tóm tắt luận án Nghiên cứu một số bệnh thường gặp ở tôm hùm bông (Panulirus ornatus Fabricius, 1798) nuôi lồng tại vùng biển Khánh Hòa và các biện pháp phòng trị

Xuất phát từ những yêu cầu cấp thiết của thực tiễn sản xuất đã nêu, luận án: “Nghiên cứu một số bệnh thường gặp ở tôm hùm bông Panulirus ornatus Fabricius, 1798 nuôi lồng tại vùng biển

KHÁI QUÁT CHUNG VỀ LUẬN ÁN

1 Tính cấp thiết của luận án

Tôm hùm là một loại đặc sản được nhiều nước trên thế giới

quan tâm nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cũng như bệnh trên tôm hùm

nuôi, đặc biệt các nước như: Úc, Canada,…

Ở Việt Nam, nghề nuôi tôm hùm đã và đang phát triển từ những

năm 2000 tại các tỉnh khu vực Nam Trung Bộ Trong đó, Khánh Hòa

có số lượng lồng nuôi chiếm khoảng 60% so với cả nước (29.206

lồng vào năm 2006) và nghề nuôi này thực sự mang lại hiệu quả kinh

tế-xã hội cho địa phương Tuy vậy, do sự phát triển tự phát, thiếu qui

hoạch, thức ăn cho tôm là loại tươi sống với hệ số chuyển đổi cao,

cùng với việc quản lý môi trường vùng nuôi và kỹ thuật nuôi chưa tốt

đã tạo cơ hội cho các tác nhân gây bệnh phát triển, tạo thuận lợi cho

sự bùng phát bệnh: đỏ thân, đen mang, mòn đuôi và đã gây thiệt

hại đáng kể cho người nuôi tôm Ngoài ra, chưa có công trình nghiên

cứu và tài liệu nói về bệnh ở tôm hùm nuôi lồng tại Việt Nam

Xuất phát từ những yêu cầu cấp thiết của thực tiễn sản xuất đã

nêu, luận án: “Nghiên cứu một số bệnh thường gặp ở tôm hùm

bông (Panulirus ornatus Fabricius, 1798) nuôi lồng tại vùng biển

Khánh Hoà và các biện pháp phòng trị” đã được thực hiện

2 Mục tiêu của luận án

Xác định được các tác nhân chính gây nên một số bệnh chủ yếu

ở tôm hùm bông nuôi lồng tại tỉnh Khánh Hòa Đưa ra cơ sở khoa

học và các phương pháp phòng trị bệnh tôm hùm nuôi lồng tại địa

phương

3 Nội dung nghiên cứu của luận án

+ Điều tra thực trạng, phát hiện các bệnh chủ yếu ở tôm hùm

bông nuôi lồng vùng biển Khánh Hòa

+ Nghiên cứu một số bệnh có tần số bắt gặp cao và gây tác hại

cho tôm hùm bông nuôi lồng tại Khánh Hòa

+ Thử nghiệm dùng thuốc và hóa chất để phòng trị bệnh ở tôm hùm bông nuôi lồng

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

Góp phần làm phong phú thêm kết quả nghiên cứu bệnh học trên giáp xác nuôi ở Việt Nam Đưa ra cơ sở và các biện pháp phòng trị bệnh cho tôm hùm ở Khánh Hòa và các tỉnh miền Trung Việt Nam

5 Những đóng góp của luận án

+ Luận án là công trình có hệ thống đầu tiên ở Việt Nam nghiên

cứu sâu về một số bệnh thường gặp ở tôm hùm bông (Panulirus ornatus) nuôi lồng

+ Luận án đã nghiên cứu xác định tác nhân của hai bệnh: bệnh

đỏ thân, bệnh đen mang ở tôm hùm bông nuôi lồng tại Khánh Hòa và các yếu tố liên quan đến sự bùng phát của hai bệnh này

+ Luận án đã đưa ra cơ sở và các biện pháp phòng bệnh đỏ thân

và bệnh đen mang ở tôm hùm bông nuôi lồng; đưa ra biện pháp trị bệnh đen mang, góp phần nâng cao năng suất, sản lượng tôm hùm nuôi ở Việt Nam, đặc biệt là tại Khánh Hòa

6 Bố cục của luận án

Luận án gồm 141 trang, trong đó có 23 bảng số liệu, 44 hình và được cấu trúc như sau:

Chương 1: Tổng quan tài liệu 32 trang Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 25 trang Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận 59 trang Kết luận và kiến nghị 2 trang Danh mục công trình công bố của tác giả 1 trang Tài liệu tham khảo: 19 trang (gồm 136 tài liệu tham khảo, trong

đó có 32 tài liệu tiếng Việt và 104 tài liệu tiếng Anh)

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Một số đặc điểm sinh học và sinh thái phân bố của tôm hùm

