hữu cơ 13

2.2.3 Phân bón vi sinh 13

2.3 Vai trò của phân đạm đối với cây lúa 16

2.4 Tổng quan về vi khuẩn vùng rễ (ENDORHIZOPHERICS) 17

2.4.1 Sự đa dạng của các chi vi khuẩn vùng rễ có khả năng cố định đạm 18 2.4.2 Bản chất quá trình cố định đạm ở vi sinh vật 22

2.4.3 Hệ thống cố định đạm tự do của vi sinh vật 25

2.5 Tổng quan về đa dạng di truyền vi khuẩn 26

2.5.1 Một số nhân tố ảnh hưởng đến đa dạng di truyền 28

2.5.2 Đa dạng di truyền vi sinh vật 28

2.6 Các phương pháp phân tích đa dạng vi sinh vật 29

CHƯƠNG III NỘI DUNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

3.1 Nội dung nghiên cứu 33

3.2 Phương tiện nghiên cứu 33

3.2.1 Vật liệu 33

3.2.2 Dụng cụ 34

3.2.3 Thiết bị thí nghiệm 34

3.2.4 Hóa chất và môi trường nuôi cấy vi khuẩn 34

3.3 Phương pháp nghiên cứu 35

3.3.1 Thu mẫu đất vùng rễ lúa 35

3.3.2 Phân lập vi khuẩn 36

3.3.3 Khảo sát hình thái khuẩn lạc và vi khuẩn 37

3.3.4 Kiểm tra hoạt tính cố định đạm của các dòng vi khuẩn 37

3.3.5 Khảo sát đa dạng di truyền vùng gen 16S rDNA của các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR- RFLP 40

3.3.6 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao đối với cây lúa ở điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới 42

3.3.7 Định danh các dòng vi khuẩn cho hiệu quả tốt với cây lúa trong điều kiện nhà lưới 49

3.3.8 Đánh giá hiệu quả cố định đạm sinh học của các dòng vi khuẩn với cây lúa cao sản trồng ở điều kiện ngoài đồng 52

3.3.8.1 Sinh thái đất phù sa 52

3.3.8.2 Sinh thái đất phèn 54

3.3.8.3 Sinh thái đất mặn 55

3.4 Tóm tắt các nội dung thí nghiệm 56

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 58

4.1 Phân lập vi khuẩn cố định đạm vùng rễ lúa tại 06 tỉnh vùng ĐBSCL 58

4.1.1 Kết quả thu mẫu đất vùng rễ 58

4.1.2 Kết quả phân lập vi khuẩn vùng rễ cố định đạm 58

4.2 Khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn phân lập 61

4.2.1 Sinh thái đất phù sa 61

4.2.1 Sinh thái đất phèn 63

4.2.3 Sinh thái đất nhiễm mặn 64

4.3 Khảo sát đa dạng di truyền tập đoàn vi khuẩn cố định đạm thông qua vùng gen 16S rDNA bằng kỹ thuật PCR kết hợp enzyme cắt giới hạn 65

4.4 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao cho canh tác lúa 87

4.4.1 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao đối với cây lúa ở điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới 88

4.4.2 Định danh các dòng vi khuẩn cho hiệu quả tốt với cây lúa trong điều kiện nhà lưới 106

4.4.3 Đánh giá hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn tuyển chọn đối với lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng 116

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 132

5.1 Kết luận 132

5.2 Đề nghị 132

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Diện tích các loại đất chính vùng ĐBSCL 6

Bảng 2.2 Biến động một số thông số của đất phèn vùng ĐBSCL 8

Bảng 2.3 Biến động một số tính chất của đất mặn vùng ĐBSCL 9

Bảng 2.4 Biến động một số tính chất của đất phù sa chua 11

Bảng 2.5 Biến động một số tính chất của đất phù sa ít chua 11

Bảng 2.6 Nhu cầu phân bón cho lúa ở ĐBSCL qua các thời kỳ 13

Bảng 2.7 Vi sinh vật lưu trữ làm phân bón 15

Bảng 2.8 Đặc điểm và chức năng của các gen nif trong hệ thống gen nif của vi sinh vật có khả năng cố định đạm 23

Bảng 2.9 Danh sách các chi vi khuẩn cố định đạm trên ruộng lúa ngập nước 25

Bảng 3.1 Công thức môi trường Burk không N (Park et al., 2005) 34

Bảng 3.2 Thành phần của dãy đường chuẩn NH4+ 38

Bảng 3.3 Mô tả giá trị đường chuẩn NH4+ 39

Bảng 3.4 Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR 41

Bảng 3.5 Chu kỳ phản ứng PCR 41

Bảng 3.6 Các nghiệm thức trong thí nghiệm 43

Bảng 3.7 Đặc tính đất thí nghiệm trong chậu thu ở Cần Thơ 45

Bảng 3.8 Các nghiệm thức được bố trí trong thí nghiệm 46

Bảng 3.9 Đặc tính đất thí nghiệm trong chậu thu ở Hòa An, Hậu Giang 48

Bảng 3.10 Đặc tính đất thí nghiệm trong chậu thu ở Cầu Ngang, Trà Vinh 49

Bảng 3.11 Đặc tính đất thí nghiệm đồng ruộng tại Huyện Thới Lai, Cần Thơ 52

Bảng 3.12 Đặc tính đất thí nghiệm đồng ruộng tại Vị Thủy Hậu Giang 55

Bảng 3.13 Đặc tính đất thí nghiệm đồng ruộng tại Trà Cú, Trà Vinh 55

Bảng 4.1 Tổng hợp các dòng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ lúa 58

Bảng 4.2 Tổng hợp đặc điểm khuẩn lạc các dòng vi khuẩn 59

Bảng 4.3 Tổng hợp đặc điểm tế bào vi khuẩn 60

Bảng 4.4 Chênh lệch nồng độ NH4+ trung bình và chiều hướng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn trong cùng 1 nhóm có mức tương đồng 100% 79

Bảng 4.5 Hàm lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn tổng hợp được ở ba vùng sinh thái 88

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn phân lập từ sinh thái đất phù sa lên sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa OM 6976 giai đoạn 20 ngày tuổi 89

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của 4 dòng vi khuẩn tuyển chọn từ sinh thái đất phù

sa đến sự sinh trưởng và phát triển của giống lúa OM6976 trồng

trong chậu 92

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của 10 dòng vi khuẩn tuyển chọn từ sinh thái đất nhiễm phèn lên sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa OM6976 giai đoạn 20 ngày tuổi 94

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của 6 dòng vi khuẩn tuyển chọn từ sinh thái đất phèn lên sự sinh trưởng cây lúa OM 6976 giai đoạn 20 ngày tuổi ở pH=3 96 Bảng 4.10 Chênh lệch về chiều cao cây và khối lượng chất khô của các NT giữa 2 môi trường (pH3-pH5) 97

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của 4 dòng vi khuẩn tuyển chọn từ sinh thái đất phèn đến sự sinh trưởng và phát triển của giống lúa OM6976 trồng trong chậu 98

Bảng 4.12 Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn phân lập từ đất nhiễm mặn đến sự sinh trưởng của lúa OM6976 ở giai đoạn 20 ngày tuổi 102

Bảng 4.13 Ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn phân lập từ đất nhiễm mặn đến cây lúa OM6976 giai đoạn 20 ngày tuổi trong môi trường Yoshida không đạm có bổ sung 4‰ NaCl 103

Bảng 4.14 Biến động chiều cao cây và khối lượng chất khô của cây lúa giữa hai môi trường Yoshida không đạm có và không bổ sung NaCl 103

Bảng 4.15 Ảnh hưởng của bốn dòng vi khuẩn đối với giống lúa OM6976 trồng trong chậu 104

Bảng 4.16 Đặc tính 6 dòng vi khuẩn tuyển chọn 107

Bảng 4.17 Kết quả giải trình tự 6 dòng vi khuẩn tuyển chọn 109

Bảng 4.18 Đặc tính của một số loài thuộc chi Burkholderia 112

Bảng 4.19 Đặc tính một số loài thuộc chi Stenotrophomonas 113

Bảng 4.20 Đặc tính một số loài thuộc chi Bacillus 115

Bảng 4.21 Hiệu quả của 2 dòng vi khuẩn và các mức phân đạm hóa học đến sinh trưởng của giống lúa OM6976 trên đất phù sa, vụ Hè thu 2013 117 Bảng 4.22 Hiệu quả của 2 dòng vi khuẩn và các mức phân đạm hóa học đến các thành phần năng suất của giống lúa OM6976 trên đất phù sa, vụ Hè thu 2013 118

Bảng 4.24 Hiệu quả của 02 dòng vi khuẩn và các mức phân đạm hóa học đến các thành phần năng suất của giống lúa OM10424 trên đất phèn tại Hậu Giang vụ Thu Đông 2013 122

Bảng 4.25 Hiệu quả cung cấp đạm của 2 dòng vi khuẩn và các mức đạm khác nhau đến sinh trưởng của cây lúa OM9921 trên đất nhiễm mặn, tại Trà Vinh vụ Đông xuân 2013-2014 126

Bảng 4.26 Hiệu quả cung cấp đạm của 2 dòng vi khuẩn và các mức phân đạm hóa học đến các thành phần năng suất của giống lúa OM9921 trên đất nhiễm mặn, tại Trà Vinh vụ Đông xuân 2013-2014 127

