LUẬN ÁN TIẾN SỸ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA THƠM KHÁNG BỆNH BẠC LÁ

Hiện nay, chỉ thị phơn tử DNA đư đ ợc sử d ng nh lƠ một công c hỗ trợ có hiệu qu trong các ch ng trình chọn t o giống cơy trồng trên thế giới.. ng d ng chỉ thị phơn tử trong chọn t o giố

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

DƯƠNG XUÂN TÚ

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA

TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA THƠM

KHÁNG BỆNH BẠC LÁ

LUẬN ÁN TIẾN SỸ CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN VÀ CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

DƯƠNG XUÂN TÚ

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA

TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA THƠM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đơy lƠ công trình nghiên c u c a riêng tôi, các k t qu nghiên c u đ c trình bƠy trong lu n án nƠy lƠ trung thực, khách quan vƠ ch a từng dùng b o v l y b t kỳ học v nƠo

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đ cho vi c thực hi n lu n án đư đ c cám n, các thông tin trích d n trong lu n án nƠy đ u đ c ch rõ ngu n g c

Hải Dương, ngày 08 tháng 6 năm 2015

Tác gi lu n án

D ng Xuơn Tú

LỜI C M N

Để hoƠn thƠnh lu n án nƠy, tôi đư nh n đ c sự quan tơm, giúp đ c a các

th y, cô giáo, các t p thể vƠ cá nhơn cùng các b n đ ng nghi p

Tôi xin bƠy t lòng bi t n sơu sắc đ n PGS.TS Phan H u Tôn, Học Vi n Nông nghi p Vi t Nam, ng i h ớng d n khoa học, đư t n tình h ớng d n vƠ giúp đ tôi trong su t quá trình thực hi n đ tƠi cũng nh hoƠn ch nh lu n án

Tôi xin chơn thƠnh c m n Ban Qu n lỦ ĐƠo t o, Học Vi n Nông nghi p

Vi t Nam; Các th y cô giáo Bộ môn Di truy n vƠ chọn gi ng cơy tr ng, Khoa Nông học, Học Vi n Nông nghi p Vi t Nam đư đƠo t o, h ớng d n, giúp đ vƠ

t o đi u ki n thu n l i để tôi hoƠn thƠnh lu n án nƠy

Tôi xin chơn thƠnh c m n lưnh đ o Vi n Cơy l ng thực vƠ Cơy thực phẩm, các đ ng nghi p thuộc Bộ môn Công ngh sinh học, Vi n Cơy l ng thực

vƠ Cơy thực phẩm đư t o đi u ki n thu n l i vƠ giúp đ cho tôi trong ti n hƠnh thực hi n các thí nghi m c a lu n án

Sau cùng lƠ gia đình đư luôn bên c nh động viên, t o đi u ki n v th i gian vƠ kinh phí để tôi hoƠn thƠnh lu n án nƠy

Tôi xin chơn thƠnh c m n!

Hải Dương, ngày 08 tháng 6 năm 2015

Tác gi lu n án

D ng Xuơn Tú

c u di truy n vƠ chọn t o gi ng lúa

1.3.2 Di truy n tính tr ng mùi th m cơy lúa 19 1.3.3 Ch th phơn t liên k t với gen qui đ nh tính tr ng mùi th m cơy

1.4.2 Ngu n gen kháng vƠ ch th phơn t liên k t với gen kháng 31 1.4.3 K t qu ng d ng ch th phơn t trong chọn t o gi ng lúa kháng 36

b nh b c lá

1.5 Nghiên c u v đa d ng di truy n ngu n gen cơy lúa 41

2.4.1 Đánh giá đa d ng di truy n t p đoƠn v t li u lúa th m kháng b nh

b c lá

49

2.4.2 Lựa chọn ch th phơn t liên k t với gen qui đ nh mùi th m vƠ

tính kháng với các ch ng vi khuẩn gơy b nh b c lá lúa các t nh phía Bắc

54

2.4.3 Lai t o các t h p lai đ nh h ớng t o v t li u cho chọn lọc dòng

lúa mới theo m c tiêu

56

2.4.4 S d ng ch th phơn t chọn cá thể mang kiểu gen th m vƠ gen

kháng b nh b c lá từ các th h phơn ly, k t h p với đánh giá kiểu hình để chọn dòng lúa mới theo m c tiêu

59

3.1 Lựa chọn ch th phơn t liên k t với gen qui đ nh mùi th m vƠ

tính kháng với các ch ng vi khuẩn gơy b nh b c lá lúa các t nh phía Bắc

3.2.3 Đ nh h ớng lựa chọn b mẹ trong lai t o gi ng lúa th m kháng

b nh b c lá cho các t nh phía Bắc

108

3.3 Lai t o các t h p lai đ nh h ớng t o v t li u cho chọn lọc dòng

lúa mới theo m c tiêu

110

3.4 S d ng ch th phơn t chọn cá thể mang kiểu gen th m vƠ gen

kháng b nh b c lá từ các th h phơn ly, k t h p với đánh giá kiểu hình để chọn dòng lúa mới theo m c tiêu

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CH VI T T T

Ch vi t t t Nghĩa đầy đủ

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

IRRI International Rice Research Institute

FAO Food and Agriculture Oganization

MABC Molecular Assissted Backcrossing

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

SRFA Selective Restriction Fragment Amplication SSR Simple Sequence Repeates hay Microsatellite

Vi n CLT - CTP Vi n Cơy l ng thực vƠ Cơy thực phẩm

DANH MỤC CÁC B NG

1.1 Một s ch t t o mùi th m chính đ c tìm ra cơy lúa 16

1.2 Ngu n g c các ch ng vi khuẩn gơy b nh b c lá lúa ph bi n

3.3 K t qu phơn tích kiểu gen th m fgr bằng ch th phơn t k t

h p v i đánh giá mùi th m trong h t qu n thể phơn ly F2 66 3.4 Ph n ng c a các m u gi ng lúa với một s ch ng vi khuẩn gơy

b nh b c lá trong đi u ki n lơy nhi m nhơn t o 68 3.5 Kiểu gen kháng vƠ m c kháng/nhi m với các ch ng vi khuẩn

gơy b nh b c lá th h F1 c a các t h p lai 79

3.6 Tỷ l phơn ly kiểu gen kháng Xa4, xa5 vƠ Xa7 th h F2 c a

các t lai đ c nh n d ng bằng ch th phơn t 82 3.7 Kiểu gen kháng vƠ m c kháng/nhi m với vi khuẩn gơy b nh b c

3.15 Phơn nhóm các m u gi ng lúa theo nhi t hóa h 102 3.16 H s PIC, s allele thể hi n c a 31 m i ch th trên 51 m u

3.17 V t li u lúa th m, ch t l ng cao đ c lựa chọn lƠm v t li u cho

3.18 V t li u lúa kháng b nh b nh b c lá (ngu n gen kháng) đ c lựa

chọn lƠm v t li u cho các t h p lai đ nh h ng 109 3.19 Các dòng gi ng lúa đ c lựa chọn lƠm v t li u lai t o 111 3.20 Danh sách các t h p lai theo đ nh h ớng 112

3.21 Kiểm tra gen th m fgr, gen kháng b c lá Xa4, xa5 vƠ Xa7 con lai

3.22 Quan sát con lai th h F1 c a các t h p lai 114 3.23 K t qu lai t o các t h p lai 4 b mẹ 115 3.24 K t qu lai t o các t h p lai BC5 trong v mùa 2013 vƠ đánh

3.25 K t qu chọn cá thể mang gen m c tiêu trên qu n thể F3 c a các

Vi n CLT - CTP

3.34 Ph n ng c a các dòng lúa với một s sau b nh h i chính trong

đi u ki n đ ng ruộng , v xuơn 2014 t i Vi n CLT ậ CTP 130 3.35 Các y u t c u thƠnh năng su t vƠ năng su t c a các dòng lúa

3.36 Phơn tích ch t l ng c a các dòng lúa trong v xuơn 2014, t i

1.8 Gen kháng xa5 đ c đ nh v với ch th RG556 vƠ RM390 34

1.9 C u trúc c a gen kháng xa5 trên NST s 5 35

1.10 Gen Xa7 đ c đ nh v với ch th liên k t g n nh t lƠ M3 ậ M5 35 3.1 Hình nh đi n di s n phẩm PCR m u ADN c a các gi ng, s

d ng các ch th RG28, RM342, RM223, L06 vƠ BADH2 61 3.2 Hình nh đi n di s n phẩm PCR m u ADN cá thể F2 c a t h p

lai BT7 x Q5, HT1 x KD18 S d ng ch th RG28, RM342,

RM223, L06 vƠ BADH2

64

3.3 Hình nh lơy nhi m c a các ch ng vi khuẩn gơy b nh trên một

s m u gi ng lúa nghiên c u trong v xuơn 2011 72 3.4 Hình nh đi n di trên máy đi n di mao qu n s n phẩm PCR s

d ng m i Npb181 vƠ RM224 trên các m u gi ng lúa 74 3.5 Hình nh đi n di s n phẩm PCR s d ng m i RG556 vƠ RM122 75 3.6 Hình nh đi n di trên máy đi n di mao qu n s n phẩm PCR s

d ng m i P3 vƠ RM5509 trên các m u gi ng lúa 75 3.7 Hình nh đi n di s n phẩm PCR s d ng các m i ch th phơn t

M Đ U

1 Tính c p thi t c a đề tƠi

Cơy lúa (Oryza sativa L.) lƠ cơy l ng thực hƠng đầu Việt Nam, lƠ cơy

trồng truyền thống gắn bó lơu đ i với ng i nông dơn Việt Nam Từ một n ớc ph i nhập khẩu l ng thực tr ớc những năm 80 c a thế kỷ 20, Việt Nam đư v n lên tự túc đ ợc l ng thực vƠ lƠ n ớc xu t khẩu g o lớn th 2 thế giới trong những năm đầu c a thế kỷ 21 Đơy lƠ một b ớc tiến r t lớn trong s n xu t lúa g o Việt Nam Tuy nhiên, g o c a Việt Nam phần lớn lƠ không th m, ch t l ợng th p, giá xu t khẩu th p nhiều so với giá g o xu t khẩu c a các n ớc trong khu vực nh Thái Lan,

n Độ Bên c nh đó, nhu cầu tiêu dùng nội địa đối với g o th m, ch t l ợng cao ngƠy cƠng tăng c về số l ợng vƠ ch t l ợng Thực tế đối với ngƠnh s n xu t lúa g o

c a ta hiện nay lƠ mới chỉ phát triển về mặt số l ợng, còn h n chế về mặt ch t l ợng,

s n phẩm có tính c nh tranh th p dẫn đến hiệu qu s n xu t th p Do vậy, chọn t o

vƠ phát triển các giống lúa th m, ch t l ợng cao ph c v cho s n xu t lƠ yêu cầu c p thiết trong nghiên c u chọn t o giống lúa Việt Nam hiện nay

Bộ giống lúa th m, ch t l ợng hiện đang đ ợc s n xu t t i các vùng miền Việt Nam còn r t đ n điệu, kh năng thích ng kém, ch t l ợng ch a cao, năng su t

th p vƠ đặc biệt lƠ kh năng chống chịu kém với một số sơu bệnh h i chính nh rầy nơu, bệnh đ o ôn, đặc biệt lƠ bệnh b c lá … do vậy nên s n xu t mang tính r i ro cao, hiệu qu s n xu t th p, khó m rộng diện tích Hiện t i, các tỉnh phía Nam,

ng i dơn vẫn gieo trồng các giống lúa ch t l ợng có nguồn gốc từ Thái nh Khaodatmali, Jasmin mặc dù những giống lúa nƠy ch a thực sự phù hợp với điều kiện sinh thái c a Việt Nam T i các tỉnh phía Bắc, các giống lúa ch t l ợng cao

