Tiểu luận môn đấu tranh sinh học VI KHUẨN VÀ VAI TRÒ TRONG ĐẤU TRANH SINH HỌC

+ Vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng, không hình thành bào tử và tinh thể độc tố, ký sinh bắt buộc.. Falcon 1971 chia vi khuẩn gây bệnh thành 2 nhóm: + Vi khuẩn hình thành bào tử vi khuẩn

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH HỌC

TIỂU LUẬN HỌC PHẦN: ĐẤU TRANH SINH HỌC VÀ ỨNG DỤNG

Đề tài:

VI KHUẨN VÀ VAI TRÒ TRONG ĐẤU TRANH SINH HỌC

Huế, 05/2015

A Mở đầu

Giảng viên hướng dẫn: Học viên thực hiện:

PGS.TS Nguyễn Văn Thuận Trương Minh Thuận

Lớp: LL&PPDH Sinh K22

Trong sản xuất nông nghiệp, các loại sâu bệnh gây ra tác hại nghiêm trọng đối với năng suất cũng như chất lượng nông sản Để bảo vệ mùa màng, người nông dân đã sử dụng thuốc hoá học (thuốc trừ sâu - TTS) có độ độc cao để phun phòng ngừa

Tuy nhiên, mặt trái của TTS là phá huỷ môi trường, tác động xấu đến sức khoẻ người dân; làm mất đi một số nguồn sinh vật có lợi cho con người như chim chóc, tôm cá… và những ký sinh thiên địch như bọ rùa, ong ký sinh, các nguồn vi sinh vật khác như nấm, virus, tuyến trùng…

Có một mâu thuẫn tồn tại trong sản xuất nông nghiệp Đó là càng thâm canh cây trồng cao, sâu bệnh phát sinh càng nhiều Càng phun thuốc để phòng trừ sâu hại thì đồng thời cũng càng huỷ diệt nhiều sinh vật có ích và càng làm tăng tính kháng thuốc của sâu hại

Bảo vệ môi trường sinh thái, bảo vệ sức khoẻ con người, nâng cao sản lượng và chất lượng nông sản - đó là một đòi hỏi đối với nền nông nghiệp TTSSH ra đời như một biện pháp hữu hiệu đáp ứng những yêu cầu nói trên

TTSSH được đưa vào nước ta từ đầu những năm 1970 với số lượng rất ít Đến nay, việc nghiên cứu TTSSH ở trong nước đã đạt được một số thành quả nhất định, tuy việc triển khai ứng dụng còn chậm Các vùng nông nghiệp, đặc biệt là các vùng trồng rau, đang tích cực triển khai việc sử dụng chế phẩm này Hai loại được sử dụng nhiều nhất vẫn là Thiên Nông và BT

B Nội dung

I Khái quát chung

Có nhiều loại vi khuẩn gây chết cho côn trùng hoặc các dịch hại khác Chúng có khắp nơi trên trái đất và có thể xâm nhập vào tất cả các bộ phận, cơ quan của cơ thể mọi sinh vật nói chung và côn trùng nói riêng

Bệnh vi khuẩn của côn trùng được nghiên cứu từ lâu Đầu tiên, năm 1870 L, Pasteur nghiên cứ vi khuẩn gây bệnh cho tằm… Sau đó năm 1885 Chashire và Cheyne nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh cho mật ong ở châu Âu, mãi sau này Metchnikov mới công bố công trình nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh cho vật gây hại nông nghiệp (sâu non, bọ hung hại lúa) ở Nam Ucraina (Steinhous, 1964; Bondarenco, 1978)

Vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng rất đa dạng, các tác giả phân nhóm khác nhau, Steinhous, (1959) đã chia chúng thành các nhóm

+ Vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng, thường xuyên có trong môi trường sống của côn trùng

+ Vi khuẩn thường xuyên hoặc thỉnh thoảng có mặt trong ống tiêu hóa côn trùng khỏe

+ Vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng, không hình thành bào tử, ký sinh không bắt buộc

+ Vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng, không hình thành bào tử, ký sinh bắt buộc + Vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng, không hình thành bào tử và tinh thể độc tố,

ký sinh bắt buộc

Bucher (1960) chia thành các nhóm

+ Vi khuẩn gây bệnh bắt buộc

+ Vi khuẩn gây bệnh hình thành bào tử và tinh thể độc tố

+ Vi khuẩn gây bệnh không bắt buộc

+ Vi khuẩn có tiềm năng gây bệnh cho côn trùng

Vi khuẩn gây bệnh bắt buộc thường liên quan đến một bệnh nhất định của côn trùng và trong tự nhiên thường thích nghi với một phổ ký chủ hẹp