Panulirus spp

1.1.1 Đặc điểm sinh học tôm hùm Panulirus spp: đặc điểm hình thái,

phân loại, chu kỳ sống, phân bố và dinh dưỡng đã được đề cập

1.1.2 Sinh thái phân bố của tôm hùm Panulirus spp: nhiệt độ nước,

độ mặn, nền đáy và độ sâu đã được đề cập trong luận án

1.2 Tình hình nuôi tôm hùm trong nước và Thế giới

1.2.1 Tình hình nuôi tôm hùm trên Thế giới: các hình thức nuôi, loài

tôm nuôi và một số quốc gia nuôi tôm hùm trên Thế giới được đề cập

1.2.2 Tình hình nuôi tôm hùm bằng lồng tại Việt Nam: những nghiên

cứu về nuôi tôm hùm, loài tôm nuôi, số lượng lồng và sản lượng tôm

hùm nuôi tại Việt Nam đã được đề cập trong luận án

1.3 Các nghiên cứu về bệnh ở tôm hùm nuôi

1.3.1 Một số phương pháp và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

bệnh trên tôm hùm: Các phương pháp vi in vitro sinh vật học, mô

bệnh học; kỹ thuật kính hiển vi điện tử, sinh học phân tử cũng đã

được sử dụng

1.3.2 Các nghiên cứu về bệnh ở tôm hùm trên Thế giới và VN:

1.3.2.1 Trên thế giới : hiện nay có các bệnh và hội chứng bệnh

ở tôm hùm: bệnh do vi rút (PaV1), bệnh do vi khuẩn (bệnh đỏ đuôi,

bệnh vỏ, ), bệnh do nấm (Fusarium, Lagenidium, ), bệnh do ký

sinh trùng (vi bào tử trùng, trùng máu, ) và bệnh do các yếu tố vô

sinh (do độc tố, do các yếu tố môi trường, )

1.3.2.2 Tại Việt Nam: mới bắt đầu từ năm 2001 bởi Đỗ Thị

Hòa, Nguyễn Thị Bích Thúy và Võ Văn Nha Ngoài ra, luận án cũng

đề cập đến các nghiên cứu về bệnh sữa trên tôm hùm, một bệnh vừa

xuất hiện vào năm 2006 và đầu 2007

CHƯƠNG 2- VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, phạm vi và địa điểm nghiên cứu: Một số bệnh

thường gặp ở tôm hùm bông nuôi thương phẩm tại Khánh Hòa

2.2 Vật liệu nghiên cứu: tôm hùm bông (Panulirus ornatus)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Sơ đồ khối nghiên cứu của luận án: cũng đã được đề cập 2.3.2 Phương pháp điều tra hiện trạng bệnh tôm hùm nuôi lồng: Thông tin được thu thập từ 2 nguồn thứ cấp và sơ cấp

2.3.3 Các phương pháp phân tích mẫu đã được sử dụng + Phương pháp thu mẫu phân tích: thu chọn lọc, chọn tôm hùm sống có dấu hiệu đặc thù: đỏ thân (166 con), đen mang (97 con), tôm khỏe (50 con) của cùng một hộ nuôi từ năm 2003-2005 Mẫu nước thu ở đáy lồng nuôi, mỗi tháng 1 lần trong năm 2003

+ Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn: theo phương pháp nghiên cứu vi khuẩn trên tôm hùm của Evans (2003) và Whitman (2004) + Phương pháp nghiên cứu nấm:

* Nuôi cấy, phân lập theo Rhoobunjongde & cs (1991), Lê Văn Khoa, Hatai & Aoki (2004)

* Phân loại nấm theo Nelson và cs(1983) và xác định trình tự đoạn DNA của nấm theo White & cs (1990), O’Donnell (1992)

* Xác định một số đặc điểm sinh thái của nấm gây bệnh, kiểm tra tác dụng của các loại hóa chất/thuốc kháng nấm trong điều kiện theo Kitancharoen & Hatai (1995) với các mức thí nghiệm về nhiệt độ: 12 oC, 22 oC, 26oC, 28oC, 30 oC, 32 oC, 35 oC, 40 oC; độ mặn:

0‰, 5‰, 10‰, 15‰, 20‰, 25‰, 30‰, 35‰, 40‰, 45‰, 50‰ và pH: 5, 6, 7, 7.5, 8, 9 Nồng độ và loại hóa chất/thuốc kháng nấm sử dụng tương ứng ở Bảng 2.4

Bảng 2.4: Một số loại hóa chất/thuốc kháng nấm và nồng độ tương

ứng dùng làm thí nghiệm

Ghi chú : ( * ) - Nồng độ được tính bằng đơn vị UI/mL

* Cảm nhiễm nấm trên tôm khỏe: áp dụng theo phương pháp

của Rhoobunjongde & cs (1991)

+ Phương pháp nghiên cứu vi rút:

* Kỹ thuật mô bệnh học: áp dụng phương pháp mô bệnh học

cho giáp xác của Lightner (1996)

* Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction): thực hiện theo

tiêu chuẩn ngành thủy sản 28 TCN 202:2004

* Phương pháp kính hiển vi điện tử: thực hiện tại Viện vệ

sinh dịch tễ Trung ương Gan tụy và mang tôm bệnh và tôm khỏe đã

được kiểm tra, đọc qua kính hiển vi điện tử hiệu JEOL 1010, Mỹ

* Phương pháp cảm nhiễm dịch gan tụy tôm bệnh dưới màng

lọc 0,2µm để xác định vai trò của vi rút trong việc gây bệnh đỏ thân

cho tôm hùm: Áp dụng theo phương pháp của Takahashi (1994)

(Hình 2.9)

Cách 1 (cho trực tiếp) Cách 2 (ngâm) Formalin 0, 50, 100, 150, 200,

250, 300, 350, 400

100, 150, 200, 250,

300, 350, 400

Nistatine (*) 0; 30; 35; 40; 45; 50 25, 30, 35

Ketoconazol 0, 50, 100, 200, 500,

750, 1000

400, 500, 600

Griseofuvine 0, 25, 50, 100, 500,

1000, 1500

300, 500, 700

+ Phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng: Áp dụng phương pháp Dogiel (1960), được Hà Ký (1968) bổ sung

Tôm hùm bông khỏe (27,5±2,5g/con) được thuần dưỡng 7 ngày

TN 2 (tiêm 0,1 mL dịch gan tụy tôm bệnh trong NaCl 0,85%

lọc qua 0,2 µm)

ĐC 3 (cho tôm ăn thức ăn không tiêm dịch gan tụy tôm bệnh

đã lọc qua 0,2 µm)

TN 3 (tiêm dịch gan tụy tôm bệnh với BPS, lọc qua 0,2 µm vào thức

ăn cho

ăn 7 ngày)

ĐC 4 Ngâm tôm trong dung dịch BPS pha loãng ở cùng nồng độ)

TN 4 (Ngâm tôm trong dịch lọc qua 0,2

µm pha loãng với BPS trong

30 phút)

TN1 (tiêm 0,1 mL dịch gan tụy tôm

đỏ thân trong BPS lọc qua 0,2

µm )

ĐC 2 (tiêm 0,1 mL NaCl 0,85%)

- Mỗi lô có 10 con

- Sục khí 24/24 giờ

- Nhiệt độ = 28oC; S‰=33‰; pH = 8,2

- Theo dõi liên tục hàng ngày

- Thí nghiệm được lặp lại 2 lần

ĐC 1 (tiêm 0,1 mL dung dịch BPS)

Tiêm trực tiếp vào đốt bụng thứ 2 của tôm khỏe

Tiêm dịch lọc gan tụy vào thức ăn cho tôm ăn

Ngâm tôm trong dịch lọc gan tụy tôm bệnh

Hình 2.9: Thí nghiệm đánh giá vai trò của vi rút với bệnh đỏ thân

trên tôm hùm

2.3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm điều trị bệnh đen mang ở tôm

hùm bông trong điều kiện thí nghiệm: Bố trí điều trị bệnh đen mang ở

tôm hùm bông được thể hiện qua sơ đồ Hình 2.11

Hình 2.11: Sơ đồ điều trị bệnh đen mang ở tôm hùm bông trong điều

kiện thí nghiệm

2.3.5 Phương pháp xác định một số yếu tố môi trường: nhiệt độ, độ

mặn, pH, hàm lượng H2S, DO, BOD5 được xác định theo các phương

pháp hiện hành

2.3.6 Các phương pháp xử lý số liệu: Các thông tin, số liệu của luận

án đã được xử lý trên máy vi tính bằng phần mềm SPSS

Nấm gây bệnh Tôm hùm bông khoẻ

(khối lượng:145,6±3,2g/con)

Tôm hùm bông bị bệnh đen mang

Tắm tôm trong

TN1 Hóa chất 1 (HC1)

TN2 Hóa chất 2 (HC2)

TN3 Thuốc kháng nấm (KN)

ĐC1

Đối chứng

dương

(không

điều trị)

ĐC2 Đối chứng

âm (tôm khoẻ)

Đánh giá kết quả của việc sử dụng thuốc trong việc điều trị

bệnh đen mang ở tôm hùm bông trong điều kiện thí nghiệm

CHƯƠNG 3- KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả điều tra hiện trạng bệnh tôm hùm bông nuôi lồng tại Khánh Hòa đến năm 2006

3.1.1 Tình hình nuôi tôm hùm bằng lồng ở Khánh Hòa Năm 2006, toàn tỉnh có khoảng 29.206 lồng đạt 1.142 tấn, tăng hơn 3 lần về số lượng lồng và hơn 2 lần sản lượng tôm nuôi so với năm

