Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu virus gây bệnh khảm lùn giúp bước ựầu phát hiện, mô tả các dạng triệu chứng bệnh khảm lùn, ựể làm cơ sở cho phân biệt với các dạng triệu chứng khác do virus
Trang 1MỞ ðẦU
1 1 Tính cấp thiết của đề tài
Ngơ là một trong các cây lương thực quan trọng, gĩp phần nuơi sống khoảng 1/3 dân số trên thế giới Diện tích trồng ngơ trên thế giới năm 2010 đạt khoảng 159,32 triệu ha, năng suất 5,24 tấn/ha và sản lượng đạt 853,03 tấn (FAO STAS, USAD 2010) [59] Những nước trồng ngơ chính ở trên thế giới là Hoa Kỳ, Trung Quốc và Brazil Gần đây bắp ngơ bao tử được coi như một loại thực phẩm cao cấp
Ở Việt Nam, cây ngơ được trồng cách đây khoảng 300 năm (Ngơ Hữu Tình
và CTV, 1997) [33] Ngơ là cây lương thực thứ hai sau cây lúa, được trồng nhiều
ở các tỉnh như Sơn La, Hà Giang, Tuyên Quang, Cao Bằng, Hịa Bình, Hà Nội, Thanh Hĩa, Nghệ An, Lâm ðồng, ðắc Lắc, ðắc Nơng, Ninh Thuận, Bình Thuận, ðồng Nai, An Giang, ðồng Tháp Diện tích trồng ngơ ở Việt Nam ngày càng tăng Năm 1990 diện tích đạt 432.000 ha, sản lượng 671 tấn/ha và năng suất đạt 1,55 tấn/ha Năm 2010 diện tích 1.126.900 ha, sản lượng 4.600.000 tấn/ha và năng suất đạt 4,09 tấn/ha (Bộ NN&PTNT, 2011) [4]
Tuy nhiên, sản lượng ngơ trong nước vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu hàng năm nước ta cịn phải nhập khẩu ngơ (trị giá trên 500 triệu USD) để sản xuất thức ăn gia súc Cây ngơ ngày càng cĩ vai trị quan trọng ở nước ta
Việt Nam là nước cĩ khí hậu nhiệt đới giĩ mùa trong năm cĩ mùa đơng lạnh
ở phía Bắc ðây là điều kiện để bệnh virus hại ngơ ở Việt Nam phát triển phong phú về số lượng và chủng loại Bệnh virus ngơ đã gây ra những thiệt hại và là mối
đe dọa cho nghề trồng ngơ trong một tương lai khơng xa Bệnh virus gây thối hĩa dẫn đến tàn lụi cây ngơ cĩ thể hủy diệt những diện tích nhỏ trong sản xuất Bệnh làm giảm năng suất và phẩm chất ngơ hạt
Bệnh khảm lùn ngơ do virus Sugarcane mosaic virus - SCMV gây là bệnh
virus phổ biến nhất trên ngơ và mía ở Việt Nam Cây ngơ bị bệnh cĩ triệu chứng khảm rất dễ nhận biết Tồn cây được biến dạng, lùn thấp, cây cĩ thể ra bắp hoặc khơng ra bắp nhưng nếu cĩ bắp thì bắp teo lép, nhỏ, ngắn ảnh hưởng rất lớn đến năng suất và sản lượng ngơ Xuất phát từ tình hình trên, chúng tơi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu bệnh virus khảm lùn ngơ (Sugarcane mosaic virus - SCMV), tại vùng Chương Mỹ, ðan Phượng (Hà Nội) và sản xuất kháng huyết thanh chẩn đốn bệnh”
- Xác định virus gây bệnh khảm lùn ngơ
- Nghiên cứu khả năng lan truyền của virus gây bệnh
Trang 2- Xác ựịnh triệu chứng bệnh trên ngô và ựiều tra mức ựộ phổ biến của virus gây bệnh trên ựồng ruộng
- Sản xuất kháng huyết thanh chẩn ựoán bệnh hại
3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
3.1 Ý nghĩa khoa học
Virus khảm lùn ngô là virus gây hại nặng ở nhiều nước trên thế giới; virus cũng là bệnh gây hại phổ biến trên cây ngô ở nước ta Việc nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh và sản xuất kháng huyết thanh chẩn ựoán có ý nghĩa khoa học giúp
bổ sung tài liệu về danh mục bệnh virus ở Việt Nam Kết quả của ựề tài cũng giúp cho việc xác ựịnh biện pháp phòng trừ bệnh có hiệu quả