đ ợc trồng vẫn ch yếu lƠ các giống cổ truyền nh Tám th m, Dự… lƠ những giống

c m quang, dƠi ngƠy, chống chịu sơu bệnh kém, năng su t th p vƠ r i ro cao; Các giống lúa đ ợc nhập nội từ Trung Quốc nh Bắc th m số 7 (BT7), H ng th m số 1 (HT1) vƠ các giống lúa chọn t o trong n ớc nh T10, AC5, TL6 lƠ những giống lúa ch t l ợng, ngắn ngƠy, có thể trồng đ ợc c 2 v nh ng năng su t không cao,

kh năng chống chịu sơu bệnh kém đặc biệt lƠ bệnh b c lá vi khuẩn

Một tr ng i lớn trong s n xu t lúa th m, ch t l ợng cao hiện nay lƠ sơu bệnh

h i, đặc biệt lƠ bệnh b c lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) Đơy

lƠ lo i bệnh h i nguy hiểm nh t đối với cơy lúa khu vực Chơu Á (Mew et al.,1993)

Bệnh b c lá lúa đ ợc ghi nhận lƠm hao h t năng su t lúa Chơu Á từ 50% đến 80% (Khush and Ogawa, 1989) Việt Nam, bệnh b c lá lúa phổ biến t t c các vùng trồng lúa trong c n ớc, từ vùng núi cao đến vùng ven biển, gơy thiệt h i đến 60% năng su t lúa hoặc có thể m t trắng Bộ giống lúa ch t l ợng đ ợc trồng phổ biến hiện nay các tỉnh phía Bắc nh BT7, AC5, T10 nhiễm bệnh b c lá r t nặng Trong những năm gần đơy, t i một số tỉnh thuộc khu vực phía Bắc nh HƠ Nội, Nam Định,

H i D ng đư h n chế hoặc không đ a vƠo c c u s n xu t đối với giống lúa BT7

vƠ T10 trong v mùa Đơy lƠ nguyên nhơn h n chế đến m c tiêu tăng s n l ợng lúa

ch t l ợng t i các tỉnh phía Bắc trong những năm qua

Công tác chọn t o giống lúa c a ta hiện nay vẫn ch yếu lƠ ph ng pháp truyền thống dựa trên lai t o vƠ chọn lọc kiểu hình Ph ng pháp nƠy có h n chế lƠ

m t nhiều th i gian, kém hiệu qu , không chính xác vì biểu hiện kiểu hình còn ph thuộc vƠo môi tr ng, đặc biệt lƠ r t khó để chọn đồng th i nhiều tính tr ng mong muốn Để chọn t o đ ợc giống lúa kháng hiệu qu vƠ bền vững với nhiều ch ng vi khuẩn gơy bệnh b c lá thì giống lúa đó ph i mang nhiều gen kháng với nhiều ch ng hoặc ph i ch a 2 hoặc 3 gen kháng hữu hiệu Bằng ph ng pháp chọn lọc truyền thống thì r t khó để thực hiện, tốn nhiều th i gian để t o ra đ ợc giống lúa kháng

Ph ng pháp nƠy cƠng khó h n khi chúng ta tiến hƠnh chọn giống lúa đồng th i có mùi th m vƠ kháng bệnh b c lá Hiện nay, chỉ thị phơn tử DNA đư đ ợc sử d ng nh

lƠ một công c hỗ trợ có hiệu qu trong các ch ng trình chọn t o giống cơy trồng trên thế giới Bằng phơn tích kiểu gen kiểm soát các tính tr ng mong muốn các nhƠ chọn giống có thể tiến hƠnh chọn b t c giai đo n sinh tr ng nƠo c a cơy trồng, chọn lọc có thể tiến hƠnh ngay các thế hệ sớm vƠ đặc biệt lƠ có thể chọn đ ợc giống mang nhiều tính tr ng mong muốn trong cùng th i điểm

Những kết qu nghiên c u đư đ ợc công bố trên thế giới về di truyền tính

tr ng mùi th m vƠ tính kháng bệnh b c lá cơy lúa lƠ c s cho việc nghiên c u

ng d ng chỉ thị DNA trong chọn t o giống lúa th m, kháng bệnh b c lá Đối với mùi th m cơy lúa, ch t 2-acetyl-1-pyrroline (2Ap) đư đ ợc công bố lƠ ch t chính (key compound) t o nên mùi th m c các giống lúa th m, đặc tr ng lƠ mùi th m

c a giống Jasmine vƠ Basmati (Buttery et al., 1983; Bradbury et al., 2005a) Ch t 2AP đ ợc xác định do gen fgr nằm trên NST số 8 kiểm soát tổng hợp (Huang et al., 1994; Bradbury et al., 2005a) Gen fgr đư đ ợc tìm ra các chỉ thị liên kết với những kho ng cách di truyền khác nhau vƠ trên các nguồn vật liệu khác nhau (Ahn et al., 1992; Louriex et al., 1996; Garland and Henry, 2001; Bradbury et al., 2005b) Đối

với bệnh b c lá lúa, hiện nay trên thế giới đư đ ợc công bố có trên 30 ch ng vi

khuẩn Xoo gơy bệnh trên lúa (Nino-Liu et al., 2006) Việt Nam cũng đư có một số

nghiên c u về các ch ng vi khuẩn gơy bệnh b c lá lúa t i các vùng trồng lúa trong

c n ớc (Furuya et al., 2003; Phan Hữu Tôn vƠ Bùi Trọng Th y, 2004; Nguyễn Thị

Liên vƠ cs., 2012) Cho đến nay đư phát hiện có 36 gen kháng chính với các ch ng

vi khuẩn gơy bệnh b c lá trên các giống lúa trồng vƠ lúa hoang d i trên thế giới

(Chun et al., 2012) Di truyền c a 36 gen kháng đư đ ợc công bố, trong đó 28 gen

đư đ ợc định vị trên các NST vƠ có chỉ thị liên kết đư đ ợc đ a ra Việt Nam, các

gen kháng Xa4, xa5, Xa7 vƠ Xa21 đư đ ợc công bố lƠ có kh năng kháng hữu hiệu

với các ch ng vi khuẩn gơy bệnh b c lá lúa các tỉnh phía Bắc (Phan Hữu Tôn vƠ

Bùi Trọng Th y, 2004; Taura et al., 2004; Lư Vĩnh Hoa vƠ cs., 2010; Vũ Hồng

Qu ng vƠ cs., 2011) Đơy lƠ những công bố có giá trị trong nghiên c u ng d ng chỉ thị DNA trong các ch ng trình chọn t o giống lúa th m kháng bệnh b c lá Tuy nhiên, những chỉ thị phơn tử liên kết với gen mùi th m vƠ gen kháng bệnh b c lá đư

đ ợc công bố với những kho ng cách di truyền khác nhau vƠ trên những nguồn vật liệu khác Do vậy, khi ng d ng các chỉ thị phơn tử đư đ ợc công bố trong các

ch ng trình chọn t o giống trên nguồn vật liệu c thể thì cần ph i tiến hƠnh kiểm tra vƠ lựa chọn chỉ thị có độ tin cậy vƠ chính xác cao

ng d ng chỉ thị phơn tử trong chọn t o giống lúa th m, chọn t o giống lúa kháng bệnh b c b c lá Việt Nam cũng đư đ ợc tiến hƠnh một số c quan nghiên

c u Tuy nhiên, việc lƠm nƠy vẫn còn r i r c, ch a thƠnh một hệ thống, ch a có nhiều kết qu đ a ra Đặc biệt, việc ng d ng chỉ thị phơn tử trong chọn t o giống lúa đồng th i mang gen mùi th m vƠ các gen kháng bệnh b c lá vẫn còn lƠ mới Việt Nam hiện nay

2 M c tiêu c a đề tƠi

Lựa chọn chỉ thị phơn tử liên kết với gen mùi th m vƠ gen kháng hữu hiệu với các ch ng vi khuẩn gơy bệnh b c lá phổ biến có độ chính xác cao sử d ng trong lai t o vƠ chọn lọc giống lúa th m kháng bệnh b c lá cho các tỉnh phía Bắc

Chọn t o đ ợc một số dòng lúa th m kháng bệnh b c lá (mang gen th m vƠ 1 hoặc 2 gen kháng hữu hiệu với các ch ng vi khuẩn gơy bệnh b c lá), năng su t khá cho phát triển s n xu t vƠ lƠm vật liệu cho công tác lai t o tiếp

3 ụ nghĩa khoa h c vƠ thực ti n

3.1 ụ nghĩa khoa h c

Ph ng pháp phơn tích di truyền từ bố mẹ đến thế hệ F2 để xác định chỉ thị phơn tử DNA liên kết với gen mùi th m vƠ gen kháng bệnh b c lá cơy lúa, có độ chính xác cao để sử d ng cho lai t o vƠ chọn lọc giống lúa th m, kháng bệnh b c lá trên nguồn vật liệu hiện có: Chỉ thị 4 mồi ESP, IFAP, INSP vƠ EAP nhận diện gen

th m fgr có độ chính xác từ 91 – 94%, chỉ thị Nbp181 nhận diện gen kháng Xa4 với

độ chính xác từ 96 – 97%, chỉ thị RG556 nhận diện gen kháng xa5 với độ chính xác

từ 65 – 76% vƠ chỉ thị P3 nhận diện gen kháng Xa7 với độ chính xác từ 82 - 92%

giữa gen kháng tính kháng

Kh ng định hiệu qu c a ph ng pháp lai t o vƠ chọn lọc kiểu hình kết hợp với sử d ng chỉ thị phơn tử DNA chọn kiểu gen m c tiêu (MAS) trong chọn t o giống lúa th m kháng bệnh b c lá

3.2 ụ nghĩa thực ti n

Chọn t o đ ợc 15 dòng lúa th m mới, mang 1 – 2 gen kháng bệnh b c lá

(trong các gen Xa4, xa5 vƠ Xa7), thể hiện kháng tốt với các ch ng vi khuẩn gơy

bệnh b c lá phổ biến các tỉnh phía Bắc Các dòng lúa nƠy đ ợc sử d ng lƠm vật liệu lai t o trong các ch ng trình chọn giống lúa th m kháng bệnh b c lá tiếp theo

Trong đó, 2 dòng lúa lƠ T7.19-2 (mang gen th m fgr vƠ gen kháng Xa7) vƠ dòng T25.82-3 (mang gen th m fgr vƠ gen kháng xa5) đáp ng đ ợc m c tiêu chọn t o về

th i gian sinh tr ng, năng su t, ch t l ợng, mùi th m vƠ kháng bệnh b c lá sẽ đ ợc tiếp t c phát triển cho s n xu t t i các tỉnh phía Bắc trong th i gian tới

4 Những đóng góp m i c a đề tƠi

Lựa chọn đ ợc chỉ thị phơn tử DNA liên kết với gen mùi th m (fgr) vƠ gen kháng bệnh b c lá (Xa4, xa5 vƠ Xa7) sử d ng cho chọn t o giống lúa th m kháng

bệnh b c lá cho các tỉnh phía Bắc với độ chính xác đến 94% đối với gen mùi th m

fgr, đến 97% đối với gen kháng bệnh b c lá Xa4, đến 76% đối với gen kháng bệnh

b c lá xa5 vƠ đến 92% đối với gen kháng bệnh b c lá Xa7

Đư xác đinh đ ợc 12 mẫu giống lúa th m, ch t l ợng cao vƠ 12 mẫu giống lúa mang gen kháng bệnh b c lá sử d ng lƠm bố mẹ cho các tổ hợp lai định h ớng trong chọn t o giống lúa th m, kháng bệnh b c lá t i các tỉnh phía Bắc