2000 (Hình 3.1)

Hình 3.1: Số lượng lồng và sản lượng tôm hùm nuôi lồng tại các vùng

nuôi ở Khánh Hòa qua các năm (nguồn: Báo cáo của Sở Thuỷ sản Khánh Hoà)

3.1.2 Những bệnh thường gặp trên tôm hùm nuôi lồng ở Khánh Hòa Kết quả điều tra cho thấy có 9 loại hội chứng bệnh khác nhau đã xảy ra trong các lồng nuôi tôm hùm ở Khánh Hòa đến năm 2004 Trong đó, dấu hiệu đỏ thân và đen mang có tần suất xuất hiện cao (65,1% và 66,4% tương ứng)

3.1.3 Một số đặc điểm dịch tễ của hội chứng đỏ thân và hội chứng đen mang trên tôm hùm bông nuôi lồng tại Khánh Hòa

3.1.3.1 Sự xuất hiện của hội chứng bệnh theo các tháng nuôi trong năm (mùa vụ)

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000

1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006

Năm

Vạn Ninh Cam Ranh Nha Trang Ninh Hoà

0 100 200 300 400 500 600 700 800

1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006

Năm

Vạn Ninh Cam Ranh Nha Trang Ninh Hoà

Hình 3.3: Phân bố của hội chứng đỏ thân và hội chứng đen mang

trên tôm hùm bông theo tháng tại Khánh Hòa năm 2003-2004

(n=229)

Từ Hình 3.3 nhận thấy: hội chứng đỏ thân thường xuất hiện

nhiều từ tháng 2-7, hội chứng đen mang thường xuất hiện tập trung từ

tháng 5-9 hàng năm Phân tích chỉ số nguy cơ tương đối (RR) và chỉ số

chênh (OR) mô tả sự liên quan giữa sự xuất hiện hội chứng bệnh và mùa

vụ cho thấy, nguy cơ xuất hiện hội chứng đỏ thân hay đen mang trong

mùa khô cao gấp 2,74 hay 1,4 lần (tương ứng) so với mùa mưa (RRđỏ thân

=2,74>1; RRđen mang =1,40>1; ORđỏ thân =2,32>1; ORđen mang = 1,59>1)

3.1.3.2 Sự xuất hiện của hội chứng bệnh theo giai đoạn tôm

trong một chu kỳ nuôi

Bảng 3.3: Phân bố của hội chứng đỏ thân/đen mang trên tôm hùm

bông theo nhóm kích cỡ tôm nuôi khác nhau

Có dấu hiệu bệnh Không dấu hiệu bệnh Loại

hội

chứng

bệnh

Tôm con (n=115)

Tôm thương phẩm (n=114)

Tôm con (n = 115)

Tôm thương phẩm (n=114)

Đỏ

thân Tỷ lệ (%) 76,5 53,5 23,5 56,5

Đen

mang Tỷ lệ (%) 41,7 91,2 48,3 8,8

(n- Số hộ nuôi trả lời có hội chứng bệnh và giai đoạn tôm nuôi)

Hội chứng đỏ thân

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

Thời gian (tháng)

Hội chứng đen mang

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0

Thời gian (tháng)

Từ kết quả Bảng 3.3, phân tích chỉ số RR và OR cho thấy nguy cơ xuất hiện hội chứng đỏ thân ở tôm con (≤7 tháng nuôi) cao hơn tôm thương phẩm (RR=1,43>1; OR= 2,83>1); còn nguy cơ xuất hiện hội chứng đen mang ở tôm thương phẩm (>7 tháng nuôi) lại cao hơn ở

tôm con (RR= 2,18>1; OR= 14,52>1)

3.1.3.3 Ảnh hưởng của kiểu lồng nuôi lên sự xuất hiện hội chứng đỏ thân/đen mang

Bảng 3.4: Phân bố của hội chứng đỏ thân/đen mang trên tôm hùm

bông theo các kiểu nuôi lồng khác nhau

Có dấu hiệu bệnh Không dấu hiệu bệnh Loại

hội chứng bệnh

Lồng nổi (n=53)

Lồng chìm (n=89)

Lồng găm (n=87)

Lồng nổi (n=53)

Lồng chìm (n=89)

Lồng găm (n=87)

Đỏ thân Tỷ lệ (%) 50,9 71,9 66,7 40,1 28,1 33,3

Đen mang Tỷ lệ (%) 47,2 74,2 70,1 52,8 25,8 29,9

n- Số hộ nuôi có hội chứng bệnh và loại hình nuôi khác nhau

Từ kết quả Bảng 3.4, phân tích chỉ số RR và OR cho thấy, nguy

cơ xuất hiện hội chứng đỏ thân/đen mang ở kiểu nuôi bằng lồng nổi thấp hơn không nuôi bằng kiểu lồng nổi (RRđỏ thân = 0,74<1; RRđen mang = 0,65<1; ORđỏ thân = 0,46<1 và ORđen mang = 0,34 <1)

