Phát hiện mycobacterium tuberculosis kháng isoniazid, rifampin và ethambutol bằng kỹ thuật real time PCR

Một trong số đó là kỹ thuật real-time PCR, sử dụng kỹ thuật real-time PCR là một kỹ thuật hoàn toàn mở, nhanh, nhạy, chính xác, không lệ thuộc vào các hãng sản xuất kít ở nước ngoài, giá

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Học viên: Khổng Thị Minh Ngân

PHÁT HIỆN MYCOBACTERIUM TUBERLUCOSIS KHÁNG ISONIAZID, RIFAMPIN VÀ ETHAMBUTOL

BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Học viên: Khổng Thị Minh Ngân

PHÁT HIỆN MYCOBACTERIUM TUBERLUCOSIS KHÁNG ISONIAZID, RIFAMPIN VÀ ETHAMBUTOL

BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS : Nguyễn Thái Sơn

Hà Nội – 2014

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 3

1.1 Tình hình nhiễm lao trên thế giới và tại Việt Nam 3

1.1.1 Trên thế giới 3

1.1.2 Việt Nam 4

1.2 Bệnh lao 6

1.2.1 Bệnh lao kháng thuốc và cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao 7

1.3 Vi khuẩn lao 11

1.3.1 Phân loại vi khuẩn lao 11

1.3.2 Hình thể vi khuẩn lao 12

1.3.3 Cấu trúc vi khuẩn lao 13

1.3.4 Đặc điểm sinh học và nuôi cấy vi khuẩn lao 16

1.3.5 Cơ chế tác động của isoniazid và cơ chế kháng isoniazid của vi khuẩn lao 18

1.3.6 Cơ chế tác động của Rifampin và cơ chế kháng Rifampin của vi khuẩn lao 20 1.3.7 Cơ chế tác động của ethambutol và cơ chế kháng ethambutol của vi khuẩn lao 21

1.4 Các phương pháp xác định lao kháng thuốc 23

1.4.1 Phương pháp xác định kiểu hình 23

1.4.2 Các phương pháp nuôi cấy cải tiến 26

1.4.3 Một số phương pháp kiểu hình mới 28

1.4.4 Phương pháp xác định kiểu gen 31

Chương 2VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41

2.1 Vật liệu nghiên cứu 41

2.1.1 Vật liệu sinh học 41

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị 42

2.1.3 Hóa chất sử dụng 43

2.2 Nội dung nghiên cứu 43

2.3 Phương pháp nghiên cứu 44

2.3.1 Phương pháp thiết kế và kiểm tra các oligonucleotide (mồi và mẫu dò) bằng cơ sở dữ liệu trên IDT và các phần mềm sinh học chuyên dụng như ClustalX và Annhyb [3,6,8,10]. 44

2.3.2 Phương pháp lấy mẫu, xử lý bệnh phẩm 46

2.3.3 Phương pháp tối ưu hóa các điều kiện phản ứng real-time PCR 48

2.3.4 Thiết lập quy trình chẩn đoán và thực hiện trên mẫu bệnh phẩm 53

Chương 3KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 54

3.1 Đánh giá các thông số của các oligonucleotide thiết kế 54

3.1.1 Trình tự và vị trí của các oligonucleotide 54

3.1.2 Đặc tính của các oligonucleotide 56

3.1.3 Khả năng bắt cặp của hệ mồi, mẫu dò trên ly‎ thuyết 59

3.2 Đánh giá khả năng bắt cặp của hệ mồi và mẫu dò 66

3.3 Khảo sát nhiệt độ lai của phản ứng 68

3.3.1 Khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 1 68

3.3.2 Khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 2 69

3.3.3 Kháo sát nhiệt độ lai phản ứng 3 70

3.3.4 Khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 4 71

3.4 Khảo sát nồng độ mồi của phản ứng 72

3.4.1 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 1 73

3.4.2 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 2 73

3.4.3 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 3 74

3.4.4 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 4 74

3.5 Khảo sát nồng độ mẫu dò (mẫu dò) 75

3.5.1 Khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 1 75

3.5.3 Khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 3 76

3.5.4 Khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 4 77

3.6 Khảo sát nồng độ Mg++ 77

3.6.1 Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 1 77

3.6.2 Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 2 78

3.6.3 Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 3 78

3.6.4 Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 4 79

3.7 Khảo sát độ lặp lại của phản ứng 79

3.7.1 Khảo sát độ lặp lại trong cùng một lần thí nghiệm 80

3.7.2 Khảo sát độ lặp lại của các phản ứng trong các lần thí nghiệm khác nhau 83

3.8 Khảo sát độ nhạy của phản ứng 87

3.8.1 Phản ứng 1- xác định đột biến kháng isoniazid 87

3.8.2 Phản ứng 2- xác định đột biến kháng Rifampin 88

3.8.3 Phản ứng 3 và phản ứng 4- xác định đột biến kháng ethambuton 89

3.9 Khảo sát độ đặc hiệu của các phản ứng 90

3.9.1 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 1- xác định đột biến kháng isoniazid 91

3.9.2 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 2- xác định đột biến kháng Rifampin 91

3.9.3 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 3 và 4 - xác định đột biến kháng ethambutol 92

3.10 Quy trình phát hiện đột biến kháng isoniazid, Rifampin và ethambutol của MTB.93 3.10.1 Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt 93

3.10.2 Quy trình xác định các đột biến kháng isoniazid, Rifampin và ethambutol 94

3.11 Ứng dụng quy trình trên mẫu bệnh phẩm 94

3.11.1 Mẫu bệnh phẩm 94

3.11.2 Ứng dụng quy trình trên 50 mẫu bệnh phẩm lao 95

3.11.3 Xác định độ đồng thuận của phương pháp real time PCR với phương pháp kháng sinh đồ 97

CHƯƠNG 4KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 101

4.1 Kết luận 101

4.2 Kiến nghị 102

TÀI LIỆU THAM KHẢO 103

CTCLQG : Chương trình chống lao quốc gia

DR : Trình tự lặp lại trực tiếp (Directed Repeat)

MDR-TB : Lao kháng đa thuốc (multidrug-resistant TB)

MIC : Minimum inhibitory concentration

MIRU-VNTR : Mycobacterial Interspered Repetitive Units of Variable

Number of Tandem Repead MTB : Mycobacterium tuberculosis

WHO : Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization)

XDR-TB : Lao đa kháng thuốc mở rộng (extensively drug resistant TB)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Vị trí các gen liên quan đến kháng thuốc ở MTB (Multidrug-resistance) 11

[11,12,26,28] 11

Bảng 1.2 Nồng độ đánh giá của các loại thuốc kháng sinh chính trong 25

phương pháp tỷ lệ[5] 25

Bảng 2.1 : Trình tự và vị trí các mồi và mẫu dò sử dụng trong đề tài 42

Bảng 3.1 : Bảng thông số kỹ thuật của mồi và mẫu dò 57

Bảng 3.2: Kiểm tra năng lượng liên kết hetero-dimer trong phản ứng 1 – xác định đột biến gen katG tại vị tí 315 58

Bảng 3.3: Kiểm tra năng lượng liên kết hetero-dimer trong phản ứng 2- xác định đột biến gen rpoB tại vị trí 516 58

Bảng 3.4: Kiểm tra năng lượng liên kết hetero-dimer trong phản ứng 3- xác định đột biến gen emb306 (A→G) 58

Bảng 3.5 : Kiểm tra năng lượng liên kết hetero –dimer trong phản ứng 4 – xác định đột biến gen emb306 (G→A) 58

Bảng 3.6: Bảng kết quả thông số khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 1 69

Bảng 3.7 : Bảng thông số khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 2 70

Bảng 3.8: Kết quả thông số khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 3 71

Bảng 3.9: Bảng thông số kết quả khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 4 72

Bảng 3.10: Bảng chi tiết kết quả khảo sát về độ lặp lại của phản ứng 1 80

Bảng 3.11: Bảng chi tiết kết quả khảo sát về độ lặp lại của phản ứng 2 81

Bảng 3.12: Bảng chi tiết kết quả khảo sát về độ lặp lại của phản ứng 3 82

Bảng 3.13: Bảng chi tiết kết quả khảo sát độ lặp lại phản ứng 82

Bảng 3.14: Hệ số biến thiên giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 1 83

Bảng 3.15: Hệ số biên thiên giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 2 84

Bảng 3.16: Hệ số biến thiên giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 3 85

Bảng 3.17: Hệ số biến thiên giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 4 86

Bảng 3.18: Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng 1 87

Bảng 3.19: Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng 2 88

Bảng 3.20: Kết quả khảo sát độ nhạy phản ứng 3 và 4 90

Bảng 3.21 : Bảng thành phần phản ứng 93

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ phân bố lao trên toàn thế giới [47] 4

Hình 1.2 : Sơ đồ thống kê số ca nhiễm mới lao bình thường và lao kháng thuốc tại Việt Nam[47] 6

Hình 1.3 Cơ chế phát triển tính kháng thuốc ở vi khuẩn lao [33] 10

Hình 1.4 Vi khuẩn lao nhuộm soi bằng phương pháp Ziehl – Neelsen[50] 13

Hình 1.5 Mô hình hóa cấu trúc màng vi khuẩn lao[51] 13

Hình 1.6 Các ống MGIT cho kết quả dương tính và âm tính 28

Hình 1.7 Thử nghiệm khử nitrate với các chủng nhạy và kháng thuốc 30

(GC: growth control) 30

Hình 1.8 : Nguyên lý kỹ thuật giải trình tự bằng phương pháp dideoxynucleotid 33

Hình 1.9 Sản phẩm của phản ứng MAS-PCR trên đoạn gen rpoB 36

Hình 1.10 Sản phẩm của phản ứng MAS-PCR trên đoạn gen KatG 37

Hình 2.1 : Sơ đồ quy trình tách chiết DNA vi khuẩn lao từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng 48