3.2 Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu virus gây bệnh khảm lùn giúp bước ựầu phát hiện, mô tả các dạng triệu chứng bệnh khảm lùn, ựể làm cơ sở cho phân biệt với các dạng triệu chứng khác do virus gây ra trên cây ngô
Sản xuất kháng huyết thanh nhằm sử dụng dùng trong chẩn ựoán, phát hiện nhanh nguyên nhân gây bệnh và chọn lọc giống ngô nhằm tạo các giống ngô sạch bệnh, kháng bệnh do virus khảm lùn ngô gây ra
4 Những ựóng góp mới của ựề tài
Bổ sung thêm các kết quả nghiên cứu về nguyên nhân gây bệnh khảm lùn
ngô ựể khẳng ựịnh Sugarcane mosaic virus - SCMV là nguyên nhân gây bệnh
khảm lùn ngô ở Việt Nam
Lần ựầu tiên ựã sản xuất ựược kháng huyết thanh chẩn ựoán nhanh bệnh virus khảm lùn ngô SCMV ở Việt Nam
5 đối tượng và phạm vi nghiên cứu
5.1 đối tượng nghiên cứu
- Bệnh virus khảm lùn ngôSCMV vùng Chương Mỹ và đan Phượng (Hà Nội)
5.2 Phạm vi nghiên cứu
- đề tài tiến hành từ năm 2007 ựến năm 2011
- Nghiên cứu khả năng lan truyền của virus khảm lùn ngô
- Xác ựịnh nguyên nhân gây bệnh virus khảm lùn ngô
- Tìm hiểu một số tác hại và mức ựộ phổ biến của bệnh virus khảm lùn ngô
- Nghiên cứu sản xuất kháng huyết thanh chẩn ựoán nhanh bệnh virus khảm lùn ngô
6 Cấu trúc của luận án
Luận án gồm 128 trang (không kể phần phụ lục), trong ựó: Mở ựầu 3 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu 35 trang; Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu 16 trang; Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận 72 trang; phần kết luận và ựề nghị 2 trang Ngoài ra, luận án còn có: 04 công trình ựã công bố liên quan ựến luận án Luận án có 38 bảng số liệu, 38 hình đã tham khảo 92 tài liệu,
trong ựó có 41 tài liệu tiếng Việt và 52 tài liệu tiếng Anh
Trang 3CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cơ sở khoa học của đề tài
Bệnh khảm lùn ngơ là bệnh phổ biến trên cây ngơ, làm giảm năng suất, chất lượng ngơ ở Việt Nam
Nguyên nhân gây bệnh là virus nên việc chẩn đốn và cơng tác phịng trừ bệnh là rất quan trọng Các triệu chứng bệnh trên ngơ cịn gây nhầm lẫn với các bệnh khác Ở nước ta những nghiên cứu về bệnh khảm lùn ngơ cịn ít, các nghiên cứu trước đây chưa xác định đầy đủ về nguyên nhân gây bệnh và chưa sản xuất được kháng huyết thanh chẩn đốn bệnh Vì vậy, việc chẩn đốn cịn gặp khĩ khăn
Nghiên cứu chính xác nguyên nhân gây bệnh bằng sử dụng kỹ thuật ELISA, RT-PCR, hiển vi điện tử và thử nghiệm chế tạo kháng huyết thanh để chẩn đốn nhanh bệnh là cần thiết hiện nay để kịp thời phịng trừ hạn chế dịch bệnh xảy ra
1.2 Những nghiên cứu ngồi nước
1.2.1 Tình hình sản xuất ngơ trên thế giới
Cây ngơ là một trong bốn loại cây lương thực chính của thế giới: Ngơ (Zea mays L.), lúa nước (Oryza sativa L.), lúa mì (Triticum sp.), sắn (Manihot esculenta
Crantz) Trong đĩ, ba loại cây gồm ngơ, lúa gạo và lúa mì chiếm khoảng 87% sản lượng lương thực tồn cầu và khoảng 43% calori từ tất cả mọi lương thực, thực phẩm Trong ba loại cây này, ngơ là cây trồng cĩ sự tăng trưởng mạnh cả về diện tích, năng suất, sản lượng và là cây cĩ năng suất cao nhất