3.1.3.4 Ảnh hưởng của mật độ tôm nuôi lên sự xuất hiện hội chứng đỏ thân/đen mang

Từ kết quả Bảng 3.5, phân tích chỉ số RR và OR cho thấy, ở mật

độ nuôi nhỏ hơn 5con/m2, nguy cơ xuất hiện hội chứng đỏ thân/đen mang thấp hơn nuôi ở mật độ từ 5 con/m2

trở lên (RRđỏ thân = 0,74<1;

Bảng 3.5: Phân bố của hội chứng đỏ thân/đen mang trên tôm hùm

bông theo mật độ nuôi khác nhau (n=224)

Có dấu hiệu bệnh Không dấu hiệu bệnh Loại

hội

chứng

bệnh

Mđ≤5 con/

m2

5<Mđ≤9 con/m2 Mđ>9

con/m2 Mđ≤5

con/m2 5<Mđ≤ 9

con/m2 Mđ>9

con/m2

Đỏ

thân Tỷ lệ (%) 19,5 38,9 41,6 34,7 29,3 36,0

Đen

mang Tỷ lệ (%) 16,7 38,2 45,1 38,8 31,2 30,0

Mđ: Mật độ; n: Số hộ có trả lời mật độ nuôi và hội chứng bệnh

3.1.3.5 Ảnh hưởng giữa việc vệ sinh lồng với sự xuất hiện hội

chứng đỏ thân/đen mang

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của việc vệ sinh lồng bè nuôi đến sự xuất hiện của

hội chứng đỏ thân/đen mang

Có dấu hiệu bệnh Không dấu hiệu bệnh Loại hội

chứng

bệnh

Có vệ sinh lồng/bè (n=120)

Không vệ sinh lồng/

bè (n=98)

Có vệ sinh lồng/bè (n=120)

Không vệ sinh lồng/bè (n=98)

Đỏ

thân Tỷ lệ (%) 60,0 78,6 40,0 21,4

Đen

mang Tỷ lệ (%) 64,2 76,5 35,8 23,5

(n- Số hộ nuôi trả lời có hội chứng bệnh và vệ sinh lồng bè)

Từ kết quả Bảng 3.6, phân tích chỉ số RR và OR cho thấy, nguy cơ

xuất hiện hội chứng đỏ thân/đen mang ở nhóm có vệ sinh lồng bè nuôi

thấp hơn nhóm không vệ sinh lồng bè nuôi (RRđỏ thân = 0,76<1; RRđen

mang=0,84<1; ORđỏ thân= 0,41<1; ORđen mang=0,55<1)

3.1.4 Những biện pháp phòng, trị bệnh tôm của người nuôi tôm hùm

lồng tại Khánh Hòa

Qua điều tra cho thấy tỷ lệ số hộ nuôi thực hiện các biện pháp phòng bệnh cho tôm hùm là khá cao (95,2%): dọn thức ăn dư thừa (99,5%), vệ sinh lồng/bè (64,4%) Các biện pháp trị bệnh cho tôm hùm hiếm gặp (3,1%) và sử dụng kháng sinh điều trị bệnh ở tôm sú

để trị bệnh tôm hùm nhưng không có hiệu quả tại thời điểm điều tra

3.2 Kết quả nghiên cứu về bệnh đen mang ở tôm hùm bông

3.2.1 Các dấu hiệu bệnh lý đặc trưng Mang có màu nâu đỏ ở những vùng tổn thương, các tổ chức mô tại

đó bị phá hủy Vị trí tổn thương chuyển thành màu đen và lan rộng khắp

cả mang, toàn bộ tơ mang phá hủy Tôm khó thở và ngoi lên mặt lồng/bè Ngoài ra, luận án còn chỉ ra một dấu hiệu đen mang do chất thải hữu

cơ bám vào mang và gây đen mang

3.2.2 Các loại tác nhân là sinh vật tìm thấy trên tôm hùm bông bệnh đen mang

Kết quả phân tích cho thấy tần suất bắt gặp từng loài vi khuẩn, ký sinh trùng, WSSV là ít đặc trưng và tỷ lệ nhiễm tương đương trên nhóm tôm bệnh và tôm khỏe Trong khi đó, 100%

mẫu (n=97) đều phát hiện có nấm Fusarium sp trên tôm bệnh

nhưng lại không tìm thấy trên tôm khỏe (0,0%) Những quan sát tiêu bản soi tươi phiến mang tôm bệnh và những nghiên cứu về bệnh đen mang do nấm gây ra trên tôm hùm của Lightner & Fontaine (1975), Evans & cs(1994), Đỗ Thị Hòa & cs (2004), cho phép

nhận định: rất có thể nấm Fusarium sp là tác nhân chính gây ra

bệnh đen mang ở tôm hùm bông nuôi lồng khu vực Khánh Hòa 3.2.3 Đặc điểm mô bệnh học ở tôm hùm bông bị bệnh đen mang