Hình 2.2 : các giai đoạn trong phản ứng Real-time PCR 49

Hình 3.1 : Kết quả kiểm tra hệ mồi và mẫu dò của phản ứng1 bằng phần mềm Annhyb 54

Hình 3.2 : Kết quả kiểm tra hệ mồi và mẫu dò của phản ứng 2 bằng phần mềm Annhyb 55

Hình 3.3: Kết quả kiểm tra hệ mồi và mẫu dò của phản ứng 3 bằng phần mềm Annhyb 55

Hình 3.4: Kết quả kiểm tra hệ mồi và mẫu dò của phản ứng 4 bằng phần mềm Annhyb56 Hình 3.5 : Khả năng đặc hiệu của mồi katG-315F đối với gen katG của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast (NCBI) 59

Hình 3.6: Khả năng đặc hiệu của mồi katG-315R đối với gen katG của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast (NCBI) 60

Hình 3.7: Khả năng đặc hiệu của Mẫu dò katG 315 đối với gen katG của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI) 61

Hình 3.8: Khả năng đặc hiệu của mồi xuôi rpoB-516F đối với gen rpoB của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI) 62

Hình 3.9 : Khả năng đặc hiệu của mồi ngược rpoB-516R đối với gen rpoB của

MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI) 62

Hình 3.10 :Khả năng đặc hiệu của Mẫu dò rpoB-516 đối với gen rpoB của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI) 63

Hình 3.11: Khả năng đặc hiệu của mồi xuôi emb 306F1 đối với gen emb của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI) 63

Hình 3.12: Khả năng đặc hiệu của mồi xuôi emb 306R12 đối với gen emb của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI) 64

Hình 3.14: Khả năng đặc hiệu của mồi xuôi emb 306-F345 đối với gen emb của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI) 65

Hình 3.15: Khả năng đặc hiệu của mồi ngược emb 306-R3 đối với gen emb của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI) 65

Hình 3.16: Khả năng đặc hiệu của Mẫu dò 306-345 đối với gen emb của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI) 66

Hình 3.14c Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của các hệ mồi và mẫu dò nhằm phát hiện đột biến 67

Hình 3.14a Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của hệ mồi và mẫu dò nhằm phát hiện đột biến katG/315/AGCACC 67

Hình 3.14b Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của hệ mồi và mẫu dò nhằm phát hiện đột biến rpoB/516/GACGTC 67

Hình 3.15: Hình ảnh khảo sát nhiệt độ bắt cặp phản ứng 1 68

Hình 3.16: Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng 2 70

Hình 3.17: Bảng thông số khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 3 70

Hình 3.18: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 4 71

Hình 3.19: Kết quả khảo sát nồng độ mồi của phản ứng phát hiện đột biến kháng Isoniazid ở gen katG 73

Hình 3.20 : Kết quả khảo sát nồng độ mồi phản ứng xác định đột biến kháng Rifampin tại gen rpoB 73

Hình 3.21: Kết quả khảo sát nồng độ mồi phản ứng xác định đột biến kháng ethambutol tại gen emb(ATG-GTG) 74

Hình 3.22: Kết quả khảo sát nồng độ mồi phản ứng xác định đột biến kháng Ethambutol tại gen emb(ATG-ATA) 74

Hình 3.23 : Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 1 75

Hình 3.24 : Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 2 76

Hình 3.25: Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 3 76

Hình 3.26 : Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 4 77

Hình 3.27 : Kết quả khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 1 77

Hình 3.28: Kết quả khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 2 78

Hình 3.29: Kết quả khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 3 78

Hình 3.30: Kết quả khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 4 79

Hình 3.31: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phản ứng 1 80

Hình 3.31: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phản ứng 2 81

Hình 3.32: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phản ứng 3 81

Hình 3.34: kết quả khảo sát độ lặp lại của phản ứng 4 82

Hình 3.34 : Độ lặp lại giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 1 83

Hình 3.36: Độ lặp lại giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 3 85

Hình 3.37: Độ lặp lại giữa 3 lần thí nhiệm của phản ứng 4 86

Hình 3.38: Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng 87

Hình 3.39: Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng 2 88

Hình 3.40: Kết quả khảo sát độ nhạy phản ứng 3 và 4 89

Hình 3.42: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 2 91

Hình 3.43: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 3 và 4 92

Hình 3.44: Quy trình xác định đột biến kháng thuốc ở lao 94

MỞ ĐẦU

Bệnh lao và vi khuẩn gây bệnh lao đã được biết rõ từ hơn một thế kỷ nay Những liệu pháp chữa trị bằng kháng sinh tỏ ra hiệu quả từ những năm 1960 Tuy nhiên, trong những thập niên 90 đến nay, đã xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn lao kháng thuốc, rất khó chữa trị và đang có nguy cơ lây lan rất nhanh, đe dọa hàng triệu người trên thế giới

Y học thế giới những năm gần đây đã ghi nhận chủng vi khuẩn gây bệnh lao kháng đa thuốc mới gọi là lao siêu kháng thuốc Những người mắc bệnh lao với chủng vi khuẩn mới này cần phải điều trị trên 2 năm so với từ 6-8 tháng như trước đây và chi phí điều trị cũng tăng lên gấp 100 lần WHO ước tính, đến nay đã có 27 ngàn ca bệnh lao mới kháng thuốc ở 41 quốc gia [47]

Việc điều trị cho bệnh nhân lao kháng đa thuốc hết sức nghiêm ngặt, cần phải theo dõi liên tục trong 2 năm Một số bệnh nhân sau một thời gian uống thuốc, thấy mình khỏe và không có triệu chứng gì, cho rằng mình đã khỏi bệnh nên tự ý bỏ trị lao Bệnh nhân không biết rằng vi trùng lao “sống dai” và rất nguy hiểm Sau một thời gian “nằm ẩn mình” và tìm cách chống lại thuốc lao, chúng sẽ hoạt động gây bệnh trở lại Lúc này, người bệnh trở nên bị lao kháng thuốc, và bệnh sẽ nguy hiểm hơn lúc phát bệnh lao ban đầu Ngoài ra, cũng có những bệnh nhân bị khó chịu do tác dụng phụ của thuốc lao trong quá trình điều trị, nhưng không đến tái khám để bác sỹ điều chỉnh thuốc, mà tự bỏ trị nửa chừng Cũng có những bệnh nhân uống thuốc lao không đều đặn, hay uống không đủ liều thuốc… Tất cả những trường hợp này đều tạo điều kiện thuận lợi cho vi trùng lao trở nên kháng thuốc Nếu điều trị không đầy đủ, vi khuẩn kháng thuốc càng mạnh hơn và khả năng hồi phục càng trở nên mong manh Và sẽ cực kỳ nguy hiểm cho cộng đồng, bởi lao kháng đa thuốc đã rất khỏe sẽ từ bệnh nhân lây lan trong cộng đồng do bị phát tán trong không khí, môi trường sinh hoạt [26,28]

Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu[2] Năm 2007, Việt Nam ước tính có 150 ca nhiễm lao mới/nghìn dân và tỷ lệ mắc

bệnh là 192 ca/nghìn dân Tỷ lệ lao đa kháng thuốc trong tổng số ca nhiễm lao mới

là 2.7%, và trong tổng số ca đã qua điều trị là 19% Theo số liệu bệnh nhân lao đăng

ký điều trị lao tại TP HCM năm 2008, với tỷ lệ kháng đa thuốc (kháng ít nhất với Rifampin và Isoniazid) vào khoảng 3.8% trong số bệnh nhân mới và trên 22% ở bệnh nhân lao tái điều trị [1,2] Ở nghiên cứu này chúng tôi tập trung nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng 3 loại thuốcchủ yếu trong điều trị lao là Rifampin, Isoniazid, và Ethambutol

Để phát hiện lao đa kháng thuốc có các phương pháp như : làm xét nghiệm nuôi cấy vi trùng lao từ các mẫu bệnh phẩm như đờm, dịch cơ thể… và làm kháng sinh đồ lao Quá trình nuôi cấy vi trùng và thử kháng sinh đồ này mất khoảng 2 đến

3 tháng mới có kết quả Hiện nay, ở Việt Nam đã có xét nghiệm giúp phát hiện kháng thuốc sớm và nhanh hơn là Hain test (thời gian thực hiện xét nghiệm khoảng

5 ngày) và Xpert MTB/RIF (thời gian thực hiện xét nghiệm khoảng 2 giờ) Tuy nhiên, hai xét nghiệm này có giá thành đắt, và không dùng phổ biến cho mọi bệnh nhân bị lao[5]

Hiện nay các tiến bộ trong lĩnh vực công nghệ sinh học đang mang tới rất nhiều lợi ích ứng dụng trong y học Một trong số đó là kỹ thuật real-time PCR, sử dụng kỹ thuật real-time PCR là một kỹ thuật hoàn toàn mở, nhanh, nhạy, chính xác, không lệ thuộc vào các hãng sản xuất kít ở nước ngoài, giá thành rẻ hơn,… nên chúng tôi chọn real-time PCR để phát hiện các đột biến kháng isoniazid, Rifampin

và ethambutol trên vi khuẩn lao trong mẫu bệnh phẩm

Chính vì những lý do trên nhóm nghiên cứu quyết định thực hiện đề tài: “ Phát

hiện Mycobacterium tuberculosis kháng Isoniazid, Rifampin và Ethambutol bằng

kỹ thuật real-time PCR” Đề tài nhằm các mục tiêu sau :

