ác định kiểu gen virus viêm gan c trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan c bằng kỹ thuật sinh học phân tử RT PCR

HCV là một virut có bộ gen là ARN, trong chu kỳ nhân đôi của virut phải sử dụng men ARN polymerase, mà men này không có khả năng sửa sai trong quá trình tổng hợp ARN, từ đó làm cho bộ ge

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Ts.Bs Nguyễn Văn Tiến

HÀ NỘI - 2012

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh viêm gan do virut C là có ảnh hưởng lớn đến tình trạng sức khỏe của con người trên toàn thế giới , bởi vì sau khi bị nhiễm virus viêm gan C cấp tính thì có khoảng 70-90% bệnh nhân chuyển từ giai đoạn cấp tính sang giai đoạn mạn tính và

có tới 20-25% trong số bệnh nhân này sẽ chuyển qua giai đoạn xơ gan và ung thư gan [17,33,36] Theo tổ chức y tế thế giới có khoảng 170 triệu người nhiễm virut viêm gan C (HCV), tương ứng với khoảng 2-3% tổng dân số toàn thế giới [14,26].Theo ghi nhận về tình hình nhiễm virut viêm gan C ở Việt Nam thì tỉ lệ người bình thường bị nhiễm căn bệnh này là khoảng 6% [42], xem như là thuộc nhóm các quốc gia có tỉ lệ nhiễm viêm gan C cao trên thế giới [13,42]

HCV là một virut có bộ gen là ARN, trong chu kỳ nhân đôi của virut phải sử dụng men ARN polymerase, mà men này không có khả năng sửa sai trong quá trình tổng hợp ARN, từ đó làm cho bộ gen của virus rất đa dạng nên người ta đã phân virus thành nhiều loại (type) khác nhau[7,50] và con đường lây nhiễm chủ yếu của HCV là qua đường máu Sau khi xác định được người dương tính với anti-HCV, Bác sĩ trước khi cho chỉ đinh điều trị phải làm xét nghiệm hai yếu tố quan trọng có vai trò tiên lượng cho thành công cũng như thời gian điều trị cần thiết là định lượng

số lượng siêu vi trong máu (HCV-ARN) và định kiểu gen của siêu vi gây viêm gan

C (HCV Genotypes) [1,37] Kiểu gen HCV phân bố khác nhau tùy theo vùng địa lý, mỗi châu lục hay mỗi nước có những kiểu gen nổi trội riêng [41,43] Hiện nay trên thế giới đã biết được 6 loại genotypes và khoảng hơn 50 subtype (dưới type)[3,7], ở Việt Nam phổ biến genotypes 1,2, và 6, kiểu genotype 3 hiếm gặp [1,50]

Để xác định được genotypes HCV thì ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, đặc biệt là chuyên ngành công nghệ sinh học phân tử đã phát minh nhiều

kỹ thuật để xác định kiểu gen HCV Trên thế giới có nhiều công ty: Bayer, Beckman Coulter, QIAgen, Roche… đã cho ra đời các bộ kit xác định genotypes HCV với độ chính xác cao Tuy nhiên, giá thành của những bộ kit này còn cao nên chưa được áp dụng rộng rãi Ở Việt Nam phổ biến hai kỹ thuật xác định genotypes

HCV: Real-time PCR (RT-PCR) và kỹ thuật giải trình tự gen (sequencing) Kỹ thuật Sequencing trong chuẩn đoán có nhiều tính ưu việt trong việc xác định kiểu gen là sự chính xác cao, tránh được những nhầm lẫn trên cùng một type hoặc subtype nhưng phương pháp này cần có các máy móc trang thiết bị hiện đại và điều kiện kỹ thuật cao nên gía thành cao chủ yếu được thực hiện tại các trung tâm nghiên cứu Kỹ thuật RT-PCR được tiến hành ở tất cả các phòng thí nghiệm PCR do dễ thực hiện không đòi hỏi máy móc trang thiết bị và kỹ thuật cao, giá thành rẻ phù hợp với điều kiện kinh tế của đa số người dân ở Việt Nam,tuy nhiên không xác định được đến subtype và có sự nhầm lẫn giữa type1 và type6 Với mục đích khuyến cáo bệnh nhân lựa chọn đúng phương pháp xác định genotype, vì vậy tôi chọn đề tài:

“Xác định kiểu gen virus viêm gan C trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan C bằng kỹ thuật sinh học phân tử RT-PCR”, với những mục tiêu như sau :

1) Xác định tỉ lệ người mang kiểu gen HCV bằng phương pháp RT-PCR sử dụng Taqman probe

2) Xác định lại kiểu gen Type 1 bằng phương pháp giải trình tự gen (Sequencing) trên đoạn gen NS5B.

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm sinh học virut viêm gan C (HCV)

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu và phân loại

Vào năm 1970, Harvey J.Alter Trưởng khoa nhiễm trùng của bộ phận truyền máu Viện Quốc gia Sức khỏe Hoa Kỳ chứng minh là nhiễm virut sau truyền máu phần lớn là do virut viêm gan không phải là A và cũng không phải là B và được đặt tên là virut không A-không B.Mười bảy năm sau (năm 1987) Michael Houghton, Qui-lim Choo và tập đoàn, Gorge K dung sinh học phân tử định clon để định tính virus không A không B , năm 1989 đã xác định virut không A không B có tên chính thức là virut viêm gan C và được công bố bằng 2 bài trên báo Science[7]

Virus viêm gan C ( Hepatitis C virus - HCV) thuộc nhóm IV (+ssARN) virus ARN Họ Flaviridae, cùng họ với virus Dengue, Flavivirus West Nile, virus tiêu chảy ở bò ( Bovine viral diarrhea - BVDV) Thuộc loài Hepacivirus[4,8,9]