Kết quả quan sát mô mang với thuốc nhuộm H&E ở 100X, 400X

đã phát hiện nấm Fusarium sp trên tôm bệnh (Hình 3.9)

Hình 3.9: Mô học mang tôm hùm bông bệnh đen mang và tôm khỏe

nhuộm H&E

3.2.4 Kết quả cảm nhiễm nấm trên tôm khỏe

Kết quả cảm nhiễm nấm cho thấy, tôm hùm bắt đầu chết ở ngày

thứ 5 sau khi cảm nhiễm Tỷ lệ tôm chết sau 14 ngày cảm nhiễm với

các mật độ nấm 8x103, 8x104, 8x105 BTĐ/mLlà khác nhau có ý

nghĩa thống kê (p<0,05) Kiểm tra tôm tại ngày thứ 3, 7 và 10 và

những tôm chết ở các lô thí nghiệm cho thấy có hơn 75% tôm có

mang chuyển sang màu nâu đen đặc thù của tôm bệnh đen mang và

khi phân lập trở lại đều tìm thấy nấm đã gây nhiễm ban đầu Trong

khi đó, ở lô đối chứng tôm đều không bị chết; mang của tôm không

bị đổi màu và không nhiễm nấm.Như vậy, nấm Fusarium sp là

nguyên nhân chính gây nên dấu hiệu đen mang ở tôm hùm bông

nuôi lồng

50 µm

C

50 µm

D

A

B

3.2.5 Một số đặc điểm hình thái, phân loại chủng nấm có tần số bắt gặp cao trên tôm hùm bông bệnh đen mang

3.2.5.1 Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái, cấu tạo của nấm: Các đặc điểm hình thái, cấu tạo của nấm được chỉ ra và so sánh chúng với đặc điểm phân loại nấm của Nelson & cs (1983) cho

thấy chủng nấm Fusarium sp tìm thấy tương tự với loài F solani

3.2.5.2 Phân loại dựa vào trình tự gen của nấm: Tiến hành xác định trình tự gen vùng ITS (bao gồm cả 5.8 S rDNA), trình tự đoạn D1/D2 rDNA 28S ba chủng nấm phân lập từ mẫu tôm hùm bông bệnh đen mang ở các đợt khác nhau (F1, F2, F4) cùng với các chủng

nấm đã xác định tên (F3- Fusarium incarnatum;F179-F oxysporum

và F180 – F solani) để so sánh Kết quả được thể hiện ở Hình 3.11

Hình 3.11: Cây quan hệ giống loài của các chủng nấm phân lập từ

mẫu tôm hùm bông bệnh đen mang và các loài có mối quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự các vùng ITS (bao gồm cả trình tự 5.8 S rDNA)

Fusarium sambucinum NRRL13708 (U34579)

Fusarium equiseti (AB277550)

Fusarium chlamydosporum (AJ853773)

F3

Fusarium incarnatum voucher NJM0177(AY633745)

Fusarium culmorum (AM262427)

Gibberella moniliformis (EF158026)

Gibberella zeae (EF158024)

Fusarium lateritium (EF560605)

84

53

51

F179_I4_4

Fusarium oxysporum f cubense (EF590328)

Fusarium redolens (AB304483)

100

Fusarium polyphialidicum (U34580)

100

100

58

Fusarium solani f.sp.phaseoli NRRL22158(L36630)

F180_I

Stenocarpella maydis (AY332489)

Fusarium ambrosium AF178397

Nectria ipomoeae (AF178398)

Chaetomium globosum (AY429049)

Thanatephorus cucumeris (DQ339103)

F4_I1_1 F1_I1

Fusarium solani (AM412641)

F2_I

Fusarium oxysporum (AY928412)

Nectria haematococca (DQ535186)

51

60

98

94

52

67

100

73

98

58

100

0.02

Như vậy, ở mức độ phân tử có thể khẳng định rằng nấm

Fusarium phân lập được trên tôm hùm bông bệnh đen mang tại

Khánh Hòa là loài F solani

3.2.6 Một số đặc điểm sinh thái của nấm có tần số bắt gặp cao trên

tôm hùm bông bệnh đen mang

Kết quả của luận án đã chỉ ra nấm Fusarium solani sinh trưởng

mạnh ở nhiệt độ từ 28-35 oC, tốt nhất là 30 oC (p<0,05) Giá trị pH từ

5,0-7,5 và 8,0-9,0; độ mặn từ 25-35‰ và 45-50‰, sinh trưởng của

nấm F solani không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p>0,05)