1 Xây dựng quy trình real-time PCR phát hiện nhanh các mẫu lao đột biến kháng Isoniazid (đột biến gen katG ở codon 315 AGC-ACC (Ser315Thr)), Rifampin (đột biến gen rpoB ở codon 516 GAC-GTC (Asp516Val)) và Ethambutol (đột biến gen emb tại codon 306 với 2 loại: ATG-GTG (Met306Val)

và ATG-ATA(Met306Ile) )

2 Ứng dụng quy trình trên các mẫu bệnh phẩm thực tế

Chương 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

1.1 Tình hình nhiễm lao trên thế giới và tại Việt Nam

1.1.1 Trên thế giới

Bệnh lao đã tồn tại rất lâu cùng con người, khoảng 150000 – 200000 năm Mặc cho mọi cố gắng của con người trong việc kiểm soát và khống chế bệnh lao, hàng năm vẫn có 8 - 9 triệu trường hợp lao mới và 2 triệu người bị chết do căn bệnh này Tỷ lệ mắc lao trên thế giới vẫn tiếp tục tăng 1% mỗi năm Trong lịch sử nhân loại, bệnh lao đã 5 lần bùng phát và lan rộng thành các vụ đại dịch lao Trong khoảng 100 - 150 năm gần đây vi khuẩn lao đã dần phát triển trong hầu hết các khu vực trên trái đất [1]

Cuối thập niên 70 đầu thập niên 80 ở một số nước phát triển đã tưởng như chế ngự được hoàn toàn bệnh lao, do đó bệnh lao đã đi vào quá khứ bởi sự lãng quên của các nhà y học và khoa học Tuy nhiên thực tế lại không như vậy bởi sự xuất hiện của cơ chế kháng lại thuốc kháng sinh của khuẩn lao, khiến cho việc phát hiện

và điều trị ngày càng trở nên khó khăn và tốn kém

Vì vậy bệnh lao vẫn tiếp tục là một trong ba căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trên thế giới cùng với hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) và sốt rét Điều này đã một lần nữa khơi dậy các nghiên cứu sâu hơn trong phương pháp phát hiện, chẩn đoán và điều trị bệnh lao Bệnh lao là kết quả của nghèo đói và nghèo đói lại là nguyên nhân làm cho bệnh lao phát triển

1.1.2 Việt Nam

Việt Nam là một trong 22 nước có tình trạng bệnh lao nặng nhất thế giới Tại châu Á, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung Quốc và Philippines về số lượng bệnh nhân lao Hiện Việt Nam có khoảng trên 200.000 người mắc bệnh lao Trong đó, số người mới mắc khoảng 185.000-187.000 người Số người nhiễm lao ở Việt Nam chiếm tới 44% dân số Số tử vong do lao rất cao, mỗi năm có khoảng 4% trường hợp tức là 3200 – 3500 tử vong Tỷ lệ lao trẻ em khoảng 60 – 61/ 100.000 trẻ Ước tính mỗi năm có khoảng 20.000 trường hợp lao trẻ em, song hiện nay trung bình chỉ điều trị khoảng 250 – 300 trẻ Ở người lớn, bệnh lao gặp phổ biến ở người nghèo lứa tuổi 15 -55 tuổi, cao nhất trong lớp người 25 – 40 là những người đang đóng góp nhiều nhất cho xã hội [1,2]

Hình 1.1 Sơ đồ phân bố lao trên toàn thế giới [47 ]

Trong giai đoạn 1997-2002, CTCLQG đã phát hiện được 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện đạt 82% số bệnh nhân ước tính (so với mục tiêu của WHO là 70%), CTCLQG đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi AFB(+) với tỷ lệ khỏi là 92% [2]

Năm 2002, khu vực Tây-Thái Bình Dương phát hiện 806.460 bệnh nhân lao các thể, 372.220 bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới Trong đó, số bệnh nhân do CTCLQG Việt nam phát hiện chiếm 12% bệnh nhân các thể và 15% số bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới

Với những kết quả đạt được trong chỉ tiêu phát hiện và điều trị bệnh nhân, năm 1996, Việt nam là nước đầu tiên ở Châu Á đã đạt được mục tiêu của WHO Việt nam đã được WHO và Ngân hàng thế giới đánh giá cao thành tích đạt được trong mọi hoạt động chống lao Từ năm 1997, WHO và Hiệp hội Bài lao và Bệnh phổi Quốc tế cùng phối hợp với CTCLQG Việt Nam tổ chức 8 khoá học về quản lý Chương trình chống lao cho các học viên quốc tế tại Việt Nam Mô hình hoạt động chống lao ở Việt nam được xem là mô hình để học viên các nước học tập

Hiện nay nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% (ở các tỉnh phía Nam là 2%, ở các tỉnh phía Bắc là 1%) Trên thực tế có thể chỉ số nguy cơ nhiễm lao hàng năm có thể cao hơn 1,5% như vậy các con số nêu trên có thể còn lớn hơn Điều đó sẽ tăng thêm sự khó khăn đối với công tác chống lao không những trong những năm tới mà có thể còn trong thời gian khá dài, ngay cả khi đã bước sang thiên niên kỷ mới[2,31]

Hiện tại Việt Nam còn đang gia tăng số lượng người nhiễm lao kháng thuốc Thep thống kê của WHO số ca lao kháng thuốc được biết tới cao nhất vào năm

2011 là 610 ca tới năm 2012 thì phát hiện thêm 273 ca Việt Nam là một trong những nước đang phát triển, điều kiện chăm sóc y tế tại những nơi vùng sâu vùng

xa còn kém Người dân không có thói quen dùng thuốc và điều trị thuốc theo bác sỹ nên tình trạng kháng thuốc đang rất báo động [45,47]

1.2 Bệnh lao

Bệnh lao gắn liền với sự phát triển xã hội loài người từ hàng ngàn năm nay Trên thế giới, chưa bao giờ và không có một quốc gia nào, một khu vực nào, một dân tộc nào không có người mắc bệnh lao và chết do lao Bệnh lao được phát hiện

từ trước công nguyên ở Ấn Độ, Ai Cập, Hy Lạp và các nước vùng Trung Á Năm

1908, Mantoux dùng phương pháp tiêm tuberculin trong da để phát hiện dị ứng lao Cũng trong năm đó, Calmette và Guérin nghiên cứu vaccine phòng lao và đã thành công vào năm 1921 (vaccine BCG- Bacillus Calmette-Guérin) Đến năm 1944, Waksmann tìm ra kháng sinh chữa lao đầu tiên là streptomycine, năm 1952, thuốc isoniazid được đưa vào điều trị lao Năm 1965, thuốc Rifampin được nghiên cứu thành công và năm 1978, cơ chế và tác dụng của pyrazynamide được xác định Những thuốc này cùng với việc tiêm chủng phòng lao bằng vaccine BCG đã làm thay đổi được tình hình lao trên thế giới [27]

Do sự phát minh các thuốc hóa học chống lao khiến việc chữa lao đơn giản hơn và hiệu quả hơn, đồng thời đã phát sinh tâm trạng lạc quan của y giới, đã làm lãng quên căn bệnh nguy hiểm này Ngày nay, bệnh lao đang xuất hiện trở lại và

Hình 1.2 : Sơ đồ thống kê số ca nhiễm mới lao bình thường và lao kháng thuốc

tại Việt Nam[47]

cùng với đại dịch HIV/AIDS trở thành một trong những căn nguyên gây mắc bệnh

và tử vong chủ yếu, đặc biệt tại các nước đang phát triển

Năm 1993, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã tuyên bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu của bệnh lao và mối hiểm hoạ của nó trong tương lai là bệnh lao kháng thuốc [41,47]

1.2.1 Bệnh lao kháng thuốc và cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao

tỷ lệ lao kháng đa thuốc mở rộng tăng từ 1 triệu ca đến 1,5 triệu ca trong khoảng thời gian từ 2-3 năm Vi khuẩn lao kháng đa thuốc đang là một thách thức lớn cho toàn cầu Trong khi thuốc chống lao hàng đầu chỉ có 5 thuốc, thì thuốc chống lao loại hai thường có độc tính cao và giá thành rất đắt Những người mắc bệnh lao với chủng vi khuẩn kháng đa thuốc mở rộng cần phải điều trị trên 2 năm so với từ 6-8 tháng trước đây và chi phí điều trị cũng tăng lên gấp 100 lần [46,48]

Tại Việt Nam, theo CTCLQG năm 2006, tình hình kháng thuốc của vi khuẩn lao tại Việt Nam đang là một vấn đề đáng lo ngại, tỷ lệ kháng thuốc tiên phát là 30,7% vào loại cao trên thế giới Tỷ lệ kháng đa thuốc chung là 4%, trong đó tỷ lệ

đa kháng thuốc thứ phát là 19.3%, tỷ lệ đa kháng thuốc tiên phát là 2,7% Ước tính đến 2015, số ca tử vong do lao khoảng 14.000 [2]

Thuốc kháng sinh đầu tiên dùng để điều trị lao là streptomycin, nhưng sau vài năm sau khi kháng sinh này được sử dụng thì người ta đã nhận thấy hiện tượng đề kháng lại streptomycin của vi khuẩn lao Sau đó các kháng sinh chống lao khác tiếp tục ra đời: para - aminosalysilic, isoniazid, Rifampin,… nhưng đều không mang lại hiệu quả sau một thời gian điều trị nhất định Khả năng điều trị thành công có thể đạt 95 - 100 % đối với những bệnh nhân mắc lao thông thường, trong khi tỷ lệ thành công với bệnh nhân mắc lao kháng thuốc là 20 - 30 %, thậm chí còn không điều trị được khi mắc lao kháng đa thuốc và kháng thuốc phổ rộng mặc dù đã dùng kết hợp đến năm loại kháng sinh điều trị lao Vì vậy, việc phát hiện và ngăn chặn sự lan truyền các chủng lao đa kháng thuốc là vấn đề quan trọng nhất trong điều trị lao hiện nay [29,32]

Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao được định nghĩa là sự giảm mức mẫn cảm

của Mycobacterium tuberculosis trong in vitro làm cho chúng có sự khác biệt với

các chủng dại chưa bao giờ tiếp xúc với thuốc kháng sinh Trong các trường hợp lao kháng thuốc cần phải phân biệt:

Lao kháng thuốc là những trường hợp vi khuẩn lao kháng với một trong những thuốc chống lao dòng thứ nhất: isoniazid, rifampin, pyrazinamide, ethambutol hoặc streptomycin

- Lao kháng đa thuốc (MDR-TB): là vi khuẩn lao kháng ít nhất với cả 2 loại thuốc là isoniazid và Rifampin, đây là 2 loại thuốc chống lao dòng thứ nhất thường được sử dụng đầu tay để điều trị cho tất cả các bệnh nhân, và có thể kháng thêm một số tác nhân hoá trị liệu khác

- Lao đa kháng thuốc phổ rộng (XDR-TB): là sự đề kháng với isoniazid và rifampin cộng với fluoroquinolone và ít nhất 1 trong số 3 thuốc chống lao dòng thứ hai dùng đường tiêm (amikacin, kanamycin hoặc capreomycin)

Kháng thuốc tiên phát là kháng thuốc xẩy ra ở một bệnh nhân trước đó chưa

sử dụng một liệu pháp điều trị chống lao nào, còn kháng thuốc thứ phát là sự phát triển của kháng thuốc trong hoặc sau liệu pháp điều trị bằng hoá chất Kháng thuốc

tự nhiên là tính kháng thuốc của các chủng kiểu dại với các thuốc đặc hiệu Ví dụ: tất cả các chủng M bovis kiểu dại đều có tính kháng thuốc tự nhiên với

pyrazinamide, Mycobacterium tuberculosis có tính kháng tự nhiên với penicillin

[2,46]

1.2.1.2 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao

Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao là một sự khuếch đại nhân tạo của một hiện tượng tự nhiên liên quan đến sự phát sinh các đột biến một cách ngẫu nhiên ở các gen nằm trong vùng nhân của tế bào vi khuẩn Không giống với nhiều vi khuẩn khác, vi khuẩn lao không có sự chuyển gen kháng thuốc giữa các vi khuẩn thông qua các gen nhảy hoặc plasmid, Các chủng vi khuẩn lao kiểu dại không tiếp xúc với các thuốc chống lao sẽ không bao giờ xuất hiện tính kháng thuốc ngoại trừ tính

kháng thuốc tự nhiên của các loài vi khuẩn với một số thuốc như M bovis kháng pyrazinamide, M tuberculosis kháng penicillin,

Trong quá trình nhân lên của trực khuẩn lao, tính kháng thuốc được phát triển theo những trật tự xác định Trong mỗi ổ lao thường có khoảng 107

tế bào trở lên trong khi đó tần số xuất hiện đột biến liên quan đến tính kháng isoniazid của vi khuẩn lao khoảng 10-7 đến 10-9 còn tần số đột biến kháng Rifampin là khoảng 10-10 Tính kháng thuốc do sự phát sinh ngẫu nhiên các đột biến liên quan này được gọi là tính kháng di truyền Khi không có mặt của thuốc kháng sinh , các chủng vi khuẩn lao mẫn cảm thuốc phát triển lấn át các chủng kháng thuốc Sự có mặt của thuốc kháng sinh trong điều trị đã cung cấp một áp lực chọn lọc cho các chủng vi khuẩn lao Các chủng mẫn cảm bị ức chế sinh trưởng, thậm chí bị tiêu diệt, các chủng kháng thuốc trở thành ưu thế hình thành tính kháng thuốc thu được, đặc biệt là trong các bệnh nhân có chứa một lượng lớn trực khuẩn lao Sự lây lan của các chủng kháng thuốc này sang những người khác làm cho những người này bị nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc ngay từ đầu (tính kháng thuốc sơ cấp) [24,27,29,46]

Tính kháng nhiều loại thuốc khác nhau của vi khuẩn liên quan đến sự có mặt đồng thời các đột biến ở các gen đặc hiệu Ví dụ, tính kháng isoniazid của vi khuẩn lao có tần số là từ 10-7 đến 10-9, sự xuất hiện các đột biến liên quan đến tính kháng Rifampin có tần số khoảng 10-10, và sự xuất hiện các đồng thời các đột biến liên quan đến tính kháng cả 2 loại thuốc này có tần số khoảng 10-14 Tuy nhiên, trong

một quần thể vi khuẩn chỉ kháng isoniazid, các đột biến ngẫu nhiên phát sinh có thể dẫn đến tính kháng rifampcin ở một vài cá thể Khi bệnh nhân được điều trị bằng tổ hợp isoniazid và Rifampin, các chủng kháng cả 2 loại thuốc này sẽ được chọn lọc phát triển ưu thế Tương tự như vậy, sự xuất hiện của các đột biến có thể dẫn đến tính kháng tổ hợp các loại thuốc kháng sinh khác ở vi khuẩn lao [36]

Hình 1.3 Cơ chế phát triển tính kháng thuốc ở vi khuẩn lao [33]

Thuốc Gen Sản phẩm

Tỷ lệ gặp ở các chủng kháng (%)

60

<10

Bảng 1.1 Vị trí các gen liên quan đến kháng thuốc ở MTB (Multidrug-resistance)

[11,12,26,28]

1.3 Vi khuẩn lao

1.3.1 Phân loại vi khuẩn lao

Trong hệ thống sinh giới, vi khuẩn lao được phân loại như sau:

Loài: Mycobacterium tuberculosis

Các chủng vi khuẩn lao được chia làm 2 nhóm:

M tuberculosis complex (MTBC) gồm 4 loài có khả năng gây bệnh lao:

- M tuberculosis

- M bovis

- M africanum

- M microti

Trong đó M tuberculosis gây bệnh phổ biến nhất

Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT) gồm nhiều loài không gây

Lao là một trong những bệnh được biết lâu đời nhất ảnh hưởng tới con người,

nguyên nhân chính gây bệnh lao ở người là vi khuẩn M tuberlucosis được Rober Koch phân lập năm 1882 M tuberlucosis đặc trưng cho họ Mycobacteria gây bệnh

trên người

Khi nhuộm bằng phương pháp Ziehl – Neelsen trực khuẩn lao không bị cồn và acid làm mất màu của carbonfuchsin nên vi khuẩn bắt màu đỏ trên nền xanh nhẹ, trên thân có nhiều hạt siêu sắc Đối với vi khuẩn lao kháng thuốc hình thể nhỏ, nát

và bắt màu nhạt hơn.Vi khuẩn lao thân mảnh 2 đầu nhọn, dài 3 - 5µm đứng riêng lẻ hoặc xếp thành hình chữ N, Y, V hoặc thành dãy phân nhánh như cành cây Tuy nhiên cũng tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy và thời gian nuôi cấy mà vi khuẩn có kích thước và hình dạng thay đổi, từ cầu trực khuẩn đến trực khuẩn dài[15]

Vi khuẩn không di động, không sinh bào tử, khó bắt màu các thuốc nhuộm

thông thường do có lớp sáp ở thành tế bào Mycobacterium tuberculosis được xếp

vào nhóm vi khuẩn Gram dương, tuy nhiên khi nhuộm Gram vi khuẩn bắt màu rất yếu hoặc không giữ được màu thuốc nhuộm Trực khuẩn lao có cấu trúc rất phức tạp, hoàn hảo, ít vi sinh vật nào có được Vi khuẩn không có lông, nha bào và vỏ

1.3.3 Cấu trúc vi khuẩn lao

1.3.3.1 Cấu trúc màng tế bào vi khuẩn lao

Lớp vách của trực khuẩn có vai trò rất quan trọng Cấu trúc của lớp này ngoài đảm bảo cho sự tồn tại của trực khuẩn, làm cho trực khuẩn bền vững đối với hiện tượng thực bào, khi xâm nhập vào cơ thể trực khuẩn lao khó bị tiêu diệt, ảnh hưởng rất lớn đến khả năng gây bệnh của trực khuẩn [23]

Vi khuẩn lao có thể kháng cồn, kháng toan, kháng axit do có thành tế bào rất chắc chắn được cấu tạo bởi những thành phần sau :

Hình 1.4 Vi khuẩn lao nhuộm soi bằng phương pháp Ziehl – Neelsen[50]

(1) Lớp photpholipid bên ngoài : Các phân tử photpholipid ưa nước hướng về phía bên trong, các phân tử kỵ nước hướng về phía bên ngoài Cấu tạo này giúp vi khuẩn lao có thể điều hòa sự thẩm thấu của vỏ ngoài trực khuẩn

(2) Lớp acid mycolic :lớp này tạo nên độc tính của trực khuẩn lao và có cấu trúc làm tăng khả năng ít thấm nước của vỏ trực khuẩn, giúp trực khuẩn tồn tại bền vững với môi trường bên ngoài, chống khả năng bị huỷ diệt bởi đại thực bào và các

tế bào miễn dịch của cơ thể

1.3.3.2 Lớp bào tương

Trong bào tương có những hạt có thể có vai trò trong việc sinh ra thể siêu lọc của trực khuẩn - kích thước nhỏ hơn trực khuẩn bình thường 20 lần Có thể đó là biến đổi của trực khuẩn khi gặp điều kiện không thuận lợi, như khi điều trị thuốc chống lao kéo dài, trực khuẩn có thể biến đổi để thích ứng Một số tác giả đã nêu ra nhận

xét: nếu trong đờm người bệnh có thể siêu lọc của trực khuẩn lao thì tổn thương ở phổi thường lan tràn, có nhiều nốt loét và bệnh kéo dài hơn các bệnh nhân khác [4,21]