TV112; B: khuẩn lạc dòng CTB3 59 Hình 4.2 Nhuộm Gram tế bào độ phóng đại 400 lần A: Gram âm dòng CT1N2; B: Gram dương dòng CT1N3 60 Hình 4.3 Hàm lượng NH4+ của 112 dòng vi khuẩn qua 2, 4, 6 ngày khảo

sát Error! Bookmark not defined

Hình 4.4 Hàm lượng NH4+ của 90 dòng vi khuẩn qua 2, 4, 6 ngày khảo

sát 64 Hình 4.5 Hàm lượng NH4+ của 178 dòng vi khuẩn qua 2, 4, 6 ngày khảo sát 65 Hình 4.6 Sản phẩm PCR vùng gen 16S rDNA của các dòng vi khuẩn

phân lập từ Cần Thơ được phân cắt bằng RE HaeIII 66

Hình 4.7 Sản phẩm PCR vùng gen 16S rDNA của các dòng vi khuẩn phân lập từ Cần Thơ và Vĩnh Long được phân cắt bằng RE

HaeIII 67

Hình 4.8 Cây phân nhóm di truyền 20 dòng vi khuẩn phân lập từ đất vùng

rễ lúa tỉnh Cần Thơ theo phương pháp UPGMA sử dụng phần mềm NTSYSpc 2.0 67 Hình 4.9 Sản phẩm PCR vùng gen 16S rDNA của các dòng vi khuẩn

phân lập từ Vĩnh Long cắt bởi HaeIII 69

Hình 4.10 Cây phân nhóm di truyền 20 dòng vi khuẩn phân lập từ đất vùng rễ lúa tỉnh Vĩnh Long theo phương pháp UPGMA sử dụng phần mềm NTSYSpc 2.0 69 Hình 4.11: Sản phẩm PCR vùng gen 16S rDNA của các dòng vi khuẩn

phân lập từ Đồng Tháp cắt bởi HaeIII 71

Hình 4.12 Cây phân nhóm di truyền 20 dòng vi khuẩn phân lập từ đất vùng rễ lúa tỉnh Đồng Tháp theo phương pháp UPGMA sử dụng phần mềm NTSYSpc 2.0 71 Hình 4.13 Sản phẩm PCR vùng gen 16S rDNA của các dòng vi khuẩn phân

lập từ Hậu Giang, Trà Vinh, Đồng Tháp và Cần Thơ cắt bởi HaeIII 73

Hình 4.14 Cây phân nhóm di truyền 20 dòng vi khuẩn phân lập từ đất vùng rễ lúa tỉnh Hậu Giang theo phương pháp UPGMA sử dụng phần mềm NTSYSpc 2.0 74 Hình 4.15 Sản phẩm PCR vùng gen 16S rDNA của các dòng vi khuẩn

phân lập từ Trà Vinh cắt bởi HaeIII 75

Hình 4.16 Cây phân nhóm di truyền 20 dòng vi khuẩn phân lập từ đất vùng rễ lúa tỉnh Trà Vinh theo phương pháp UPGMA sử dụng phần mềm NTSYSpc 2.0 76 Hình 4.17 Sản phẩm PCR vùng gen 16S rDNA của các dòng vi khuẩn

phân lập từ Kiên Giang cắt bởi HaeIII 77

Hình 4.18 Cây phân nhóm di truyền 20 dòng vi khuẩn phân lập từ đất vùng rễ lúa tỉnh Kiên Giang theo phương pháp UPGMA sử dụng phần mềm NTSYSpc 2.0 78 Hình 4.19 Cây phân nhóm di truyền 40 dòng vi khuẩn phân lập trên đất phù

sa theo phương pháp UPGMA sử dụng phần mềm NTSYSpc 2.0 80 Hình 4.20 Cây phân nhóm di truyền 40 dòng vi khuẩn phân lập trên đất phèn theo phương pháp UPGMA sử dụng phần mềm NTSYSpc 2.0 81 Hình 4.21 Cây phân nhóm di truyền 40 dòng vi khuẩn phân lập trên đất nhiễm mặn theo phương pháp UPGMA sử dụng phần mềm

NTSYSpc 2.0 82 Hình 4.22 Cây phân nhóm di truyền 120 dòng vi khuẩn phân lập trên 3 vùng sinh thái khác nhau (phù sa, phèn và mặn) theo phương pháp UPGMA sử dụng phần mềm NTSYSpc 2.0 84 Hình 4.23 Chiều cao cây lúa OM 6976 20 ngày tuổi 90 Hình 4.24 Bông lúa OM 6976 của các NT ở mức phân bón 75%N 100 Hình 4.25 Khả năng làm đổi màu môi trường NFB của 6 dòng vi khuẩn sau 4 ngày chủng 108

Hình 4.26: Ảnh chụp dòng CTB3 (Serratia marcescens) dưới kính hiển vi

Hình 4.33 Ảnh hưởng của 02 dòng vi khuẩn cố định đạm và các mức phân đạm lên năng suất thực tế của giống lúa OM10424 tại Hậu Giang vụ Thu Đông 2013 124 Hình 4.34 Giống lúa OM 9921 ở mức phân bón 75%N 126 Hình 4.35 Ảnh hưởng của 02 dòng vi khuẩn cố định đạm và các mức phân đạm lên năng suất thực tế giống lúa OM9921 tại Trà Vinh vụ

Đông xuân 2013-2014 128

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

16S rDNA: 16S-ribosomal Deoxyribose nucleotide acid

AM: An Minh

ARA: Acetylene reduction assay

CĐNN&CNSTH: Cao Đẳng Nông Nghiệp và Công Nghệ Sau Thu Hoạch cm: centimet

DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

ĐH KHTN: Đại học Khoa Học Tự Nhiên

ĐHCT: Đại học Cần Thơ

ĐHNL TPHCM: Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

ĐHNNHN: Đại học Nông Nghiệp Hà Nội

ĐHQGHN: Đại học Quốc Gia Hà Nội

KH&CNVN: Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

KHKTNNMN: Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam

KHLN: Khoa Học Lâm Nghiệp

NCBI: National centre for biotechnology information

NHTN: Nông Hóa Thổ Nhưỡng

Nif: nitrogen fixing

NT: Nghiệm thức

PCR: Polymerase chain reaction

PH: Phụng Hiệp

RE: Restriction Enzyme

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism T/ha: Tấn/ha

TGGE: Temperature Gradient Gel Electrophoresis TN: Tam Nông

TV: Trà Vinh

ƯDCN: Ứng Dụng Công Nghệ

VL: Vĩnh Long

VSV: Vi sinh vật

CHƯƠNG I

MỞ ĐẦU – TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây lúa có vị trí quan trọng đặc biệt ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) Theo số liệu thống kê năm 2012 diện tích trồng lúa cả năm của ĐBSCL là 4181,3 nghìn ha (cả nước là 7753,2 nghìn ha) đóng góp hơn 50% sản lượng lúa cả nước (24293 nghìn tấn trong 43661,8 nghìn tấn của cả nước) Lượng gạo xuất khẩu của vùng trong năm 2012 chiếm 90% tổng lượng gạo xuất khẩu của cả nước (Tổng cục Thống kê Việt Nam, 2013) Mặc dù Việt Nam là nước xuất khẩu gạo lớn thứ 2 trên thế giới nhưng nông dân vẫn nghèo do giá gạo xuất khẩu rất thấp so với giá thành sản xuất Một trong những yếu tố làm tăng giá thành sản xuất lúa gạo phải kể đến đầu tiên là phân bón Với chu kỳ canh tác liên tục 3 vụ lúa/năm ở các tỉnh ĐBSCL và tập quán canh tác lúa của nông dân lấy đi cả nguồn hữu cơ là rơm rạ để trồng nấm hay đốt đồng sạ chay làm cho đất ngày càng suy kiệt dinh dưỡng Đồng thời việc nông dân chỉ sử dụng phân bón hóa học theo trào lưu chung của thế giới hiện nay mà không quan tâm tới việc bón phân hữu cơ làm cho đất có nguy cơ bị thoái hóa, không những giảm hiệu quả sử dụng phân bón mà còn gia tăng ô nhiễm môi trường Trong 12 nguyên tố thiết yếu cần phải cung cấp cho cây trồng nói chung thì nông dân vùng ĐBSCL chủ yếu tập trung bón cho lúa các nguyên tố đa lượng NPK với một lượng lớn (80-120 kg N/ha/vụ, 40-60 kg P2O5/ha/vụ và 30-60 kg

K2O/ha/vụ) Tuy nhiên, hiệu quả sử dụng các loại phân bón này chưa cao và tùy thuộc vào trạng thái tồn tại của chúng trong đất, phương pháp bón phân, khả năng lưu trữ phân của đất, điều kiện môi trường đất và hoạt động của các vi sinh vật trong đất Trong các nguyên tố đa lượng, cây lúa có nhu cầu về phân đạm lớn nhất và thường phân đạm có hiệu quả tức thời làm cho cây sinh trưởng mạnh ngay sau khi bón do vậy nông dân thường lạm dụng bón nhiều phân đạm và không cân đối với các loại phân bón khác làm giảm năng suất, chất lượng nông sản (Phạm Sỹ Tân và Chu Văn Hách, 2012) Theo Võ Minh Kha (2003) cây lúa chỉ sử dụng được từ 50–60% lượng phân bón vào, phần còn lại bị cố định ở trong đất, thất thoát do bị rửa trôi, phản đạm hóa và bay hơi vì thế gây ô nhiễm môi trường

