Tiểu luận môn đấu tranh sinh học VI KHUẨN VÀ VAI TRÒ CỦA CHÚNG TRONG ĐẤU TRANH SINH HỌC

- Vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng, không hình thành bào tử, ký sinh không bắt buộc.- Vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng, không hình thành bào tử, ký sinh bắt buộc.. - Vi khuẩn gây bệnh cho

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH HỌC

-ššš -TIỂU LUẬN

Chuyên đềĐẤU TRANH SINH HỌC VÀ ỨNG DỤNG

Đề tài

VI KHUẨN VÀ VAI TRÒ CỦA CHÚNG TRONG

ĐẤU TRANH SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn Học viên thực hiện

PGS.TS Nguyễn Văn Thuận Nguyễn Thị Ái Nhi

Chuyên ngành: LL & PPDH môn Sinh học

Khóa học: 2013-2015

H uế, 05/2015

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 3

NỘI DUNG 4

1.Khái quát chung về vi khuẩn 4

2 Lịch sử sử dụng vi khuẩn trong đấu tranh sinh học 4

3 Phân loại vi khuẩn được sử dụng trong đấu tranh sinh học 4

4 Các họ vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng và chuột 5

5 Một số vi khuẩn được ứng dụng trong phòng chống côn trùng và chuột 6

6 Xét vi khuẩn Bacillus thuringiensis 7

6.1 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus thuringiensis 7

6.2 Cơ chế tác động của vi khuẩn B Thuringiensis lên côn trùng 10

6.3 Chuyển gen Bt vào thực vật 13

6.4 Công nghệ sản xuất chế phẩm Bt 14

6.5 Ưu và nhược điểm của chế phẩm Bt 17

6.6 Hiện trạng sử dụng chế phẩm Bt 18

KẾT LUẬN 24

TÀI LIỆU THAM KHẢO 25

MỞ ĐẦU

Trong xu hướng hội nhập với quốc tế, từ năm 1990 đến 2010, chương trình côngnghệ sinh học cấp nhà nước và một số tổ chức phi chính phủ như bánh mì nhà thờthế giới Tây Đức VN8910-030, CABI…đã đầu tư cho các viện nghiên cứu sảnxuất các chế phẩm vi sinh vật (VSV) để phòng trừ sâu, bệnh hại cây trồng bằngcông nghệ vi sinh Công nghệ vi sinh là ngành mũi nhọn của công nghệ sinh học,

có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao nên công nghệ này đã phát triển nhanh với tốcđộcao Công nghệ vi sinh đã khai thác hết khả năng kì diệu của các vi sinh vật đểtạo ra hàng loạt sản phẩm như rượu, bia, nước giải khát, axít hữu cơ, vitamin,kháng sinh, vắcxin, đặc biệt là các chế phẩm vi sinh trừ sâu, bệnh hại cây trồng, tạo

ra sản phẩm hữu cơ cung cấp cho người dân

NỘI DUNG 1.Khái quát chung về vi khuẩn

- Vi khuẩn là sinh vật tiền nhân, nhân chỉ gồm 1 chuỗi AND, không có màng nhân

- Hình thái đơn giản, gồm 3 dạng: Hình cầu, hình que, hình xoắn

- Vi khuẩn có mặt khắp nơi trên trái đất, có khả năng xâm nhập vào tất cả các bộ phận cơ quan sinh vật nói chung và của côn trùng nói riêng

- Là nhóm có vai trò quyết định trong việc chuyển hóa vật chất trong tự nhiên Tuynhiên nhiều loài gây bệnh người –động vật – thực vật dẫn đến gây tổn thất nghiêm trọng

2 Lịch sử sử dụng vi khuẩn trong đấu tranh sinh học

Bệnh vi khuẩn của côn trùng được nghiên cứu từ lâu Đầu tiên, năm 1870

L.Pasteur nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh cho tằm… Sau đó năm 1885 Chashire và Cheyne nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh cho ong mật Châu Âu, mãi sau này

Metchnikov mới công bố công trình nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh cho vật gây hại nông nghiệp (sâu non, bọ hung hại lúa) ở Nam Ucraina (Steinhous, 1964;

Bondarenco, 1978)

3 Phân loại vi khuẩn được sử dụng trong đấu tranh sinh học

a.Theo cách phân chia của Steinhous (1959), vi khuẩn gây bệnh được chia thành 5 nhóm:

- Vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng, thường xuyên có trong môi trường sống của côn trùng

- Vi khuẩn thường xuyên hoặc thỉnh thoảng mặt trong ống tiêu hóa côn trùng khỏe

- Vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng, không hình thành bào tử, ký sinh không bắt buộc.

- Vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng, không hình thành bào tử, ký sinh bắt buộc

- Vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng, không hình thành bào tử và tinh thể độc tố, ký sinh bắt buộc

b Theo cách phân chia của Bucher, vi khuẩn gây bệnh được chia thành 4 nhóm:

- Vi khuẩn gây bệnh bắt buộc

- Vi khuẩn gây bệnh hình thành bào tử và tinh thể độc tố

- Vi khuẩn gây bệnh không bắt buộc

- Vi khuẩn có tiềm năng gây bệnh cho côn trùng

Vi khuẩn gây bệnh bắt buộc thường liên quan đến một số bệnh nhất định củacôn trùng và trong tự nhiên thường thích nghi với một phổ ký chủ hẹp

Vi khuẩn gây bệnh không bắt buộc có thể làm tổn hại hoặc có thể xâm

nhiễm vào các mô của cơ thể côn trùng mẫn cảm với chúng Trước khi xâm nhập vào khoang máu, chúng thường sinh sản trong ruột côn trùng

Vi khuẩn gây bệnh không bắt buộc có thể nuôi cấy trên môi trường nhân tạo

Vi khuẩn có tiềm năng gây bệnh, bình thường không sinh sản trong ruột côn trùng, nhưng có thể xâm nhập vào khoang máu Chúng phát triển được trong môi trường nhân tạo không chuyên tính với từng nhóm côn trùng chuyên biệt

c Theo cách phân chia của Falcon, vi khuẩn gây bệnh được chia thành 2 nhóm:

- Vi khuẩn hình thành bào tử (vi khuẩn gây bệnh bắt buộc và phần lớn vi khuẩn gây bệnh không bắt buộc) có tạo thành tinh thể độc tố và không tạo thành tinh thể độc tố

- Vi khuẩn không hình thành bào tử (vi khuẩn gây bệnh hoàn toàn không bắt buộc

và vi khuẩn có tiềm năng gây bệnh cho côn trùng)

4 Các họ vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng và chuột

Đã mô tả được hơn 100 loài vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng và chuột, đại diện thuộc các họ:

- Họ Enterobacteriaceae (thuộc bộ Eubacteriales).

Họ Enterobacteriaceae gồm các loài vi khuẩn sống ở ruột côn trùng

Chúng có dạng hình que, gram âm, không hình thành bào tử Phát triển tốt trên môitrường dinh dưỡng bình thường Vi khuẩn thuộc họ này có loài là ký sinh bắt buộc,không bắt buộc và hoại sinh

Loài Salmonella enteridis gây bệnh thương hàn cho các loài chuột

- Họ Bacillaceae

Họ Bacillaceae gồm vi khuẩn hình thành bào tử, gram dương, hình que Có

ý nghĩa trong BPSH là các loài thuộc giống Bacillus, Clostridium

Đại diện là các loài thuộc các giống Bacillus; Clostridium gây bệnh cho côn trùng

- Họ Pseudomonadeceae.

Họ Pseudomonadeceae gồm các loại vi khuẩn hình que, gram âm, khônghình thành bào tử Các loài Pseudomonas aeruginosa, P chlororaphis, P.fluorescens, là những vi khuẩn có tiềm năng gây bệnh cho côn trùng

5 Một số vi khuẩn được ứng dụng trong phòng chống côn trùng và chuột

a Vi khuẩn Coccobacillus acridiorum

Gây bệnh nhiễm trùng máu cho châu chấu Schistocare paramensis, đã đượcdùng làm thuốc phun trừ châu chấu thành công ở Mexico, Colombia, Argentia

b Vi khuẩn gây bệnh cho ấu trùng bọ hung: Bacillus popolliae (dạng bệnh A) và

B lentimormus (dạng bệnh B)

Bệnh sữa được phát hiện đầu tiên ở ấu trùng bọ hung ở Nhật Bản Popilliajaponica từ năm 1921 gồm 2 dạng cơ bản là dạng A và B Vi khuẩn gây nên 2 dạng

bệnh này được mô tả với tên Bacillus popolliae dạng bệnh A) và B lentimormus (dạng bệnh B) Trong 2 loài vi khuẩn này thì loài B popolliae phổ biến hơn chiếm 88% trường hợp và được chú ý nghiên cứu hơn Loài B popolliae là vi khuẩn ký

sinh bắt buộc, gram dương; bào tử có tính kháng cao với các điều kiện bất lợi củamôi trường, lây nhiễm bệnh cho bọ hung qua đường tiêu hoá