1.3.3.3 Nhân

Chứa các acid nhân (ADN, ARN) ở trực khuẩn lao, việc thông tin di truyền ngoài vai trò của thể nhiễm sắc (chromosom) còn có vai trò của plasmid nằm ngoài nhiễm sắc thể Có thể, thể nhiễm sắc của trực khuẩn đã chuyển một số thông tin di truyền nào đó cho plasmid vì plasmid có kích thước phân tử nhỏ hơn nó nên dễ chuyền thông tin từ tế bào này sang tế bào khác Như vậy trong cơ chế kháng thuốc của trực khuẩn lao ngoài nhiễm sắc thể, plasmid cũng đóng vai trò quan trọng [18,26,33]

Bộ gen hoàn chỉnh của Mycobacterium tuberculosis chủng H37Rv có chiều

dài 4.411.532 bp - bao gồm 3794 gen, trong đó có 3924 gen mã hóa cho protein và

50 gen mã hóa cho các RNA chức năng; đây là genome có kích thước rất lớn, đặc tính là chứa nhiều Guanine và Cystosine (G + C khoảng 65%) và không thay đổi hầu như trên toàn bộ genome (điều này khẳng định cho giả thuyết rằng hầu như không có sự chuyển gen theo chiều ngang giữa các vi khuẩn) Chỉ một số rất ít các vùng có sự chênh lệch trong tỷ lệ G+C Một nhóm các gen đáng chú ý với tỷ lệ G+C cao (>80%) duy nhất trong vi khuẩn và thuộc về họ protein PE và PPE Những nhóm có G+C thấp (<50%) là các nhóm mã hóa cho các protein xuyên màng hoặc

mã hóa sự tổng hợp polypeptide Sựkhác biệt này đối với tỷ lệ G+C thấp được giải thích là hậu quả của tính kỵ nước bắt buộc của các acid amine - là điều cần thiết đối với mọi protein xuyên màng nào được mã hóa bằng các đơn vị mã hóa có tỷ lệ G+C Bộ gen của vi khuẩn lao có chứa tới 90,8 % trình tự được dự đoán là có mã hóa cho protein và chỉ có 8 gen giả (pseudogene - gen không mang thông tin di truyền mã hóa cho protein) [22,40,41]

Trong hệ gen của phần lớn các vi khuẩn thường có nhiều operon rRNA (operon rrn) nằm gần vị trí khởi đầu tái bản Tuy nhiên hệ gen của vi khuẩn lao chỉ

có duy nhất 1 operon rrn cách vị trí khởi đầu tái bản 1,5Mb Điều này góp phần lý giải về tốc độ sinh trưởng rất chậm của vi khuẩn đặc biệt này [17,42]

Một trong những đặc tính được quan tâm nhiều nhất của Mycobacterium

tuberculosis là nghiên cứu sự có mặt và phân bố của các trình tự chèn (IS), trong đó

đặc biệt là đoạn IS6110 Thể gen của M tuberculosis H37Rv có 16 bản sao IS6110

và 6 bản sao IS1081; tuy nhiên chỉ có 95% số chủng vi khuẩn lao có chứa 4-20 bản sao IS6110 Bộ gen của Mycobacterium tuberculosis thiếu hệ thống MutS có tác dụng sửa chữa các lỗi trong bắt cặp nucleotide Tuy nhiên sự tái bản ở vi khuẩn lao lại rất chính xác do sự có mặt của gần 45 gen liên quan đến cơ chế sửa chữa DNA

bao gồm cả 3 bản sao của gen mutT mã hóa cho loại enzyme chịu trách nhiệm cho

việc loại bỏ các Guanin bị oxy hóa trong quá trình tái bản- nguyên nhân gây ra sự bắt cặp sai [28,31,32]

1.3.4 Đặc điểm sinh học và nuôi cấy vi khuẩn lao

* Đặc điểm sinh học : Ngoài hình thể bình thường, trực khuẩn lao còn có thể

tồn tại dưới thể siêu lọc (kích thước nhỏ hơn trực khuẩn bình thường 20 lần), qua được các lưới lọc có kích thước 0,2-0,5 m có thể đó là biến đổi của trực khuẩn khi gặp điều kiện không thuận lợi Cũng có thể đó là sự biến đổi của trực khuẩn khi điều trị thuốc chống lao kéo dài, là dạng thích ứng của trực khuẩn trong quá trình điều trị Một số tác giả đã nêu ra nhận xét: nếu trong đờm người bệnh có thể siêu lọc của trực khuẩn lao thì tổn thương ở phổi thường lan tràn, có nhiều nốt loét và bệnh kéo dài hơn các bệnh nhân khác [1]

Ngoài thể siêu lọc, trực khuẩn lao còn tồn tại dưới thể L Đó là các trực khuẩn lao mất một phần hoặc toàn bộ cấu trúc vỏ vi khuẩn, hạt nhân biến đổi nhìn không

rõ, bào tương thuần nhất, ít các hạt hơn trực khuẩn lao thông thường, nhìn bề ngoài trên kính hiển vi điện tử thể L có dạng hình cầu, sinh sản theo kiểu nẩy chồi, không thể nuôi cấy ở môi trường thông thường

Về mặt sinh học thể L chuyển hóa rất ít, hầu như không chịu tác dụng của các thuốc chống lao Thể L thực chất có thể là hình thức tồn tại của loại trực khuẩn lao nằm vùng dai dắng trong cơ thể, có vai trò quan trọng trong việc tái phát bệnh lao

Theo dõi hình thể L có thể sẽ giúp cho công tác điều trị, có thể dự đoán khả năng tái phát của bệnh [4,5]

Ở điều kiện tự nhiên, vi khuẩn có thể tồn tại 3 – 4 tháng Trong phòng thí nghiệm người ta có thể bảo quản vi khuẩn trong nhiều năm Trong đờm của bệnh nhân lao ở phòng tối, ẩm sau 3 tháng vi khuẩn vẫn tồn tại và giữ được độc lực Dưới ánh nắng mặt trời vi khuẩn bị chết sau 1,5 giờ Ở 42 độ C vi khuẩn ngừng phát triển và chết sau 10 phút ở 80 độC; với cồn 90 độ vi khuẩn tồn tại được ba phút, trong acid phenic 5% vi khuẩn chỉ sống được một phút

Khi phát triển vi khuẩn cần đủ oxy, vì vậy giải thích tại sao lao phổi là thể bệnh gặp nhiều nhất và số lượng vi khuẩn nhiều nhất trong các hang lao có phế quản thông.Trong điều kiện bình thường, trung bình 20 – 24 giờ/1lần, nhưng có khi hàng tháng, thậm chí “nằm vùng” ở tổn thương rất lâu (Persister), khi gặp điều kiện thuận lợi chúng có thể tái triển lại

Có những quần thể vi khuẩn phát triển mạnh, nằm ngoài tế bào (Nhóm A ): có những quần thể vi khuẩn phát triển chậm, từng đợt (Nhóm B); có những vi khuẩn nằm trong tế bào (Nhóm C) Những quần thể vi khuẩn này chịu tác dụng khác nhau tuỳ từng thuốc chống lao [28,43]

* Đặc điểm nuôi cấy vi khuẩn lao : Trực khuẩn lao là vi khuẩn ưa khí bắt

buộc, không mọc được ở điều kiện kị khí, nhiệt độ thích hợp để mọc là 370C, hầu như không mọc ở nhiệt độ dưới 370C hoặc trên 420C

Trực khuẩn lao rất hiếu khí, phát triển tốt nhất khi pO2 là 100 mmHg và pCO2

là 40 mmHg Đỉnh phổi và vùng phổi dưới xương đòn hay mắc lao nhất (pO2

120-130 mmHg khi đứng) rồi đến thân xương và đầu xương (pO2 là 100 mmHg) Gan lách, dạ dày, thực quản ít mắc lao hơn vì pO2 thấp [4]

Không nuôi được vi khuẩn lao ở môi trường thông thường, phải nuôi ở môi trường đặc biệt, giàu chất dinh dưỡng, chứa trứng, khoai tây, xitrat, glixerol, asparagin, xanh malachit Môi trường thường dùng là môi trường đặc Loewenstein được cải tiến bởi Jensen, hoặc môi trường lỏng Sauton

Trực khuẩn lao là vi khuẩn mọc chậm, thời gian một thế hệ của

Mycobacterium tuberculosis khoảng 18 giờ, phải 4-6 tuần sau mới hình thành

khuẩn lạc điển hình, dạng R Trong điều kiện tự nhiên vi khuẩn lao có thể tồn tại 3 đến 4 tháng nơi tối ẩm, trong điều kiện phòng thí nghiệm người ta có thể giữ và bảo quản chúng trong nhiều năm Tuy nhiên dưới ánh sáng mặt trời trực tiếp thì sau 30 phút vi khuẩn lao sẽ bị tiêu diệt Dưới ánh sáng của tia cực tím, vi khuẩn lao chỉ tồn tại được 2 đến 3 phút ở nhiệt độ 42o C vi khuẩn lao ngừng phát triển, ở nhiệt độ