Xuất phát từ những nguyên nhân trên, việc nghiên cứu và ứng dụng phân đạm sinh học (được tổng hợp từ vi sinh vật) ngày càng được quan tâm nhiều hơn Phân bón vi sinh trong nông nghiệp ngày càng trở thành cụm từ phổ biến

và thân quen hơn không chỉ đối với các nhà nghiên cứu mà còn đối với người trực tiếp canh tác Các nghiên cứu về vi sinh vật có ích trong trồng trọt ngày

càng được thực hiện nhiều hơn và hiệu quả của nhóm vi sinh vật này ngày càng được khẳng định Vi sinh vật cố định đạm cộng sinh với rễ cây họ đậu đã được

nghiên cứu và ứng dụng từ hơn 30 năm nay (Keyser et al., 1982) và đã trở nên

phổ biến trong sản xuất Vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ lúa có khả năng

cố định đạm cũng đã được khá nhiều tác giả công bố (Gillis et al., 1995; Tran Van et al., 2000; Menard et al., 2007…) Tuy nhiên, ứng dụng vi sinh vật cố

định đạm trong canh tác lúa thì còn nhiều hạn chế Khảo sát sự đa dạng của các chủng vi khuẩn này có vai trò rất quan trọng trong việc tìm ra những dòng có nhiều ưu điểm và thích hợp với cây lúa của vùng ĐBSCL Bên cạnh đó, sự tương tác giữa vi khuẩn và cây chủ trong đó có cây lúa vẫn luôn là vấn đề rất phức tạp Kết quả thực tế cho thấy tính hiệu quả của vi khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào tương tác vi khuẩn - cây chủ (host plant) cũng như điều kiện sinh thái

của môi trường (Rao and Rao, 1985; Ladha et al., 1986; Patnaik et al., 1994)

Một chủng vi khuẩn có thể cho tác động tốt trong điều kiện phòng thí nghiệm nhưng lại kém hiệu quả khi khảo sát ở điều kiện thực tế đồng ruộng (với rất nhiều yếu tố môi trường rất khó kiểm soát) và ngược lại Chính điều này làm cho việc ứng dụng phân bón sinh học từ các chủng vi khuẩn chưa được áp dụng rộng rãi trong sản xuất vì tính ổn định của các loại phân bón này không cao

Đề tài “Đa dạng di truyền tập đoàn vi khuẩn cố định nitơ trong đất vùng rễ lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long và tuyển chọn một số dòng có khả năng cố định đạm cao cho canh tác lúa” được tiến hành nhằm cung cấp

một cái nhìn tổng quan về các chủng vi khuẩn vùng rễ lúa, đồng thời tìm ra một

số chủng vi khuẩn có khả năng cố định nitơ phù hợp với lúa trồng vùng ĐBSCL, góp phần giảm lượng phân bón hóa học cho lúa nhưng vẫn ổn định về năng suất cũng như hạn chế ô nhiễm môi trường - một vấn đề cấp bách của toàn thế giới trong thời điểm hiện tại cũng như tương lai

1.2 Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu

1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu

 Phân lập được tập đoàn vi khuẩn cố định đạm ở vùng đất quanh rễ lúa trồng trên 3 loại đất chính ở các tỉnh ĐBSCL (đất phù sa, đất phèn và đất mặn)

 Tìm ra được 2-3 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm hữu hiệu phù hợp với lúa trồng ở từng vùng sinh thái khác nhau (đất phù sa, đất phèn

và đất mặn) vùng ĐBSCL

 Khảo sát đa dạng di truyền tập đoàn vi khuẩn cố định đạm thông qua vùng gen 16S rDNA

1.2.2 Nhiệm vụ nghiên cứu

Phân lập vi khuẩn từ đất vùng rễ lúa của 6 tỉnh thành thuộc đồng bằng sông Cửu Long đại diện cho ba vùng sinh thái với Thành Phố Cần Thơ và tỉnh Vĩnh Long đại diện cho sinh thái đất phù sa; tỉnh Đồng Tháp và tỉnh Hậu Giang đại diện cho sinh thái đất nhiễm phèn; tỉnh Trà Vinh và Kiên Giang đại diện cho sinh thái đất nhiễm mặn

Tuyển chọn các dòng vi khuẩn cho từng vùng sinh thái bằng các thí nghiệm

in vitro trong phòng thí nghiệm, các thí nghiệm thực nghiệm trong điều kiện

nhà lưới và ngoài đồng Khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa và giải trình tự các dòng vi khuẩn tuyển chọn

Sử dụng cặp mồi tổng để khuếch đại vùng gen 16S rDNA của các dòng vi khuẩn cố định đạm hiệu quả trong phòng thí nghiệm và sử dụng enzyme cắt giới

hạn HaeIII thuộc nhóm endonuclease để khảo sát sự khác biệt của vùng gen này

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: các dòng vi khuẩn vùng rễ lúa có khả năng cố

định đạm

Phạm vi nghiên cứu: Các dòng vi khuẩn vùng rễ lúa thu từ các mẫu đất

thuộc 6 tỉnh thành thuộc khu vực ĐBSCL bao gồm thành phố Cần Thơ, tỉnh Vĩnh Long, tỉnh Hậu Giang, tỉnh Đồng Tháp, tỉnh Trà Vinh và tỉnh Kiên Giang

có khả năng cố định đạm

1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Quyết định công nhận Nghiên cứu sinh số 720/QĐ-ĐHCT ngày 22/6/2010 của Trường Đại Học Cần Thơ

- Thời gian đào tạo hệ không tập trung là 4 năm (6/2010 đến 6/2014) theo quyết định giao đề tài và ngươi hướng dẫn Nghiên cứu sinh số 4088/QĐ –ĐHCT ngày 26/12/2012 và quyết định cử cán bộ, viên chức đi đào tạo Nghiên cứu sinh

số 926/QĐ-ĐHCT ngày 24/6/2010 của Hiệu trưởng trường Đại học Cần Thơ

- Thời gian nghiên cứu thực tế từ tháng 6/2010 đến tháng 3/2014

Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất, phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, nhà lưới thuộc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học Phòng Phân

tích đất thuộc Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Phòng Thí nghiệm chuyên sâu Trường Đại Học Cần Thơ

Ruộng lúa Ông Bùi Xuân Kỷ, thuộc ấp Thới Hòa B, Xã Tân Thạnh, Huyện Thới Lai, Thành Phố Cần Thơ

Ruộng lúa Ông Phan Hoàng Nhiệm Ấp Vĩnh Thuận, Xã Vĩnh Tường, Huyện Vị Thủy, tỉnh Hậu Giang

Ruộng lúa ông Hứa Lập Điền Ấp Đôn Chụm, Xã Tập Sơn, Huyện Trà Cú, tỉnh Trà Vinh

1.5 Những đóng góp của luận án

- Phân lập được tập đoàn vi khuẩn gồm 380 dòng vi khuẩn từ đất vùng rễ lúa trên môi trường Burk không đạm Dùng phương pháp so màu Indophenol Blue xác định cả 380 dòng đều có khả năng cố định đạm, 26 dòng vi khuẩn đã được khảo sát khả năng cung cấp đạm cho cây lúa cao sản ở giai đoạn mạ, 12 dòng vi khuẩn được khảo sát khả năng cung cấp đạm ở điều kiện nhà lưới, và 6 dòng được khảo sát khả năng cung cấp đạm cho cây lúa ở điều kiện ngoài đồng

- Bước đầu khảo sát sự đa dạng về vùng gen 16S rDNA của 120 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao đại diện cho mỗi tỉnh thành Kết quả 120 dòng khảo sát có mức tương đồng đạt 75%

- Bước đầu định danh và mô tả các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 6 dòng

vi khuẩn tuyển chọn cho lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng Sinh thái đất phù sa

dòng CTB3 tương đồng với chủng Serratia marcescens (99%), CT1N2 tương đồng với dòng Ideonella sp (99%) Sinh thái đất nhiễm phèn dòng TN20 tương đồng với dòng vi khuẩn Burkhoderia tropica (99%), dòng PH27 tương đồng với dòng Burkhoderia sp (100%); sinh thái đất mặn dòng AM3 tương đồng với dòng Stenotrophomonas panacihumi (99%), dòng TV2B7 tương đồng với dòng

- Xác định được đa dạng di truyền vùng gen 16S rDNA của các dòng vi khuẩn vùng rễ lúa có khả năng cố định đạm cao

- Một số kết quả của đề tài có thể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo và

bổ sung giáo trình giảng dạy

* Ý nghĩa thực tiển

- Cung cấp nguồn vật liệu ban đầu (6 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao hữu hiệu với cây lúa) cho các nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học phục vụ canh tác lúa

- Kết quả đề tài góp phần cũng cố hướng nghiên cứu ứng dụng phân bón

vi sinh trong sản xuất lúa nhằm hạn chế ô nhiễm môi trường

CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Diện tích đất trồng lúa và hiện trạng sử dụng phân bón cho lúa ở ĐBSCL

Theo Niên giám thống kê 2012, ĐBSCL có tổng diện tích đất trồng cây lương thực có hạt là 4220,7 nghìn ha, trong đó diện tích đất trồng lúa khoảng 4181,3 nghìn

ha Theo Ban Biên tập Bản đồ Đất VN (1976), các loại đất chính dùng để sản xuất lúa ở vùng ĐBSCL gồm đất phù sa, đất phèn, đất mặn, đất xám bạc màu, đất lầy và than bùn, trong đó ba nhóm đất chiếm diện tích lớn nhất là đất phèn, đất mặn và đất phù sa (Bảng 2.1)