3.3 Kết quả nghiên cứu về bệnh đỏ thân ở tôm hùm bông

3.3.1 Dấu hiệu bệnh lý đặc trưng

+ Trạng thái: tôm bệnh không nhanh nhẹn và kém bắt mồi

+ Màu sắc: mặt bụng của phần lưng xuất hiện màu đỏ nhạt, sau đó

toàn bộ thân tôm xuất hiện màu đỏ nhạt đến đỏ bầm

+ Biến đổi hình thái bên ngoài: đôi khi gặp tình trạng phù nề của

phần cơ giữa giáp đầu ngực và phần bụng

+ Mức độ ảnh hưởng: tôm chết rải rác đến hàng loạt, tỷ lệ chết tích

lũy lên đến 80%

Ngoài ra, năm 2007 còn bắt gặp một dạng tôm hùm bông bị đỏ

thân kèm theo dấu hiệu trắng sữa ở bụng nhưng loại tôm với dấu hiệu

này không được đưa vào nghiên cứu trong luận án

3.3.2 Các loại tác nhân gây bệnh là sinh vật tìm thấy trên tôm hùm bông

bệnh đỏ thân

Có nhiều loài sinh vật ký sinh khác nhau tìm thấy ở trên và

ở trong cơ thể tôm hùm bị đỏ thân: các giống ký sinh trùng, vi

khuẩn, động vật bám, WSSV và cũng được tìm thấy ở nhóm tôm

khỏe với tỷ lệ nhiễm tương đương Ngoại trừ một vi rút lạ có thể

vùi dạng hình cầu hay bầu dục, bắt màu tím của hematoxylin,

nằm ngoài nhân các tế bào mô liên kết tổ chức gan tụy tôm (Hình 3.21) chỉ gặp ở nhóm tôm bị bệnh đỏ thân (91,6%), nhưng không

gặp ở nhóm tôm khỏe (0,0%); 2 loài vi khuẩn: Vibrio alginotylicus và V parahaemolyticus đã gặp trên nhóm tôm bị

bệnh với tần số 67,5% và 33,1% tương ứng, cao hơn so với nhóm tôm khỏe (4,0%) Vì thế, vi rút tìm thấy (Hình 3.21) và 2 loài vi

khuẩn V.alginolyticus, V parahaemolyticus đã nghi ngờ là tác nhân chính gây bệnh đỏ thân ở tôm hùm bông nuôi lồng

Hình 3.21: Mô bệnh học của tổ chức gan tụy tôm hùm bị bệnh đỏ

thân cho thấy các thể vùi (mũi tên) có màu tím của hematoxylin nằm ngoài nhân của các tế bào mô liên kết, nằm xen kẽ giữa các biểu mô gan tụy hình ống

50µm

A

3.3.3 Kết quả cảm nhiễm lên tôm khỏe dịch nghiền gan tụy tôm

bệnh đỏ thân qua màng lọc 0,2 µm

Ở lô thí nghiệm TN1 và TN2, khi tiêm vào cơ thể tôm khỏe dịch

nghiền gan tụy tôm bị bệnh lọc qua màng lọc 0,2µm, đã làm tôm chết

với tỷ lệ 80-100% sau 5-7 ngày thí nghiệm và những con tôm hùm

chết đều có dấu hiệu đỏ toàn thân Quan sát tế bào mô liên kết của tổ

chức gan tụy và mang những tôm này thấy dạng thể vùi hình cầu hay

bầu dục, bắt màu tím của hematoxylin và nằm ngoài nhân, nhưng

không tìm thấy nó trong các mô của tôm ở lô tôm khỏe (đối chứng)

(Hình 3.22)

Hình 3.22: Sự biến đổi mô bệnh học trong mô liên kết của tổ chức

gan tụy và mô mang tôm hùm bông bị bệnh đỏ và tôm hùm bông khỏe

từ cảm nhiễm nhân tạo.

20µm

C

10µm

D

B

30µm

A

20µm

E

20µm

F

Như vậy, xác nhận rằng có một loại vi rút tồn tại và nhân lên trong bào tương, nằm bên ngoài nhân tế bào mô liên kết ống gan tụy

và tế bào mang tôm bệnh là nguyên nhân gây ra hiện tượng đỏ thân ở tôm hùm bông nuôi lồng Đồng thời xác nhận hai loài vi khuẩn:

Vibrio alginolyticus và V parahaemolyticus không phải là tác nhân

gây bệnh chính mà chỉ là tác nhân góp phần làm tôm hùm bông chết tại các vùng nuôi thuộc tỉnh Khánh Hòa

3.3.4 Kết quả quan sát mẫu mô gan tụy và mô mang tôm hùm bông

bị bệnh đỏ thân và tôm khỏe dưới kính hiển vi điện tử

Hình 3.23: Tế bào gan tụy tôm hùm bông bệnh đỏ thân (do cảm nhiễm

nhân tạo) và tôm khỏe dưới kính hiển vi điện tử

Nu

Nu

Cyt

Nu

D

C

Hình 3.23 cho thấy tế bào mô liên kết ống gan tụy và tế bào

mang tôm bị bệnh thể hiện rất rõ sự nhiễm của một vi rút dạng hình

bầu dục, có kích thước đường kính khoảng 96-100nm, chiều dài

khoảng 288-310nm Các hạt vi rút quan sát dưới kính hiển vi điện tử

có dạng hoàn chỉnh, bao gồm cả phần lõi và vỏ (nucleocapsit) tập

trung thành đám trong một bọc lớn (Hình 3.23B), nằm trong sinh

chất, bên ngoài nhân của các tế bào mô liên kết gan tụy tôm Trong

khi đó, mẫu tôm khỏe không thể hiện các dấu hiệu này (Hình 3.23A)

3.4 Kết quả thử nghiệm dùng thuốc và hóa chất hạn chế bệnh

đen mang ở tôm hùm bông nuôi lồng trong điều kiện thí nghiệm

3.4.1 Kết quả thử nghiệm hiệu quả của một số hóa chất và thuốc

kháng nấm trong việc kìm hãm sự phát triển nấm Fusarium solani

gây bệnh đen mang ở tôm hùm trong điều kiện in vitro

3.4.1.1 Dùng Formalin với nồng độ, thời gian và phương pháp

sử dụng khác nhau: Khi đưa trực tiếp Formalin nồng độ từ 200-350

ppm có thể kìm hãm sự phát triển của nấm Fusarium solani Còn khi

ngâm rìa khuẩn lạc nấm Fusarium solani đang phát triển trong

Formalin với thời gian (10, 20 và 30 phút) và nồng độ khác nhau

(100, 150, 200, 250, 300, 350 và 400ppm) cho thấy, trong thời gian

ngâm 20 phút, nhóm nồng độ Formalin từ 150-400 ppm cho sự khác

nhau có ý nghĩa thống kê giữa kích thước khuẩn lạc nấm ở các lô

dùng Formalin và lô đối chứng (p<0,05)

3.4.1.2 Dùng Hydrogen peroxyde (H2O2) với các nồng độ khác

nhau: Khi ngâm rìa khuẩn lạc nấm Fusarium solani đang phát triển

trong H2O2 ở các thời gian (10, 20 và 30 phút) và nồng độ khác nhau

(500, 750, 1000 và 1500ppm) thì với thời gian ngân là 10 phút, ở

nồng độ H2O2 từ 500ppm trở lên mới có thể kìm hãm được sự phát

triển của nấm sau 120 giờ nuôi cấy (p<0,05) Mặt khác, trong cùng

một nồng độ H2O2 sử dụng (500, 750, 1000 hay 1500 ppm), sự phát triển của rìa khuẩn lạc nấm ở các thời gian ngâm khác nhau (20, 30 phút) không cho sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p>0,05)

3.4.1.3 Dùng một số thuốc kháng nấm (Griseofulvine, Ketoconazol, Nistatin) với các nồng độ, thời gian và phương pháp sử dụng khác nhau:

Kết quả nghiên cứu cho thấy + Có sự sai khác có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (p<0,05) giữa kích thước khuẩn lạc nấm ở các nồng độ khác nhau của Griseofulvine/Ketoconazol/Nistatin (phương pháp đưa thuốc trực tiếp trong môi trường nuôi cấy nấm) và kích thước khuẩn lạc nấm ở các nồng độ khác nhau của Griseofulvine/Ketoconazol (phương pháp ngâm rìa khuẩn lạc nấm) Đây chính là cơ sở để dùng Griseofulvine hay Ketoconazol bằng cách duy trì nồng độ thuốc trong một thời gian

để kìm hãm sự phát triển của nấm gây bệnh đen mang ở tôm hùm trong điều kiện thí nghiệm

+ Ở cùng nồng độ 500ppm (Griseofulvine, Ketoconazol) và 30UI (Nistatin), sau 120 giờ nuôi cấy, phương pháp đưa thuốc trực tiếp trong môi trường nuôi cấy nấm có tác dụng ức chế sự phát triển của nấm tốt hơn so với phương pháp ngâm rìa khuẩn lạc nấm trong thuốc 20 phút trước khi nuôi cấy, sự sai khác này có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

3.4.2 Kết quả thử nghiệm điều trị bệnh đen mang ở tôm hùm bông

trong điều kiện thí nghiệm in vivo

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tắm Formaline 300 ppm trong

20 phút, 2 ngày lần, liên tục 3 lần cho kết quả khá tốt trong trị bệnh đen mang ở tôm hùm bông nuôi lồng so với tắm Hydrogen peroxide