800 C vi khuẩn lao chết sau 10 phút [4,5,47]

1.3.5 Cơ chế tác động của isoniazid và cơ chế kháng isoniazid của vi khuẩn lao

* Cơ chế tác động của isoniazid (INH) : INH là thuốc chống lao dòng 1

được sử dụng rộng rãi nhất Từ khi được tìm ra năm 1952 nó đã được coi là thuốc

cơ bản trong điều trị lao và các trường hợp nhiếm lao tiềm ẩn MTB nhạy cảm cao với INH (MIC 0,02-0,2 µg/ml) INH chỉ hoạt động chống lại vi khuẩn lao đang nhân lên mà không có tác dụng với vi khuẩn lao không nhân lên hoặc ở trong điều kiện kỵ khí

Isoniazid là một thuốc tổng hợp (hyđrrazie của acid isonicotinic ), là một chất kết tinh màu trắng, tan trong nước, cơ bản được sử dụng chủ yếu để điều trị nhiễm

các thành viên M tuberculosis complex (M tuberculosis, M bovis, M africanum

và M microti) như là tất cả mycobacteria Các chủng mẫn cảm của M tuberculosis

có MIC nhỏ hơn 0.05 mg/ml Các giả thuyết về cơ chế diệt khuẩn tập trung vào tác dụng dựa trên sự tổng hợp acid mycolic, ức chế chuyển hoá NAD dẫn tới tác động

đến chuyển hoá năng lượng và tổng hợp các phân tử lớn của vi khuẩn lao Gen katG

mã hoá cho enzyme catalase peroxidase là enzyme duy nhất chỉ có ở MTB có khả năng hoạt hoá tiền INH thành dạng hoạt động [42]

* Cơ chế kháng isoniazid của vi khuẩn lao : Cơ sở phân tử của tính kháng

với isoniazid phức tạp hơn và được gây ra bởi đa dạng đột biến trong 4 gen khác

nhau của M tuberculosis, katG mã hoá catalase peroxidase, inhA mã hoá enoyl acyl

carrier protein (ACP) reductase, kasA mã hoá cho b-ketoacyl A C P synthase và ahpC mã hoá cho alkylhydroperoxide reductase Mặc dù thế, gần 5-10% các chủng

M tuberculosis kháng isoniazid không có một đột biến có thể xác định Tính kháng

isoniazid ở mức cao có liên quan đến lâm sàng chủ yếu là do các đột biến thêm

đoạn/ mất đoạn hoặc các đột biến nhầm nghĩa/ vô nghĩa bên trong gen katG Đối

với sự đề kháng INH, đột biến trên gen katG hay gặp nhất ở vị trí 315 [12] Sự thay thế Ser315Thr xảy ra ở khoảng 30-60% chủng kháng sự thay thế này trong gen katG đã chỉ ra trực tiếp là dẫn tới tính kháng cao với isoniazid Đột biến S315T được đi kèm bởi sự mất đi vị trí enzyme giới hạn ở vị trí này Do đó đột biến nhầm nghĩa có thể được phát hiện dễ dàng bằng phân tích giới hạn các đoạn được khuếch

đại (PCR-RFLP) Sự kiện và tính lan truyền của đột biến này trong các chủng M

tuberculosis lâm sàng kháng isoniazid thay đổi đáng kể phụ thuộc vào vùng địa lý

và thành phần dân tộc của những cá nhân bị nhiễm Do đó sàng lọc sự thay đổi di

truyền này trong gen katG có thể cung cấp một phương pháp sàng lọc nhanh cho việc phát hiện các chủng lao M tuberculosis kháng isoniazid, cung cấp tính lan

rộng cao của đột biến đặc biệt có thể được thiết lập từ một vùng địa lý xác định [27]

Đột biến thay thế S315T trên gen katG cũng thường đi kèm với biểu hiện của

protein alkyl hydroperoxide reductase (ahpC) Sự biến đổi của 5 nucleotide khác đã được xác định ở vùng promoter của gen ahpC, dẫn tới bieur hiện quá mức của ahpC

và đề kháng INH [39]

Đột biến xảy ra trên gen inhA sẽ dẫn tới kháng ngay từ đầu với INH và

ethionamide (ETH) Sáu vị trí đột biến trong cấu trúc của gen inhA liên quan đến kháng INH đã được xác định là Ile16Thr, Ile21Thr, Ile21Val, Ile47Thr, Val78Ala

và Ile95Pro Tuy nhiên các đột biến này ít gặp Các nghiên cứu cũng cho thấy

khoảng 70-80% các chủng lâm sàng kháng INH có sự đột biến ở gen katG và inhA

[14]

Đột biến xảy ra trên gen kasA dẫn tới sự đề kháng yếu với INH, mà thường

gặp ở các vị trí codon 66 (GAT-AAT), codon 269 (GGT-AGT), codon 312 AGC) and codon 413 (TTC-TTA) Tuy nhiên các đột biến này cũng được tìm thấy trên các chủng nhạy cảm với INH [40]

(GGC-Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng sự kháng INH chủ yếu liên

quan đến đột biến trên gene katG INH được dùng trong liệu pháp như là một tiền

thuốc và cần phải được biến đổi để thành dạng hoạt động Catalase-peroxidase, sản phẩm của gene katG, thực hiện chức năng biến đổi này Do đó, đột biến trong gene này gián tiếp gây kháng thuốc INH Các nghiên cứu ban đầu cho thấy sự mất hoàn

toàn gene này thì hiếm, bởi vì hoạt tính peroxidase của gene katG cần thiết cho hoạt

động giải độc của vi khuẩn, cho nên những đột biến một mặt làm giảm hoạt tính catalse tuy nhiên mặt khác gene vẫn duy trì hoạt tính peroxidase Đột biến ở codon

315 AGC-ACC (Ser315Thr) được ghi nhận xuất hiện thường xuyên nhất, là một minh chứng rõ ràng sự cân bằng tốt nhất giữa mất khả năng hoạt hóa [11,24]

1.3.6 Cơ chế tác động của Rifampin và cơ chế kháng Rifampin của vi khuẩn lao

* Cơ chế tác động của Rifampin (RIF) : Rifampin được đưa vào sử dụng

trong điều trị chống lao vào đầu những năm 1970 và là một thành phần rất quan trọng trong điều trị Cơ chế tác động của RIF liên quan đến ức chế enzyme RNA polymerase phụ thuộc DNA, enzyme này là một phức oligomer bao gồm 4 tiểu đơn

vị khác nhau (α, , ’ và )và được mã hoá bởi các gen rpoA, rpoB, rpoC, rpoD)

có thể xẩy ra một trong hai dạng là core enzyme (a2bb9) và holoenzyme (a2bb9 plus s) [11,17]

RIF gắn với tiểu đơn vị b của RNA polymerase (rpoB), enzyme chịu trách

nhiệm cho sao chép và biểu hiện của các gen ở mycobacteria, kết quả là ức chế hoạt động sao chép của vi khuẩn

*Cơ chế kháng Rifampin của vi khuẩn lao : Chẩn đoán phân tử của tính

kháng rifampin là phù hợp nhất vì các nghiên cứu chỉ ra rằng tính kháng thuốc là do

đột biến ở vùng lõi của gen rpoB Các phương pháp phân tử đã được tận dụng bao gồm đọc trình tự tự động trực tiếp vùng đích đã được khuếch đại của gen rpoB

Khuếch đại vùng đích bằng PCR tiếp đó là bằng phân tích tính đa hình các sợi đơn (SSCP) và thử nghiệm có thể thương mại hoá dựa trên khuếch đại vùng đích bằng PCR sau đó lai mẫu dò thẳng với các đầu dò oligonucleotide (INNO-LiPA Rif TB kit, Innogenetics, Zwijnaarde, Belgium) Dữ liệu từ một số nghiên cứu chỉ ra rằng

khoảng 95% chủng M tuberculosis lâm sàng kháng rifampin mang các đột biến

điểm riêng biệt hoặc các đột biến thêm đoạn, mất đoạn định vị trong vùng lõi 81 bp

(vùng xác định tính kháng rifampin) của rpoB (các codon 507 đến 533) mã hoá cho

27 acid amin [12,20] Đây là mối tương quan chặt chẽ của sự thay thế acid amin đặc biệt và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Các đột biến mất nghĩa tiêu biểu

ở codon 516/ 526/531 cho kết quả kháng rifampin ở mức cao trong khi đó những sự thay đổi acid amin ở vị trí 514 hoặc 533 thường cho kết quả kháng rifampin ở mức thấp Trên 95% khả năng kháng rifampin liên quan đến các đột biến trong vùng lõi

gồm 81 bp của gene rpoB ở các vi khuẩn lao, từ codon 507 đến codon 533 với sự

thay đổi thường nhất là ở codon 516: Asp-516-Val (GAC  GTC) Tuy nhiên, các nghiên cứu cụ thể hơn được tiến hành từ các vùng khác nhau trên thế giới đã chỉ ra rằng tần số của các đột biến đặc biệt thay đổi đáng kể giữa các cộng đồng dân tộc và các vùng địa lý Tuy nhiên cơ chế kháng thuốc chưa được xác định ở gần 5% các chủng lâm sàng kháng rifampin khi không có đột biến nào được phát hiện ở vùng

lõi 81 bp hoặc ở đâu đó trong gen rpoB khi những chủng này được xác nhận tính

kháng rifampin bởi xét nghiệm tính mẫn cảm chuẩn, điều này cho thấy một phần nhỏ của các chủng kháng rifampin sẽ không được phát hiện bởi các phương pháp phân tử so với thử nghiệm tính mẫn cảm thuốc kiểu hình thông thường [21,25]