Chọn t o đ ợc 15 dòng lúa th m mới, đồng th i mang 1 – 2 gen kháng bệnh

b c lá phổ biến các tỉnh phía Bắc Các dòng lúa nƠy đ ợc sử d ng lƠm vật liệu mới cho lai t o trong các ch ng trình chọn giống lúa th m kháng bệnh b c lá tiếp theo Trong đó, 2 dòng lúa lƠ T7.19-2 vƠ dòng T25.82-3 đáp ng đ ợc m c tiêu chọn t o sẽ đ ợc tiếp t c phát triển cho s n xu t t i các tỉnh phía Bắc trong th i gian tới

Ch ng 1

T NG QUAN TÀI LI U 1.1 Ch n t o vƠ phát triển lúa th m ch t l ng cao

Nghiên c u chọn t o vƠ phát triển lúa th m ch t l ợng cao lƠ một trong những

u tiên hƠng đầu c a hầu hết các n ớc s n xu t lúa g o trên thế giới Do nhu cầu sử

d ng g o th m tăng cao trong trong những năm gần đơy, ng i tiêu dùng sẵn sƠng

tr giá cao cho g o th m, ch t l ợng Hai nhóm lúa th m nổi tiếng trên thế giới lƠ Jamine vƠ Basmati có giá g o th ng phẩm th ng cao g p 2 – 3 lần so với giá g o

c a các giống lúa th ng không th m Giá g o c a lúa Jasmine vƠ Basmati cao lƠ

b i vì không chỉ do nhu cầu mùi th m vƠ đặc thù c a h t g o mƠ còn lƠ l ợng cung

c p có h n (Bradbury, 2009) Mặc dù n Độ lƠ vùng cung c p g o Basmati lớn nh t, chiếm kho ng một phần ba diện tích trên thế giới nh ng năng su t so với giống lúa

không th m lƠ r t th p (Garg et al., 2006) Năng su t c a giống lúa Jasmine cũng r t

th p, một phần do di truyền c a giống, phần nữa lƠ do các giống lúa Jasmine r t mẫn

c m với các lo i sơu bệnh h i (Lorieux et al., 1996; Toojinda et al., 2005) Mặt khác,

giống lúa th m cũng r t kén vùng trồng, điều nƠy sẽ nh h ng đến sự m rộng diện tích Lúa th m sẽ thể hiện mùi th m cao h n khi đ ợc trồng trong điều kiện thích hợp Hầu nh giống lúa Jasmine Thái Lan đ ợc trồng trong vùng Isan, Đông Bắc

c a Thái Lan, đơy lƠ vùng đ t cát, nhiễm mặn, th ng bị ngập ng vƠ h n nên năng

su t lúa r t th p, bù l i mùi th m r t cao, g o ch t l ợng cao vƠ tr thƠnh th ng

hiệu đặc thù c a Thái lan (Itani et al., 2004) nh h ng c a môi tr ng dẫn đến

năng su t th p các giống lúa th m lƠ nguyên nhơn dẫn đến việc h n chế s n xu t các giống lúa nƠy Mỹ vƠ những n ớc s n xu t lúa g o truyền thống khác (Bradbury, 2009) Một số n ớc có nền s n xu t lúa g o truyền thống th ng tập trung khai thác theo h ớng năng su t cao với hệ thống t ới tiêu vƠ tăng c ng phơn bón, nh ng mùi th m vƠ ch t l ợng bị gi m Nhiều n ớc trong m ng l ới xu t khẩu

g o trên thế giới nh Mỹ cũng ph i nhập khẩu một khối l ợng lớn g o th m thừ Thái Lan, n Độ vƠ Pakistan b i vì họ không thể s n xu t đ ợc g o th m ch t

l ợng cao t i đ t n ớc c a họ (Boriss, 2006) Từ khi bắt đầu cuốc cách m ng xanh, hầu hết các ch ng trình chọn giống lúa trên thế giới tập trung vƠo c i tiến kh năng

chống chịu sơu bệnh h i vƠ đặc biệt lƠ tăng năng su t h t Để tăng sự quan tơm vƠ phát triển tr l i các giống lúa th m trên thế giới, th i gian gần đơy các lỗ lực trong công nghệ sinh học vƠ chọn giống đư tập trung vƠo tăng năng su t vƠ kh năng chống chịu c a các giống lúa th m nh ng vẫn giữ mùi th m vƠ ch t l ợng c a các giống lúa nƠy Việc lƠm nƠy lƠ r t khó đối với giống lúa Basmati b i với một số chỉ tiêu ch t l ợng so với các giống lúa th m ch t l ợng khác nh lƠ độ kéo dƠi h t khi

n u, độ mềm vƠ ch t l ợng n u n ớng (Garg et al., 2006) Mặc dù đư có những cố

gắng, nh ng kết qu c a một số ch ng trình chọn t o giống trong việc c i t o năng

su t vƠ kh năng chống chịu c a giống lúa Basmati bị giới h n b i ph ng pháp chọn lọc truyền thống (Bradbury, 2009) Một số tác gi sử d ng ph ng pháp chọn

giống đột biến (Soomro et al., 2003) hoặc sử d ng chuyển gen (Garg et al., 2006)

nh ng vẫn ch a có giống lúa th m nƠo đ ợc c i tiến di truyền đ ợc đ a ra (Bradbury, 2009) Mặc dù còn có những h n chế về kết qu trong c i tiến các giống lúa th m so với các giống lúa không th m, nh ng kết qu c a các ch ng trình chọn giống với m c đích c i t o tăng năng su t cho giống lúa Jasmine Thái Lan đư thu

đ ợc kết qu đáng kể, thƠnh công h n so với việc c i tiến năng su t c a giống lúa

Basmati (Toojinda et al., 2005)

T i Nhật B n, để thỏa mưn nhu cầu c a ng i tiêu dùng, việc nghiên c u vƠ chọn t o giống lúa ch t l ợng cao đư đ ợc u tiên hƠng đầu vƠ hầu hết các giống lúa trong s n xu t đều lƠ các giống th m có h t g o trong, ít b c b ng, hƠm l ợng amylose th p (từ 15-20%), c m mềm, dẻo, ngon Đơy cũng lƠ xu h ớng chung đư vƠ đang diễn ra t i các n ớc sử d ng lúa g o lƠ cơy l ng thực chính nh ĐƠi Loan, HƠn Quốc T i Trung Quốc, các giống lúa d ng Japonica cho c m mềm, dẻo ngon

đư vƠ đang đ ợc phát triển m nh (Chen et al., 2006) T i HƠn Quốc công tác chọn

t o các giống lúa ch t l ợng cao đáp ng nhu cầu c a ng i tiêu dùng đang đ ợc đặt lên lƠ u tiên hƠng đầu trong công tác nghiên c u vƠ s n xu t lúa (Korea Country Report, 2005) T i Úc, trong ch ng trình nghiên c u về lúa, chính ph Úc cũng đư dƠnh tới 49% kinh phí cho nghiên c u về lúa để nghiên c u vƠ chọn t o giống mới, đặc biệt lƠ các giống lúa cho năng su t cao, ổn định trong điều kiện thay đổi th i tiết, khí hậu vƠ có ch t l ợng cao phù hợp tiêu chí xu t khẩu, nh t lƠ cho thị

tr ng Nhật B n (Blakeney, 2008) Nghiên c u vƠ s n xu t lúa ch t l ợng cao cũng

đặc biệt đ ợc quan tơm t i Thái Lan Để tăng c ng tính c nh tranh trên thị tr ng lúa g o thế giới, Thái Lan đư có những ch ng trình nghiên c u lớn, hƠng năm đầu

t hƠng triệu đô la Mỹ cho việc phát triển các giống lúa th m, h t dƠi vƠ có ch t

l ợng cao (Vanavichit et al., 2004) Thái Lan lƠ n ớc xu t khẩu g o th m, ch t

l ợng cao lớn nh t vƠ có giá cao nh t trên thế giới, kho ng 700 USD/t n, cao h n g o

ch t l ợng c a Mỹ vƠ Việt Nam lƠ 34 USD vƠ 150USD theo th tự (FAOSTAT, 2013)

Việt Nam, lúa th m, ch t l ợng cao đ ợc trồng trên c ba miền Bắc, Trung, Nam Miền Nam có các giống lúa th m ch t l ợng nổi tiếng nh NƠng Th m Chợ ĐƠo, NƠng H ng, TƠu H ng; miền Trung nổi tiểng với lúa Gié An Cựu vƠ Lúa

th m; Miền Bắc đặc tr ng với nhóm lúa Tám, Dự vƠ gần đơy có giống BT7, T10, AC5 cũng đ ợc xếp vƠo nhóm lúa th m ch t l ợng cao Tập đoƠn lúa Tám c a Việt Nam lƠ đặc s n độc đáo nổi tiếng từ ngƠn x a với h t g o nhỏ, trong, c m dẻo, th m ngon Một số giống b n địa Việt Nam yêu cầu vùng đ t trồng phù hợp nh giống NƠng Th m Chợ ĐƠo chỉ trồng xư Mỹ Lệ, huyện Cần Đ ớc, tỉnh Long An; giống Séng Cù vùng cao biên giới tỉnh LƠo Cai, M ng Kh ng, Bát Xát, Simakai thì

c m mới ngon (Nguyễn Văn Luật, 2009) Chọn t o giống lúa th m ch t l ợng cao

ph c v cho s n xu t trong những năm vừa qua đư có m c tiêu, định h ớng rõ rƠng

vƠ đ ợc tiến hƠnh nhiều c quan nghiên c u trên c n ớc nh Viện Cơy l ng thực vƠ Cơy thực phẩm, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Lúa đồng bằng sông Cửu long, Tr ng Đ i học Nông nghiệp HƠ Nội Kết qu cũng đư đ a ra đ ợc một

số giống lúa th m, ch t l ợng cao ph c v cho s n xu t Kết qu nghiên c u c a đề

tƠi “Nghiên cứu phát triển một số giống lúa đặc sản cho một số giống lúa đặc sản cho một số vùng sinh thái của Việt Nam” giai đo n 2001-2005, đư c i tiến vƠ t o ra

một số giống lúa th m nh Nếp 87, OM3536, OM2524, HT1, NƠng Th m chợ đƠo dòng 5 vƠ một số giống khác nh nếp DT12, nếp DS101, nếp PD2, TK106, LT2 (Nguyễn Hữu Nghĩa, 2006) Các giống lúa th m ch t l ợng cao mới chọn t o nh

H ng Cốm do tr ng Đ i học Nông nghiệp HƠ Nội chọn t o; giống lúa CL8, CL9

do Viện Di truyền nông nghiệp chọn t o; giống lúa HT9, AC5, T10, HDT8 do Viện Cơy l ng thực vƠ Cơy thực phẩm chọn t o đư đ ợc đ a vƠo s n xu t t i các tỉnh phía Bắc trong th i gian gần đơy Các giống lúa OM43-26, OM39, OM201,

OM2031, OM1490, OMCS2000, OM4900 do Viện Lúa đồng bằng sông Cửu long chọn t o cũng đư đang đ ợc đ a vƠo s n xu t vƠ phát triển trong s n xu t t i các tỉnh phía Nam Tuy nhiên, cho đến nay các giống lúa th m ch t l ợng mới đ ợc đ a vẫn còn h n chế nh ch t l ợng ch a cao, chỉ m c trung bình nên r t khó để c nh tranh với ch t l ợng c a các giống lúa nh Jasmine, Basmati đư có th ng hiệu trên thế giới; Kh năng chống chịu sơu bệnh h i kém, thích ng hẹp nên độ r i ro cao Thực tế s n xu t hiện nay cho th y: các giống lúa th m ch t l ợng cao mới