Sau khi xâm nhập vào vật chủ 3-4 ngày thì vi khuẩn bắt đầu sinh bào tử, tớingày thứ 13-16 thì bào tử của vi khuẩn đạt tới mức tối đa Trên môi trường thức ănnhân tạo vi khuẩn không hình thành bào tử, vì vậy phải nuôi nhân vi khuẩn nàytrên ấu trùng bọ hung Nhật Bản Sau 20 ngày ủ bệnh, một ấu trùng bọ hung NhậtBản tích luỹ tới 20 tỷ bào tử Từ các sâu bị bệnh có thể gom vi khuẩn và sản xuấtthành chế phẩm dạng bột chứa 100 triệu bào tử trong 1 gam chế phẩm

c Vi khuẩn Bacillus cereus diệt rệp sáp Quadraspidiotus perniciosus, sâu đục quả

táo Laspeyresia pomonella; ong lá Pristiphora erichsoni

Là vi khuẩn rất phổ biến trong tự nhiên, gram dương, hình thành bào tửnhưng không tạo thành tinh thể độc Tính gây bệnh cho côn trùng của vi khuẩn này

rất khác nhau Người ta cho rằng tính gây bệnh của B.cereus chủ yếu liên quan tới

sự tạo thành men photpholipaza và một loại ngoại độc tố như của Bacillus

thuringiensis

d.Vi khuẩn Serratia marcescens gây bệnh cho bọ hung Melolontha melolontha, tằm

và sâu đục thân ngô, có tính gây bệnh cao cho châu chấu, một số rệp sáp, bọ xít,

e Vi khuẩn Salmonella enteridis gây bệnh thương hàn chuột và các loài gặm nhấm

khác

f Vi khuẩn Bacillus thuringiensis

6 Xét vi khuẩn Bacillus thuringiensis

6.1 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis (viết tắt là: Bt) là vi khuẩn gây bệnh côn trùng quan

trọng nhất và được sử dụng rộng rãi trong đấu tranh sinh học để phòng trừ sâu bệnh trên thế giới

1870 Louis Pasteur (1822 – 1895) nghiên cứu bệnh gai trên tằm đã phát hiện

ra vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Vi khuẩn B thuringiensis là một loại trực khuẩn gram dương, dạng hình

que, hình thoi hoặc ở dạng chuỗi nhiều phân tử Hình thành bào tử và tinh thể độc

tố Tính độc hay tính diệt sâu của vi khuẩn B thuringiensis phụ thuộc vào các độc

tố do vi khuẩn sinh ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng Theo Kreig, Langenbrusch (1981) có gần 525 loài thuộc 13 bộ côn trùng đã ghi nhận bị

nhiễm vi khuẩn B thuringiensis, trong đó nhiều nhất là ở bộ cánh vảy (có 318

loài), sau đó là bộ hai cánh (59 loài), bộ cánh màng (57 loài), bộ cánh cứng (34 loài); các bộ khác có từ 1-12 loài bị nhiễm vi khuẩn này

Các loại độc tố của vi khuẩn B Thuringiensis:

B thuringiensis có 7 loại độc tố

*Ngoại độc tố alpha (α-exotoxin)

Là một loại men được vi khuẩn dùng để tiếp nhận các chất dinh dưỡng: đó làmen Lexitinaza C (Phospholipaza C)

Tính chất: Hòa tan trong nước, không bền vững khi nhiệt độ cao (không chịunhiệt)

Tác dụng: Tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập cơ thể côn trùng

* Ngoại độc tố beta (β- exotoxin)

Độc tố này được Halt và Arkawwa (1959) tìm ra khi nuôi ấu trùng ruồi nhà

bằng thức ăn có chứa B thuringiensis Độc tố này có thể tách được từ môi trường nuôi cấy B thuringiensis

Thành phần của ngoại độc tố beta gồm adenin, riboza và phospho với tỷ lệ 1:1:1

Tính chất: Ngoại độc tố beta hoà tan trong nước, bền vững ở nhiệt độ cao, cóthể chịu được ở nhiệt độ 120-1210C trong 10 - 15 phút, vì thế gọi làngoại độc tố

chịu nhiệt Ngoại độc tố beta còn gọi là Thuringiensis Không phải tất cả các chủng đều tạo thành ngoại độc tố beta Một số BT không sinh tinh thể độc nhưng có thể

Tính chất giả thiết: Có thể là một men không độc, có thể thuộc nhóm

Phospholipaza, tác động lên phospholipit ở thành tế bào giải phóng axit béo

(Coppel et al, 1977, Bondarenko, 1978; Chen, 1994)

Không gây độc khi chưa hòa tan (Coppel et al, 1997, Kandydin, 1989,Sundara Babu, 1985

Cấu tạo tinh thể nội độc tố có dạng 8 mặt gồm nhiều lớp những chuỗi phân

tử hình trụ (Vankova, 1962) Các tinh thể nội độc tố khác nhau về hình dạng và cóthể chia thành 5 loại: Dạng nhị tháp, hình cầu, hình vuông, hình lỏm, và không cóhình dạng ổn định (Ren Gixin, Feng Xichang, F Weixiong, 1983)

Theo phân tử lượng, các tinh thể nội độc tố có thể chia thành 3 nhóm: nhóm cóphân tử lượng là 140.000 - 160.000; 60.000 - 130.000 và 40.000 - 50.000.( Kandybin, 1989)

Ngoài ra còn có các độc tố khác chưa được nghiên cứu đầy đủ.

6.2 Cơ chế tác động của vi khuẩn B Thuringiensis lên côn trùng

Theo đặc điểm của cách xâm nhiễm và sự gây tổn thương đầu tiên cho côn

trùng thì xếp B.Thuringiensis thuộc nhóm vi sinh vật có tác động đường ruột.

- Đường nhiễm trùng là: cơ quan tiêu hoá

- Chỗ phá huỷ của vi khuẩn là: ruột giữa của côn trùng

- Yếu tố gây chết côn trùng: Tinh thể nội độc tố delta

Yếu tố chính gây chết sâu có trong các chế phẩm B thuringiensis là các tinh

thể nội độc tố delta

Diễn biến: Khi các tinh thể nội độc tố (ở dạng bào) tử được côn trùng ăn cùng với

thức ăn Trong ruột côn trùng, dưới tác động của hệ men các tinh thể nội độc tốđược phân giải sinh ra độc tố Thành phần các độc tố được tạo thành trong ruột côntrùng phụ thuộc vào bộ men ở dịch ruột côn trùng Bộ men này không giống nhau

ở các loài côn trùng khác nhau Do đó, có sự khác nhau về tính mẫn cảm của các

loài côn trùng với cùng một dòng vi khuẩn B thuringiensis Với sự phân huỷ tinh

thể nội độc tố sẽ tạo thành các độc tố và khi các độc tố này tác động lên màng baochất dinh dưỡng và biểu mô của ruột giữa thì quá trình bệnh lý bắt đầu Các tế bàobiểu mô bắt đầu trương và trở nên mủn Đầu tiên là các tế bào hình trụ bị tổnthương Những thay đổi trong màng tế bào ghi nhận được chỉ 15 phút sau khi côn

trùng ăn phải thức ăn có vi khuẩn B thuringiensis Sau 2-3 giờ trong các tế bào

hình trụ, hình chén đã tạo thành các vết nứt, các tế bào bị nhăn nheo và vỡ ra Sựphá vỡ trao đổi chất ở các tế bào biểu mô ruột giữa dẫn đến các ion lọt từ khoangruột sang dịch máu Chứng liệt và chết xảy ra do không cân bằng ion trong dịch

máu Đồng thời các bào tử vi khuẩn từ ruột xâm nhiễm vào dịch máu và sinh sản

nhanh gây nhiễm trùng máu

Ngoại độc tố beta tác động chậm hơn nội độc tố denta, sau khi nội độc tốphá hủy thành ruột giữa, ngoại độc tố nhanh chóng xâm nhập vào máu, lan tới cácnội quan, gây rối loạn sinh lý làm cho côn trùng chết nhanh hơn.

*Chế phẩm B Thuringiensis còn có tác động gây ngán đối với côn trùng.

Cơ chế gây ngán mang đặc điểm tác động tiếp xúc Khi chế phẩm tiếp xúc với cơquan cảm nhận vị giác của côn trùng Tác động gây ngán phụ thuộc vào liều lượng

và tính chất của loại chế phẩm Thực nghiệm cho thấy chế phẩm BTB – 202 vàdenddrabacillin gây ngán cao nhất (Prischepa, 1982)

* Chế phẩm vi khuẩn B Thuringiensis còn có tác động gây dị hình (quái

thai) ở thế hệ sau; đặc biệt là các chế phẩm ngoại độc tố Với liều lượng thấp hơn

liều lượng gây chết, chúng có tác động kìm hãm sinh trưởng, phát triển và biến tháidẫn đến hiện tượng dị hình, giảm sức sinh sản của cá thể cái trưởng thành Chếphẩm BTB – 202 có tác động gây dị hình mạnh nhất (Kandybin, 1989).

Đối với các côn trùng có tính mẫn cảm cao với B thuringiensis như tằm

(Bombyx mori) thì bào tử chỉ đóng vai trò nhỏ bé hoặc không có vai trò trong tác

động của B thuringiensis lên côn trùng Bởi vì ở trường hợp này không đủ thời

gian để bào tử mọc mầm và xâm nhiễm thì côn trùng đã chết do nội độc tố(Sundara Babu, 1985)

6.3 Chuyển gen Bt vào thực vật

Các nhà khoa học đã tiến hành chuyển gen Bt mã hóa cho protein tinh thểđộc tố từ vi khuẩn Bt vào thực vật Cây trồng được chuyển gen Bt này sẽ có khảnăng tự kháng lại sâu hại đích Các protein sản sinh trong thực vật không bị rửatrôi hay bị phân huỷ dưới ánh nắng mặt trời.Vì vậy, bất kể trong điều kiện sinh

thái, khí hậu thế nào thì cây trồng vẫn được bảo vệ khỏi sự tấn công của sâu đụcthân, hay đục quả.

6.4 Công nghệ sản xuất chế phẩm Bt

Hình 2 Một số chế phẩm Bt

Bảng1 Một số loài Bt chính được sử dụng trong sản xuất chế phẩm.

- Nguyên liệu và môi trường nuôi cấy vi khuẩn:

Do vi khuẩn Bt có thể tiết ra enzym amylaza, proteaz ngoại bào nên sử dụng cácsản phẩm thủy phân cơ chất là tinh bột và protein trong các sản phẩm nông nghiệphoặc phế thải khi chế biến nông sản để xây dựng tế bào, sinh trưởng, phát triển,đồng thời tạo thành bào tử và tinh thể độc

- Lên men (nuôi cấy mở rộng thu sinh khối):

Phương pháp nuôi cấy bề mặt:

Trên bề mặt rắn có độ ẩm là 50 – 65% và môi trường cần có độ xốp đáng kể khôngkhí dễ khuếch tán vào các khe hở thông thoáng, CO2 dễ ra ngoài.

Vi khuẩn sẽ mọc lên trên bề mặt cơ chất là các hạt hoặc sơi, mảng nguyên liêu vàtiếp nhân oxy của không khí để sinh trưởng

Các khay đã được phun dịch nhân giống đặt trong các phòng nuôi cấy có các điềukiện thích hợp su 4-5 ngày, vi khuẩn phát trển và sinh bào tử cũng như hình thànhtinh thể độc

Sau khi kết thúc nuôi cấy, thu gom môi trường ở các khay và sấy ở không khi nóng

40 – 45oC cho đến độ ẩm hoặc lọ kín và lưu hành trên thị trường

Phương pháp nuôi cấy chìm:

Vi khuẩn được nuôi cấy trong các nồi lên men có thể tích lớn, được thổi khí qua hệmáy nén trong điều kiện vô trùng

Thiết bị có thể được trang bị hệ điều khiển tự động hóa việc cấp khí, nhiệt độ, điềuchỉnh pH, phá bọt

Thời gian nuôi cấy ngắn, số lượng tạo ra nhiều

- Hoàn thành chế phẩm:

Từ dịch men chìm có thể tạo 3 dạng chế phẩm:

Chế phẩm dạng lỏng: dịch lên men sau khi kết thúc được bổ sung các chấtphụ gia, chất bảo quản chống thối, chất bám dính rồi đóng chai

Chế phẩm dạng nhão: Sau khi ly tâm dịch lên men ta thu được sinh khối ướt

có độ ẩm khoảng 85%, không cần sấy khô mà trộn với dầu thành dạng nhũ tương

Chế phẩm dạng bột: Ly tâm thu được dạng dịch đặc nhão như trên trộn cácchất phụ gia như tinh bột, xenlulozo, Rồi đem sấy bằng các thiết bị sấy phunhoặc sấy thăng hoa Bột khô đóng gói trong bao PE hoặc giấy thiếc hoăc trong bọckín