1.3.7 Cơ chế tác động của ethambutol và cơ chế kháng ethambutol của vi khuẩn lao

* Cơ chế tác động của ethambutol (EMB) : Ethambutol (một chất có cấu

trúc tương tự arabinose) là một thuốc chống lao cơ bản cũng ức chế sự kết hợp của acid mycolic với thành tế bào mycobacteria EMB là một thuốc kìm khuẩn chỉ có tác động lên quá trình phát triển của vi khuẩn mà không có hiệu lực lên quá trình sao chép EMB can thiệp lên qua trình sinh tổng hợp arabinogalactan tế bào Nó ức chế trùng hợp arabinan từ arabinogalactan và lipoarabinomannan ở thành tế bào và gây ra tích luỹ D-arabinofuranosyl-P-decaprenol, một trung gian trong quá trình sinh tổng hợp arabinan [12,18]

* Cơ chế kháng ethambutol của vi khuẩn lao :Các nghiên cứu di truyền và

hoá sinh chỉ ra rằng tính kháng với ethambutol liên quan với đột biến trong gen

embB[33], một trong 3 gen được mã hoá bởi operon embCAB Gen embB mã hoá

một arabinosyl transferase, một protein màng trọn vẹn với 12 domain xuyên màng

bị ức chế bởi thuốc Phân tích trình tự DNA của gen embB từ các chủng kháng ethambutol chỉ ra rằng vùng xác định kháng EMB (ERDR) ở embB được định vị

trong vòng tế bào chất của domain xuyên màng Gần 50 đến 70% các chủng kháng

ethambutol chứa các đột biến mất nghĩa bên trong ERDR của gen embB với phần

lớn chủng mang các thay đổi ở codon 306 Các nghiên cứu khác nhau dã xác định được 5 vị trí đột biến ở codon 306 (ATG →GTG/CTG/ATA/ATC/ATT)) dẫn tới sự thay thế 3 axit amin (Val, Leu and Ile) của các chủng kháng EMB [43,44] Các đột biến này chiếm 70- 90% ở các chủng kháng EMB [39,32] Tuy nhiên cũng có khoảng 30% số chủng có kiểu hình đề kháng EMB mà vẫn không xác định được đột

biến trên gen emb Tại nghiên cứu này chúng tôi tập trung vào xác định 2 loại đột biến kháng thuốc tại gen emb là ATG→ GTG(Met306Val) và ATG→

ATA(Met306Ile) là hai đột biến có nghĩa và thường gặp khi vi khuẩn lao kháng Ethambutol [44]

1.4 Các phương pháp xác định lao kháng thuốc

Phát hiện sớm tính kháng thuốc chính là một trong những ưu tiên trong chương trình kiểm soát bệnh lao Nó cho phép bắt đầu điều trị thích hợp ở những bệnh nhân cũng như giám sát kháng thuốc Phát hiện kháng thuốc bằng phương pháp truyền thống đã được thực hiện dựa trên phát hiện sự phát triển của M

tuberculosis với sự có mặt của các kháng sinh Tuy nhiên, do các nhược điểm của

các phương pháp này mà hầu hết là do mất nhiều thời gian để có được kết quả, trong những năm gần đây, công nghệ mới và cách tiếp cận đã được đề xuất Chúng bao gồm cả hai phương pháp kiểu hình và kiểu gen

Phương pháp kiểu hình dựa trên cơ sở sự sinh trưởng của vi khuẩn lao trên môi trường chứa thuốc kháng sinh, phương pháp kiểu gen dựa trên cơ sở phát hiện đột biến liên quan đến kháng thuốc kháng sinh bằng kỹ thuật sinh học phân tử Mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm riêng nhưng cả hai đều hỗ trợ nhau trong việc chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc

Phương pháp kiểu gen có lợi thế là thời gian xác định ngắn hơn, không phải nuôi cấy, có thể thực hiện trực tiếp trong các mẫu lâm sàng, nguy cơ nhiễm sinh học thấp và có thể tự động hóa Tuy nhiên, không phải tất cả các cơ chế phân tử của sự kháng thuốc đều đã được biết đến Phương pháp kiểu hình, nói chung thực hiện đơn giản và dễ dàng tiếp cận hơn trong các labo chẩn đoán lao Phần sau đây mô tả các phương pháp kiểu hình và kiểu gen cũng như các phương pháp mới gần đây đã đề xuất để phát hiện kháng thuốc ở vi khuẩn lao

1.4.1 Phương pháp xác định kiểu hình

Nói chung phương pháp kiểu hình đánh giá dựa trên ức chế sự phát triển của

vi khuẩn lao trong điều kiện có thuốc kháng sinh để phân biệt các chủng nhạy cảm

và đề kháng Điều này là có thể thực hiện khi các chủng MTB phân lập được từ bệnh nhân chưa từng điều trị lao trước đó rất giống nhau về mức độ nhạy cảm, thể hiện như phạm vi hẹp của nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các thuốc chống lao chính [5] Định nghĩa cổ điển cho một chủng lao kháng thuốc là nó hiển thị mức độ

nhạy cảm thấp hơn đáng kể hơn so với một chủng hoang dại mà chưa được tiếp xúc với thuốc[2]

Có ba phương pháp kiểu hình truyền thống được thực hịên trên môi trường đặc: phương pháp tỷ lệ, phương pháp tỷ lệ nồng độ ức chế tối thiểu và phương pháp nồng độ tới hạn Các phương pháp cải tiến gần đây được thực hiện trên môi trường lỏng bao gồm phương pháp

Vi khuẩn lao được nuôi cấy trong môi trường có thuốc kháng sinh Mức độ kháng thuốc của vi khuẩn được đánh giá thông qua số khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy

1.4.1.1 Phương pháp truyền thống

1.4.1.1.1 Phương pháp tỷ lệ

Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất Chủng vi khuẩn lao được nuôi cấy trên môi trường có chứa chất kháng sinh và môi trường đối chứng không chứa chất kháng sinh với các nồng độ như nhau Kết quả được kiểm tra lần đầu sau

28 ngày ủ ở 37oC Nếu tỷ lệ giữa số khuẩn lạc phát triển trên môi trường chứa chất kháng sinh so với số khuẩn lạc phát triển trên môi trường kiểm chứng lớn hơn 1% (đối với INH, RIF và axit para-aminosalycilic) hoặc hơn 10% (đối với các thuốc kháng sinh khác) thì chủng đó được kết luận là kháng thuốc[5] Sau 42 ngày nuôi cấy, đếm lại số khuẩn lạc để đánh giá xem chúng có nhạy cảm với loại thuốc kháng sinh nào hay không

Nếu thử nghiệm được thực hiện trên môi trường thạch, môi trường 7H10/11 Middlebrook được sử dụng và được ủ trong khí trường có CO2 10% Kết quả được phân tích sau 21 ngày hoặc thậm chí sớm hơn nếu xuất hiện chủng đề kháng [15] Nồng độ tới hạn của các loại thuốc chính được sử dụng trong phương pháp tỷ lệ được thể hiện trong bảng sau:

Kháng sinh Löwenstein-Jensen 7H10 agar 7H11 agar

1.4.1.1.2 Phương pháp tỷ lệ nồng độ ức chế tối thiểu (Resistance ratio method)

Hai hệ thống môi trường nuôi cấy được chuẩn bị với hàm lượng kháng sinh được pha loãng giảm dần bậc hai Hệ thống thứ nhất dùng để nuôi cấy chủng vi

khuẩn lao cần kiểm tra Hệ thống thứ hai nuôi cấy chủng M tuberculosis H37Rv

đề kháng được thể hiện ở tỷ lệ MIC của chủng kiểm tra so với MIC của chủng chuẩn Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc được xác định là nồng độ kháng sinh pha loãng cao nhất trong môi trường mà số khuẩn lạc vi khuẩn lao phát triển thấp hơn 20 Nếu tỷ số giữa MIC của chủng được kiểm tra với MIC của chủng chuẩn H37Rv nhỏ hơn 2 thì kết luận chủng cần xác định là nhạy cảm với thuốc, còn nếu lớn hơn hoặc bằng 8 thì kết luận là chủng kháng lại thuốc kháng sinh [5,16,26] Thử nghiệm này cũng bị ảnh hưởng nhiều bởi nồng độ cấy truyền cũng như sự sống sót của các chủng Hơn nữa những khác biệt trong tính nhạy cảm của chủng chuẩn cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ đề kháng (RR) của các chủng kiểm tra

1.4.1.2 Phương pháp nồng độ tới hạn

Cũng sử dụng hai hệ thống nuôi cấy, hệ thống 1 là dãy ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy có chứa thuốc kháng sinh được pha loãng giảm dần bậc hai và hệ thống 2 là môi trường kiểm chứng không có thuốc kháng sinh Tính kháng thuốc của chủng được thể hiện là nồng độ thuốc pha loãng cao nhất có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn Nồng độ tới hạn trong môi trường được xác định giống như trong phương pháp tỷ lệ nhưng nồng độ được cho là tới hạn lại được xác định tùy theo mỗi phòng thí nghiệm nghiên cứu [12] Đọc kết quả sau 4 tuần/37oC hoặc 5-6 tuần nếu chưa đạt đủ mức độ sinh trưởng Nếu trên môi trường chứa thuốc kháng sinh có ít hơn 20 khuẩn lạc so với trên môi trường đối chứng thì được xác định là nhạy cảm với thuốc kháng sinh Phương pháp này cũng bị ảnh hưởng nhiều bởi sự sống sót của vi khuẩn [26]

1.4.2 Các phương pháp nuôi cấy cải tiến

Phương pháp nuôi cấy truyền thống trên môi trường thạch tốn thời gian do tốc

độ sinh trưởng chậm của các chủng vi khuẩn Vì vậy một số hệ thống nuôi cấy cải tiến đã ra đời nhằm khác phục nhược điểm này, có thể rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống còn 1-2 tuần