Vào năm 1961, năng suất ngơ trung bình của thế giới chỉ xấp xỉ 2 tấn/ha, năm 2010 tăng gấp hơn 2,5 lần (đạt 5,24 tấn/ha), sản lượng đã tăng từ 204 triệu tấn lên 853,03 triệu tấn (gấp 4 lần), diện tích tăng từ 104 triệu lên 159,32 triệu hecta (hơn 1,5 lần)
1.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh virus hại ngơ trên thế giới
Virus hại ngơ là một trong những bệnh gây hại nghiêm trọng cho cây ngơ, cĩ thể làm giảm năng suất ngơ từ 15 - 30% phụ thuộc vào tuổi cây lúc lây nhiễm, điều kiện sinh thái, canh tác, giống ngơ (Wilidins, Gordon and Nauled - 1967) [89] Ở một số nước Châu Phi bệnh virus ngơ gây thiệt hại tới 25% năng suất ngơ Ở Trung Quốc bệnh virus ngơ gây thiệt hại từ 20 - 80% năng suất ngơ Bệnh gây thối hĩa giống, ảnh hưởng đến phẩm chất, làm giảm giá trị thương phẩm của cây ngơ (Chen
et al, 2002) [47]
Hiện nay trên thế giới theo tổ chức phân loại virus ICTV (International
Comittee on Taxonomy of Viruses) và theo Van Regenmortel et al (2000) [85]; Van Regenmortel et al (2002) [86] cĩ 12 bệnh virus hại ngơ đã được phân loại đĩ là:
- Maize chlorotic dwarf virus (MCDV) họ Secoviridae
- Maize chlorotic mottle virus (MCMV) họ Tombusviridae
- Maize dwarf mosaic virus (MDMV) họ Potyviridae
Trang 4- Maize mosaic virus (MMV) họ Rhabdoviridae
- Maize rayado fino virus (MRFV) họ Marafiviruses
- Maize rough dwarf virus (MRDV) họ Reoviridae
- Maize stem borer virus (MSBV) Unassignedviruses
- Maize sterile stunt virus (MSSV) họ Rhabdoviridae
- Maize streak virus (MSV) họ Geminiviridae
- Maize strip virus (MStpV) thuộc Bunyaviridae
- Maize white line mosaic satellite virus (MWlMV) thuộc Satelliteviruses
- Maize white line mosaic virus (MWLMV) họ Unassignedviruses
Trong ñó có nhiều bệnh phổ biến ở các vùng trồng ngô thế giới
1.2.3 Giới thiệu chung về chi Potyvirus
Bệnh khảm lùn ngô Sugarcane mosaic virus - SCMV do một virus của chi potyvirus gây ra Vì vậy, ñặc tính chung của virus khảm lùn ngô hoàn toàn giống với virus thuộc chi potyvirus họ Potyviridae
Chi potyvirus thuộc họ Potyviridae là họ virus thực vật lớn nhất với
trên 200 loài Tất cả thành viên trong họ ñều có bộ gen RNA sợi ñơn, cực dương, có cấu trúc hình sợi mềm ñường kính 11-15 nm và dài 650 – 950 nm (Berger, 2005) [43]
Hiện nay, các potyvirus ñược phân loại thành 6 chi trên cơ sở (i) tổ chức bộ
gen, (ii) môi giới truyền bệnh và (iii), so sánh trình tự ðặc ñiểm bộ gene, mối quan
hệ vector và số loài của các chi Trong số 6 chi, chi Potyvirus là quan trọng nhất, cả
về số lượng loài cũng như các bệnh có ý nghĩa kinh tế mà chúng gây ra (Berger, 2005) [43]
Các virus của 5 chi Potyvirus, Macluravirus, Ipomovirus, Rymovirus và Tritimovirus có bộ gen không phân ñoạn tức bộ gen chỉ gồm 1 phân tử RNA duy nhất nên gọi là virus có bộ gen ñơn Các virus của chi còn lại, chi Bymovirus, có bộ
gen kép gồm 2 phân tử RNA-1 và RNA-2 ðối với các bymovirus, phân tử RNA-1 tương ñương với 2/3 kích thước tính từ ñầu 3’ còn phân tử RNA-2 tương ñương phần còn lại của bộ gen của các virus có bộ gen ñơn
1.3 Những nghiên cứu bệnh virus hại ngô ở Việt Nam
1.3.1 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam
Trước ñây, sản xuất ngô ở Việt Nam còn nhỏ lẻ và phân tán, chủ yếu là tự cung tự cấp theo nhu cầu của hộ nông dân Tại một số vùng miền núi do khó khăn
về sản xuất lúa nước nên nông dân phải trồng ngô làm lương thực chính Các giống ngô ñược trồng ñều là các giống truyền thống của ñịa phương, giống cũ nên năng suất rất thấp (Bộ môn cây lương thực, 1977) [1]
Vào thập kỷ 60 của thế kỷ trước, diện tích ngô Việt Nam chưa ñến 300 nghìn hecta, năng suất chỉ ñạt trên 1 tấn/ha, ñến ñầu những năm 1980 cũng không cao hơn nhiều, chỉ ở mức 1,1 tấn/ha, sản lượng ñạt khoảng hơn 400.000 tấn do vẫn
Trang 5trồng các giống ngô ựịa phương với kỹ thuật canh tác lạc hậu (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2011) [4]
Năm 2010, diện tắch ựạt 1.126.900 ha, tổng sản lượng khoảng 4.600.000 tấn Các giống ngô lai của Việt Nam bước ựầu cũng ựã xuất bán sang các nước Bangladesh, Cam-pu-chia, Lào, Quảng Tây -Trung Quốc, Pakistan, Indonesia, Ấn độẦ (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2011) [4]
1.3.2 Những nghiên cứu về bệnh virus hại ngô
Trên ngô, theo tài liệu ựiều tra cơ bản bệnh hại cây trồng ở Miền Bắc 1973 -
1974 của Viện Bảo vệ thực vật (NIPP) mới phỏng ựoán có thể có hai bệnh trên ngô
do virus gây ra Bệnh virus ngô ở Việt Nam lần ựầu tiên ựược Vũ Triệu Mân nghiên cứu theo ựề tài khoa học của Sở khoa học và Công nghệ Hà Nội tiến hành ựiều tra từ năm 1986 [39]
Bằng các phương pháp phát hiện triệu chứng sử dụng kỹ thuật hiển vi ựiện tử, lây bệnh nhân tạo, sử dụng kháng huyết thanh và ELISA (Vũ Triệu Mân và CTV)
ựã ựi ựến một số kết luận sau: đã phát hiện ở Việt Nam có một số virus hại ngô chắnh
+ Bệnh virus khảm lá ngô (Maize mosaic virus)
+ Bệnh virus khảm lùn cây ngô (Maize dwarf mosaic virus) tác giả cho là một
chủng của virus SCMV
+ Bệnh khảm sọc lá ngô (Maize strreak virus)
+ Bệnh khảm ựốm lá ngô (Maize chlorotic mottle virus)
Năm 1986, Vũ Triệu Mân và Hà đình Tuấn bằng phương pháp sử dụng kắnh hiển vi ựiện tử phát hiện ra hai loại virus hình sợi là:
+ Virus khảm lá: Sợi mềm với kắch thước 486 - 500nm x 13,1nm (Vũ Triệu Mân, 1991) [15]
+ Virus khảm lùn cây: Dạng sợi với kắch thước 855,2 x 13,1nm (Vũ Triệu Mân, 1991) [15]
(Sử dụng kắnh hiển vi ựiện tử JEM 100 CXII ở ựộ phóng ựại 40.000lần) Virus ngô
truyền bằng rệp ngô Rhopalosiphum maydis với mật ựộ 4 - 5 con/cây với bệnh khảm lá
và khảm lùn, 30% số cây ựã xuất hiện bệnh sau khi lây 10 - 15 ngày (1986 - 1987) và 7 ngày (1987 - 1988) (Vũ Triệu Mân, 1991) [15]
Bệnh khảm lá và khảm lùn còn truyền qua tiếp xúc có học nhờ bột Carborandium
600 Mesh, sau 12 - 15 ngày lây bệnh (Vũ Triệu Mân, 1991) [15]
Về môi giới truyền bệnh: Loại nhện ựỏ Tetranychus cinnabarius không truyền
bệnh virus trên ngô Trong số côn trùng môi giới truyền bệnh thì rệp ngô
Rhopalosiphum maydis có khả năng truyền bệnh virus lớn nhất Bằng thắ nghiệm lây
bệnh nhân tạo (cơ học tiếp xúc, côn trùng môi giới) ựã xác ựịnh ựược thời gian ủ bệnh của bệnh khảm lá và khảm lùn ngô (Vũ Triệu Mân, 1991) [15]
Năm 2003 - 2005 nhóm nghiên cứu Vũ Triệu Mân, Hà Viết Cường, Ngô Bắch Hảo, Trần Thị Như Hoa ựã nghiên cứu sản xuất kháng huyết thanh và kit ELISA,