Bảng 2.1: Diện tích các loại đất chính vùng ĐBSCL

TT Loại đất Diện tích (1000 ha) Tỷ lệ (%)

và (ii) đất phèn hoạt động

* Đất phèn tiềm tàng: Đất có phản ứng chua đến rất chua pHH2O từ 4,3 đến 4,9; pHKCL từ 3,9 đến 4,4; riêng tầng sinh phèn pHH2O dao động từ 3,4 đến 3,7 Tầng sinh phèn có hàm lượng S tổng dao động từ 0,96 - 1,44% Đất phèn tiềm tàng có thành phần sa cấu là đất thịt pha sét hoặc đất thịt pha cát Hàm lượng đạm tổng số khoảng 0,1% N, lân tổng khoảng 0,1% P2O5 và lân dễ tiêu khoảng 6,7 mg P2O5/100 g đất Hàm lượng kali tổng số và dễ tiêu ở mức trung bình tương ứng 1,6% K2O và 17,2 mg K2O/100g đất (Nguyễn Văn Đạo, 2013)

* Đất phèn hoạt động: Đây là đất rất chua pHH2O từ 3,5 - 4,5; pHKCl từ 3,1- 4,0; riêng tầng phèn pHH2O chỉ khoảng 3,0 Hàm lượng S tổng số từ 0,91 – 1,63% Đất có sa cấu là thịt pha sét Có hàm lượng đạm lân và kali ở mức trung bình, tương ứng là 0,1%N; 0,09%P2O5; 1,08%K2O Lân dễ tiêu khoảng 6,8 mg

P2O5/100g đất; Kali dễ tiêu trung bình 14,1 mg K2O/100 g đất (Nguyễn Văn Đạo, 2013)

Ba khu vực đất phèn chủ yếu ở ĐBSCL là vùng Đồng Tháp Mười, khu tứ giác Long Xuyên và vùng trũng Tây sông Hậu

Một cách tổng quát, trên phần lớn các loại đất phèn trồng lúa ở ĐBSCL thường có 3 tầng chính: tầng A, tầng B, tầng C

Tầng A: còn gọi là tầng canh tác, có màu nâu đen, nhiều chất hữu cơ và các ống rễ chưa phân hủy hết, đất tơi xốp

Tầng B: gọi là tầng phèn, đất sét nặng, màu xám, rất dẽ chặt, có nhiều đốm rỉ (Fe2O3) lẫn nhiều ống phèn vàng tươi (jarosite) dọc theo ống rễ hoặc đường nứt trong đất Tầng này tích tụ nhiều chất được rửa trôi từ tầng A xuống nên còn gọi là tầng tích tụ

Tầng C: gọi là tầng mẫu chất hay tầng phèn tiềm tàng Đất sét rất mềm nhão, yếm khí, màu xám xanh, có lẫn xác bả thực vật chưa phân hủy màu đen Giữa các tầng có sự chuyển tiếp từ từ về màu sắc và độ mịn của hạt đất, sự hiện diện của các đốm rỉ hoặc ống phèn và chất hữu cơ

Đất phèn thường có độ pH thấp, cây lúa dễ bị ngộ độc H+, đây là một cation gây độc thông qua pH môi trường và làm cho độ hòa tan chuyển hóa dinh dưỡng kém (Lê Huy Bá, 1996) Theo Võ Tòng Xuân (1984) đất phèn pH thấp gây hại cho lúa một cách trực tiếp hay gián tiếp, pH =3,5- 4,0 trong dung dịch, lúa bị ngộ độc trực tiếp vì H+, pH thấp làm cho các phản ứng nitrate hóa, sulphate hóa, amon hóa diễn ra khó khăn Cây lúa bị ngộ độc H+ sẽ sinh trưởng còi cọc, có thể không có hạt Trong đất phèn hàm lượng hữu cơ cao, Al và Fe

di động cao, Ca2+ và Mg2+ thấp, Al3+ di động cao (Đất Việt Nam, 2000) Tập hợp số liệu về tính chất tầng đất mặt của đất phèn vùng ĐBSCL (Bảng 2.2) cho thấy một số nét nổi bật sau: Hàm lượng đạm, carbon hữu cơ, các cation kiềm giảm mạnh, hàm lượng lân, kali có xu hướng tăng nhẹ Một điểm nổi bật là sự suy giảm dung tích hấp thu trong đất phèn vùng này, khả năng trao đổi cation giảm từ 45,89 meq/100 g đất (số liệu 1975) xuống còn khoảng 16,70 meq/100

g đất (số liệu 2005 - Bảng 2.2) Có lẽ xu hướng này là do tập quán sử dụng chủ yếu phân hóa học mà không có bổ sung nguồn hữu cơ cho đất (Trần Minh Tiến

và ctv 2013)

Bảng 2.2: Biến động một số thông số của đất phèn vùng ĐBSCL

Chỉ tiêu Thông số Số liệu 1975 Số liệu 2005 Biến động

Nguồn (Trần Minh Tiến và ctv., 2013)

Hệ vi khuẩn trong đất nhiễm phèn chịu tác động nhiều của pH thấp Khi

pH môi trường thấp sẽ làm gia tăng nồng độ ion H+, pH thấp có thể làm ảnh hưởng đến sự hoạt động của enzyme trong tế bào hoặc làm tổn thương các protein trên màng tế bào ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn điều này làm cho số lượng loài của vi khuẩn trong đất phèn cũng ít phong phú hơn (Nguyễn

Lân Dũng và ctv 2007)

2.1.2 Đặc tính nhóm đất mặn

Nhìn chung đất mặn có phản ứng trung tính và kiềm yếu, hàm lượng hữu

cơ cũng như các nguyên tố dinh dưỡng khác đều ở mức trung bình và khá (Hội khoa học Đất Việt Nam, 2000) Tập hợp số liệu về tính chất đất mặn của vùng ĐBSCL (Bảng 2.3) cho thấy: Hàm lượng các chất tổng số trong đất mặn cũng như dễ tiêu đều tăng hoặc giữ ổn định, không thay đổi nhiều Hàm lượng lân dễ tiêu giảm khá rõ, khoảng 20% (từ 6,59 xuống còn 5,23 mg P2O5/100g đất), nhưng tỷ lệ kali dễ tiêu lại tăng gần 30%, từ 40,0 lên 56,0 mg K2O/100g đất Dưới tác động của việc rửa mặn làm cho hàm lượng các cation trao đổi đều giảm nhẹ, hàm lượng Ca2+ giảm từ 2,39 xuống 2,25 meq/100g đất và Mg2+ giảm từ

3,33 xuống 3,31 meq/100 g đất (Trần Minh Tiến và ctv., 2013)

Đất mặn thường phân bố dọc theo bờ biển, muối gây mặn chủ yếu là NaCl

Ở các vùng đất nhiễm mặn, khi trồng lúa thường dễ gây ngộ độc do sự tích lũy ion Cl- và Na+ Các tỷ lệ và thành phần muối khác nhau có ảnh hưởng sâu sắc đến cấu tạo giải phẫu của các cơ quan cây trồng như: độ dày vỏ - tuỷ, độ dày

của gỗ, kích thước ống mạch, sự phân hoá hệ mạch,… (Lê Đức Diên và ctv.,

1978) Mặn cũng gây hư hại cấu trúc vi tế bào đặc biệt là lục lạp (Trần Đăng Kế

và Nguyễn Như Khanh, 2001) Nồng độ muối cao làm tăng áp suất thẩm thấu của đất nên dù cây đang ngập nước nhưng cây vẫn không hút được nước, đây gọi là hiện tượng hạn sinh lý Đặc biệt khi cây hút các ion độc vào trong tế bào, các ion này sẽ ức chế hoạt động các enzyme và các chất kích thích sinh trưởng làm rối loạn hoạt động trao đổi chất, năng lượng và các hoạt động sinh

lý bình thường của tế bào (McCue and Hanson, 1990) Ngoài ra, sự dư thừa các ion trong đất còn làm giảm hiệu quả hô hấp (Trần Đăng Kế và Nguyễn Như

Khanh, 2001), quang hợp (Robinson et al., 1997), tích luỹ các chất oxy hoá

mạnh gây hư hại nghiêm trọng đối với tế bào (Sairam and Tyagi, 2004) Để cây lúa có thể phát triển, người trồng lúa cần có giai đoạn rửa mặn cho đất

Bảng 2.3: Biến động một số tính chất của đất mặn vùng ĐBSCL

Chỉ tiêu Thông số Số liệu 1975 Số liệu 2005 Biến động

(%N)

Chỉ tiêu Thông số Số liệu 1975 Số liệu 2005 Biến động

Nguồn (Trần Minh Tiến và ctv., 2013)

Hệ vi sinh vật đất mặn thường chịu ảnh hưởng của một số yếu tố như hàm lượng kim loại nặng của các muối trong đất, áp suất thẩm thấu, stress (Ibekwe

et al., 2010; Chowdhury, 2011) Đặc biệt ở những vùng mặn khí hậu khô nóng

có ẩm độ không khí thấp, vi sinh vật sẽ gặp hiện tuợng stress thường xuyên hơn, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và làm giảm mật số Thêm vào đó, đất nông nghiệp nhiễm mặn thường phải sử dụng nhiều phân bón hóa học trong sản xuất,

gây ngộ độc cho hệ vi sinh vật (Rietz & Haynes, 2003; Sardinha et al., 2003)