1.4.2.1 Phương pháp sử dụng hệ thống nuôi cấy BACTEC

Sử dụng môi trường lỏng Middlebrook 7H9 biến đổi với nguồn cacbon duy nhất là axit palmitic được đánh dấu phóng xạ 14C Trong môi trường chứa thuốc kháng sinh, chủng kháng thuốc sẽ sinh trưởng và chuyển hóa axit palmitic giải

phóng CO2 chứa 14C Sự gia tăng CO2 chứa phóng xạ 14C trong môi trường được

tự động phát hiện bằng máy BACTEC 460

Để thực hiện phương pháp này, sử dụng một lọ môi trường có chứa chất kháng sinh cần nghiên cứu và lọ kia là môi trường kiểm chứng không có thuôc kháng sinh rồi dược ủ ở 370C Nếu sử dụng 2 ống chứng được nuôi cấy với huyền dịch vi khuẩn có độ pha loãng cách nhau 100 lần, thì kết quả được xác định giống như phương pháp tỷ lệ với tỷ lệ sinh trưởng là 1%

Phương pháp này đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược Phẩm (FDA) của Hoa Kỳ (Mỹ) phê duyệt và cũng được coi là tiêu chuẩn vàng để xác định sự nhạy cảm với các thuốc chống lao dòng 1 [40]

Phương pháp có thể này rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống còn 2-4 tuần Tuy nhiên do chi phí cao trong đầu tư thiết bị và khó khăn trong xử lý chất thải phóng xạ nên việc áp dụng phương pháp này trong chẩn đoán lâm sàng còn hạn chế

1.4.2.2 Phương pháp sử dụng hệ thống nuôi cấy MGIT

Phát hiện sự có mặt của vi khuẩn lao dựa trên việc phát hiện tín hiệu huỳnh quang khi vi khuẩn sinh trưởng trên môi trưởng lỏng Middlebrook 7H9 Gắn phức hợp huỳnh quang (muối ruthenium) ở đáy ống môi trường Phức hợp này nhạy cảm với sự có mặt của O2

hòa tan trong môi trường, O2 trong môi trường có tác dụng làm mất tín hiệu hiệu huỳnh quang của muối ruthenium Lúc đầu do lượng O2

hòa tan trong môi trường lớn nên kìm chế sự phát quang của phức hợp Khi có mặt của

vi khuẩn trong môi trường, do hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn đã tiêu thụ bớt lượng O2

dẫn đến việc phát sáng của huỳnh quang Sự phát triển của vi khuẩn cũng

có thể được phát hiện bởi sự xuât hiện độ đục không đồng nhất hoặc những hạt nhỏ hay mảnh vụn trong môi trường nuôi cấy

Để thực hiện phương pháp này, sử dụng một ống nghiệm có chứa kháng sinh

và một ống đối chứng, được nuôi cấy với huyền dịch vi khuẩn và ủ ở 370C (ngày 0) Bắt đầu từ ngày thứ ba (ngày 2), các ống được kiểm soát hàng ngày với một bóng đèn tia cực tím Sự hiện diện của một chất huỳnh quang màu da cam trong ống chứa kháng sinh tại cùng thời điểm như trong ống chứng hoặc trong vòng hai ngày kể từ

ngày kiểm soát được xác định là sự đề kháng với thuốc, nếu không, được coi là nhạy cảm Thời gian đọc kết quả tối đa là 14 ngày sau nuôi cấy [13]

Hệ thống nuôi cấy MGIT đã được phê chuẩn để xác định nhanh chóng sự đề kháng của vi khuẩn với thuốc chống lao dòng 1, với kết quả tương dương như các phương pháp truyền thống trên môi trường rắn và hệ thống BACTEC-460

Hình 1.6 Các ống MGIT cho kết quả dương tính và âm tính

Hệ thống MGIT là một phương pháp thuận tiện, nhanh, tin cậy để thực hiện các thử nghiệm xác định độ nhạy cảm kháng sinh (DST) trực tiếp và gián tiếp ở những nước nghèo, đặc biệt sử dụng khá thành công như một phương pháp phát hiện trực tiếp từ các bệnh phẩm lâm sàng bị nhiễm (đờm) [41] Tuy nhiên, do chi phí cao trong đầu tư đã hạn chế việc sử dụng rộng rãi hệ thống chẩn đoán này

1.4.3 Một số phương pháp kiểu hình mới

Những nhược điểm của phương pháp kiểu hình truyền thống mất nhiều thời gian cho việc xác định, cần phải có đội ngũ xét nghiệm có kỹ năng tốt trong hầu hết các kỹ thuật, vì vậy một số phương pháp kiểu hình mới đã ra đời có thể thực hiện trên các chủng đã phân lập hoặc trực tiếp từ bệnh phẩm

1.4.3.1 Phương pháp sử dụng phage đặc hiệu

Hiện tại có hai dạng của phương pháp sử dụng phage đặc hiệu để phát hiện nhanh sự kháng thuốc của MTB, đó là sự khuếch đại phage một cách sinh học trong phân lập MTB do Wilson mô tả (Wilson 1997); và dạng thứ hai là dựa trên

mycobacteriophage phát hiện tín hiệu (Jacobs 1993) Chúng dựa trên khả năng của các chủng MTB còn sống hỗ trợ sự phát triển của mycobacteriophage lây nhiễm Các phage nội sinh không gây nhiễm bị bất hoạt bởi các hoá chất điều trị Số lượng phage nội sinh, thể hiện số MTB còn sống ban đầu, được xác định sau chu kỳ gây nhiễm, nhân lên và giải phóng ở mycobacteria phát triển nhanh chóng Trong trường hợp kháng thuốc, trực khuẩn vẫn còn sống sót và bảo vệ mycobacteriophage [13].

Thử nghiệm thương mại FastPlaque TB đã được sử dụng để phát hiện sự đề kháng với RIF ở cả chủng MTB phân lập và trực tiếp trên các bệnh phẩm lâm sàng

*Kỹ thuật sử dụng phage phát hiện tín hiệu luciferase

Chủng vi khuẩn lao được nuôi cấy trên môi trường chứa thuốc kháng sinh 2-4 ngày sau đó được lây nhiễm bởi mycobacteria phage chứa gen biểu hiện luciferase Khả năng sống sót của vi khuẩn lao trên môi trường nuôi cấy được phát hiện bằng tín hiệu luciferase trong vòng vài phút sau khi gây nhiễm Các chủng MTB nhạy cảm với INH hoặc RIF tín hiệu ánh sáng sẽ bị dập tắt, ngược lại với các chủng đề kháng, tín hiệu ánh sáng sẽ tiếp tục được hình thành Thử nghiệm này với các thuốc chống lao dòng 1 có độ tương đồng 98% so với hệ thống BACTEC TB-460 [5,13] Tuy nhiên các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, phương pháp phát hiện tính kháng thuốc bằng phage đặc hiệu trên các chủng MTB phân lập được cho phép rút ngắn thời gian chẩn đoán vì không phải nuôi cấy vi khuẩn đến khi hình thành khuẩn lạc

có thể quan sát bằng mắt thường, có độ nhạy cao nhưng độ đặc hiệu thấp và thay đổi Hiện cũng không có đủ bằng chứng đánh giá độ chính xác của thử nghiệm này trong chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc, đặc biệt là trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm đờm [13,40]

1.4.3.2 Phương pháp đo màu

Một số phương pháp đo màu đã được sử dụng trong nững năm gần đây để phát

hiện nhanh tính kháng thuốc của M tuberculosis Phương pháp này sử dụng tín hiệu

màu chỉ thị cho phản ứng oxy hóa khử để phát hiện sự sinh trưởng của vi khuẩn lao trên môi trường chứa kháng sinh Tính kháng thuốc được phát hiện bằng sự thay đổi màu sắc của chất chỉ thị màu tương ứng với số lượng vi khuẩn lao sống sót trong môi trường Các chất chỉ thị màu đã được sử dụng cho phương pháp này như alamar blue

hoặc muối tetrazolium 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide Phương pháp sử dụng chỉ thị màu có độ nhạy tương đối nhưng độ đặc hiệu thấp để phát hiện nhanh MDR-TB [35]

1.4.3.3 Phương pháp khử nitrate

Đây là một kỹ thuật rất đơn giản dựa trên khả năng M tuberculosis khử nitrate thành nitrite được phát hiện bằng cách thêm một thuốc thử hoá học vào môi trường

nuôi cấy M Tuberculosis được nuôi cấy trên môi trường Loewenstein-Jensen chứa

chất kháng sinh và khả năng khử nitrate thành nitrite được xác định sau 10 ngày nuôi cấy Các chủng kháng thuốc sẽ khử nitrate và được nhận ra bởi màu hồng đỏ trong môi trường trong khi các chủng nhạy cảm sẽ mất khả năng này do chúng bị ức chế bởi chất kháng sinh Một số nghiên cứu gần đây áp dụng phương pháp này trên mẫu bệnh phẩm đờm cho độ nhạy và độ đặc hiệu khác nhau, đặc biệt cho kết quả tốt trong phát hiện đề kháng với INH và RIF [38]

Các phương pháp này đều dựa trên nguyên lý xác định khả năng phát triển của

vi khuẩn lao trong môi trường nuôi cấy có kháng sinh từ đó đưa ra kết luận về khả năng kháng thuốc của chủng vi khuẩn lao đang nghiên cứu Nhược điểm của phương pháp này là thời gian nuôi cấy để chẩn đoán dài, ít nhất mất 2 - 4 tuần mới cho kết quả vì thế không đáp ứng được công tác điều trị và kiểm soát lao kháng thuốc

Hình 1.7 Thử nghiệm khử nitrate với các chủng nhạy và kháng thuốc

(GC: growth control)