Virut Viêm gan C hiện nay được xem là nguyên nhân phổ biến nhất gây bệnh viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư gan nguyên phát [6,12]

1.1.2 Hình thái cấu trúc virut viêm gan C

Virut viêm gan C là loại virut hướng gan dưới kính hiển vi điện tử người phát hiện HCV có hình cầu, hình đa diện hoặc hình que kích thước nhỏ (Hình 1.1)

Hình 1.1 Hình thái của HCV dưới kính hiển vi điện tử

Về cấu trúc của virut viêm gan C bao gồm lõi ARN, nhân core, gai glycoprotein

tin (mARN) truyền đạt thông tin di truyền cho protein của virut [17,40,47]

Tổ chức Genome của HCV được chia làm hai vùng

Vùng cấu trúc mã hóa cho các protein cấu trúc gồm:

- Gen C mã hóa cho protein nuclecapsit p22 làm nhiệm vụ gắn với ARN để tạo nuclecapsit

- Gen E1 mã hóa cho glycoprotein vỏ ngoài p33

- Gen E2 mã hóa cho protein vỏ ngoài gp 70

Vùng không cấu trúc mã hóa cho các protein không cấu trúc bao gồm:

- Gen NS2 mã hóa cho protein gắn vào màng (p23)

- Gen NS3 mã hóa cho proteaza và helicaza (p72)

- Gen NS4 được chia thành NS4A mã hóa cho protein p10 và NS4B mã hóa cho protein p27

- Gen NS5 được chia thành NS5a mã hóa cho replicaza và NS5b mã hóa cho ARN-Polymeraza phụ thuộc ARN cần cho quá trình sao chép

Phân tử ARN dạng mạch thẳng có chứa một đơn khung mở (ORF- open reading frame), mã hóa cho một tiền chuỗi protein với chiều dài khoảng 3000 gốc amino axit (Hình 1.3) Trong quá trình virrut sao chép chuỗi protein này sẽ được kích hoạt bởi enzyme virut giống như tế bào chủ trong ba protein cấu trúc (gồm nhân lõi-core, E1,E2) và bảy protein không cấu trúc (bao gồm: p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B)[31] Một protein khác (kí hiệu F-Temed) hoặc ARF (khung đọc thay thế) được dự đoán là kết quả của khung đọc thay thế riboxome trong quá trình sao chép cùng với vùng nhân của hệ gen ARN[39,43,46]

Cấu trúc Không cấu trúc

Tổng hợp chuỗi polyprotein

Protein

Core Glycoprotein vỏ Protease Proteaza và helicaza Replica và ARN-polymerase

Hình 1.3: Tổ chức genome HCV

Các gen cấu trúc mã hóa cho lõi protein của virut và protein vỏ của virut là E1,E2 được đặt ở phần đuôi 5’ của khung đọc mở theo chiều ngược bởi vùng mã hóa cho các protein phi cấu trúc p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B (Hình 1.3) Các protein cấu trúc là hợp phần quan trọng của virut viêm gan C, do đó các protein phi cấu trúc sẽ không có sự gắn kết với virut xong lại cùng nằm trong quá trình sao chép ARN và morphogenesis virut [50]

ORF (Open reading frame) được cố định ở các vùng không bị mã hóa là vùng 5’

và vùng 3’ (NCRs- Noncoding regions) bao gồm các chuỗi nucleotit có liên quan đến sự điều chỉnh quá trình sao chép của virut Tất cả các NCR đều có chứa các vùng miền bảo tồn cao so với các vùng protein mã hóa của genome HCV

Mức độ chuyển hóa cao của các NCRs làm cho chúng thành mục tiêu nghiên cứu:

+ Nâng cao chất lượng việc chẩn đoán phân tử

+ Nghiên cứu cho việc điều trị kháng virut

+ Nghiên cứu kháng sinh chống HCV

Phần 5’ NCR có khoảng 341 nucleotit và nó có một cấu trúc phức thứ hai với bốn vùng khác nhau (I-IV) [30], 125 nucleotit đầu tiên của 5’ NCR được phân ba đều ra các vùng I và II là phần cơ bản của quá trình sao chép ARN trong virut [ 21,52] Các vùng (II-IV) thiết lập một tâm đầu vào của ribosome bên trong (IRES) bao gồm ribosome liên kết và độc lập khởi động cho quá trình sao chép tương ứng[7,52]

Chuỗi 3’ NCR có chứa ba vùng chức năng khác nhau: một vùng có thể thay đổi, một chuỗi U/UC có chiều dài thay đổi và đuôi X đã chuyển đổi ở mức độ cao tại đuôi 3’ của hệ gen HCV, vùng thay đổi có chứa khoảng 40 nucleotit và không quan trọng đối với quá trình sao chép ARN Tuy nhiên nếu bỏ đi chuỗi này có thể dẫn đến việc giảm sút đáng kể hiệu quả của quá trình sao chép[21] Chiều dài của chuỗi vùng U/UC thay đổi theo các chuỗi HCV khác nhau và nằm trong khoảng từ

30- 80 nucleotit [35] Chiều dài nhỏ nhất trong vùng này đối với quá trình sao chép ARN được cho là có chứa 26 nucleotit homouridine trong môi trường tế bào [22,49] Đuôi X với mức chuyển hóa cao có khoảng 98 nucleotit có chứa ba stem-loops (SL1-SL3) [23] và quá trình tiêu hủy hoặc thay thế nucleotit trong các vùng này thường không gây tử vong [23] Một cách gọi tên khác của quá trình tương tác giữa đuôi 3’ X và SL2 là “ kissing-loop” và một phần phức hợp của vùng

mã hóa NS5B đã được mô tả [23,35] Sự tương tác này bao gồm một cấu trúc ARN tertiary của genome HCV, đây chính là phần quan trọng của quá trình sao chép HCV trong hệ thống môi trường tế bào [23,49] Cuối cùng cả NCRs đều xuất hiện