2.1.3 Đặc tính nhóm đất phù sa

Đất phù sa được hình thành do sản phẩm bồi đắp của các hệ thống sông theo những loại hình tam giác châu thổ hoặc đồng bằng ven biển Theo phân loại phát sinh, nhóm đất phù sa được chia ra thành ba loại chính (i) đất phù sa

hệ thống sông Hồng; (ii) đất phù sa hệ thống sông Cửu Long; và (iii) đất phù sa

hệ thống các sông khác Tuy nhiên, theo hệ thống phân loại mới (Viện Thổ

nhưỡng Nông hóa, 2005) thì hầu hết đất phù sa thuộc hai loại chính là (i) đất phù sa chua và (ii) đất phù sa ít chua

Do đặc điểm hình thành, độ phì nhiêu của đất phù sa phụ thuộc chất lượng sản phẩm phong hóa từ thượng nguồn Nói chung, trừ những đất phù sa chua mang sản phẩm từ đá mẹ giàu thạch anh, nghèo dinh dưỡng, còn đại bộ phận đất phù sa có các chất dinh dưỡng như hữu cơ, đạm, lân, kali, Ca++, Mg++ ở mức trung bình và khá; đặc biệt những đất phù sa mới, chưa khai thác nhiều thường giàu kali (Hội khoa học Đất Việt Nam, 2000) Số liệu so sánh biến động một số tính chất của đất phù sa chua (Bảng 2.4) và đất phù sa ít chua (Bảng 2.5) cho thấy hầu hết các loại đất phù sa đều có xu thế gia tăng độ chua (giảm pH), thể hiện qua chỉ số pH, trị số pHKCl của đất phù sa ít chua giảm từ 1 đến 2 đơn vị Hàm lượng carbon hữu cơ tăng khá rõ ở cả hai loại đất phù sa Hàm lượng lân

và kali dễ tiêu có xu thế tăng nhẹ ở loại đất phù sa chua, nhưng giảm mạnh ở đất phù sa ít chua Tổng các cation trao đổi và dung tích hấp thu ở cả hai loại đất đều có xu thế giảm nhẹ Có lẽ do lượng phù sa bồi đắp hàng năm vào mùa

lũ nên sự suy giảm các chỉ tiêu về độ phì của đất không rõ ràng mặc dù nông dân khu vực này cũng sử dụng chủ yếu là phân hóa học

Đất phù sa có pH gần như trung tính đây là môi trường lý tưởng cho các nhóm vi sinh vật phát triển Ở đất phù sa trồng lúa hệ vi sinh vật phụ thuộc nhiều vào mực nước trên ruộng lúa Tình trạng ngập nước lâu ngày ảnh hưởng đến độ thoáng khí chế độ nhiệt và chất dinh dưỡng làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng

và phát triển của các nhóm vi khuẩn Trong đất lúa nhóm vi khuẩn kỵ khí và vi hiếu khí chiếm tỷ lệ cao hơn so với nhóm hiếu khí (Lê Xuân Phương 2008) Bảng 2.4: Biến động một số tính chất của đất phù sa chua

Nguồn (Trần Minh Tiến và ctv., 2013)

Bảng 2.5: Biến động một số tính chất của đất phù sa ít chua

Chỉ tiêu Số liệu 1975 Số liệu 2012 (n=75)

Nguồn (Trần Minh Tiến và ctv., 2013)

2.2 Hiện trạng sử dụng phân bón cho lúa ở ĐBSCL

2.2.1 Phân bón vô cơ

Trong sản xuất nông nghiệp nói chung và sản xuất lúa nói riêng, phân bón

là một trong những yếu tố then chốt ảnh hưởng đến năng suất cây trồng Theo Niên giám thống kê năm 2012, năng suất lúa ĐBSCL tăng liên tục trong nhiều năm qua từ 4,23 t/ha năm 2000 tăng lên 5,04 t/ha năm 2005; 5,47 t/ha năm 2010

và hiện nay năng suất trung bình cả năm là 5,67 t/ha (Tổng cục thống kê, 2012) Hiện nay, năng suất bình quân lúa Đông xuân vùng ĐBSCL đạt 6,69 t/ha và Hè thu đạt 5,19 t/ha Thực tế vụ Đông xuân rất nhiều hộ nông dân đã đạt 8,5 t/ha

và vụ Hè thu đạt 6,5 t/ha Vai trò của phân bón hết sức quan trọng trong thâm canh tăng năng suất lúa Trong 3 nguyên tố phân đa lượng N, P, K trong thâm canh lúa ở ĐBSCL thì phân N góp phầm làm tăng năng suất khoảng 40-45%, phân lân góp phần khoảng 20-30% và phân kali góp phần khoảng 5-10% (Phạm

Sỹ Tân, 2008) Tuy nhiên sự lạm dụng bón phân hóa học, bón không đúng cách

và đúng thời điểm thường đem lại những bất lợi cho môi trường và sản phẩm lúa hàng hóa Theo thống kê lượng phân bón cho lúa ĐBSCL không ngừng tăng lên theo thời gian (Bảng 2.6)

Theo khuyến cáo về hàm lượng phân bón cho lúa của Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long đối với đất phù sa ngọt vùng ĐBSCL, phân đạm được khuyến cáo cho vụ Đông xuân vào khoảng 100-120 kg N/ha và 80-100 kgN/ha cho vụ

Hè thu Tuy nhiên, thực tế người nông dân đã sử dụng cao hơn mức khuyến cáo này, đặc biệt vù Hè thu cao hơn cả vụ Đông xuân Đối với nhóm đất phèn, theo khuyến cáo nhu cầu phân bón của lúa thấp hơn vụ Đông xuân là 80-100 kgN/ha

và Hè thu là 60-80 kgN/ha thì nông dân vẫn bón nhiều hơn so với khuyến cáo (Phạm Sỹ Tân, 2005)

Bảng 2.6 Nhu cầu phân bón cho lúa ở ĐBSCL qua các thời kỳ

2.2.2 Phân bón hữu cơ

Phân hữu cơ được chia thành 2 nhóm là phân hữu cơ truyền thống và phân hữu cơ công nghiệp

Phân bón hữu cơ truyền thống là loại phân có nguồn gốc từ chất thải của người, động vật hoặc từ các phế phụ phẩm trồng trọt, chăn nuôi, chế biến nông, lâm, thủy sản, phân xanh, rác thải hữu cơ, các loại than bùn được chế biến theo phương pháp ủ truyền thống Có thể chia phân hữu cơ truyền thống ra làm 4 nhóm bao gồm phân chuồng; phân rác; than bùn và phân xanh (Bùi Huy Hiền, 2012) Hiện nay do sự phát triển của phân bón hóa học với những tiện dụng mà dạng phân bón này mang lại, việc ủ và sử dụng phân hữu cơ truyền thống của người dân ngày càng ít đi, đặc biệt trong canh tác lúa

Phân hữu cơ công nghiệp được chế biến từ các nguồn hữu cơ khác nhau

để tạo thành phân bón tốt hơn so với bón nguyên liệu thô ban đầu Hiện nay có thể chia ra 5 loại bao gồm: phân hữu cơ, phân hữu cơ khoáng, phân hữu cơ sinh học, phân vi sinh, phân hữu cơ vi sinh Hiện nay phân hữu cơ công nghiệp cũng

đã được khá nhiều công ty đầu tư sản xuất, đây được xem là dạng phân bón ít ảnh hưởng đến môi trường hơn dạng phân bón vô cơ Tuy nhiên, cho đến hiện tại số lượng nông dân sử dụng loại phân bón này cho canh tác lúa vẫn còn khiêm tốn (Bùi Huy Hiền, 2012)

2.2.3 Phân bón vi sinh

Vi sinh vật (VSV) là một thành phần của hệ thống sinh học đất Cùng với chất hữu cơ, VSV sống trong đất, nước và vùng rễ cây có vai trò quan trọng trong các mối quan hệ giữa cây và đất trồng Hầu như mọi quá trình xảy ra trong đất đều có sự tham gia trực tiếp hoặc gián tiếp của VSV (quá trình mùn hóa, khoáng hóa hợp chất chất hữu cơ, quá trình phân giải hoặc cố định hợp chất vô

cơ v.v ) VSV là một yếu tố sinh học có ý nghĩa của hệ thống dinh dưỡng cây

trồng Tiêu chuẩn Việt Nam năm 1996 (TCVN6169-1996) đã định nghĩa: "Phân

VSV (phân vi sinh) là sản phẩm chứa các VSV sống, đã được tuyển chọn có mật

độ phù hợp với tiêu chuẩn ban hành, thông qua các hoạt động sống của chúng tạo nên các chất dinh dưỡng mà cây trồng có thể sử dụng được (N, P, K, S, Fe ) hay các hoạt chất sinh học, góp phần nâng cao năng suất và (hoặc) chất lượng nông sản Phân VSV phải bảo đảm không gây ảnh hưởng xấu đến người, động, thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản"

Hiện nay, hai loại phân bón vi sinh phổ biến nhất bao gồm phân VSV cố định nitơ (phân đạm sinh học) và phân VSV phân giải phosphat khó tan (phân lân vi sinh)