Trang 6ứng dụng phương pháp RT-PCR chẩn đốn hơn 30 loại virus gây bệnh ở Việt Nam (Vũ Triệu Mân, 2003) [25]
Trong hội thảo quốc gia bệnh hại thực vật Việt Nam lần thứ 10, Hà Viết Cường đã báo cáo cĩ 52 virus thực vật thuộc 52 lồi đã được xác định ở Việt Nam
trong đĩ cĩ Sugarcane mosaic virus – SCMV (Hà Viết Cường, 2011) [7]
1.3.3 Phân loại SCMV ở Việt Nam
Ở Việt Nam bệnh virus khảm lùn ngơ đã được Vũ Triệu Mân nghiên cứu tác giả cho rằng bệnh khảm lùn ngơ là một chủng của virus khảm lá mía (SCMV) Vũ Triệu Mân, 1991 [15]
Theo Hà Viết Cường ở Việt Nam, bệnh khảm lá ngơ đã được quan sát thấy từ lâu Các nghiên cứu gần đây đã phát hiện được 2 potyvirus hại họ hịa thảo là SCMV và SrMV (Hà Viết Cường, 2010) [6]
SCMV gây bệnh khảm lá ngơ, mía và hồng tinh ðây là bệnh virus phổ biến nhất trên ngơ và mía ở Việt Nam Phân tích phả hệ dựa vào trình tự gen CP cho thấy virus ở Việt Nam khá đa dạng, phân nhĩm với các mẫu cĩ nguồn gốc ký chủ khác nhau thuộc nhiều khu vực địa lý là châu Mỹ, châu Âu và châu Á ðặc biệt 3 mẫu SCMV phân lập từ mía ở Việt Nam tạo thành một nhĩm riêng biệt (nhĩm IV) chia
sẻ chung tổ tiên với tất cả các mẫu SCMV trên thế giới (Hà Viết Cường, 2008) [64]
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Mẫu giống ngơ, cây thí nghiệm và cơn trùng mơi giới
- Mẫu lá ngơ nghi nhiễm bệnh được thu thập trên những cây cĩ triệu chứng bị virus điển hình, trên ruộng sản xuất tại các điểm điều tra Cắt các phần lá non cĩ triệu chứng bệnh điển hình cho vào túi nilong bảo quản ở nhiệt độ -40C và -200C trong phịng thí nghiệm
- Bảo quản khơ bằng cách cho mẫu vào vào lọ nhựa cĩ chứa các hạt silicagel đã được làm khơ Mơ tả triệu chứng bệnh, đánh dấu ký hiệu lọ đựng mẫu
- Hạt ngơ sạch, cây chỉ thị được gieo trên đất đã khử trùng và trồng cách ly Cây ngơ sạch được thử ELISA trước khi lây bệnh nhân tạo Thu mẫu và bảo quản mẫu lá cây chỉ thị sau khi lây bệnh nhân tạo ðược bảo quản ở - 200C và bảo quản khơ bằng siliagel
- Hạt cây chỉ thị dùng trong thí nghiệm do Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới cung cấp cĩ nguồn gốc từ Nhật Bản, ðan Mạch và Australia Bao gồm: Họ Rau muối
Chenopodiaceae: Rau muối thân tím Chenopodium amaranticolor Coste.; rau muối hoang dại Chenopodium album L.; rau muối trắng Chenopodium quinoa Willd
Họ cà Solanaceae: Thuốc lá Nicotiana benthamiana Domin, N.tabacum cv Samsun, N tabacum cv White Burley, N tabacum cv Xanthi – nc
- Tập đồn giống ngơ do Viện nghiên cứu ngơ cung cấp bao gồm các giống:
Trang 7- Sử dụng côn trùng môi giới là rệp ngô Rhopalosiphum maydis thuộc họ
Aphididae, bộ Cánh ñều Homoptera (Bộ môn côn trùng, 2004) [2] Rệp ñược nuôi trên cây ngô trong lồng cách ly
- Thỏ thí nghiệm nặng trên 2 kg nuôi tại Trung tâm bệnh cây nhiệt ñới Trường ðại học Nông nghiêp
2.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hoá chất nghiên cứu
Máy ñọc bản ELISA, máy PCR của hãng Biotech (Mỹ) Tủ lạnh bảo quản mẫu Sanyo (Nhật Bản), tủ ñịnh ôn hãng Binder (ðức) cân ñiện tử, bể nhiệt hãng Prolabo (Pháp), máy siêu ly tâm Beckman 90.000 vòng/phút hãng (Mỹ)