để làm việc cùng với sự tương tác ARN-ARN theo chiều dài có thể sẽ hình thành một vòng tuần hoàn gen tạm thời [46]

1.1.4 Gen và Protein

Như đã mô tả ở phần trên, quá trình chuyển hóa của chuỗi protein HCV là được khởi động thông qua sự tương tác của một số phần trong NCRs của hệ genome HCV ARN Chuỗi protein là sản phẩm có chứa 10 protein sẽ đồng thời chuyển hóa hoặc chuyển hóa bước đầu được kích hoạt từ chuỗi protein Các protein đuôi N như

C, E1, E2 và p7 đều được kích hoạt bởi một tín hiệu peptit trong tế bào (SP)[15,20] Lõi tiền protein được tạo ra vẫn có chứa tần số tín hiệu E1 tại đuôi C của nó Tiếp theo sẽ kích hoạt tần số tín hiệu này bằng một tín hiệu peptit là peptidase (SPP) dẫn đến việc hình thành lõi protein hoàn chỉnh [15,20]

Các protein phi cấu trúc NS2 đến NS5B của chuỗi protein HCV là đều kích hoạt bởi hai protease có virut mã hóa ( NS2-NS3 và NS3) với protease NS2-NS3 cysteine được kích hoạt tại chỗ ghép nối NS2-NS3 và protease NS3 serine được kích hoạt bởi các protein duy trì chức năng [17,51]

Các vị trí tiếp theo của nucleotit virut và gốc amino axit theo HCV chuỗi H77 kiểu gen 1a, được tiếp nhận theo số NC_004102 Một số thông số đặc trưng cho các protein HCV được tập hợp trong bảng dưới đây

Bảng 1.1: Tổng quan về kích thước của protein HCV Protein Số aa Vị trí aa trong chuỗi Trọng lượng protein

Core: protein core HCV có độ pH kiềm cao là một protein gắn ARN tạo ra

nucleocapsid của HCV Protein core đã được báo cáo tương tác với nhiều loại protein của tế bào tác động đến chức năng của nhiều protein của tế bào và chức năng của tế bào túc chủ như gen dịch mã, chuyển hóa lipid, chết theo chương trình

và khá nhiều tín hiệu dẫn đường Ngoài ra protein core mồi dẫn gan hóa mỡ và ung thư gan ( UTG)[51,52]

E1 và E2: là protein type I xuyên màng và có đoạn cuối C ái nước làm neo

Được chuyển vị đến ruột của ergoplasme và được glycosyl hóa tại đấy Do kết nối rất mạnh với N liên kết glycosyl hóa E1,E2 tạo thành non-covalent heterodimer đã cho là tạo thành vỏ của HCV Quá trình đóng gói các phần tử của HCV và trồi ra chưa được hiểu thấu đáo nên cần nghiên cứu có hệ thống vấn đề này[15,20,48]

F-Protein, ARFP: Tổng hợp protein này là do một khung đọc mở thay thế

trong nội tại gen core Được đặt tên là khung protein đọc mở thay thế ( ARFP ) hay

là khung F ( F frame shift ) có 160 amino acid ARFP hay F là cần thiết cho ARN-HCV tăng sinh Được thể hiện trong diễn biến tự nhiên như thế nào khi nhiễm HCV cần làm sáng tỏ [7,46]

Protein P7: P7 là một polypeptide có 60 amino acid, nằm tại vị trí giao nhau

của gen cấu trúc và gen không cấu trúc Chưa biết chắc chắn là P7 có được đóng gói

không với các phần tử khác của HCV, P7 gồm 2 vùng để tạo thành hexamer là kênh cho các ion hoạt động, có thể cho rằng P7 có vai trò quan trọng trong đóng gói vì một protein như vậy của virus gây tiêu chảy ở Bò ( BVDV- bonine diarrhea virus)

đã chứng minh là rất cần thiết để sản sinh virus-progeny nhưng không thể để cho tăng sinh ARN virus [28]

Protein tự tiêu NS2-3 ( autoprotease): kết nối NS2/3 bị tách bởi autoprotease

để có NS2 và đoạn cuối N thứ ba của NS3 Mặc dù hoạt tính protease của NS2-3 cho genome HCV tăng sinh trong chu kỳ sinh trưởng nội bào cũng như trong in vitro cho subgenomic replicon nhưng cũng cần để biết NS2 còn có chức năng nào khác sau khi tách rời NS3[7,48,51]

Protein NS3-4A-NS3: là protein đa chức năng có chứa một serin protease tại

phần ba đoạn N-cuối chịu trách nhiệm dòng xuôi tách biệt ở vùng không cấu trúc là một NTPase/ARN vùng helicase hai phần ba của C tận cùng

NS4A :là 154 polyamino acid tác động đến NS3 tại tế bào nội màng và cần như

một đồng yếu tố cho NS3 serin protease Cấu trúc tinh thể của phức hợp đã cho thấy NS3-4A là thành phần tích hợp của enzyme nhân Đáng ngạc nhiên NS3 seri protease có ảnh hưởng tới sự đề kháng miễn dịch tế bào tự nhiên của túc chủ bởi đã