2.2.3.1 Tình hình nghiên cứu phát triển phân bón vi sinh ở Việt Nam

Theo Phạm Văn Toản (2012) hiện nay tại Việt Nam cụm từ nông nghiệp sạch và an toàn ngày càng được quan tâm nhiều hơn, chính vì thế việc đầu tư vào nghiên cứu và ứng dụng phân bón vi sinh vật ngày càng được các nhà khoa học quan tâm Các nhóm vi sinh vật được thu thập, tuyển chọn nhằm ứng dụng trong sản xuất phân bón bao gồm: Nhóm VSV cố định nitơ, VSV phân giải hợp chất phospho khó tan, VSV tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật, VSV đối kháng VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng và VSV chuyển hoá chất hữu cơ Mỗi nhóm vi sinh vật khi sử dụng làm phân bón đều có những ưu điểm khác nhau Việc sản xuất phân bón từ vi sinh vật có thể là riêng biệt theo từng nhóm hoặc phối hợp Các loại phân bón vi sinh hiện có ở nước ta bao gồm:

- Phân VSV cố định nitơ (phân đạm vi sinh, nitragin) chứa các VSV sống cộng sinh với cây bộ đậu, hội sinh trong vùng rễ cây trồng cạn hay tự do trong đất, nước có khả năng sử dụng nitơ (N) từ không khí tổng hợp thành đạm cung cấp cho đất và cây trồng

- Phân VSV phân giải hợp chất phospho khó tan (phân lân vi sinh, phosphobacterin) sản xuất từ các VSV có khả năng chuyển hóa các hợp chất phốt pho khó tan thành dễ tiêu cho cây trồng sử dụng

- Phân VSV kích thích, điều hòa sinh trưởng thực vật chứa các VSV có khả năng sản sinh hoạt chất sinh học có tác dụng điều hòa, kích thích quá trình trao đổi chất của cây

- Phân VSV có chứa các chủng VSV đối kháng vi khuẩn/vi nấm gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn

- Phân VSV đa chủng, phân VSV chức năng có chứa hỗn hợp các VSV có khả năng cố định nitơ, phân giải phosphat khó tan, sinh tổng hợp hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật và đối kháng vi khuẩn/vi nấm gây bệnh vùng rễ cây trồng có tác dụng cung cấp dinh dưỡng và nâng cao hiệu quả

sử dụng phân khoáng, đồng thời có khả năng hạn chế bệnh vùng rễ cây

trồng do vi khuẩn hoặc vi nấm gây ra, qua đó nâng cao năng suất nông sản

và hiệu quả kinh tế

Hiện tại nguồn vi sinh vật thu thập và lưu trữ tại Việt Nam để ứng dụng vào sản xuất phân bón cũng khá phong phú (Bảng 2.7)

Bảng 2.7: Vi sinh vật lưu trữ làm phân bón

Cố định nitơ

hội sinh, tự do

Azospirillum, Azotobacter, Agrobacterium, Arthrobacter, Flavoacterium, Serratia, Klebsiella, Enterobacter

Viện TNNH, CNSH – KH&CNVN, ĐH KHTN-ĐHQGHN, ĐHNNHN, ĐHCT

Tổng hợp kích

thích sinh

trưởng thực vật

Azospirillum, Azotobacter, Agrobacterium, Arthrobacter, Flavobacterium, Mycorhiza

Viện TNNH, CNSH – KH&CNVN, ĐH KHTN-ĐHQGHN, ĐHNNHN Phân giải hợp

chất phospho

khó tan

Bacillus, Pseudomonas, Mycorhiza, Candida, Micrococcus, Flavobacterium

Viện TNNH, KHLN, CNSH – KH&CNVN, KHKTNNMN, CĐNN&CNSTH ĐH KHTN-ĐHQGHN, ĐHNNHN, ĐHCT Đối kháng

nấm, vi khuẩn

gây bệnh vùng

rễ cây trồng

Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Burkholderia, Trichoderma, Chetonium, Penicillium, Aspergillus

Viện TNNH, KHLN, CNSH – KH&CNVN, KHKTNNMN, ƯDCN, CĐNN&CNSTH ĐH KHTN-ĐHQGHN, ĐHNNHN, ĐHCT

Phân hủy hữu

cơ

Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Trichoderma, Chetonium, Penicillium, Aspergillus

Viện TNNH, KHLN, CNSH – KH&CNVN, KHKTNNMN, ƯDCN, CĐNN&CNSTH ĐH KHTN-ĐHQGHN, ĐHNNHN, ĐHNL TPHCM, ĐHCT

Nguồn (Phạm Văn Toản, 2012)

2.2.3.2 Thực trạng phân bón vi sinh ở Việt Nam

Phân bón VSV, mặc dù đã được nghiên cứu từ lâu, song do nhiều yếu tố chủ quan và khách quan khác nhau nên mức độ ứng dụng cho đến nay còn hết sức hạn chế Chế phẩm (phân bón) VSV trên nền chất mang khử trùng chỉ được triển khai ứng dụng trong khuôn khổ các đề tài nghiên cứu hoặc các dự án sản xuất thử, thử nghiệm Diện tích sử dụng tùy theo thời kỳ và thường không ổn định Do người nông dân quen sử dụng phân hóa học và hiệu lực phân VSV không thể đánh giá bằng mắt thường, nên địa bàn sử dụng chỉ mang tính chất cục bộ và phân VSV chưa trở thành sản phẩm hàng hóa Hiện nay việc sản xuất phân VSV ở Việt Nam mới dừng ở mức nghiên cứu, triển khai và thử nghiệm dưới dạng quy mô nhỏ Cả nước chỉ có một vài cơ sở sản xuất phân hữu cơ VSV trên nền chất mang không khử trùng với điều kiện trang thiết bị thiếu thốn, cơ

sở hạ tầng chưa đồng bộ, nên chất lượng không cao, thiếu ổn định (Phạm Văn

Toản, 2012)

2.3 Vai trò của phân đạm đối với cây lúa

Đạm tham gia cấu tạo nên cơ thể thực vật, đạm có trong protein, đạm điều tiết các hoạt động sống của cây, tham gia vào các chất kích thích sinh trưởng các cytokinin, vitamin Đạm có hoạt tính sinh học cao, làm tăng hay giảm các hoạt động sinh lý của cây Đạm cũng có mặt trong các enzyme xúc tác các quá trình biến đổi sinh hóa trong cây (Nguyễn Thị Lẫm, 1994)

Đối với cây lúa, đạm là nguyên tố quan trọng nhất giúp cho cây sinh trưởng

và phát triển, tăng khả năng đẻ nhánh, các nhánh hữu hiệu và kiến tạo năng suất,

là thành phần chủ yếu của protein và chất diệp lục làm cho lá xanh tốt (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008) Nếu thiếu đạm, cây lúa lùn hẳn lại, nở bụi ít, chồi nhỏ, lá ngắn, hẹp, trở nên vàng và rụi sớm, cây lúa còi cọc không phát triển Giai đoạn sinh sản, nếu thiếu đạm, cây lúa sẽ cho bông ngắn, ít hạt, hạt nhỏ và có nhiều hạt thoái hóa Thừa đạm, cây lúa phát triển thân lá quá mức, mô non, mềm, dễ ngã, tán lá rậm rạp, lượng đạm tự do trong cây cao, nên cây dễ nhiễm bệnh, làm giảm năng suất rất lớn Lượng đạm cần thiết để tạo ra một tấn lúa là từ 17-25 kg N, năng suất càng cao, lượng đạm cần thiết để tạo ra một tấn lúa càng nhiều Tuy

nhiên hiệu suất sử dụng phân đạm cho lúa lại thấp, thường không quá 40% (Nguyễn Như Hà, 2006)

Phân đạm được cung cấp vào đất chủ yếu ở 2 dạng: nitrat (NO3-) và amôn (NH4+) Tuy nhiên cây không sử dụng hết lượng đạm này, trong tự nhiên các dạng đạm này thường bị thất thoát Đối với đạm amôn quá trình thất thoát do bay hơi khi NH4+ chuyển đổi thành NH3 (khí amoniac) trong môi trường oxy hóa của đất và các vi sinh vật hiếu khí, còn với đạm nitrat, sự thất thoát là do quá trình phản nitrat hóa trong môi trường khử và vi sinh vật yếm khí: NO3- 

(NO2-)  (N2O)  (N2)

Hiện tượng bay hơi NH3 xảy ra ngay sau khi bón urê hay đạm amôn vào ruộng Sự thất thoát này phụ thuộc vào nhiệt độ, gió và đặc biệt là độ pH của nước ruộng Ban ngày khi tảo quang hợp thì pH tăng, làm tăng sự mất đạm; ban đêm, lúc tảo hô hấp thì pH giảm, sự mất đạm cũng giảm theo Việc bón phân vào những chân ruộng cạn, có mật độ thực vật thủy sinh cao, ánh sáng dồi dào

có thể làm thất thoát đến 60% lượng đạm amôn do bay hơi NH3 (Võ Minh Kha 2003)

Quá trình khử nitrat trong ruộng lúa diễn ra chậm hơn và xảy ra ở tầng đất khử (cách lớp đất mặt chừng 0,5–1 cm và dày từ 10–20 cm), do hoạt động của các vi sinh vật Đất càng yếm khí thì quá trình khử diễn ra càng mạnh

2.4 Tổng quan về vi khuẩn vùng rễ (ENDORHIZOPHERES)

Vùng rễ là vùng đất tiếp xúc trực tiếp với rễ cây và chứa các hợp chất mà

rễ cây tiết ra (Kennedy, 1999) Vùng này được mô tả lần đầu tiên bởi Lorenz Hiltner (1904) (trích dẫn của Nelson, 2007) Có nhiều loại hợp chất khác nhau được tiết ra từ rễ cây kích thích hoạt động của vi sinh vật như carbohydrate (đường và oligosaccharides), acid hữu cơ, vitamin, nucleotide, flavonoid,

enzyme, hormon, và các hợp chất dễ bay hơi (Prescott et al., 1999) Đây là

nguyên nhân làm cho mật số của vi sinh vật vùng gần rễ cao hơn vùng xa rễ Ở đất có thực vật sẽ có mật số vi sinh vật cao hơn ở vùng đất trọc không có thực vật Sự tương tác giữa vi sinh vật vùng rễ và thực vật là quá trình tác động qua lại Vi sinh vật sử dụng các chất tiết ra từ rễ cây như nguồn dinh dưỡng đồng thời qua quá trình sống vi sinh vật hoạt động và cung cấp lại cho cây nhiều các hợp chất hữu ích Các nghiên cứu về nhóm vi sinh vật vùng rễ cho thấy, trong quá trình sống chúng tiết ra tiết ra CO2, các acid hữu cơ và acid vô cơ, có tác dụng lớn đối với việc làm cho các khoáng chất hoặc các chất như lân dưới dạng không tan thành dạng dễ tan, giải phóng kali thành dạng tự do từ đó cây có thể hấp thụ được Bên cạnh đó vi sinh vật còn tiết ra các chất kích thích tố tăng trưởng của thực vật như IAA giúp thực vật phát triển được tốt (Samuel 2007)

2.4.1 Sự đa dạng của các chi vi khuẩn vùng rễ có khả năng cố định đạm

Vi khuẩn vùng rễ có khả năng cố định đạm rất đa dạng, chúng thuộc nhiều

chi khác nhau như: Beijerinkia, Azospirillum, Pseudomonas, Burkholderia, Bacillus,

Serratia, Ideonella, Azotobacter, Xanthobacter, Klebsiella, Rhodospirillum, Rhodopseudomonas, Rhodomicrobium, Chromatium, Chlorobium,…Các nghiên

cứu về hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn ở đất vùng rễ cây ảnh hưởng đến sự phát triển của cây trồng cho thấy, hiệu quả cố định đạm của chúng phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau: Chủng vi sinh vật, loài cây, loại đất, mật số vi sinh vật, điều kiện môi trường (Bashan and Levanony, 1988) Đối với cây lúa cũng

có khá nhiều các loài vi khuẩn có khả năng cố định đạm được công bố: Loài

Burkholderia vietnamiensis được tìm thấy ở rễ cây lúa trồng miền nam Việt

Nam (Gillis et al., 1995; Tran Van et al., 2000; Menard et al., 2007); Loài

Pseudomonas stutzeri A15 sống nội sinh trong rễ lúa (You et al., 1995); Stenotrophomonas maltophilia là loài có khả năng cố định đạm, sản xuất chất

điều hòa sinh trưởng kích thích sự phát triển của các loài cây trồng trong đó có

lúa, đồng thời giúp chúng chống lại các độc tố do ô nhiễm môi trường (Ryan et

al., 2009; Liba et al., 2006); Loài Klebsiella pneumoniae được phân lập từ lúa

và một số cây trồng khác, có khả năng cố định đạm cho cây không thuộc họ đậu

(Ladha et al., 1983); vi khuẩn Azospirillum là chi vi khuẩn được phân lập ở rất

nhiều nơi trên thế giới và đã được chứng minh bởi nhiều tác giả về khả năng

cung cấp đạm cho cây lúa (Khan et al., 1994; Nguyễn Hữu Hiệp và ctv., 2005; Nguyễn Hữu Hiệp và Trần Văn Chiêu, 2009; Lăng Ngọc Dậu và ctv., 2007; Tarrand et al., 1978; Magalhães et al., 1984; Reinhold et al., 1987; Ben et al., 1997; Khammas et al., 1989; Eckert et al., 2001); Pantoea agglomerans là loài

vi khuẩn nội sinh và cố định đạm trong cây lúa, loài này được phân lập bởi Yang

et al (1999); Herbaspirillum seropedicae cố định đạm tốt cho lúa vùng nhiễm

phèn nhôm (Gyaneshwar et al., 2001) Ngoài các loài nêu trên vùng rễ cây lúa còn có sự hiện diện của rất nhiều chi vi khuẩn như: Bacillus, Enteribacter,

Xanthobacter, Azoarcus, Pseudomonas, Zoogloea, Beijerinckia, Clostridium (Alam et al., 2001; Malik et al., 1997; Purushothaman et al., 1979; Piao et al.,

2005) Nhìn chung vi sinh vật cố định đạm với cây lúa là rất đa dạng

Một số chi vi khuẩn vùng rễ có khả năng cố định đạm phổ biến

Chi Azotobacter

Vi khuẩn Azotobacter được phân lập và đặt tên bởi nhà bác học Beyjeirinh

vào năm 1901, là vi khuẩn cố định đạm hiếu khí tự do, thường phân bố ở các

vùng đất, vùng nước có pH trung tính hoặc hơi kiềm Azotobacter là vi khuẩn

hình cầu (song cầu khuẩn), Gram âm, không sinh nha bào, tế bào có kích thước

dao động từ 1,5-5,5 m Khuẩn lạc có màu trắng trong, mô, nhày, khi già chuyển sang màu vàng lục hoặc màu nâu thẫm, tế bào được bao bọc bởi lớp vỏ dày và tạo thành nang xác, khi gặp điều kiện thuận lợi nang xác này sẽ nứt ra và tạo thành các tế bào mới (Lê Xuân Phương, 2008)

Azotobacter đồng hóa tốt các loại đường đơn và đường kép, cứ tiêu tốn 1

gam đường glucose nó có khả năng đồng hóa được 8-18 mg nitơ (Nguyễn Đức

Lượng, 1996) Ngoài khả năng cố định đạm sinh học, Azotobacter còn có khả

năng sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học, điển hình là các hormone thực vật như auxin, một số vitamin thuộc nhóm B như B1, B6…, một số acid hữu cơ như: acid nicotinic, acid pentotenic, biotin và các loại chất kháng sinh thuộc nhóm Anixomyxin

Chi Azotobacter có rất nhiều loài khác nhau như Azotobacter

chroococcum, A vinelandii, A beijerinckii, A nigricans, A Armeniacus, A Paspali,… Vi khuẩn Azotobacter và một số loài vi khuẩn khác như Azoarcus

sp., Burkholderia sp., Gluconacetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum sp.,

Azotobacter sp có thể được phân lập từ vùng rễ hay một vài bộ phận của một

số loài cây như lúa gạo, mía đường, bắp, lúa miến, các loại cây ngũ cốc khác

hay khóm và cà phê (Barriuso et al., 2008)

Chi Azospirillum

Azospirillum là vi khuẩn Gram âm, có dạng hình xoắn, hơi cong như hình

dấu phẩy hoặc hình chữ S, dài khoảng 2,0-3,8 µm, sinh trưởng tốt ở 30ºC, thuộc phân lớp -proteobacteria, có khả năng di động và hình thành dạng giống nang

bào trong điều kiện bất lợi Các chủng Azospirillum đã được phân lập từ vùng

rễ của nhiều loài cỏ và ngũ cốc ở nhiều vùng khí hậu trên thế giới và bắt đầu được ứng dụng trong nông nghiệp từ những năm 1970 (Steenhoudt and Vanderleyden, 2000) Cho đến năm 2011, nhóm vi khuẩn cố định đạm tự do này đã được xác định gồm 10 loài dựa trên các đặc điểm chuyên biệt về hóa

sinh và phân tử của chúng: Azospirillum lipoferum, A oryzae, A largimobile,

A Melinis, A brasilense, A Irakense, A amazonense, A halopraeferens, A Doebereinerae và gần đây nhất là A canadensis (Saharan and Nehra, 2011)

Quá trình biến dưỡng carbon và nitơ được biến đổi linh hoạt tùy vào điều

kiện môi trường giúp vi khuẩn Azospirillum thích nghi tốt với môi trường phải cạnh tranh dinh dưỡng như ở vùng rễ thực vật Azospirillum có thể sử dụng nitơ

ở dạng amonium, nitrate, nitrite, amino acid và cả nitơ phân tử (N2) Ở điều kiện

vi hiếu khí, các loài Azospirillum tương tác chặt chẽ với rễ và vùng rễ của nhiều

loài ngũ cốc và hoa màu quan trọng, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của các loài cây này trên hai cơ chế chính là cố định đạm và sản xuất phytohormone như

IAA (Indole-3-acetic acid), IBA (Indole-3-butyric acid), ABA (abscisic acid)

và Cytokynin Azospirillum được xem là một trong những chi vi khuẩn kích

thích sinh trưởng cây trồng được nghiên cứu nhiều nhất về khả năng sản xuất

IAA (Martínez-Viveros et al., 2010) Liều chủng của các chủng Azospirillum

được áp dụng thành công cho cả những cây chưa từng bị xâm thực vùng rễ bởi

Azospirillum cũng như không cho sự khác biệt khi chủng vào cây thường niên

hay cây lâu năm Một cách tổng quát, có thể nói các loài vi khuẩn thuộc chi

Azospirillum không có tính chuyên hoá Sự ảnh hưởng của vi khuẩn Azospirillum lên sự phát triển cây trồng hiện vẫn đang được đầu tư nghiên cứu