Các hóa chất dùng trong thí nghiệm ñều ñược mua từ Cộng hòa liên bang ðức
2.2 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu
2.2.1.Thời gian
Từ năm 2007 - 2011
2.2.2 ðịa ñiểm nghiên cứu
- Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt ñới, Trường ðại học Nông nghiệp
Hà Nội
- Trường Cao ñẳng Nông nghiệp và PTNT Bắc Bộ, Xuân Mai – Chương Mỹ -
Hà Nội
- Viện nghiên cứu ngô - ðan Phượng - Hà Nội
- Vùng sản xuất ngô ñại trà ở huyện ðan Phương và Chương Mỹ (Hà Nội)
2.3 Nội dung nghiên cứu
- Xác ñịnh nguyên nhân và triệu chứng bệnh
- Nghiên cứu các phương thức truyền bệnh do virus SCMV
- ðiều tra diễn biến bệnh khảm lùn cây ngô trên các giống ngô tại các ñiểm ñiều tra
- Thử nghiệm sản xuất kháng huyết thanh SCMV
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp ELISA
Phương pháp kiểm tra virus bằng ELISA gián tiếp dựa theo tài liệu mô tả của Gibbs & Harrison (1980) [61]
2.4.2 Phương pháp RT-PCR
Quy trình chiết tách RNA tổng số bằng kít Tripure theo hướng dẫn của nhà
sản xuất hoặc bằng phương pháp CTAB/LiCl của Chang et al (1993)
Trang 8Phương pháp làm sạch SCMV theo phương pháp của Von Baumgarten & Ford, 1981 [88]
2.4.3 Xác ñịnh virus bằng phương pháp hiển vi ñiện tử
Sử dụng phương pháp lát cắt cực mỏng của tác giả Milne (1972) Lúc ñầu mô bệnh ñược cố ñịnh trong dung dịch glutaraldehyde tiếp theo là osmium tetroxide Mẫu ñược làm khô rồi ñược ñúc trong viên con nhộng epoxy và ñược ñưa vào máy ultramicrotome cắt lát cắt cực mỏng từ 50 – 100 nm chiều dày mẫu ñược nhuộm màu trong urannyl acetate và lead citrate và ñược kiểm tra bằng kính hiển vi ñiện tử JEOL 1010
2.4.4 Phương pháp ñiều tra ngoài ñồng
Áp dụng phương pháp nghiên cứu, ñiều tra và phát hiện bệnh hại theo
“Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật” của Viện Bảo vệ thực vật, 2003
[40] Áp dụng phương pháp nghiên cứu, ñiều tra và phát hiện bệnh hại theo Vũ Triệu Mân (2003) [25]
ðiều tra theo phương pháp 5 ñiểm trên ñường chéo góc, mỗi ñiểm 100 cây ñối với ruộng có diện tích lớn, ñiều tra 100% số cây ñối với cây có diện tích nhỏ Nếu cây biểu hiện triệu chứng ñặc trưng sau 10 ñến 20 ngày kể từ ngày xuất hiện những biểu hiện ñầu tiên thì ñược coi là nhiễm bệnh
Tại Viện nghiên cứu ngô tiến hành ñiều tra toàn bộ số cây ở ô thí nghiệm bộ giống chín trung bình tại Bộ môn Canh Tác theo tiêu chuẩn ngành 10 TCN 341:2006 [3] Theo dõi ñịnh kỳ 10 ngày một lần, thu thập số liệu và tính tỷ lệ bệnh
Tỷ lệ bệnh: TLB (%) = × 100
b a
Trong ñó: a: Số cây có triệu chứng nhiễm bệnh virus; b: Tổng số cây ñiều tra ðiều tra tình hình cây bị rệp trên ruộng sản xuất ñại trà ñiều tra 500 cây/ha
và tính tỷ lệ cây bị rệp theo công thức sau:
Số cây có rệp
Tỷ lệ cây bị rệp (%) = × 100
Tổng số cây ñiều tra
2.4.5 Phương pháp xác ñịnh sự lan truyền của virus
- Phương pháp xác ñịnh sự lan truyền của virus khảm lùn cây ngô (SCMV) bằng tiếp xúc cơ học dựa theo tài liệu mô tả của Vũ Triệu Mân (2003) [25] và phương pháp của D.spire phòng thí nghiệm Versailles IRRA Pháp
- Phương pháp xác ñịnh sự lan truyền của virus khảm lá ngô (SCMV) bằng côn trùng môi giới theo Nguyễn Thị Kim Oanh (1996)[29] và Bộ môn Côn trùng (2004) [2]
2.4.6 Phương pháp tính và xử lý số liệu
Số liệu thu thập ñược xử lý trong Microsoft Office Excel và SPSS 15.0
Trang 9CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác ñịnh nguyên nhân gây bệnh khảm lùn ngô
Sự nhận biết các biểu hiện triệu chứng có thể nhìn thấy ở một cây ngô bị bệnh virus là một phương pháp ñơn giản nhất
Tuy vậy, việc phân tích triệu chứng khảm lá trên cây ñơn tử diệp là một việc làm có nhiều khó khăn; Vì dạng khảm và sọc hay ñốm thường ñều xuất hiện theo chiều dài gân lá Chúng tôi lấy các triệu chứng chủ yếu ñiển hình nhất cho từng nhóm ñể dạng triệu chứng (Theo phân nhóm của Vũ Triệu Mân và CTV, 1988 - 2000) kết hợp với thử ELISA và RT-PCR ñể khẳng ñịnh cây bị nhiễm bệnh
3.1.1 Mô tả triệu chứng bệnh virus khảm lùn ngô
Quan sát bệnh virus trên ngô tại các vùng trên thấy bệnh virus khảm lùn ngô xuất hiện phổ biến và hại trên lá non, lá bánh tẻ
Các mẫu bệnh trên ñược thu thập ở các vùng ñiều tra và kiểm tra bằng phương pháp ELISA trực tiếp
ðể có thể không bị nhầm lẫn giữa các triệu chứng do virus khảm lùn gây ra với các loại hình triệu chứng khác chúng tôi mô tả chi tiết như sau:
Biểu hiện triệu chứng trên lá bệnh ở giai ñoạn ñầu rất khó phát hiện, rất nhầm với bệnh khảm lá ngô Bệnh có thể xuất hiện sớm nhưng biểu hiện triệu chứng ñặc trưng dễ nhận biết nhất khi cây ngô ñược 8 – 10 lá
ðặc ñiểm chính của bệnh là toàn cây ñược biến dạng, cây có sự giảm rất mạnh
về chiều cao do các dóng ngắn lại Cây có thể lùn thấy ở mức ñộ khác nhau tùy thuộc vào thời gian nhiễm bệnh Chiều dài và chiều rộng của lá bị thu lại, bản lá hẹp lại, hai mép lá hơi cong lên các áo lá xếp xích nhau Lá có xu hướng xòe ngang
so với thân cây, tạo bởi gốc lá và thân cây rất lớn (70o -80o) toàn cây thường có màu xanh ñậm hơn so với cây khỏe hoặc có màu vàng Có hiện tượng khảm ñặc biệt rõ
ở lá non và lá bánh tẻ
Cây ngô bị nhiễm bệnh nhẹ vẫn có thể trỗ cờ, nhưng cờ ngô có số lượng phấn không ñáng kể và thường nhánh cờ cũng xòe ngang ngắn hơn bình thường so với trục chính Cây có thể ra bắp hoặc không ra bắp nhưng nếu có bắp thì bắp teo lép, nhỏ, ngắn
Cây ngô bị nhiễm bệnh nặng không trỗ cờ ñược hoặc chỉ nhú lên một ñoạn dù không bật ra khỏi lá bao ñược Nếu nhổ cây ngô ñó lên thì thấy hệ thống rễ co ngắn lại, các ñốt rễ xếp xít nhau, rễ có màu nâu tối so với cây khỏe và có nhiều lông nhỏ ở rễ chính Các lá thường chết héo trước lúc thu hoạch, thân khô héo rũ xuống
Các cây bị bệnh có triệu chứng như trên ñược thu về kiểm tra lại bằng kháng huyết thanh của virus SCMV của hãng Agdia (Mỹ) ñều cho kết quả dương tính
Trang 103.1.2 Kiểm tra một số loại virus gây hại ngơ ngồi đồng tại các vùng khác nhau,
vụ xuân 2009 - 2010 bằng phương pháp ELISA gián tiếp
Bảng 3.1 Kết quả kiểm tra virus SCMV gây hại trên ngơ và cây ký chủ ngồi đồng, vụ xuân 2009 - 2010 bằng phương pháp ELISA gián tiếp
Ghi chú: ðiều tra ở ngồi đồng và trên tập đồn giống ngơ giai đoạn cây 7- 9 lá
Mẫu bệnh nghi nhiễm bệnh virus trên 18 giống ngơ được thu thập ở Viện nghiên cứu ngơ ðan Phượng và các giống ngơ được trồng sản xuất đại trà vụ xuân