ức chế tín hiệu RIG-1 và TLR Nhận xét này sẽ rất hấp dẫn NS3 có thể là hướng cho thuốc chống HCV Chất ức chế serin protease đã nổi lên là thành phần cực kỳ

có hiệu quả và trở thành nguyên lý hàng đầu để nghiên cứu điều trị bệnh nhân HCV mạn tính Tác dụng men hoạt tính của NS3NTP-ase /helicase là rất cần thiết cho ARN-HCV tăng sinh Đích của chức năng trong quá trình sinh trưởng có thể là không xoắn 2 vòng tăng sinh, ARN trung gian làm loại trừ ARN cấu trúc thứ phát hay là tách rời genome với protein gắn kết Những tiến bộ về hiểu biết cơ chế phân

tử của enzyme này có thể là một chiến lược mơi về thuốc ức chế HCV

NS4B : Do tính chất rất ái nước nên NS4B là thành phần HCV rất khó nghiên

cứu và hiểu biết chưa nhiều, cho đến nay được biết NS4B với 27-kDa là thành phần

tích hợp với protein màng khu trú tại ergoplasme xuất xứ từ thành phần riêng lẻ của màng Đáng chú ý biểu hiện của NS4B sẽ mồi dẫn tổn thương màng đặc hiệu được đặt tên là web-màng tác dụng như một giàn giáo để tạo thành cấu tạo phức hợp tăng sinh HCV

NS5A :là kẽm phosphoryl hóa protein kim loại chức năng chưa biết, mặc dù đã

có nhiều tài liệu nói về chức năng có thể có của NS5A cũng như một danh mục khổng lồ về tương tác với các yếu tố khác của NS5A nên chức phận của NS5A lại không rõ ràng Khởi đầu thì rất hấp dẫn vì NS5A có tiềm năng điều hòa đáp ứng interferon, tuy kết quả nghiên cứu còn trái ngược nhau Một nhận xét nổi bật là trên replicon thích ứng của nuôi cấy tế bào thấy độ tập trung đột biến cao trong phần trung tâm của NS5A, hiện tượng trên chỉ ra rằng NS5A có tác động hiệu quả trên điều hòa tăng sinh của HCV Yếu tố liên kết màng của NS5A được làm trung gian bởi một amphipathic alpha helix khu trú tại N-đoạn cuối, tuy ít thực nghiệm về tiêu hủy protein mới đây nhưng cũng cho phép định nghĩa ba vùng protein tại domain cytosolic Gần đây nhất cấu trúc ba chiều của đoạn N- cuối domain 1 cũng được giải quyết bằng chụp hình Sau khi dimer hóa cấu trúc này tạo ra basic groove đối diện với cytosol tại bề mặt màng tế bào Cấu trúc kiểu claw like được cho rằng

đã cung cấp chỗ cho ARN gắn kết và vì vậy đã tham dự vào việc điều hòa đích của genome ngay trong phức hợp sinh trưởng HCV [7,48,51]

NS5B: Chìa khóa của replicase khởi hoạt tổng hợp genome ARN mới là NS5B

ARN- phụ thuộc ARN polymerase (RdRp) NS5B là kích thước đo theo mấu của protein neo màng (tail-anchored protein) có đặc trưng bởi domain xuyên màng tại C- đoạn cuối của protein chịu trách nhiệm tác động hậu dịch mã màng Cấu trúc của NS5B là điển hình cấu tạo polymerase dáng hình bàn tay phải với dưới vùng ngón tay, mu bàn tay, ngón tay cái bao bọc thành vòng tròn nơi có hoạt tính cao Quá trình tăng sinh thông qua tổng hợp một vòng ARN bổ sung mang dấu (-) sử dụng genome như là một khuôn mẫu và hậu quả của tổng hợp được ARN (+) từ ARN(-)

trung gian Tác động như là thành phần trung tâm của tăng sinh NS5B nổi lên như

là một đích chính để làm thuốc mới có hiệu quả

1.1.5 Vòng đời của virut viêm gan C

Chưa biết đầy đủ vòng đời của HCV vì chưa có môi trường nuôi cấy HCV in vitro để thể hiện vòng đời và sinh trưởng của HCV Nhưng vì hình thành hệ thống replicon đã như một cuộc cách mạng giúp tìm hiểu sinh trưởng vòng đời của HCV

Hình 1.4 : Mô hình hiện tại vòng đời và sinh trưởng HCV [51]

(1:Sự hấp phụ bề mặt tế bào gan nhờ đồng tiếp nhận 2: Xâm nhập nội tế bào 3: Sự dung hợp với àng lipit tế bào gan 4: Phá bỏ lớp vỏ ngoài giải phóng ARN (+) 5: Dịch mã và sao chép ARN nhờ Web màng 6: Tập hợp

và đóng gói 7: Tạo virut hoàn chỉnh 8: Sự phóng thích ra khỏi tế bào gan)

Mô hình thay thế nghiên cứu bước xâm nhập đầu tiên bao gồm kiểu nhiễm virus sao chép ngược kiểu giả type ( infectious retroviral pseudotype) đã làm rõ vai trò chức năng của glycoprotein HCV:

Bước 1: xâm nhập kiểu nội nhập tế bào trong môi trường phụ thuộc pH thấp và cũng chưa biết yếu tố nào là khuôn cho virion thâm nhập, tuy cũng xác định được các yếu tố tham gia, pH thấp, và hòa màng nội nhập tế bào gan và đầu tiếp nhận trên

tế bào gan là bước khởi đầu[11,32]

HCV E2 có ái lực mạnh với vòng ngoài rộng của CD81, một tetrspaspamin có trên mặt nhiều loại các tế bào kể cả các tế bào gan và có thêm các đồng tiếp nhận lớp B type 1 SR-B1 ( tế bào dọn rác – scavenger cell) và CLDN1 ( the tight junction

claudin -1 ) (Hình 1.5) [7,16]

Ngoài ra lipoprotein tỷ trọng thấp ( low density lipoprotein) cũng được xem là một dạng đầu tiếp nhận quan trọng và được xác định giá trị do nghiên cứu với sự hiện diện của thành phần huyết thanh người Đặc biệt là lipoprotein tỷ trọng cao kết hợp làm cho SR-B1 tăng độ hướng dẫn và thâm nhập HCV vào tế bào gan và còn

bảo vệ chống kháng thể trung hòa của cơ thể [7,34]