(Saharan and Nehra, 2011; Steenhoudt and Vanderleyden, 2000)

Chi Burkholderia

Burkholderia là vi khuẩn Gram âm, hình que, chúng có thể di chuyển nhờ

các chiên mao ở đầu (Jesús et al., 2004) Vi khuẩn Burkholderia sinh trưởng và

phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí, nhưng trong môi trường ít khí thì phát triển tốt nhất, chúng phát triển sâu trong môi trường nuôi cấy từ 1-4 mm

(Paulina et al., 2001) Trong môi trường nuôi cấy, chúng tạo thành những khuẩn

lạc trắng hoặc hơi vàng, đường kính khoảng 2-4 mm, tròn, phẳng hoặc lài (Jesús

et al., 2004) Chi Burkholderia lần đầu tiên được công bố bởi Yabuuchi et al

(1992) dựa trên việc phân tích di truyền rRNA nhóm II, chúng được phân loại

lại và đặt tên từ một số loài thuộc chi Pseudomonas Chi Burkholderia có khả

năng cố định đạm rất đa dạng, có 39 loài đã được phát hiện, ngoài khả năng cố

định đạm vi khuẩn thuộc chi Chi Burkholderia còn có khả năng sản xuất chất

kích thích sinh trưởng cây trồng, có khả năng hòa tan lân khó tan, phân hủy sinh

học…(Elmerich and Newton, 2007) Những loài Burkholderia có khả năng cố định đạm được công bố như Burkholderia brasilensis, Burkholderia tropica (Baldani, 1996), Burkholderia kuruiensis (Zhang et al., 2000), Burkholderia

unamae (Caballero-Mellado et al., 2004), Burkholderia cepacia TG17 (Dương

Thị Nguyễn Quyên và ctv., 2009), Burkholderia vietnamiensis (Gillis et al., 1995) Các nghiên cứu về chi Burkholderia trên một số loại cây trồng cho kết quả khá tốt Loài Burkholderia vietnamiensis chủng trên lúa giúp lúa tăng khả

năng đâm chồi 33%, rễ tăng 57% diện tích lá tăng 30% năng suất lúa tăng

13-22% (La Nguyễn Tường Vi, 2010) Tran Van et al (1996) khi chủng

Burkholderia vietnamiensis trên lúa cũng làm năng suất lúa tăng đáng kể

Chi Bacillus

Bacillus là nhóm vi khuẩn Gram dương, các tế bào vi khuẩn thường sắp

xếp thành dạng chuỗi (streptobacillus) có khả năng tạo bào tử nên có khả năng tồn tại một thời gian dài trong điều kiện môi trường bất lợi Về mặt số lượng,

chi Bacillus chiếm đại đa số trong nhóm vi khuẩn Gram dương, có khả năng

kích thích tăng trưởng sống tại vùng rễ thực vật (chiếm khoảng 90%), chủ yếu

là các loài Bacillus mycoides, B subtilis, B pumilus, B megaterium, B

thuringiensis, B firmus và B licheniformis (Antoun and Prévots, 2005) Các cơ

chế ảnh hưởng lên cây trồng của chi Bacillus cũng được nghiên cứu nhiều trong

nhiều năm, cung cấp nguồn kiến thức khá đầy đủ về các cơ chế này Tại vùng

rễ, một số chủng Bacillus tiết ra một số chất chuyển hóa giúp tăng cường lượng

chất dinh dưỡng sẵn có cho cây trồng, ngoài ra, chúng còn có thể sản xuất

phytohormone IAA Một khi hiện diện trong vùng rễ, B subtilis có khả năng

tương tác bền vững và kích thích sự sinh trưởng cây trồng một cách rõ rệt

García et al., (2004) đã tiến hành chủng B licheniformis trên cà chua và hồ tiêu, kết quả cho thấy, B licheniformis có thể được dùng như phân bón sinh học mà

không làm biến đổi các điều kiện cần cho cây phát triển trong nhà lưới Bên

cạnh khả năng tiết chất chuyển hóa, phytohormone, vi khuẩn Bacillus còn được

chú ý nghiên cứu và sử dụng trong kiểm soát sinh học các tác nhân vi sinh gây

bệnh cây trồng như Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani trên cà chua,

Colletotrichum gloeosporioides trên tiêu Cayene, CMV (Cucumber mosaic

virus) trên dưa leo, (Antoun and Prévots, 2005; Saharan and Nehra, 2011)

Một số nghiên cứu về chi vi khuẩn này đã được công bố: Xie et al (2006) đã phân lập được vi khuẩn Bacillus megaterium có khả năng cố định đạm từ đất

của các ruộng lúa ở vùng đồng bằng dọc theo sông Dương Tử (Yangtze), Trung

Quốc Barua et al (2011) cũng đã phân lập được vi khuẩn Bacillus megaterium

cố định đạm sống tự do trong đất canh tác lúa nhiễm mặn tại vùng duyên hải tại

Ấn Độ Năm 2005, lần đầu tiên Ding et al phát hiện được vùng gen nifH chịu

trách nhiệm mã hóa cho enzyme cần thiết của quá trình cố định đạm trên các

chủng Bacillus megaterium phân lập từ vùng rễ lúa mì, bắp, cỏ hoang và cây

liễu tại Bắc Kinh

Chi Serratia

Loài Serratia sp được lấy tên từ nhà vật lý người Ý, thuộc họ

Enterobacteriaceae, trong cùng bộ với Klebsielleae Bên cạnh chủng Serratia

marcescens còn có những loài thông thường được biết đến bao gồm: S odorifera, S liquifaciens, S rubidaea, S ficaria và S pymuthica, S fonticola Serratia marcescens… là vi khuẩn Gram âm, hình que, không có bào tử, thường

được tìm thấy trong đất, nước, một số cây trồng, ruột người hay động vật

(Bhadra et al., 2005) Nhiệt độ thích hợp cho S marcescens phát triển là 5-40ºC

nhưng tốt nhất là ở 37ºC, pH trong khoảng 5 đến 9

Một số loài thuộc Serratia sp đã được phân lập từ bông vải (Gossypium

hirsutum), bắp (Zea mays), vùng rễ lúa và hạt lúa (Gyaneshwar et al., 2001)

Các chủng vi khuẩn này không gây bệnh và thường được sử dụng như tác nhân

điều hòa sinh học trong nông nghiệp nhờ vào hoạt tính của enzyme chitinase và khả năng kích thích hệ miễn dịch của cây trồng Ngoài ra, chúng cũng được biết đến với vai trò là một chất hỗ trợ sự phát triển của cây bằng cách tăng sức đề

kháng của cây trồng, giúp cây chống lại các mầm bệnh (Kloepper et al., 1993),

tạo ra những hợp chất kháng bệnh (Queiroz and Melo, 2006) và hơn hết là chúng

có khả năng hòa tan lân (tốc độ 0,05-0,7%), đặc biệt là các loại lân khoáng và các loại lân không tan cao: phosphate cứng (rock phosphate, RP), Ca3(PO4)2, hydroxyapatite…nhờ đó làm tăng lượng phospho hòa tan giúp cây hấp thụ và

phát triển tốt (Ben et al., 2009) Theo nghiên cứu của Gyaneshwar et al (2001) cho thấy S marcescens là một loại vi khuẩn thường nội sinh trong cây lúa và

chúng có khả năng làm tăng chiều dài rễ và khối lượng khô của cây lúa Theo báo cáo của Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học

Indonesia (2003-2004), S marcescens được phân lập từ vùng đất quanh rễ cây

trà (tea rhizosphere) có khả năng kháng với các loại nấm gây bệnh cho cây

(Widiastuti, 2008) Bên cạnh đó, vi khuẩn S marcescens còn có khả năng tăng

99% khối lượng khô của cây bắp (maize), tăng khả năng nảy mầm của hạt giống, chiều dài của chồi mầm, chiều dài thân, diện tích lá, hàm lượng phenolic

chlorophyll,… (Hameeda, 2008) Vi khuẩn Serratia marcescens thường được

mô tả như vi khuẩn cố định đạm có khả năng hòa tan lân khó tiêu sống tự do

trong vùng rễ hoặc nội sinh trong rễ cây trồng Bên cạnh đó, chủng Serratia

marcescens EB-67 phân lập được từ vùng rễ lúa đã được chứng minh có khả

năng tăng sinh khối của lúa miến trồng trong nhà kính đến 99% (Gopalakrishnan

et al., 2011)

2.4.2 Bản chất quá trình cố định đạm ở vi sinh vật

Phản ứng cố định đạm sinh học xảy ra được ở một số vi sinh vật là nhờ sự xúc tác của một enzyme chuyên biệt là nitrogenase Đây là một đa enzyme xúc tác cho phản ứng cố định nitơ khử N2 thành NH3 Nitrogenase gồm 2 protein chứa Fe-S, protein nhỏ hơn có trọng lượng phân tử là 60 kDa, chứa 1 chùm Fe-S có 4 nguyên

tử, phân tử lớn hơn có trọng lượng phân tử là 220 kDa và chứa nguyên tử S linh động

36 nguyên tử Fe và 2 nguyên tử Mo (Bothe and Neuer, 1988)

Theo Evans and Barber (1977) thì quá trình cố định đạm xảy ra như sau:

N2 +6H+ +6e 2NH3

NH3 sẽ kết hợp acid hữu cơ tạo thành protein:

NH3 + Acid hữu cơ Amino acid Protein

Nitrogenase