Vi khuẩn gây bệnh không bắt buộc có thể làm tổn hại hoặc có thể xâm nhiễm vào các mô của cơ thể côn trùng mẫn cảm với chúng Trước khi xâm nhập vào khoang máu, chúng thường sinh sản trong ruột côn trùng

Vi khuẩn gây bệnh không bắt buộc có thể nuôi cấy trên môi trường nhân tạo

Vi khuẩn có tiềm năng gây bệnh, bình thường không sinh sản trong ruột côn trùng, nhưng có thể xâm nhập vào khoang máu Chúng phát triển được trong môi trường nhân tạo không chuyên tính với từng nhóm côn trùng chuyên biệt

Falcon (1971) chia vi khuẩn gây bệnh thành 2 nhóm:

+ Vi khuẩn hình thành bào tử ( vi khuẩn gây bệnh bắt buộc và phần lớn vi khuẩn gây bệnh không bắt buộc) có tạo thành tinh thể độc tố và không tạo thành tinh thể độc tố

+ Vi khuẩn không hình thành bào tử (vi khuẩn gây bệnh hoàn toàn không bắt buộc và vi khuẩn có tiềm năng gây bệnh cho côn trùng)

1 Các họ vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng và chuột.

Đã mô tả hơn 100 loài vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng và chuột Đại diện thuộc các họ:

Enterobacteriaceae thuộc bộ Eubacteriales

Micrococcaceae thuộc bộ Eubacteriales

Pseudomonadaceae thuộc bộ Pseudomonadales

Họ Enterobacteriaceae:

+ Sống ở ruột côn trùng

+ Vi khuẩn hình que Gram âm (-) không hình thành bào tử Phát triển tốt trên môi trường dinh dưỡng bình thường

Loài Salmonella enteridis gây bệnh thương hàn cho các loài chuột.

Họ Bacillaceae: vi khuẩn hỡnh que, Gram dương (+) hỡnh thành bào tử Đại

diện là cỏc loài thuộc cỏc giống Bacillus; Clostridium gõy bệnh cho cụn trựng

Họ Pseudomonadaceae: vi khuẩn Gram õm (-) khụng hỡnh thành bào tử.

Cỏc loài: Pseudomonas aeruginosa; P Chlororaphis… là cỏc loài vi khuẩn cú tớnh

năng gõy bệnh cho cụn trựng

II Vài nét về Bacillus thuringiensis và thuốc trừ sâu Bt

1 Vài nét về Bacillus thuringiensis

Sơ lược lịch sử phát hiện Bacillus thuringiensis

Trong những năm đầu tiên của thế kỉ Xĩ kể từ khi nhà bỏc học Louis Pasteur đã phát hiện ra một loài vi khuẩn gây bệnh trên con tằm, ông đã xác định đó là vi

khuẩn Bacillus thuringiensis Năm 1915 một nhà bác học người Đức E Berliner đã

phân lập đợc một loài vi khuẩn từ ấu trùng của loài bướm phấn Địa Trung Hải

(Anagasta kuchniella), tác giả đã xác định tên vi khuẩn là Bacillus thuringiensis, về

sau chủng này bị thất lạc cho mãi tới năm 1927 nhà khoa học K Master mới phân

lập lại và từ sau đó trở đi Bacillus thuringiensis được các nhà khoa học từ nhiều bộ

môn khác nhau trên thế giới nghiên cứu khá kĩ và rất sâu về tất cả các mặt như sinh

lí học, sinh thái học và sinh học phân tử

Vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Đến nay Bacillus thuringiensis đợc nhiều nước trên thế giới, ngay cả nớc ta

cũng đã biết đến với tên viết tắt là Bt

2 Cấu tạo

Bt là trực khuẩn sinh bào tử hiếu khớ khụng bắt buộc, bắt màu thuốc nhuộm gram dương, kớch thước 3-6 àm, cú phủ tiờm mao khụng dày, tế bào đứng riờng rẽ hoặc x p thếp th ành t ng chu i Quá trình sống có thể chia ra 3 giai đoạn: thểừng chuỗi Quá trình sống có thể chia ra 3 giai đoạn: thể ỗi Quá trình sống có thể chia ra 3 giai đoạn: thể sinh dưỡng, nang bào tử, bào tử và tinh thể

a Thể sinh dưỡng:

Thể sinh dưỡng dạng que, hai đầu tự, kớch thước 1,2- 1,8 mm x 3- 5mm, bắt màu Gram dương Lông mọc xung quanh, hơi động hoặc không động, thường tồn tại một cá thể hoặc hai cá thể liền nhau Thể sinh dưỡng thường sinh sản theo kiểu phân chia ngang Trong thời kì sinh sản thường có 2, 4, 8, thể dinh dưỡng liền nhau thành chuỗi Lúc này vi khuẩn sinh trưởng nhanh, trao đổi chất nhiều, dễ nuôi cấy trên môi trường

b.Nang bào tử:

Khi các thể vi khuẩn già, một đầu nào đó trong cơ thể hình thành bào tử hình bầu dục, còn đầu kia hình thành tinh thể hình thoi Đó là giai đoạn nang bào tử Nang bào tử hình trứng dài, to hơn thể sinh dưỡng

c Bào tử và tinh thể:

Khi nang bào tử phát triển đến một giai đoạn nào đó chúng sẽ nứt ra giải phóng bào tử và tinh thể Kích thước bào tử 0,8- 0,9mm x 2 mm Bào tử ở dạng ngủ

có thể đề kháng với các điều kiện môi truờng bất lợi Chế phẩm vi khuẩn thường được bảo quản ở dạng bào tử Tinh thể thường có kích thước thay đổi khoảng 0,6

mm x 2 mm ; hình thoi hoặc hình tròn, hình bầu dục tùy theo loài và loại môi trường Tinh thể là một loại protein là chất diệt sâu có hiệu quả chủ yếu

Tế bào vi khuẩn Bt với tinh thể (crystal) và bào tử (spore)

3 Độc tính của vi khuẩn Bt

Vi khuẩn Bt gây bệnh cho côn trùng qua con đường tiêu hóa Bào tử nảy mầm dẫn đến sự sinh sản của vi khuẩn trong cơ thể vật chủ làm cho côn trùng chết song yếu tố chính làm cho côn trùng chết nhanh chóng chính là chất độc do vi khuẩn sinh ra Các chủng Bt khác nhau sinh ra hai loại chất độc chính, đó là các chất độc tinh thể(Cry) đợc mã hóa bởi các gen Cry khác nhau và các chất độc phân giãi tế bào (Cyt) có tác động riêng rẽ và tổ hợp cùng Cry làm tăng tác dụng của tinh thể độc

Tinh thể độc Cry đợc tạo ra với lợng lớn hơn nhiều và có hiệu quả chính gây

độc cho côn trùng

Tinh thể Cry còn gọi là nội độc tố δ Gen Cry được chia thành 4 lớp chớnh: Cry I, II, III, IV

+Gen Cry I: Thường tổng hợp cỏc Protein hỡnh thoi gõy bệnh cho cụn trựng

bộ cỏnh vẩy

+ Gen Cry II: Tạo tinh thể dạng hỡnh thỏp gõy bệnh cho cụn trựng bộ cỏnh vẩy và cụn trựng bộ 2 cỏnh Vớ dụ như gen Cry IIA gõy bệnh cho loài Lymantria

+ Gen Cry III: Tổng hợp tinh thể dạng hỡnh thoi, gõy bệnh cho cụn trựng bộ

+ Gen Cry IV: Tổng hợp cả tinh thể dạng hỡnh thoi và hỡnh thỏp, chỉ gõy bệnh cho cụn trựng bộ 2 cỏnh Diptera

Nhóm chất độc Cyt bao gồm các ngoại độc tố (sản phẩm tiết của vi khuẩn)

+ Ngo i ại đ c t : ộc tố: ố: α exotoxin hay phospholipase

+ Ngo i ại đ c t : ộc tố: ố: β exotoxin hay ngo i ại đ c t b n nhi t ộc tố: ố: ền nhiệt ệt

+ Ngo i ại đ c t : ộc tố: ố: γ exotoxin đ c t tan trong nộc tố: ố: ư c ớc

 Cơ chế gây độc của tinh thể độc

Cú khả năng diệt cỏc loại sõu hại cõy trồng Chủ yếu sõu non bộ cỏnh vẩy, mọt hại kho tàng thuộc bộ cỏnh cứng, cỏc loại muỗi, cung quăng, bộ 2 cỏnh

Tinh thể độc cùng với bào tử xâm nhập vào cơ thể sâu bằng con đường tiêu hóa khi sâu ăn phải lá có vi khuẩn Trong điều kiện bình thường, tinh thể độc không hòa tan Khi đi vào ruột giữa của sâu, nơi có pH kiềm cao(>9,5) làm cho tinh thể