Bước 2: giải phóng sợi ARN (+) tác dụng như một m-ARN và có 2 vùng NCR3’

và 5’ vùng không mã hóa là vùng bảo tồn cao trong các chủng HCV được phân lập

và có chứa IRSE ( internal ribosome entry site) IRES gắn trực tiếp với riboxom 40S và được coi là yếu tố tiền khởi động cần thiết cho cap-dependent dịch mã Cấu trúc ba chiều HCV IRES gắn với 40S ribosomal subunit minh họa cơ sở phân tử để dịch mã tạo ra polyprotein bằng bộ máy dịch mã của tế bào [7,46]

Bước 3: xâm nhập ergoplasme và polyprotein tự cắt đoạn để sinh 3 protein cấu trúc C,E1,E2 và 7 protein không cấu trúc NS; đặc biệt tạo ra ARN (-) làm khuôn mẫu để HCV sinh trưởng tạo lại ARN sợi (+), tại 1 thời điểm nào đó genome HCV thay chức phận trở thành phức hợp sinh trưởng liên quan đến màng (membrane associated replication complex)[7]

Bước 4: đóng gói và xuất ra ngoài

Mọi việc của quá trình đều trong nguyên sinh chất không liên quan đến nhân tế bào gan như HBV

Như tất cả virus ARN (+) đã nghiên cứu từ trước đến nay HCV tạo ra một phức hợp màng liên kết bao gồm protein virut,yếu tố tổn thương màng, và những thành tố của tế bào túc chủ Yếu tố tổn thương màng đặc hiệu được coi như là một web màng, đã được xác định là nơi ARN tăng sinh trên tế bào Huh-7 chứa subgenomic HCV replicon

Hình 1.5 : Các đầu đồng tiếp nhận HCV[29]

Một khi đã vào trong tế bào gan và chỉ trong nguyên sinh chất tế bào gan chu kỳ sinh trưởng của HCV mới khởi động dựa chủ yếu vào bộ máy của nội tế bào để hoàn thành chu kỳ sinh trưởng đặc hiệu nhất genome HCV dịch mã để tạo ra một protein đơn độc có khoảng 3011 amino acid gọi là chất đa protein Chất đa protein tiếp theo quá trình tự phân hủy bởi protease của virus và tế bào gan để tạo ra 3 protein cấu trúc có liên quan đến virion và 7 protein không cấu trúc

Một khung nhóm có thể xuất hiện tại vùng nhân (core) để sản xuất ra khung đọc

mở thay thế protein ( ARFP) HCV mã hóa hai protease NS2 cystein tự tiêu protein

và NS3-4A serin protease NS protein tuyển chọn genome HCV vào trong một phức hợp ARN sinh trưởng gắn với săp xếp lại màng nguyên sinh chất theo Olaf Isken tuyển chọn là do cái gọi là NF/NFAR protein đặt tên là NF90/NFAR-1 can thiệp vào quá trình tăng trưởng của ARN-HCV

1.2 Genotype HCV

HCV là một virus có bộ gen là ARN, trong chu kỳ nhân đôi của virus phải sử dụng men RNA polymerase, mà men này không có khả năng sửa sai trong quá trình tổng hợp ARN, từ đó làm cho bộ gen của virus rất đa dạng nên người ta đã phân virus thành nhiều loại (type) khác nhau[7,50]

Tiến hành so sánh đối chiếu chuỗi nucleotit của các chủng virut thu nhận được

từ các bệnh nhân nhiễm bệnh với các nhóm bệnh khác nhau của quá trình lây nhiễm tại các vùng miền địa lý khác nhau người ta đã phát hiện thấy sự tồn tại của ít nhất

là 06 nhóm gen chính bao gồm type 1, type 2,type 3 type 4,type 5 và type 6[12,39] Khi tính toán mức trung bình trên toàn bộ genome hoàn chỉnh, khi đó sự khác biệt

về các tâm nucleotit là 30- 35% với sự biến đổi nhỏ trong các vùng xác định như là glycoprotein E1 và E2 mà tại đó chuỗi của gen nhân và một số gen không có cấu trúc như NS3 thì có sự bảo toàn cao hơn Khả năng khác nhau của các chuỗi ở mức thấp nhất giữa các genotype được phát hiện thấy trong 5’ NCR, tại đó chuỗi riêng lẻ

và cấu trúc ARN thứ cấp là cần thiết cho quá trình sao chép và chức năng chuyển hóa[44,47]

Mặc dù có sự đa dạng về các chuỗi HCV, tất cả trình tự bổ sung và kích thước trên đoạn gen là có sự đồng nhất Tuy nhiên trái ngược với quan sát chung là sự biến đổi của chuỗi trình tự mã hóa ở cả hai vị trí khung đọc và kích thước của protein là không có sự bảo tồn cao với kiểu gen Điều này trái ngược với tính chất bảo tồn tiến hóa của rất nhiều bản sao HCV, đồng ý với ý kiến này cho rằng có khả năng gen này là sản phẩm sinh ra từ sự nhân đôi của ARN có sự biến đổi codon thứ

ba của gen lõi[42,44]

Hình 1.6 : Sự phân bố của các kiểu gen [44]

Mỗi nhóm gen trong bộ 06 nhóm gen quan trọng nhất của HCV đều có chứa một chuỗi các subtype có liên quan chặt chẽ với nhau Trong đó, sự khác biệt của mỗi subtype vào khoảng 20- 25% về chuỗi nucleotit, với genotype con số này là