đ ợc chọn t o trong th i gian đ ợc đ a ra nhiều về số l ợng giống nh ng diện tích che ph c a các giống nƠy trên s n xu t lƠ r t ít T i các tỉnh phía Bắc, các giống lúa

th m ch t l ợng cao mới chọn t o vẫn ch a thể thực sự thay thế đ ợc giống lúa BT7, lƠ một giống lúa ch t l ợng cao có nguồn gốc từ Trung Quốc đư bộc lộ r t nhiều h n chế về kh năng chống chịu sơu bệnh h i, đặc biệt lƠ bệnh b c lá trong v mùa Đơy lƠ thánh th c lớn đối với các nhƠ chọn t o giống lúa Việt Nam trong

th i gian tới

1.2 ng d ng ch th phơn tử trong ch n t o gi ng lúa

Trong những năm gần đơy, chỉ thị phơn tử DNA đư đ ợc đ a vƠo sử d ng phổ biến trong chọn t o giống trên nhiều đối t ợng cơy trồng theo các m c tiêu khác nhau Trong đó, cơy lúa lƠ đối t ợng cơy trồng đ ợc các nhƠ nghiên c u quan tơm vƠ

đ a ra nhiều kết qu nghiên c u ng d ng theo các m c tiêu nh : năng su t, ch t

l ợng, ngắn ngƠy, chống chịu với điều kiện b t thuận (abioticstress) vƠ sơu bệnh h i (bioticstress) Với những kết qu đư đ t đ ợc, vai trò c a chỉ thị phơn tử DNA đư

đ ợc kh ng định nh lƠ một công c mới giúp cho công tác chọn t o giống cơy trồng có hiệu qu h n, chính xác h n vƠ nhanh h n

1.2.1 Một số chỉ thị phân tử DNA được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống lúa

1.2.1.1 Chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA: Chỉ thị đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn - RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Chỉ thị nƠy đ ợc các nhƠ di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên

c u lập b n đồ các gen liên quan đến bệnh ng i (Botstein et al., 1980) thực

vật, chỉ thị nƠy lần đầu tiên đ ợc áp d ng trong nghiên c u gen kiểm soát tổng hợp ARN ribosom trong vùng c u trúc nhơn c a lúa mì (Appels and Dvorak, 1982)

lúa, chỉ thị RFLP đ ợc sử d ng nhiều trong lập b n đồ QTLs cho các tính tr ng ch t

l ợng vƠ năng su t lúa (Lin et al., 1995), các gen kháng đ o ôn (Hittalmani et al.,

1995), gen kháng rầy nơu (Hirabayashi and Ogawa, 1995), các gen kháng bệnh b c

lá (Yoshimura et al., 1998; Yer and McCouch, 2004; He et al., 2006) vƠ nhiều các

tính tr ng khác nh kh năng chịu mặn, h n… Chỉ thị RFLP lƠ chỉ thị đồng trội, có

kh năng biểu hiện t t c các alen c a cùng một locus gen, do vậy có thể phơn biệt

đ ợc các cá thể đồng hợp tử vƠ dị hợp tử Đơy lƠ đặc điểm u việt c a lo i chỉ thị RFLP H n chế c a ph ng pháp nƠy lƠ tốn nhiều th i gian cần có mẫu dò đánh d u

vƠ enzyme cắt giới h n, đòi hỏi nhiều trang thiết bị phòng thí nghiệm Đặc biệt lƠ cần một l ợng lớn DNA

1.2.1.2 Chỉ thị phân tử dựa trên kĩ thuật phản ứng chuỗi trùng phân (Polymerase Chain Reaction - PCR)

Kỹ thuật PCR đ ợc Kary Mullis phát minh ra năm 1985 vƠ đư nhanh chóng

đ ợc sử d ng hầu hết các phòng thí nghiệm trên toƠn thế giới Ph n ng dựa trên

nguyên tắc tổng hợp DNA nh enzym DNA Polymerase chịu nhiệt (Taq, Pfu…) với

sự có mặt c a đo n DNA khuôn mẫu, DNA mồi, các nucleotit (dNTP) gồm 4 lo i: dATP, dCTP, dGTP, dTTP vƠ ion Mg2+ ho t động nh một ch t xúc tác (Saiki and Gelfand, 1989) Tuỳ theo b n ch t c a những đo n mồi sử d ng mƠ có những hệ thống chỉ thị đặc tr ng gồm chỉ thị STS, RAPD, SSR, AFLP, SNP, c thể nh sau:

Chỉ thị STS (Sequence Tagged Sites): Chỉ thị STS dựa trên ph n ng PCR,

đ ợc đ a ra nh việc xác định trình tự 2 đầu mỗi đo n c a mẫu dò dùng trong RFLP phát hiện đ ợc đa hình liên kết gen, chọn một đo n đặc hiệu để thiết kế mồi dùng cho ph n ng PCR Đơy lƠ lo i chỉ thị đồng trội có thể phơn biệt đ ợc gen tr ng thái đồng hợp tự vƠ dị hợp tử Mỗi đo n gen khác nhau sẽ có trình tự nucleotide khác nhau, tùy từng vị trí mƠ mồi có thể gắn vƠo những đo n khác nhau, nếu ghép 2 đầu c a một đo n DNA nh t định thì sẽ đ ợc nhơn lên đa hình thể hiện qua chiều dƠi đo n đ ợc xác định qua điện di Trong nhiều tr ng hợp, đo n nhơn lên có kích

th ớc bằng nhau nh ng có trình tự nucleotide khác nhau, muốn phát hiện ph i dùng đến enzyme cắt giới h n Enzyme nƠy nhận biết đ ợc các trình tự khác nhau đó vƠ cắt những vị trí nh t định sẽ t o ra đ ợc các đo n khác nhau, điện di sẽ xác định

đ ợc đa hình Trình tự mồi STS phát hiện sự biến đổi m c allen c a gen trong

phơn tử DNA Nh ợc điểm chỉ thị STS lƠ đòi hỏi ph i biết tr ớc đ ợc một vƠi trình

tự DNA c a gen (Olson et al., 1989)

Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA): Lo i chỉ thị nƠy dựa

trên ph n ng PCR, nhơn bội những đo n DNA trong hệ gen, sử d ng đo n mồi đ n

lẻ, ngẫu nhiên (random primers) dƠi kho ng 9-10 nucleotit d ới nhiệt độ kết cặp

th p (kho ng 370C) (Williams et al., 1990) RAPD sinh ra những chỉ thị trội b i sự

có mặt hay vắng mặt những băng DNA đặc tr ng, vì vậy không phơn biệt đ ợc thể

dị hợp tử Đơy lƠ h n chế c a lo i chỉ thị nƠy so với chỉ thị đồng trội RFLP Mặc dù vậy, chỉ thị nƠy vẫn lƠ một công c hữu hiệu trong việc lập b n đồ di truyền những dòng nhị bội, những dòng cận phối hay các quần thể lai tr l i Lợi thế c a lo i chỉ

thị nƠy lƠ không cần biết những thông tin về trình tự (William et al., 1993) Do chỉ

thị RAPD có h n chế lƠ độ nh y bị ph thuộc vƠo điều kiện c a ph n ng, đôi khi kết qu không lặp l i đ ợc, nên ng i ta đư khắc ph c bằng cách nhơn dòng những băng RAPD đặc hiệu, xác định trình tự c a chúng rồi thiết kế những đo n mồi dƠi kho ng 20bp từ c hai đầu vƠ gọi lƠ chỉ thị SCARs (Sequence - Characterized Amplified Region)

Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism): Lo i chỉ thị nƠy

đ ợc sử d ng rộng rưi trong nghiên c u lập b n đồ gen vƠ xác định chỉ thị phơn tử liên kết gen Kĩ thuật t o ra các lo i chỉ thị nƠy đ ợc gọi lƠ nhơn chọn lọc những

đo n cắt giới h n (Selective Restriction Fragment Amplication - SRFA) Ph ng pháp nƠy có thể phát hiện đ ợc sự có mặt c a những đo n cắt giới h n b t kỳ (Vos

et al., 1995) Kĩ thuật AFLP có thể t o ra số l ợng chỉ thị di truyền nhiều nh t so với

các kĩ thuật khác đối với mỗi tổ hợp mồi L ợng DNA tổng số tiêu tốn cho kĩ thuật nƠy l i r t ít Đơy lƠ một ph ng pháp có hiệu qu c trong nghiên c u đa d ng di truyền, tìm chỉ thị liên kết vƠ lập b n đồ gen Tuy nhiên, chỉ thị AFLP chỉ có thể phát hiện đ ợc một tr ng thái alen c a gen, do đó không thể phơn biệt giữa thể đồng hợp tử vƠ dị hợp tử vƠ giá thƠnh cho nghiên c u lƠ t ng đối cao

Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeates hay Microsatellite): lƠ chỉ thị nghiên

c u đa hình những đo n DNA lặp l i đ n gi n, đ n vị lặp từ 1 – 6 nucleotide B n

ch t đa hình c a SSR đ ợc sinh ra do sự nhơn bội từ DNA tổng số c a hệ gen nh

sử d ng 2 đo n mồi chặn biên 2 đầu với trình tự c a vùng lặp l i Giá trị c a SSR lƠ

chỗ nó sinh ra đa hình từ r t nhiều vùng t ng ng, bao ph rộng khắp hệ gen vƠ phơn biệt đ ợc tr ng thái alen khác nhau c a gen (chỉ thị đồng trội), có thể phơn biệt

đ ợc đồng hợp tử vƠ dị hợp tử, dễ dƠng phát hiện bằng PCR thực vật, tần số vƠ

số l ợng SSR đư đ ợc xác định trên các cơy rừng nhiệt đới, cơy bắp c i (Lagercrantz

et al., 1993), lúa mì vƠ 34 giống cơy trồng khác (Morgante and Oliveri, 1993) Hiện

nay, nghiên c u sƠng lọc (screening) th viện genome lúa cho th y có kho ng 25.000 chỉ thị SSR Chỉ thị nƠy đ ợc sử d ng nhiều trong nghiên c u da d ng di truyền, tìm chỉ thị liên kết vƠ lập b n đồ gen với độ chính xác cao, đ n gi n vƠ rẻ

tiền (McCouch et al., 2002; Liu et al., 2002 )

Chỉ thị SNP (Single Nucleotide Polymorphisms): Chỉ thị đa hình nucleotide

đ n (Single Nucleotide Polymorphisms - SNP) có thể phơn biệt sự khác nhau trong phơn tử AND m c độ từng nucleotit trong c u trúc di truyền giữa các cá thể hoặc NST Chỉ thị SNP đ ợc tìm ra đầu tiên trong bộ gen ng i, kho ng 1.250 bp lƠ sƠng lọc đ ợc 1 SNP (Liu, 2007) vƠ lúa thì c kho ng 200 - 700bp xu t hiện 1 SNP (Kenneth, 2009) Hiện nay, ng d ng c a chỉ thị SNP đang r t phổ biết trong lĩnh vực nghiên c u về di truyền, lập b n đồ gien vƠ xem xét t ng quan c a các gien

liên kết trên toƠn bộ genome tới các tính tr ng nghiên c u (Jin et al., 2010) Những

bộ chỉ thị SNP với mật độ phơn bố trên toƠn bộ genome nƠy đ ợc r t nhiều viện nghiên c u vƠ công ty trên thế giới thiết kế vƠ ng d ng tiến hƠnh hoƠn toƠn tự động

vƠ đ t thông hiệu r t cao (Shen et al., 2004) Trong những năm gần đơy những

nghiên c u về di truyền thông qua các công nghệ genotyping ng d ng chỉ thị SNP

đư đ ợc tiến hƠnh trên r t nhiều loƠi nh lƠ nho (Lijavetzky et al., 2007), lúa (Caicedo et al., 2009; Elizabeth et al., 2009), đậu t ng (Hyten et al., 2009), lúa

m ch (Close et al., 2009), ngô (Yan et al., 2009), lúa mì (Akhunov et al., 2009)

Trong ng d ng chỉ thị DNA liên kết để chọn gen qui định một tính tr ng nƠo

đó thì việc lựa chọn chỉ thị lƠ quan trọng quyết định đến sự thƠnh công Sự lựa chọn nƠy dựa trên một số đặc điểm u tiên chính nh : độ chính xác c a chỉ thị (liên kết chặt với gen m c tiêu), dễ sử d ng, tuơn th tự động hóa cao, kh năng lặp l i cao, chi phí th p Bên c nh đó, sự lựa chọn chỉ thị còn ph i ph thuộc vƠo thiết bị máy móc c a phòng thí nghiệm vƠ trình độ c a cán bộ nghiên c u Một số lo i chỉ thị phơn tử DNA đ ợc đ a ra với các đặc điểm nh sau:

Đặc điểm RFLP RADP AFLP SSR SNP

DNA yêu cầu (μg) (DNA

required)

Ch t l ợng DNA (DNA quality) Cao cao T bình T bình cao

Số locus đa hình phơn tích

(Number of polymorph loci

1.2.2 Một số kết quả ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa

Hiện nay, một số gen kiểm soát một số tính tr ng chính trong cơy lúa nh

th i gian sinh tr ng, năng su t, ch t l ợng, kh năng chống chịu sơu bệnh h i (biotic stress) vƠ các điều kiện b t thuận (abiotic stress) đư đ ợc định vị trên NST bằng các chỉ thị phơn tử ADN Các chỉ thị phơn tử ADN nƠy đ ợc sử d ng nh lƠ một công c hỗ trợ đắc lực trong công tác lai t o vƠ chọn lọc giống lúa mới

Những năm gần đơy, các nhƠ nghiên c u thuộc IRRI đư thƠnh công trong việc chuyển gen quỦ vƠo các giống lúa trồng bằng ph ng lai tr l i vƠ chọn lọc nh chỉ thị phơn tử (MABC) Kết qu đư đ ợc t o ra lƠ các giống lúa vừa có năng su t cao, vừa có kh năng chống chịu với các điều kiện môi tr ng b t thuận, đặc biệt lƠ trong việc quy t nhiều gen kháng b c lá vƠo một giống nh dòng IRBB64 mang bốn gen

kháng Xa4, xa5, Xa7 vƠ Xa21, dòng IRBB63 mang các gen xa5, Xa7, Xa13 (Le et al., 2006)

T i Trung Quốc, các nhƠ chọn giống đư sử d ng ph ng pháp MABC để

chuyển thƠnh công hai gen Xa21 vƠ Xa4 vƠo dòng ph c hồi Mianhui 725 cho tổ hợp

lúa lai Shuhui 207 Sử d ng MABC với các chỉ thị phơn tử liên kết pTA21 vƠ AB9

nhóm tác gi nƠy cũng đư chuyển thƠnh công gen Xa21 vƠo dòng Minghui63 T ng

tự, các tác gi cũng đư thu đ ợc dòng ph c hồi Minghui 63 mang tổ hợp gen kháng

b c lá Xa21 vƠ gen Bt kháng sơu, dòng Minghui 63 mang hai gen kháng đ o ôn 1(t) vƠ Pi-2(t), dòng Minghui 63 mang hai gen kháng rầy nơu (Shen et al., 2001)

Pi-T i úc, các nhƠ nghiên c u đư thƠnh công trong việc xác định vƠ ng d ng những chỉ thị phơn tử DNA nh R28, RM223, RM342 liên kết với gen mùi th m

(fgr) trong việc chọn t o giống lúa th m (Garland and Henry, 2001)

T i Thái Lan, chỉ thị phơn tử DNA cũng đư đ ợc sử d ng một cách hữu hiệu

trong việc t o ra các dòng, giống lúa th m mới (Vanavichit et al , 2004) Họ cũng

đư thƠnh công trong việc kết hợp giữa nuôi c y h t ph n vƠ sử d ng chỉ thị phơn tử liên kết với gen quy định mùi th m, tính kháng bệnh b c lá, đ o ôn để t o nhanh các giống lúa mới có mùi th m vƠ có kh năng chống chịu tốt với một số sơu bệnh

h i chính Các nhƠ chọn giống ng i Thái cũng đư thƠnh công trong việc quy t các gen kháng b c lá, đ o ôn vƠo các giống lúa th m c a địa ph ng nh Thai Hom Mali, Kao Khor 6 (thuộc nhóm giống lúa Jasmine) thông qua con đ ng lai hồi quy

kết hợp sử d ng chỉ thị phơn tử (Jairin et al., 2009)

Việt Nam, một số công trình nghiên c u sử d ng chị thị phơn tử DNA để phát hiện gen kháng bệnh vƠ lập b n đồ gen kháng đối với một số bệnh chính cơy lúa đư đ ợc triển khai t i một số viện nghiên c u vƠ tr ng đ i học trong n ớc Nghiên c u c a Viện Lúa đồng bằng sông Cửu long vƠ Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Miền nam về phơn tích di truyền tính kháng rầy nơu c a giống lúa hoang nh chỉ thị phơn tử Các nhƠ nghiên c u đư xác định đ ợc hai gen kháng rầy

nơu loƠi lúa d i O Officinalis, đ ợc định vị trên NST số 3 vƠ số 7 liên kết với 2

chỉ thị t ng ng lƠ RM168 vƠ RM18 (Nguyễn Thị Lang vƠ cs., 2007) Nghiên c u xác định gen kiểm soát tính tr ng kháng đ o ôn vƠ rầy nơu lúa bằng các chỉ thị AFLP, các tác gi đư tìm đ ợc một số chỉ thị AFLP liên kết với tính kháng rầy nơu

vƠ đ o ôn hai dòng lúa nghiên c u (Nguyễn Thị Lang vƠ Bùi Chí Bửu, 2003; Bùi Chí Bửu vƠ Nguyễn Thị Lang, 2005) Nghiên c u c a Viện Di truyền nông nghiệp,

đư quy t vƠ chọn lọc đ ợc dòng lúa mang c hai gen kháng bệnh đ o ôn P1-1 vƠ P1-5 qua sử d ng chỉ thị phơn tử liên kết với các gen để chọn lọc (Lư Tu n nghĩa vƠ

cs., 2011) Nghiên c u lập b n đồ gen kiểm soát tính b t d c đực nh y c m nhiệt độ cũng đư đ ợc tiến hƠnh, các tác gi thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp đư xác định

đ ợc bốn chỉ thị phơn tử AFLP liên kết gen tgms-vn1 (gen b t d c đực nhơn nh y

c m với nhiệt độ) với kho ng cách gần nh t lƠ 3,5cM trên vai ngắn c a NST số 2

c a hệ gen lúa (Ph m Ngọc L ng, 2005) L u Thị Ngọc Huyền vƠ Vũ Đ c Quang

(2003) đư xác định 3 gen kháng rầy nơu bph3, bph4, Bph6 vƠ phát hiện đ ợc một

lo t chỉ thị phơn tử SSR liên kết gần với các gen kháng đó Nguyễn Thị Lang với sự cộng tác c a các tác gi thuộc IRRI đư thƠnh công trong việc lập b n đồ gen kháng

Bph10-1 kháng tốt đối với quần thể rầy nơu ĐBSCL (Nguyễn Thị Lang vƠ Bùi Chí

Bửu, 2003) ng d ng chỉ thị phơn tử trong chọn t o giống lúa chịu mặn, một số kết

qu nghiên c u về chỉ thị phơn tử DNA liên kết với gen chọi mặn cơy lúa đư đ ợc công bố Phơn tích QTL chịu mặn cơy lúa, Bùi Chí Bửu vƠ Nguyễn thị Lang (2004) đư xác định đ ợc chỉ thị RM223 liên kết với gen chịu mặn cơy lúa với kho ng cách 6,3 cM trên nhiễm sắc thể số 8; Chỉ thị OSR1 vƠ RM315 liên kết với QTLs cho tính chống chịu mặn lúa, định vị trên nhiễm sắc thể số 1 Sử d ng

ph ng pháp chọn giống bằng chỉ thị phơn tử (MABC) nhóm tác gi c a Viện Di

truyền Nông nghiệp đư chọn t o đ ợc các dòng mang QTL/gen Saltol chịu mặn vƠ Sub1 chịu ngập có nền di truyền c a giống lúa trồng phổ biến c a Việt Nam c thể: Bắc Th m 7- Saltol, AS996-Saltol , Bắc th m 7 – Sub1, AS996-Sub1, Khang Dơn 18-Sub1, OM6976-Saltol Các dòng nƠy đư đ ợc nhơn vƠ trồng thử nghiệm trên đồng ruộng (Le et al., 2011; 2012; Ta et al., 2012)

Những kết qu nghiên c u về sử d ng chỉ thị phơn tử DNA trong chọn t o giống lúa theo m c tiêu đư đ ợc công bố trong vƠ ngoƠi n ớc lƠ t ng đối phong phú c về nghiên c u c b n vƠ nghiên c u ng d ng Đơy lƠ c s cho việc tiếp t c nghiên c u vƠ ng d ng các chỉ thị phơn tử DNA trong công tác chọn t o giống lúa theo các m c tiêu khác nhau, trên các nguồn vật liệu khác nhau Việt Nam trong hiện t i vƠ th i gian tới

1.3 Nghiên c u về mùi th m vƠ ch th phơn tử liên k t v i gen qui đ nh mùi

th m cơy lúa

1.3.1 Chất tạo mùi thơm trong cây lúa

Về ch t t o mùi th m trong cơy lúa, cho đến nay, trên thế giới đư có nhiều kết

qu nghiên c u đ ợc công bố Ch t th m trong lúa có tới h n một trăm hợp ch t dễ bay h i nh hydrocarbons, alcohol, aldehydes, ketones, acid, esters, phenols, pyridines, pyrazines vƠ những hợp ch t khác Trong đó, ch t 2-acetyl-1-pyrroline (2Ap), lƠ ch t chính t o nên mùi th m những giống lúa, đặc tr ng lƠ 2 giống

Basmati vƠ Jasmine (Buttery et al., 1983; Bradbury, 2009) Một số ch t t o mùi

th m chính đ ợc tìm ra cơy lúa do tác gi Bradbury (2009) đ a ra theo b ng 1.1

B ng 1.1 M t s ch t t o mùi th m chính đ c tìm ra cơy lúa

H p ch t th m Ng ỡng

t o mùi

th m (ppb)

Nguồn: Bradbury (2009)

Những kết qu nghiên c u đư đ ợc công bố về định l ợng ch t 2Ap trong các giống lúa th m vƠ giống lúa không th m lƠ một bằng ch ng để kh ng định ch t 2Ap

lƠ ch t t o mùi th m chính trong các giống lúa th m HƠm l ợng ch t 2Ap đ ợc tìm

ra c các giống lúa th m vƠ giống lúa không th m, tuy nhiên giống lúa không

th m thì th p h n nhiều HƠm l ợng 2AP những giống lúa th m đ t tới 0,9 mg/kg, cao g p h n 100 lần so với các các giống lúa không th m (0,006-0,008 mg/kg)

(Buttery et al., 1983) HƠm l ợng 2AP trong các giống lúa th m Jasmine 85 lƠ 212,0 ppb; Khao Dawk Mali lƠ 322,2ppb, NƠng th m chợ đƠo lƠ 83,6ppb (Nguyen et al.,

2006) Trong cơy lúa, ch t th m 2Ap đư đ ợc tìm th y hầu hết các bộ phận c a

cơy, trừ phần rễ (Lorieux et al., 1996)

Ch t 2AP đ ợc t o thƠnh trong điều kiện nhiệt độ bình th ng t t c các

bộ phận c a cơy lúa phía trên mặt đ t Ch t 2AP có c u t o gồm vòng pyrroline vƠ nhóm methyl-keton đ ợc tác gi Yoshihashi (2002) đ a ra trong hình 1.1:

Hình 1.1 C u t o 2-acetyl-1-pyrroline

Nguồn: Yoshihashi (2002)

Tác gi Yoshihashi et al (2002) đư đề xu t đ ng h ớng sinh tổng hợp 2AP

từ L-proline theo s đồ sau:

Hình 1.2 S đ m i quan h giữa BAD vƠ sự t ng h p 2AP

Nguồn: Yoshihashi et al (2002)

Ch t tiền thơn c a 2AP lƠ proline, đơy lƠ ch t tham gia vƠo quá trình điều hoƠ thẩm th u c a tế bƠo đ ợc t o ra nhiều h n khi cơy lúa r i vƠo tình tr ng khô h n

Sự tích luỹ proline trong điều kiện khô h n tỷ lệ thuận với sự hình thƠnh 2AP vƠ đó cũng lƠ lỦ do t i sao giống lúa th m Thái lan Khao Dawk Mali 105 có mùi r t th m

trong điều kiện khô h n vùng Tung Kula Rong Hai (Yoshihashi et al., 2002)

Tổng hợp ch t 2AP trong cơy lúa ph thuộc vƠo b n ch t di truyền c a giống

vƠ một số yếu tố mồi tr ng nh nhiệt độ, th i v , vĩ độ, vùng sinh thái vƠ điều kiện

khô h n, mặn…Tác gi Itani et al (2004) đư nghiên c u về hƠm l ợng ch t 2AP

trong h t c a các giống lúa Nhật B n ph thuộc các yếu tố nh di truyền (giống),

th i gian thu ho ch vƠ nhiệt độ môi tr ng Theo tác gi , trong 63 mẫu giống lúa

th m đ ợc trồng trong cùng điều kiện, có nhiều mẫu giống có hƠm l ợng 2AP

t ng đ ng nhau, có những giống cao 200% vƠ có những giống th p chỉ bằng 60%

so với m c trung bình Ch t 2Ap trong h t lƠ cao nh t khi thu ho ch th i điểm 4 –

5 tuần sau trỗ vƠ gi m 20% khi thu th i điểm 7 tuần sau trỗ HƠm l ợng ch t 2AP trong h t cũng đ ợc đ a ra lƠ đ t cao h n khi giai đo n từ trỗ đến chín m c nhiệt

độ th p (25oC vƠo ban ngƠy vƠ 20oC vƠo ban đêm) so với m c nhiệt nhiệt độ cao (35oC vƠo ban ngƠy vƠ 30oC vƠo ban đêm) trên t t các giống lúa nghiên c u Theo

Lorieux et al (1996), 2 giống lúa Basmati vƠ Jasmin thu ho ch vƠo đầu mùa đông sẽ

có hƠm l ợng 2AP trong h t lƠ cao nh t Theo Yoshihashi et al (2002), ch t 2AP

trong h t vƠ ch t l ợng h t c a cơy lúa tăng khi đ ợc trồng trong điều kiện h n vƠ

vĩ độ cao Nh vậy, mùi th m cơy lúa lƠ r t khác nhau khi đ ợc gieo trồng trong các điều kiện khác nhau nh th i v , nhiệt độ, vùng sinh thái, vĩ độ vƠ điều kiện h n, mặn…

Mùi th m lúa đ ợc miêu t giống nh mùi th m cơy d a d i một số

n ớc chơu Á, lá khô c a cơy d a d i đ ợc cho vƠo g o không th m khi n u để t o mùi th m nh đối với mùi th m c a c m n u từ g o Jasmine hoặc Basmati (Bradbury, 2009) NgoƠi ra, 2AP còn đ ợc tìm một số lo i cơy trồng khác nh ngô, đậu xanh (Brahmachary and Ghosh, 2002)

Có nhiều ph ng pháp giúp xác định đ ợc mùi th m c a lúa, bao gồm c định tính vƠ định l ợng Ph ng pháp định tính nh nếm h t c m nhận đ ợc mùi

th m c a h t g o khi nhai, ph ng pháp ngửi mùi mẫu lá hoặc h t g o ngơm trong dung dịch KOH 1.7% hoặc I2-KI (Nguyen et al., 2006) Ph ng pháp định l ợng

ch t 2Ap bằng ph ng pháp sắc kỦ khí (Buttery et al., 1983; Itani et al., 2004)

NgoƠi ra Nadaf (2006) đư tìm ra ch t 2,4-dinitrophenol hydrazyine giúp nhận biết sự

có mặt c a 2AP, vì ch t nƠy khi ph n ng với 2AP sẽ t o ra ch t mƠu đỏ cam lƠ acetyl-phenyl hydrazone

2-1.3.2 Di truyền tính trạng mùi thơm ở cây lúa

Di truyền mùi th m lúa đ ợc nhiều nhƠ khoa học trên thế giới quan tơm nghiên c u Tùy từng tác gi nghiên c u, do sử d ng nguồn vật liệu lai t o khác nhau đư đ a ra kết luận về sự có mặt c a từ 1 – 3 gen qui định mùi th m cơy lúa Khi nghiên c u tỉ lệ phơn ly giữa cá thể th m vƠ không th m trong quần thể F2 c a nhiều tổ hợp lai, các nhƠ nghiên c u cho rằng có một số gen khác nhau (trội hoặc lặn) liên quan tới tính tr ng th m (Berner and Hoff, 1986) Theo Reddy and

Sathyanarayanaid (1980) thì có 3 gen trội qui định mùi th m cơy lúa lƠ Ska, Skb

vƠ Skc Các kết qu nghiên c u gần đơy đư đ ợc công bố đều khẳng định gen đ n

lặn nằm trên nhiễm sắc thế số 8 chịu trách nhiệm kiểm soát tổng hợp hợp ch t th m

2Ap Gen nƠy đ ợc đặt tên lƠ fgr (fragrant) (Huang et al., 1994; Bradbury et al., 2005a; Patil et al., 2012) Theo Kuo et al (2006), quá trình tổng hợp 2Ap trong cơy

lúa ph thuộc vƠo ho t tính c a enzyme Betaine Aldehyde Dehydrogenase 2 (BAD2) sẽ c nh tranh c ch t với enzyme sinh tổng hợp 2AP, ch t 2AP vì thế sẽ

gi m vƠ lúa sẽ ít th m hoặc không có mùi th m Bradbury et al (2005a) nghiên c u

đặc điểm di truyền c a gen qui định mùi th m trong 2 giống lúa Basmati vƠ Jasmine

đư kết luận: mùi th m c a 2 giống lúa nƠy lƠ do 2AP, đ ợc kiểm soát b i gen đ n

lặn fgr trên nhiễm sắc thể số 8 Kết qu gi i trình tự vùng gen nƠy cho th y đột biến

m t 8bp vƠ thay đổi 3 nucleotite exon th 7 c a gen qui định tổng hợp BAD trên

NST số 8 lƠ nguyên nhơn t o nên mùi th m 2AP C u trúc gen fgr đ ợc nhóm tác

gi đ a ra đ ợc bắt đầu bằng bộ 3 (codon) ATG, 15 exon, 14 intron vƠ kết thúc bằng

bộ 3 TAA Gi i trình tự nucleotid exon 7 đ ợc nhóm tác gi đ a ra c đối với giống lúa th m vƠ giống lúa không th m, sai khác nh sau:

Hình 1.3 S đ c u trúc c a gen fgr Gi ng lúa th m lƠ sự m t 8 bp vƠ 3

nucleotide (SNP) b 3 in đ m vƠ g ch chơn trong exon

Nguồn: Bradbury et al (2005a)

Kết qu nghiên c u nƠy cũng đ ợc các tác khác đ a ra trong các nghiên c u

t ng tự Đo n gen sinh tổng hợp enzyme BAD2 đ ợc xác định lƠ do bị đột biến

m t 8 bp vƠ thay đổi 3 SNPs exon 7 dẫn đến kết thúc sớm trong quá trình gi i mư

sẽ lƠm enzyme BAD2 m t ho t tính, vì thế enzyme sinh tổng hợp ch t 2AP nhiều

h n vƠ lúa có mùi th m (Kuo et al., 2006) Theo Chen et al (2008), sự có mặt c a

allen trội BADH2 qui định tổng hợp enzyme Betaine Aldehyde Dehydrogenase (BAD2) đư c chế sự tổng hợp ch t 2AP t o mùi th m trong cơy lúa Có 2 tr ng thái

allen lặn c a gen nƠy lƠ badh2-E2 vƠ badh2-E7 kiểm soát sự tổng hợp ch t 2AP Tác gi Srivong et al (2008), Tr ng đ i học Khon Kaen, Thái Lan đư tiến hƠnh

phơn tích trình tự exon 7 trên NST số 8 c a giống lúa th m Khao Dok Mali 105, Kor Khor 6 cũng cho th y sự m t đo n 8pb vƠ 3 nucleotide đ n trong khi đó giống lúa không th m Sew-Mae-Jan vƠ Niew-san-Pah-Tawng không có sự m t đo n nƠy

Tác gi Kovach et al (2009), Tr ng Đ i học Cornell (Mỹ) đư tiến hƠnh

nghiên c u về nguồn gốc gen kiểm soát mùi th m cơy lúa Theo nhóm tác gi nƠy,

gen đ n lặn badh2 nằm trên NST số 8, lƠ gen chính kiểm soát tổng hợp 2AP t o mùi

th m hầu hết các giống lúa, đ i diện nhóm Basmati vƠ Jasmine Đánh giá trên 242 mẫu giống lúa có nguồn gốc khác nhau bằng các chỉ thị SNP vƠ SSR, nhóm tác gi

đư đ a ra kết luận: gen badh2 đ ợc tìm ra ch yếu các giống lúa trồng vƠ tập trung phần lớn (60%) nhóm giống lúa th m Allen lặn badh2 kiểm soát tổng hợp 2AP

đ ợc tìm ra với 10 thể đột biến khác nhau từ allen trội BADH2 các nhóm giống,

dẫn đến hƠm l ợng 2AP cũng khác nhau các nhóm giống: Indica, Japonica, Japonica nhiệt đới vƠ Japonica ôn đới

Cũng nghiên c u về nguồn gốc gen qui định tính tr ng mùi th m trong cơy lúa, tác gi Prathepha (2009), Tr ng đ i học Mahasarakham, Thái Lan đư tiến hƠnh

xác định gen fgr/badh2 qui định mùi th m trên giống lúa cỏ (weedy rice – O sativa

f spontanea) t i vùng Đông bắc c a Thái Lan bằng mồi chỉ thị oligonucleotide: F:

5’-TGCTCCTTTGTCATCACACC-3’ vƠ R: 5’-TTTCCACCAAGTTCCAGTGA-3’

với 3 cặp allen BADH2/BADH2, BADH2/badh2 vƠ badh2/ badh2 Kết qu đư phát hiện đ ợc allen badh2 có tần su t lớn với giá trị lƠ 0,547 trong các mẫu giống lúa trồng Trong khi đó, allen badh2 không đ ợc tìm ra lúa hoang (wide rice - O rufipogon) Kết qu nghiên c u đư c ng cố thêm về gi thuyết về allen badh2 qui

định tổng hợp 2AP t o mùi th m có trong lúa cỏ có nguồn gốc mùi lúa trồng

Theo Vinita et al (2010), Viện nghiên c u Nông nghiệp n Độ, sự khác

nhau về mùi th m giữa nhóm lúa th m Basmati c a n Độ vƠ nhóm lúa th m Jasmine c a Thái lƠ do ngoƠi ch t 2AP, lƠ ch t t o mùi th m chính, thì có sự khác nhau về thƠnh phần c a một số hợp ch t dễ bay h i khác Allen qui định tổng hợp

ch t t o mùi th m có nguồn gốc từ các giống lúa th m t i vùng núi Himalayan

QTL qaro8.1 trên NST số 8 quyết định chính đến sự tổng hợp ch t 2AP c nhóm

giống lúa Basmati vƠ Jasmine, allen trội BADH2 qui lƠ đối với lúa không th m Bên

c nh đó, QTL qaro4.1 trên NST số 4 vƠ qaro3.1 trên NST số 3 cũng liên quan đến

mùi th m 2 nhóm giống lúa trên nh ng 2 QTL nƠy ch a đ ợc gi i mư

Nh vậy, di truyền về mùi th m t o b i ch t 2AP cơy lúa đư đ ợc các tác

gi nghiên c u trên thế giới công bố, cho đến nay, đều kh ng định do gen đ n lặn

fgr nằm trên NST số 8 kiểm soát tổng hợp, do đột biến m t đo n 8 pb vƠ 3 SNPs

exon th 7

1.3.3 Chỉ thị phân tử liên kết với gen qui định tính trạng mùi thơm ở cây lúa

Đư có nhiều kết qu nghiên c u định vị gen fgr kiểm soát tổng hợp ch t 2AP

vƠ chỉ thị phơn tử liên kết với gen nƠy trong cơy lúa đư đ ợc công bố Ahn et al

(1992) sử d ng một số chỉ thị RFLP để định vị gen qui định mùi th m trong cơy lúa

Kết qu đư xác định gen fgr qui định tổng hợp ch t t o mùi th m 2AP trong lúa g o

đ ợc xác định vị trí trên nhiễm sắc thể số 8, chỉ thị gần nh t lƠ RG28 với kho ng

cách di truyền lƠ 4,5 cM Lorieux et al (1996) sử d ng quần thể DH (Double

Haploide – đ n bội kép) với 135 dòng cùng với 4 lo i chỉ thị RFLP, RAPD, STS vƠ Isozymes để lập b n đồ QLT c a tính tr ng mùi th m c a lúa Kết qu cho th y một

số chỉ thị nằm trên NST số 8 đều có liên kết với gen kiểm soát sự có mặt c a ch t 2AP Trong đó có một QLT nằm giữa RG28/Y5 vƠ RG1 (6.4&5.3cM) trên NST số 8 quyết định 69% đến sự thay đổi c a tính tr ng mùi th m, có 16 chỉ thị đư đ ợc xác định trên NST số 8 trong đó Y5 (RAPD marker) có liên kết hoƠn toƠn với chỉ thị

RFLP lƠ RG28

T i Úc, các nhƠ nghiên c u đư thƠnh công trong việc xác định chỉ thị phơn tử

nh RG28, RM223, RM342 liên kết với gen quy định tính tr ng mùi th m fgr nằm

trên NST số 8 Nhóm tác gi nƠy cũng thiết kế l i mồi chỉ thị RG28 chuyển đổi từ RFLP thƠnh SSR để đ n gi n h n trong sử d ng Những chỉ thị nƠy đư đ ợc ng

d ng thƠnh công trong việc chọn t o giống lúa th m (Garland and Henry, 2001)

Vanavichit et al (2004) đư phát hiện ra một đo n nhiễm sắc thể kho ng 27,6

kb đ ợc đặt tên lƠ Os2AP ch a 15 exon nằm trên NST số 8 điều khiển tính tr ng không th m lúa Sự m t đo n 8 bp trong exon th 7 đư kìm hưm ho t động đồng hoá ch t proline thƠnh các hợp ch t không th m c a đo n gen trên vƠ cung c p nguồn proline cùng các ch t trung gian khác để t o ra ch t 2AP Đo n 8 bp nƠy

đ ợc sử d ng để t o chỉ thị phơn tử Aromarker đư vƠ đang đ ợc sử d ng một cách hữu hiệu trong chọn t o giống lúa th m t i Thái Lan

Dựa trên những kết qu nƠy, Bralbury et al (2005b) đư sử d ng kỹ thuật

ASA (Allele Specific Amplification) với 4 cặp mồi ESP, EAP, IFAP, INSP (chỉ thị BADH2) giúp phơn biệt kiểu gen c a các giống lúa đồng hợp tử th m (cho băng 257bp), dị hợp tử th m (cho 2 băng dƠi 355bp vƠ 257bp) vƠ giống không th m (cho băng dƠi 355bp) Từ đơy m ra một ph ng pháp hữu ích giúp xác định chính xác

tr ng thái kiểu gen c a tính tr ng mùi th m Trình tự ho t động c a các mồi nh sau:

Sau khi chỉ thị BADH2 đ ợc tìm ra trên giống lúa Basmati vƠ Jasmine, tác

gi Henry and Water (2006) đư tiến hƠnh nghiên c u chỉ thị nƠy trên các giống lúa

th m khác đang đ ợc trồng t i Úc Kết qu đư kh ng định chỉ thị BADH2 cùng với một số chỉ thị khác nh RG28, RM224 vƠ RM342 có chính xác cao trong việc xác định gen qui định mùi th m trên các giống lúa th m đang đ ợc trồng t i Úc, dễ sử

d ng, chỉ cần điện di trên gel agarose có thể phơn biệt đ ợc đa hình

Chen et al (2006),bằng việc sử d ng một số chỉ thị SSR nh L02 với cặp mồi xác định lƠ 5’- CATCGGATAGTTCTCGGCAA-3’ (forward) vƠ 5’- GATA CGTCGGTGTCGGTCAA-3’ (rerverse) vƠ L06 với cặp mồi đặc hiệu lƠ 5’-GCAA GTGACGGAGTACGCCT3’(forward) vƠ 5’-GCTAACTTCCGCTCACGCAA-3’

(reverse), độ dƠi vƠ vị trí c a gen fgr cũng đ ợc xác định chính xác h n, gen fgr

đ ợc xác định trên nhiễm sắc thể số 8, có độ dƠi kho ng 69 kb

Kết qu nghiên c u c a Vinita et al (2010) cũng kh ng định 2AP lƠ ch t t o

mùi th m chính trong các giống lúa th m nghiên c u Nghiên c u xơy dựng b n đồ

di truyền QTL điều khiển tính tr ng mùi th m trong lúa, nhóm tác gi nƠy đ a ra kết

Nguồn: Bradbury et al (2005b)

qu cũng t ng đồng với những nghiên c u c a các tác gi tr ớc: Có 3 vị trí QTL

đ ợc xác định liên quan đến tính tr ng mùi th m, đó lƠ qaro8.1 nằm trên NST số 8

có Ủ nghĩa ch yếu vƠ nó đóng vai trò một allen không ch c năng (không th m) c a gen BADH2 qui định tổng hợp enzyme betaine aldehyde dehydrogennase (BADH);

T ng tự, các allen c a gen BADH1 trong ph m vi QTL qaro4.1 nằm trên NST số 4 liên quan đến mùi th m trong cơy lúa; Gen nằm d ới QTL qaro3.1 trên NST số 3

vẫn ch a đ ợc gi i mư Nhóm tác gi nƠy đư phát triển các chỉ thị phơn tử liên kết

với QTL qaro8.1 nằm trên NST số 8 đư đ ợc ng d ng trong chọn t o giống lúa

th m

Dựa trên các nghiên c u di truyền về mùi th m trong cơy lúa đư đ ợc công

bố, nhóm tác gi Ahmadikhah et al (2010) thuộc Tr ng đ i học Nông nghiệp

Gorgan, Iran đư phát triển chỉ thị Allele Specific Amplification (ASA) với cặp mồi Arm1 (forward: 5'- TCCT CTCAATACATGGTTTATG- 3', reverse: 5'-TTGGAAACAAACCTTAACCAT AG -3') cho đa hình đồng trội có thể phơn biệt chính xác các giống lúa th m với d i băng 103 bp vƠ các giống lúa không th m với

d i băng lƠ 111 bp thay thế cho ph ng pháp đánh giá mùi th m 2AP bằng phơn tích hoặc c m quan

Tóm l i, hiện nay đư phát hiện đ ợc một số chỉ thị liên kết với gen fgr qui

định mùi th m trong cơy lúa với độ chính xác cao: chỉ thị RFLP lƠ RG28; các chỉ thị SSR: L06, RM223, RM342; đặc biệt lƠ chỉ thị BADH2 gồm 4 mồi: ESP, EAP, IFAP

vƠ INSP nhơn trực tiếp vùng gen th m (ASA - Allele Specific Amplification), có độ chính xác cao đư đ ợc sử d ng nhiều trong chọn giống lúa th m trên thế giới Tuy nhiên, các chỉ thị nƠy đ ợc phát hiện vƠ công bố trên những nguồn vật liệu khác

nhau, kho ng cách di truyền với gen fgr cũng khác nhau

1.3.4 Kết quả ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa thơm

Các chỉ thị liên kết với gen th m fgr đư đ ợc tìm ra vƠ ng d ng có hiệu qu

trong nhiều ch ng trình chọn t o giống lúa th m trên thế giới vƠ Việt Nam

T i úc, các nhƠ nghiên c u đư ng d ng những chỉ thị phơn tử nh BADH2,

RG28, RM223, RM342 để xác định gen quy định tính tr ng mùi th m fgr trong

chọn t o giống lúa th m vƠ đư t o ra đ ợc một số giống lúa th m phát triển cho s n

xu t (Garland and Henry, 2001; Henry and Water 2006)

T i Thái Lan, sau khi nhóm tác gi Vanavichit phát hiện ra vùng gen kiểm soát tính tr ng mùi th m trong cơy lúa, nhóm chỉ thị phơn tử DNA liên kết với vùng gen nƠy (Aromarkers) cũng đ ợc thiết kế đư vƠ đang đ ợc sử d ng một cách hữu

hiệu trong việc t o ra các dòng, giống lúa th m mới (Vanavichit et al., 2007)

Chỉ thị phơn tử đ ợc ng d ng nhiều trong chọn t o vƠ c i tiến giống lúa

th m n Độ Tác gi Katherine et al (2008), Tr ng đ i học Wale, n Độ, đư sử

d ng 42 chỉ thị DNA InDels để đánh giá đa hình giữa các giống lúa th m vƠ không

th m Kết qu đư xác định đ ợc 9 chỉ thị có độ tin cậy cao để phơn biệt các giống lúa th m vƠ không th m, sử d ng có độ phơn gi cao trên nền điện di gel agarose Các chỉ thị nƠy d ợc sử d ng phù hợp cho chọn giống lúa th m đối với những

phòng thí nghiệm ch a có hệ thống điện di gel polyacrylamide Tác gi Singh et al (2011) dựa trên thông tin về trình tự trên gen badh2 đư tiến hƠnh nghiên c u vƠ thiết

kế mồi nks.badh2 với độ chính xác cao trong xác định gen qui định mùi th m trên các giống lúa Basmati Tác gi Kumari et al (2012) đư tiến hƠnh nghiên c u về độ

chính xác c a chỉ thị BADH2 trên 208 dòng phơn ly thế hệ F10 c a tổ hợp lai CSR10 x Taraori Basmati vƠ đư kết luận rằng, chỉ thị BADH2 có độ chính xác cao,

sử d ng để xác định gen qui định mùi th m trong ch ng trình chọn t o giống lúa

th m n Độ Tác gi Salgotra et al (2012), Tr ng đ i học Công nghệ & Khoa

học nông nghiệp n độ đư sử d ng chỉ thị phơn tử trong lai backcross để chuyển các gen kháng bệnh b c lá vƠo giống lúa th m Basmati Kết qu đư chọn đ ợc 7 dòng lúa th m kháng tốt với các ch ng vi khuẩn gơy bệnh b c lá phổ biến n độ, trong

đó: 3 dòng lúa th m mang 4 gen đồng hợp tử xa5 + xa13 + Xa21 + fgr; 4 dòng mang 3 cặp gen xa13 + Xa21 + fgr Các dòng lúa nƠy r t có giá trị để phát triển cho

s n xu t vƠ sử d ng lƠm nguồn vật liệu lai t o n Độ C i tiến kh năng kháng

bệnh b c lá vƠ đ o ôn trên giống Basmati, tác gi Singh et al (2012) đư tiến hƠnh lai hồi qui giữa giống nền lƠ Busa Basmati 1 mang gen kháng bệnh b c lá xa13 vƠ Xa21 với giống cho lƠ Tetep mang gen kháng bệnh đ o ôn Pi54 Sử d ng chỉ thị phơn tử

kết hợp với chọn lọc truyền thống chọn ph hệ từ thế hệ BC2F2, kết qu đư chọn

đ ợc 7 dòng lúa mang tới 89,5% đặc điểm c a giống Busa Basmati 1, có mùi th m,

mang các gen kháng bệnh b c lá xa13, Xa21 vƠ gen kháng bệnh đ o ôn Pi54 tr ng

thái đồng hợp tử Các dòng lúa th m nƠy đư thể hiện tính kháng rộng với bệnh đ o

ôn vƠ b c lá n Độ

T i Bangladesh, tác gi Miao (2010), Tr ng đ i học Nông nghiệp Bangladesh, đư sử d ng 3 chỉ thị SSR lƠ RM223, RM515 vƠ RM342 tiến hƠnh chọn các dòng lúa mang gen th m trên 22 dòng lúa nghiên c u Kết hợp giữa chọn kiểu gen vƠ chọn kiểu hình, nhóm tác gi đư chọn đ ợc 5 dòng lúa lƠ Indian Ndingo, Namsagui19, IR77452, Basmati370 vƠ Si – Feng 43 có mùi th m vƠ mang các đặc điểm nông học tốt để phát triển cho s n xu t vƠ sử d ng lƠm vật liệu cho các ch ng

trình chọn t o giống lúa th m Bangladesh Tác gi Jewel et al (2011), Tr ng đ i

học Nông nghiệp Bangladesh đư sử d ng chỉ thị phơn tử RM223, RM342, RM515

chọn kiểu gen th m fgr, kết hợp với phơn tích hóa sinh vƠ đánh giá kiểu hình để

chọn dòng lúa th m mới từ 26 mẫu giống lúa vật liệu Kết qu đư chọn đ ợc 6 dòng

lúa th m mang kiểu gen th m fgr đồng hợp tử, mang các đặc điểm tốt Trên nguồn

vật liệu nghiên c u, nhóm tác gi cũng đ a ra kết luận về chỉ thị phơn tử RM223 có

độ chính xác cao trong chọn kiểu gen th m fgr vƠ mùi th m trong h t g o có t ng

quan thuận với chiều dƠi h t g o vƠ t ng quan nghịch với chiều rộng h t g o

T i Mỹ, tác gi Romesh et al (2011), Tr ng Đ i học Tenness, đư thƠnh

công trong việc sử d ng chỉ thị phơn tử chọn t o các dòng lúa th m kháng b c lá Nhóm tác gi đư sử d ng phép lai backcross dòng lúa th m IRS 544-12 với các dòng

cho (donor) gen kháng bệnh b c lá xa13 vƠ Xa21 Bằng ph ng pháp chọn lọc ph

hệ, sử d ng chỉ thị phơn tử RM515 cho chọn lọc gen th m fgr, chỉ thị RG136 cho gen kháng xa13 vƠ pTA248 cho gen kháng Xa21, kết qu đư chọn đ ợc 16 dòng lúa mang đồng hợp tử c 3 gen fgr, xa13 vƠ Xa21 đ ợc sử d ng lƠm vật liệu cho ch ng

trình chọn giống theo m c tiêu t i Mỹ

T i Iran, tác gi Kiani (2011), Tr ng đ i học Nông nghiệp Sari, đư sử d ng

chỉ thị 4 mồi ESP, IFAP, INSP vƠ EAP chọn kiểu gen th m fgr đồng hợp tử trên

quần thể phơn ly F2 c a các tổ hợp lai giữa mẹ lƠ các giống lúa th m địa ph ng Sang tarom, Tarom deylamani với bố lƠ giống lúa năng su t cao Neda, Nemat Kết

qu đư chọn đ ợc 12 dòng mang gen th m fgr đồng hợp tử, đ ợc đánh giá có mùi

th m vƠ mang những đặc tính nông học mong muốn Những dòng lúa nƠy tiếp t c

đ ợc đánh giá để phát triển s n xu t vƠ sử d ng lƠm vật liệu lai t o cho ch ng trình chọn t o giống lúa th m Iran

T i Việt Nam, những ng d ng về chỉ thị phơn tử liên kết với gen fgr qui

định mùi th m ph c v công tác chọn t o giống lúa th m cũng đư đ ợc tiến hƠnh trong th i gian gần đơy Nguyễn Thị Lang vƠ Bùi Chí Bửu (2004) đư sử d ng chỉ thị

phơn tử RG28 vƠ RM223 để phát hiện gen quy định tính tr ng mùi th m fgr trong

chọn t o giống lúa th m Việc ng d ng chỉ thị phơn tử nƠy đư góp phần nơng cao hiệu qu c a công tác chọn t o giống lúa th m vƠ b ớc đầu đư t o ra một số dòng lúa tẻ th m triển vọng t i vùng ĐBSCL nh OM4900, OM6074, OM5999 vƠ OM6035 (Nguyễn Hữu Nghĩa vƠ cs., 2006) Nhóm tác gi D ng Xuơn Tú vƠ cs (2009), Viện Cơy l ng thực vƠ Cơy thực phẩm, đư sử d ng các mồi c a chỉ thị

BADH2 để kiểm tra gen th m fgr trên nguồn vật liệu gồm 42 mẫu giống lúa đ ợc

thu thập t i các địa ph ng Kết qu cho th y, 23 mẫu giống lúa trong đó có giống

Jasmine vƠ Basmati, đ ợc xác định có mùi th m đều có gen th m fgr tr ng thái

đồng hợp tử, t ng đ ng với mùi th m vƠ gen th m đ ợc phát hiện trên giống

Jasmine vƠ Basmati 19 mẫu giống không th m không thể hiện có gen th m fgr Kết

qu nghiên c u c a nhóm tác gi đư kh ng định chỉ thị phơn tử BADH2 có kh năng phơn biệt chính xác 100% giữa các giống lúa th m vƠ không th m ng d ng chỉ thị

phơn tử BADH2 sƠng lọc gen th m fgr trong chọn t o giống lúa th m, kết qu đư

chọn t o đ ợc một số giống lúa th m, ch t l ợng cao triển cho s n xu t t i các tỉnh phía Bắc nh HDT2, HDT8 (D ng Xuơn Tú vƠ cs., 2010; 2013) Phan Hữu Tôn vƠ Tống Văn H i (2010), Tr ng Đ i học Nông nghiệp HƠ Nội đư sử d ng chỉ thị phơn

tử BADH2 trong giới h n 2 mồi: ESP (nhơn vùng gen không th m) vƠ IFAP (nhơn

vùng gen th m) để sƠng lọc các giống lúa ch a gen mùi th m fgr Độ chính xác c a

chỉ thị BADH2 đư đ ợc nhóm tác gi kh ng định với v ch băng kho ng 257 bp (có

gen fgr) đều xu t hiện trên các giống lúa có mùi th m vƠ không xu t hiện các

giống không th m Bằng sử d ng chỉ thị nƠy, nhóm tác gi đư sƠng lọc gen th m trên 66 mẫu giống lúa tẻ vƠ 18 mẫu giống lúa nếp đ ợc thu thập t i các địa ph ng

vƠ những dòng triển vọng Kết qu sƠng lọc kiểu gen th m kết hợp với chọn lọc kiểu hình, nhóm tác gi đư giới thiệu đ ợc 2 giống lúa tẻ th m (T33 vƠ T12) vƠ 2 giống

lúa nếp (NV1 vƠ NV3) cho phát triển s n xu t Tác gi Trần T n Ph ng vƠ cs

(2010) cũng đư sử d ng chỉ thị phơn tử BADH2 để đánh giá gen th m fgr, kết hợp

với đánh giá mùi th m bằng ph ng pháp phơn tích hóa học trên 19 mẫu giống lúa địa ph ng vƠ giống lúa nhập nội Kết qu cho th y, các giống lúa đ ợc đánh giá có mùi th m đều đ ợc phát hiện có gen th m

Nghiên c u ng d ng chỉ thị phơn trong chọn t o giống lúa th m trên thế giới

vƠ trong n ớc tuy ch a nhiều, nh ng những kết qu đư đ ợc công bố thì chỉ thị

BADH2 có độ tin cậy cao để xác định gen th m fgr từ nguồn gốc không chỉ trên các

giống lúa th m Jasmine vƠ Basmati mƠ còn trên nhiều vật liệu lúa th m khác

1.4 Nghiên c u về b nh b c lá lúa vƠ ch th phơn tử liên k t v i gen qui đ nh tính kháng b nh b c lá cơy lúa

Bệnh b c lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gơy ra Đơy lƠ lo i bệnh h i nguy hiểm nh t đối với cơy lúa khu vực Ch u Á (Mew et al.,

1993) Bệnh b c lá lúa đ ợc ghi nhận lƠm hao h t năng su t Chơu Á lƠ từ 50% đến 80% % (Khush and Ogawa, 1989) Việt Nam, bệnh phổ biến t t c các vùng trồng lúa, từ vùng núi cao đến vùng ven biển, gơy thiệt h i đến 60% năng su t hoặc

có thể m t trắng, nh t lƠ đối với các giống có nguồn gốc từ Trung Quốc (BT7, KD18, Q5) Việc sử d ng thuốc b o vệ thực lƠ ít có tác d ng trong phòng trừ bệnh V n đề trong s n xu t lúa hiện nay quan tơm lƠ chọn giống kháng bệnh Muốn chọn t o

đ ợc giống lúa kháng với bệnh b c lá cho s n xu t một vùng sinh thái nƠo đó thì

tr ớc hết chúng ta cần biết đ ợc thƠnh phần vƠ số ch ng vi khuẩn gơy bệnh, sau đó

lƠ gen kháng đặc hiệu với từng ch ng vi khuẩn đó

1.4.1 Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa

Vi khuẩn Xoo, gơy bệnh b c lá cho cơy lúa, xơm nhập có tính th động qua

th y khổng, lỗ khí trên mép lá, đặc biệt lƠ qua vết th ng xơy xát trên lá Trong điều kiện m a ẩm, trên bề mặt lá sẽ tiết ra những giọt dịch vi khuẩn vƠ thông qua sự

va ch m, tiếp xúc giữa các lá lúa bệnh có thể lơy lan từ lá nƠy sang lá khác để tiến hƠnh xơm nhiễm lặp l i nhiều lần trong suốt th i kỳ sinh tr ng vƠ phát triển c a cơy lúa Bệnh b c lá th ng phát sinh d ới d ng các sọc vƠng kéo dƠi từ mép lá Trên phiến lá, vết bệnh lan rộng theo c chiều dƠi vƠ chiều rộng, có mép viền hình