độc tan ra Tuy nhiên dạng hòa tan này cha phải là dạng hoạt động Dạng tiền độc

tố này đợc protease trong ruột giữa của sâu hoạt hóa thành dạng hoạt tính độc tố

Độc tố này liên kết với tế bào biểu mô thành ruột, đâm qua màng tạo lỗ xuyên màng, làm mất cân bằng ion nội bào của tế bào biểu mô và làm cho chúng bị phân giãi, sâu ngừng ăn và bị chết đói pH trong ruột giảm xuống với pH nội môi trong huyết tương Độ pH thấp này cho phép các bào tử nảy mầm, xâm chiếm vật chủ và cuối cùng là gây chết

Cơ chế gây độc của tinh thể độc

Quỏ trỡnh từ khi nhiờ̃m Bt cho đến chết thỡ sõu non phải cú thời gian ủ bệnh, những sõu tuổi nhỏ thời gian tiềm ẩn 1-2 ngày, sõu tuổi lớn thời gian ủ bệnh kộo dài 4-5 ngày, tuỳ từng độ tuổi sõu mà khả năng chết cũng khỏc nhau Tuổi nhỏ dờ̃ chết, tuổi lớn chọ̃m hơn

III Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu Bt

 Thuốc trừ sõu vi sinh là những chế phẩm sinh học được sản xuất ra từ cỏc chủng vi sinh vọ̃t được nuụi cấy trờn mụi trường dinh dưỡng khỏc nhau theo phương phỏp thủ cụng, bỏn thủ cụng hoặc phương phỏp lờn men cụng nghiệp để tạo ra những chết phẩm cú chất lượng cao cú khả năng phũng trừ được cỏc loại sõu hại cõy trồng nụng, lõm nghiệp

 Bt được sản xuất chủ yếu theo hai cách: lên men thường (lên men bề mặt) và lên men chìm có sục khí Công nghệ lên men xốp đạt hiệu quả không cao nên hiện nay ở nước ta và nhiều nước trên thế giới đều không dùng phương pháp này mà chủ yếu dùng phương pháp lên men chìm

 Theo phơng pháp lên men chìm, ngoài việc xác định chủng Bt thích hợp và môi trờng dinh dỡng tối ưu cũng như tìm kiếm các chất tăng cườngquá trình trao đổi chất và chất chống nhiễm phage, việc sản xuất Bt còn phải chú ý quan tâm tới những thông số kĩ thuật khác rất quan trọng trong quá trình lên men nh yếu tố nhiệt độ, độ pH, độ oxy hòa tan, tốc độ không khí để xác định thời gian thu hoạch lượng sinh khối tối ưu sao cho thu được nhiều tinh thể

độc tố nhất Cuối cùng phải nghiên cứu công nghệ sấy phun, phối trộn…để

đảm bảo chất lượng của thuốc Bt

1 Chế độ thông gió

Đây là chỉ tiêu quan trọng cho quá trình hình thành bào tử và các loại tinh thể độc tố, ngưỡng tốt nhất trong quá trình lên men là 0,5- 0,6m3 không khí Nếu chế độ thông gió ở mức cao, bào tử phát triển nhanh, thời gian lên men ngắn, tinh thể độc tố được tạo ra nhỏ, do đó hiệu quả diệt sâu không cao, vì vậy khi lên men người sản xuất phải luôn chú ý tới chỉ tiêu này

2 Chế độ nhiệt

Nhiệt độ cũng có ảnh hưởng lớn tới sự hình thành bào tử, nhiệt độ tốt nhất cho quá trình lên men là 29-300C, nếu nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn thì thường kéo dài quá trình lên men làm hạn chế đến sự tạo ra mật độ bào tử Vì vậy khi lên men ngời ta cần phải theo dỏi nhiệt độ để ổn định, nếu như điện không đảm bảo cần thiết phải sử dụng ổn áp để tránh hiện tượng giảm sút số lượng bào tử cũng như tinh thể độc tố được hình thành trong giai đoạn logarit (giai đoạn gần kết thúc lên men)

3.Chế độ luân chuyển giống

Đây cũng là chỉ tiêu làm giảm sự hình thành bào tử cũng như sự tạo tinh thể

độc, nếu như dùng một giồng liên tục sẽ thường gây hiện tượng nhiễm phage (thực khuẩn thể) Bình thường khi lên men khoảng 10- 15 lần giống Bt cũ, chúng ta cần thay chủng giống mới thì sẽ khắc phục được hiện tượng phân đốt hoặc lượng sinh khối tạo ra ít bào tử và ít các tinh thể độc tố Do đó việc luân chuyển giống là một công việc cần thiết để nâng cao năng suất cũng như chất lượng bào tử của tinh thể

độc tố Bt Nếu đảm bảo chỉ tiêu này sẽ đảm bảo chất lượng của Bt và hiệu qủa diệt sâu sẽ cao

4 Kết quả lên men

Tính ổn định của quá trình lên men đợc thể hiện ở kết quả lên men thông qua một số chỉ tiêu nhmật độ bào tử nhiều, tạo ra tinh thể nội độc tố - endotoxin cao, kích thước tinh thể độc tố lớn và lượng sinh khối thu hồi trong quỏ trình lên men rất nhiều Một số nghiên cứu trước đây cho biết quá trình sản xuất Bt có thể bị nhiễm thực khuẩn thể( bacteriophage) xâm nhập làm hỏng toàn bộ mẻ cấy, làm phá hủy tế bào và các tinh thể nội độc tố khi đang sinh trưởng hậu quả là chế phẩm diệt côn trùng cho hiệu lực trừ sâu thấp

 Đối với chế phẩm dạng lỏng ngời ta thu hồi sinh khối ( gồm bào tử và các tinh thể độc) sau khi kết thúc quá trình lên men đem hỗn hợp với các chất phụ gia, chất bám dính, chất chống thối để tạo ra chế phẩm Bt, sau đó kiểm tra chất lượng, cuối cùng đóng chai để bảo quản sử dụng

 Chế phẩm Bt có thể ở dạng sữa nh thuốc sữa Thuricide 90TS khá ổn định và bền lâu, trong quá trình sản xuất người ta có thể tách bào tử và tinh thể độc

tố nhờ li tâm sinh khối và không cần sấy khô mà đa ngay vào nhũ tương (nước chứa dầu) Ngoài phương pháp ly tâm, người ta còn dùng phương pháp axit hóa dịch nuôi cấy đến pH 6,0- 6,2, sau đó chuyển sang giai đoạn

tách Sau khi tách nhận được dạng bột nhão có độ ẩm 85% với hiệu suất 100kg/m3 dịch nuôi cấy với lượng bào tử 20.20>9/g

 Dịch nuôi cấy đã tách vi khuẩn Bt có thể sử dụng lại một lần nữa nhưng không thể sử dụng nhiều lần vì tích lũy nhiều chất ức chế sinh trưởng Tuy nhiên dịch đó có thể sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thức ăn chăn nuôi

điều này đảm bảo việc rút gọn khối lượng thu đợc trong quá trình công nghiệp, giảm lượng nước thải, tăng giá trị kinh tế của quá trình lên men ở giai đoạn cuối để tách giải phóng bào tử và tinh thể độc ra khỏi màng tế bào, người ta đã đa vào thiết bị đặc biệt chuyên dùng để trộn với bột nhóo trong

30 phút làm đều các bào tử và tinh thể độc tố sao cho đồng nhất, sau đó đa bột nhão tạo chế phẩm bằng cách trộn với Cacboxy Metyl Cellulose (CMC), phân tử CMC hấp thụ tinh thể và bào tử Chế phẩm thu được ở dạng nhớt, không làm cho bào tử chết và sản xuất Bt ở dạng này có tính u việt là giảm được năng lượng và thời gian sấy

 Đối với chế phẩm dạng bột khô

 Đây là dạng tiện lợi và phổ biến nhất vì dạng chế phẩm này thờng dễ sử dụng, dễ bảo quản, lượng sinh khối thu đợc trong quá trình lên men và được tách ra nhờ li tâm, đợc làm khô bằng phương pháp đông lạnh hoặc sấy khô trong máy sấy phun hoặc li tâm vắt sau đó trộn với các chất phụ gia như: tinh bột, lactoza, thạch tín, cao lanh…

 Để tăng độ bám dính của chế phẩm Bt người ta thường dùng một số chất như: bột mì, dextrin, cazein tạo chế phẩm, cuối cùng kiểm tra chất lượng và

đóng gói bảo quản để sử dụng Chế phẩm Bt bột trước khi đóng thành gói phải đảm bảo hàm lợng chất khô đạt tiêu chuẩn 7- 10%

 Trong quá trình tạo chế phẩm thường sử dụng các thiết bị phù hợp, thao tác nhanh để không mất bào tử, không ảnh hưởng đến chất lượng của tinh thể

độc tố