>30% Một số genotype như 1a,1b, và 3a có sự phân bố rộng hơn cả, điều này có thể là kết quả của quá trình truyền máu và dùng chung kim tiêm giữa những người

sử dụng ma túy trong vòng 30-70 năm qua và bây giờ phần lớn là phân bố ở các nước phương tây (Hình 1.6 ).(Đây là những kiểu gen được gặp phổ biến nhất trong các thử nghiệm lâm sàng và thông tin mới nhất đã được thu thập trên các phản ứng với interferon (INF) và các phương pháp điều trị virus khác) Trong đó 1a phân bố toàn thế giới, 1b phân bố nhiều ở Châu Âu và Bắc Mỹ, type 2 phân bố địa trung hải

và Trung Đông, type 3 chủ yếu ở Châu Âu, type 4 phân bố ở trung đông, type 5 ở Nam Phi, type 6 ở Hồng Kông và Việt Nam [42,44]

Kiểu gen 1a được phân bố rộng rãi ở bắc Âu và Mỹ, các nước có nền công

ở Nam Phi

Type 6a tìm thấy ở Việt Nam, các

khu công nghiệp ở Hồng Kông và

gần đây tìm thấy ở Autralia

Kiểu gen 3a được phân bố ở các khu

vực công nghiệp hóa ở Châu Âu

Kiểu gen 2 [2a,2b,2c] tìm thấy

chủ yếu ở các nước vùng Địa

Trung Hải và viễn Đông

Một mô hình khác về tính đa dạng của chuỗi được quan sát thấy trong khu vực châu Phi và Đông Nam Á, Ở đây có những kiểu gen gần gũi và khu vực địa lý cụ thể Ví dụ, sự lây nhiễm HCV ở miền tây Châu Phi là do genotype 2, trong khi những người ở Trung Phi, chẳng hạn như Cộng hòa Dân chủ Congo và Gabon, lại

có sự lưu hành của kiểu gen 1 và 4,còn kiểu gen 6 sự lưu hành ở khu vực Đông Á là phổ biến Phân tích ở mức độ phân tử cho thấy rằng sự có mặt của các kiểu gen này

có thời gian lưu hành tại các khu vực địa lý tương ứng ít nhất vài thế kỷ [42,44] Kiểu gen 6 là một ví dụ nổi bật của sự đa dạng HCV trong vùng lưu hành Thật vậy, kiểu gen HCV được phân lập đầu tiên từ Đông Á rất khác nhau mà ban đầu các nhà nghiên cứu phân loại là kiểu gen 7,8,9 và 11[42] Những chủng này khi được phân loại như là phân nhóm của kiểu gen 6 Lây nhiễm kiểu gen 6 là một con số đáng kể trong vùng dịch tễ: tổ chức WHO xác định có 62 triệu người bị nhiễm trong khu vực Tây Thái Bình Dương, chiếm 1/3 lây nhiễm các kiểu gen trên toàn thế giới [42] Kiểu gen 6 phân lập đã thu được từ các cư dân của Thái Lan, Ấn Độ, Campuchia, Lào, Myanmar, Việt Nam, Trung Quốc, Hồng Kông và Indonesia [42,44] Sự lưu hành của HCV trong cộng đồng có sự thay đổi giữa các nước Đông

Á, từ khoảng 0,5% tại Singapore và Hồng Kông, khoảng 6% tại Việt Nam và Thái Lan [42] và vượt quá 10% tại Myanma, tỷ lệ báo cáo tại Trung Quốc là khoảng 2-3% xấp xỉ khoảng 30 triệu người [42] Tất nhiên,không phải nhiễm HCV ở Đông Á

là do kiểu gen 6 và sự phân bố kiểu gen HCV có thể thay đổi giữa các nước trong khu vực Đông Á

Các genotype của HCV có sự khác nhau về độc lực, khẳ năng gây bệnh và khả năng đáp ứng điều trị bằng interferon (genotype 1 đáp ứng thấp hơn các genotype khác: 18,1% so với 54,9%)[2]

Hậu quả về tính đa dạng gen của HCV:

+Làm virut có khả năng né tránh đáp ứng miễn dịch của vật chủ dẫn đến tỉ lệ nhiễm HCV mạn cao (>80%)

+ Sau khi khỏi bệnh, cơ thể không có miễn dịch bảo vệ và vẫn có nguy cơ bị tái nhiễm

+ Việc nghiên cứu sản xuất vacin phòng bệnh rất khó khăn hiện chưa có vacin (do thiếu hệ thống nuôi cấy tế bào thích hợp, do HCV đột biến gen tạo ra chủng virut mới)

1.3 Bệnh học viêm gan virut C

1.3.1 Dịch tễ học

HCV lây truyền bằng sự tiếp xúc trực tiếp qua máu Đường truyền bệnh bao gồm việc dùng chung các vật dụng ma túy như kim chích, dây cầm máu, ống hút, ống píp,vv… Kim dùng xăm mình, xỏ da và châm cứu cũng có thể truyền HCV, dùng chung các vật dụng cá nhân như dao cạo, bàn chải đánh răng hay dũa móng tay tuy ít nguy cơ nhưng vẫn có thể làm lây nhiễm bệnh

Trước năm 1992, nhiều người đã bị nhiễm HCV qua máu hoặc do nhận máu của người khác Đến năm 1992, cách thử máu đáng tin cậy để xác định kháng thể HCV được sử dụng và từ đó các nguồn cung cấp máu được thử nghiệm Ngày nay, tỉ lệ lây nhiễm HCV do truyền máu bị nhiễm rất thấp dưới 0.01 % một số ít (khoảng 1%- 3% người có quan hệ tình dục khác phái, một vợ một chồng) có thể

bị lây nhiễm HCV do có quan hệ tình dục không an toàn Những người thuộc nhóm có “nguy cơ mắc bệnh cao” (như đàn ông đồng tính, mãi dâm, người có nhiều bạn tình, người mang bệnh lây qua đường tình dục) thường dễ bị nhiễm HCV qua đường tình dục hơn