và vụ thu 2008 - 2009 - 2010 được trồng tại 3 huyện (Chương Mỹ, ðồng Tháp, Gia Lâm) – Hà Nội và Huyện Lương Sơn (Hịa Bình) Thu thập các mẫu cây bị bệnh trên cây mía, hồng tinh, cỏ voi Mẫu bệnh thu thập được kiểm tra bằng phương
pháp ELISA gián tiếp (bảng 3.1)
Trang 11Các mẫu bệnh có triệu chứng khảm lùn ñiển hình ñược kiểm tra bằng phương
pháp ELISA gián tiếp ñều có phản ứng dương với kit ELISA Những cây ñã kiểm tra
ñược ñánh dấu ñể lấy mẫu thử sau khi chế tạo ra kháng huyết thanh phục vụ cho các thí
nghiệm nghiên cứu về khả năng lan truyền của virus SCMV
3.1.3 Kiểm tra virus khảm lùn ngô (SCMV) vụ xuân 2010 - 2011 bằng phương
pháp RT- PCR
Từ các mẫu ngô, mía, cỏ thu thập ñã kiểm tra bằng phương pháp ELISA, lựa
chọn một số mẫu ñiển hình ñể kiểm tra bằng phương pháp RT-PCR nhằm phát hiện
chính xác virus khảm lùn ngô (Sugarcane mosaic virus - SCMV) Kết quả kiểm tra
ñược thể hiện ở bảng 3.2 và hình 3.4
Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra virus khảm lùn ngô (SCMV)
bằng phương pháp RT-PCR STT Ký hiệu
1 NB-ðP-11 Khảm lùn ðồng Tháp - ðan Phượng - Hà Nội +
2 NB-CM-11 Khảm lùn Thủy Xuân Tiên – Chương Mỹ - Hà Nội +
4 CB-11 Khảm lùn Trường ðại học Nông nghiệp - Hà Nội +
Hình 3.4 Kết quả kiểm tra SCMV bằng phương pháp RT-PCR trên một số
mẫu ngô, mía, cỏ thu thập ngoài ñồng vụ xuân 2011
Ghi chú:
Marker: GeneRuler thang DNA 1,0 kb của
hãng Fermentas
3: Cỏ voi bị bệnh SCMV ở Chương Mỹ
1: Ngô nhiễm SCMV ở ðan Phượng 4: Mía nhiễm SCMV ở Gia Lâm
2: Ngô nhiễm SCMV ở Chương Mỹ
Trong mẫu nhiễm với SCMV, sản phẩm RT-PCR cho thấy các mẫu 1,2,3,4
ñều tạo một vạch băng có kích thước là 1,6 kb ñặc trưng cho loài thuộc chi
Trang 12Potyvirus Tiếp theo sử dụng nguồn cây bệnh này ñể làm các thí nghiệm xác ñịnh
khả năng lan truyền của virus SCMV
3.1.4 Phương pháp hiển vi ñiện tử
Lấy mẫu bệnh trên cây ngô và mía có triệu chứng ñiển hình Thực hiện ñúc mẫu và cắt theo phương pháp của Milne (1972) Các thí nghiệm thu ñược kết quả trên hình 3.5 là sợi virus SCMV sau khi ñã ñược làm tinh khiết từ mẫu thu ñược ở Huyện Chương Mỹ và ðan Phượng– Hà Nội Kích thước sợi virus trong mẫu làm sạch ño ñược từ 700 ñến 790nm chiều dài, ñường kính biến ñộng từ 12 – 13nm
Ở hình 3.6 virus trên lát cắt ñều là các thể vùi ñược cắt ngang có dạng hình quả khế hay hoa thị
Hình 3.5 Sợi virus SCMV sau khi ñã
ñược làm tinh khiết từ mẫu thu ñược
ở Huyện Chương Mỹ - Hà Nội
Ảnh chụp trên kính hiển vi ñiện tử JEOL
1010 ở ñộ phóng ñại 10.000 – 15.000 lần
tại Viện VSDT – Hà Nội
Hình 3.6 Thể vùi của virus nằm trong
tế bào lá ngô tại Chương Mỹ - Hà Nội
Ảnh chụp trên kính hiển vi ñiện tử JEOL
1010 ñộ phóng ñại 25.000 tại Viện VSDT – Hà Nội
3.2 Kết quả nghiên cứu về ñặc ñiểm lan truyền của virus SCMV
ðể tìm hiểu khả năng lan truyền của virus SCMV thực hiện các thí nghiệm lây bệnh nhân tạo bằng cơ học tiếp xúc và bằng côn trùng môi giới trên cây ngô, cây chỉ thị và cây ký chủ phụ
3.2.1 Khả năng lan truyền của virus SCMV bằng phương pháp tiếp xúc
cơ học
Nhằm xác ñịnh cây mẫn cảm với virus SCMV trong thí nghiệm nhà lưới lây nhiễm bệnh nhân tạo bằng phương pháp tiếp xúc cơ học nhờ bột carborandum 600 Mesh kết quả thí nghiệm ñược trình bày ở bảng 3.3