Các nhân viên y tế cũng có nguy cơ nhiễm bệnh vì những tai nạn việc làm như

bị kim đâm hoặc trong những trường hợp không thêt tránh được có thể tiếp xúc trực tiếp với máu của người mang bệnh

Khoảng 5% những bà mẹ bị HCV có thể truyền bệnh cho con vào lúc trước hoặc trong khi sinh nở Sự lây truyền này tùy thuộc vào mức độ HCV có trong máu của người mẹ Có đến 10% người có HCV không xác định được tại sao họ bị mắc

bệnh HCV không lây truyền qua những tiếp xúc thông thường hang ngày như ăn chung bàn, uống chung ly nước, ôm, hắt hơi hoặc ho

1.3.2 Diễn biến của bệnh nhân nhiễm virut viêm gan C

Viêm gan C cấp tính

Khỏi (10-30%) Mang các dấu ấn của HCV mạn tính (70-90%)

Mang dấu ấn âm tính không triệu chứng 50% VGMT tối thiểu 50%

1.3.3 Các xét nghiệm chẩn đoán bệnh viêm gan virut C

1.3.3.1 Các xét nghiệm kháng thể HCV

+ ELISA II là một cuộc thử nghiệm máu đơn giản để phát hiện kháng thể HCV

+ RIBA là cuộc thử nghiệm kháng thể thứ nhì, có thể được dung sau cuộc thử nghiệm Elisa,để xác nhận sự hiện diện của kháng thể HCV

1.3.3.2 Xét nghiệm số lượng siêu vi C

Cuộc xét nghiệm đo số lượng HCV lưu truyền trong máu Đơn vị đo lường siêu

vi HCV là số lượng mỗi mili-lít(ml) máu hoặc đơn vị đo lường tiêu chuẩn được gọi

là Đơn Vị Quốc Tế (International Units)

1.3.3.3 Xét nghiệm chức năng và sinh hóa của gan

Có một số cuộc thử nghiệm máu để đo lường sức hoạt động của gan Bảng thử nghiệm gan (hepatic panel) gồm các số đo lường chức năng của gan Số đo lường phổ thông nhất là ALT và AST (alanine aminotransferase & aspartate aminotransferase - mà trước đây gọi là SGPT và SGOT) ALT và AST là những chất men (enzymes) được tiết vào trong máu khi gan bị hư và thường tăng cao ở người bị nhiễm HCV Nhiều người có HCV có chỉ số cao của hai loại men gan này, thường là dấu hiệu đầu tiên là họ đã bị nhiễm bệnh Những cách đo lường khác là ALK và GGT (alkaline phosphatase & gamma-glutamyl transpeptidase) cũng được

sử dụng trong việc thử nghiệm

1.3.3.4 Sinh thiết gan

Sinh thiết ( hay thử mẫu tế bào) gan được dùng để đo lường mức độ viêm, số lượng sẹo, và tình trạng sức khỏe của gan Việc này cũng có thể dùng để xác định cách chữatrị Cách thức thông thường nhất là làm tê da và bắp thịt rồi nhanh chóng

đưa một kim dài và nhỏ vào gan và rút ra để lấy mẫu thử nghiệm Cách thức này làm nhiều người sợ, nhưng rất hiếm có biến chứng

1.3.3.5 Xét nghiệm phân định loại HCV (Genotype HCV)

Cuộc xét nghiệm phân định loại HCV được dùng để xác định bạn bị nhiễm loại HCV nào Ðiều này rất hữu ích cho việc quyết định cách chữa trị, như là chọn lựa loại thuốc, và cần điều trị bao lâu

1.4 Các kỹ thuật xét nghiệm xác định kiểu gen HCV

Hiện nay kỹ thuật được ứng dụng trong xác định kiểu HCV ở Việt Nam là kỹ

thuật Real-time PCR và giải trình tự gen ( InoLIPA và Sequencing)

1.4.1 Kỹ thuật Real-time PCR

Real-time PCR là kỹ thuật PCR( Polymerase chain reaction-Phản ứng chuỗi polymerase) mà kết quả khuếch đại DNA đích được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, chính vì vậy nên được gọi là Real-time Như vậy, có thể nói Real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng tỉ bản sao dựa vào chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thí nghiệm có thể thấy được

1.4.1.1 Lịch sử phát hiện kỹ thuật PCR

Vào một buổi tối cuối tuần tháng 4 năm 1983, trong lúc đang lái xe trên đường

ở gần vùng đồi núi của California, một ý tưởng lóe lên trong đầu của Kary Mullis khi ông phải lùi xe lại do chạy lố đường, hình ảnh hai làn bánh xe mới tách khỏi hai làn bánh xe cũ:” Dùng nhiệt độ tách đôi sợi AND thành hai mạch đơn’’ Lúc đó Kary Mullis chỉ là một nhà hóa sinh học bình thường, đang làm việc tại một phòng thí nghiệm nhỏ

Từ ý tưởng đó, Kary Mullis đã phát minh ra kỹ thuật PCR ( phản ứng chuỗi polymerase) vào năm 1985, tạo nên cuộc cách mạng lớn trong đời sống khoa học Chỉ sau 8 năm (1993), K Mullis đã được trao giải Nobel về hóa học nhờ

phát minh này

1.4.1.2 Nguyên lý kỹ thuật PCR

Từ một đoạn ADN chọn lọc, nó sẽ được nhân lên gấp hàng triệu lần hoặc hơn nữa trong một thời gian ngắn Trong thời gian này, sự sao chép ADN được tạo ra trong môi trường in vitro như trong quá trình phân bào

Để tạo được quá trình này, trước tiên chuỗi ADN kép được làm nóng đến mức

bị tách thành hai nhánh đơn Làm nguội các nhánh đơn này rồi nhờ xúc tác của enzyme ADN polymerase và các tiền chất deoxynucleotid tương ứng để nhánh ADN bổ sung được tổng hợp Trong ống nghiệm, quá trình này không thể tự xảy ra được mà phải có các đoạn ADN mồi (primer) sẽ tổng hợp với những vị trí bổ sung trên hai chuỗi đơn Các đoạn mồi khởi động đặc thù thường được tổng hợp nhân tạo Từ vị trí gắn của mồi khởi đông, nhánh bổ sung sẽ được tổng hợp Mồi khởi động mang tính đặc thù riêng cho mỗi AND có trình tự nhất định Với mỗi loại mồi khởi động thì chỉ ADN đặc hiệu với nó được sao chép

Sau khi các chuỗi bổ sung đã được tổng hợp xong, hai chuỗi kép được tạo thành qua quá trình này sẽ lại được dùng nhiệt để tách ra và quá trình tổng hợp lại được lặp lại như thế để sản sinh ra 4 chuỗi ADN và cứ như thế tiếp diễn

sản phẩm khuếch đại đặc hiệu xuất hiện trong ống PCR thì taqman probe đặc hiệu với trình tự đích sẽ bắt cặp vào sản phẩm khuếch đại và sẽ bị thủy giải bởi men taq polymerase ( nhờ hoạt tính 5’-3’ exonuclease) khi tổng hợp sợi bổ sung ở giai đoạn kéo dài Sự thủy giải taqman probe sẽ làm tách rời chất phát huỳnh quang (fluorophore) FAM ở đầu 5’ khỏi chất hấp phụ huỳnh quang (quencher) ở đầu 3’ của probe, nhờ vậy ống phản ứng sẽ phát huỳnh quang khi bị chiếu tia cực tím hay laser

và sự phát huỳnh quang này sẽ được ghi nhận bởi đầu đọc real time của máy

Hình 1.8: Nguyên lý kĩ thuật Real time PCR sử dụng Taqman Probe (phát

hiện , đinh lƣợng và định type HCV)

1.4.1.4 Máy Real-time PCR [10]

Điều kiện đầu tiên để có thể thực hiện được Real-time PCR (RT - PCR) là phải

có máy RT - PCR Máy này cũng có một buồng ủ nhiệt chạy được chương trình

luân nhiệt như máy PCR bình thường, nhưng có thêm một thiết bị được gọi là thiết

bị real-time Đây là một thiết bị quang học có hai chức năng:

+ Có các nguồn sáng phát ra được các tia sáng kích thích có bước sóng xác định lên các tube phản ứng RT- PCR

+ Có được camera hay cảm biến quang ghi nhận được ánh sáng huỳnh quang phát ra từ các tube phản ứng RT- PCR khi các tube phản ứng này được chiếu các tia sáng kích thích

1.4.2 Kỹ thuật Sequencing

Nguyên lý: Kỹ thuật Sequencing dựa trên phương pháp enzyme Sanger (phương

pháp đầu tận cùng của chuỗi) Chìa khóa của phản ứng này là sử dụng dideoxynucleotide không có nhóm OH ở vị trí 3’ trong phản ứng tổng hợp ADN

Do đó khi enzyme AND polymerase gắn chúng vào sợi AND thì quá trình tổng hợp

bị ngừng lại Vì vậy phương pháp này còn được gọi là phương pháp dideoxy[5]

Hình 1.9 : Qúa trình tổng hợp chuỗi AND khi có mặt của didNTP

Hình 1.10: Xác định trình tự nucleotid

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: tháng 1/2011 đến tháng 1/2012

Địa điểm nghiên cứu: Phòng xét nghiệm - Khoa truyền nhiễm - Bệnh viện Bạch

Mai

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là những mẫu huyết thanh các bệnh nhân đã xác định

Anti HCV dương tính đến xét nghiệm tại Khoa Truyền nhiễm Bệnh viện Bạch Mai

Tổng số mẫu xét nghiệm antiHCV (+) là 239 mẫu trong đó có 228 mẫu có số

lượng virut >102copies/ml máu mới xác định kiểu gen bằng kỹ thuật RT- PCR

Bệnh nhân có các tiêu chuẩn sau:

+ Đã xác định Anti HCV (+)

+ Không đồng nhiễm với các virut gây viêm gan khác như HBV, HGV

+ Không đồng nhiễm với HIV

+ Số lượng virut >102copies/ml máu

2.2 Dụng cụ và hóa sinh phẩm

2.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị

Dụng cụ: Kim tiêm các loại,Tube các loại, Pipet các loại, Đầu côn các loại

Trang thiết bị: Hệ thống máy Real-time PCR CFX96TM, Máy ủ nhiệt khô

MS0030, Máy li tâm Microfuge 16, Máy li tâm, Máy Vortex Biocote, Máy

Spindow, Pipet Man Nichipet EX, Máy hút chân không 7A-230, Tủ lạnh, máy giải

trình tự gen 3130XL do Công ty Nam Khoa thực hiện

2.2.2 Hóa chất sinh phẩm

Bộ hóa chất do Công Ty Nam Khoa sản xuất và cung cấp bao gồm:

+ Sinh phẩm dùng để tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên:Bộ thuốc thử NK

cDNAsynthesys kit (cung cấp cho 50 mẫu thử)

+ Sinh phẩm dùng để phát hiện và định lượng HCV-RNA:Bộ thuốc thử NK

+ Sinh phẩm dùng để định type HCV

+ Hệ thống mồi và mẫu dò được thiết kế dựa vào trình tự các gen trên vùng 5’NC trên bộ gen HCV được công bố trên ngân hàng gen được tổng hợp và cung cấp bởi công ty Nam Khoa và có trình tự như sau: