Nghiên cứu đặc tính sinh dược học của dịch chiết từ lá cây Dâu tằm (Morus alba L

Bảng 3.2 .Bảng kêt quả định tính một sô hợp chât tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết từ lá cây Dâu tằm.. Đặc biệt, lá dâu tằm theo dân gian có khả năng ổn định huyết áp,đường huyết.V

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

cùng kính trọng và chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các, thầy cô trong Ban giám hiệu, phòng Sauđại học, khoa Sinh - Kĩ thuật nông nghiệp trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã giúp

đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoànthành luận văn của mình

Xin cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn quan tâm, giúp đỡ, độngviên, cổ vũ, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn

Hà Nội, ngày 4 thảng 7 năm 2013 Tác giả

Danh mục hình, biểu đồ

Bảng 2.4 Mô hình nghiên cứu khả năng hạ glucose của các phân

đoạn dịch chiết từ lá cây Dâu tằm

Bảng 3.2 Bảng kêt quả định tính một sô hợp chât tự nhiên trong

các phân đoạn dịch chiết từ lá cây Dâu tằm

Bảng 3.5 Trọng lượng trung bình của hai nhóm chuột nuôi bằng

hai chế độ dinh dưỡng khác nhau

41

11

Bảng 3.6 So sánh một sô chỉ sô hóa sinh máu giữa chuột nuôi

thường và nuôi béo phì thực nghiệm

13 Bảng 3.8 Kêt quả nông độ glucose huyêt lúc đói của các lô chuột

sau 21 ngày điều trị

47

14

Bảng 3.9 So sánh một sô chỉ sô lipid máu ở chuột ĐTĐ trước và

sau điều trị bằng cao phân đoạn ethanol, cao phân đoạn n - hexan

và cao phân đoạn ethylacetate

50

g

4

Hình 3.1 Quy trình chiêt xuât các chât tự nhiên từ lá cây Dâu tằm 35

6 Hình 3.3 Chuột béo phì (A) và chuột ăn thường (B) 40

Hình 3.4 Biêu đô biêu diên sự tăng trọng của các nhóm chuột với 2

chế độ dinh dưỡng khác nhau trong vòng 8 tuần

Hình.3.6 Nông độ glucose huyêt lúc đói của các lô chuột thí

nghiệm trước và sau khi tiêm 72 giò’

46

10

Hình 3.7 Nông độ glucose huyêt lúc đói của các lô chuột trước và

sau 21 ngày điều trị

48

11

Hình 3.8 So sánh một sô chỉ sô lipid máu ở chuột ĐTĐ trước và

sau điều trị bằng cao phân đoạn ethanol, cao phân đoạn n - hexan

và cao phân đoạn ethylacetate

50

MỞ ĐÀU

1 Lý do chọn đề tài

Việt Nam nằm trong khu vực có khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có một thảm thựcvật hết sức đa dạng và phong phú Đó chính là nguồn tài nguyên thiên nhiên vô giá màcho đến nay chúng vẫn chứa đựng nhiều điều bí ẩn Ngày nay, các sản phẩm thiên nhiênngày càng được con người quan tâm và ứng dụng rộng rãi trong các ngành kinh tế quốcdân bởi tính năng độc đáo, ít độc hại, dễ hấp thu và đặc biệt không làm tổn hại đến môisinh Nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, tới 3 Á diện tích của cả nước là núi rừng

trùng điệp, cùng với điều kiện khí hậu rất đa dạng với nhiều tiểu vùng khí hậu khá đặctrung đã tạo cho Việt Nam có thảm thực vật thiên nhiên vô cùng phong phú, đặc biệt làkho tàng các cây dược liệu Theo thống kê, hiện nay số loài thực vật bậc cao có mạch ởnước ta vào khoảng 12.000 - 13.000 loài, thì số loài được dùng làm thuốc chiếm tới4.000 loài

Việc tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học từ nguồn dược liệu đã và đang làvấn đề thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học cũng như các nhà quản lý và kinhdoanh ở nhiều nước, nhất là các nước công nghiệp phát triển Nghiên cứu để khai thác,

để kế thừa, ứng dụng và phát triển nguồn thực vật làm thuốc là vấn đề có ý nghĩa khoahọc, kinh tế và xã hội rất lớn ở nước ta Có thể nói tác dụng chữa bệnh của cây cở đượcquyết định chủ yếu bởi các hợp chất tự nhiên chứa trong chúng Nghiên cứu thành phầnhóa học và hoạt tính sinh học của các cây thuốc không những góp phần làm sáng tỏ tácdụng chữa bệnh của thảo dược mà còn tạo ra nhiều loại thuốc mới để phòng chống, trợgiúp, ngăn ngừa và chữa trị bệnh Hiện nay, con người đã phát hiện được rất nhiều hợpchất từ cây cỏ với các đặc tính sinh học quý giá

Cây Dâu tằm hay còn gọi là cây Dâu ta, có tên khoa học là Morus alba L, là một loài thực vật thuộc họ Dâu tằm (Moracaae) Nó được biết đến là một loài cây phổ biến,

có mặt trong nhiều bài thuốc chữa bệnh Ở Việt Nam, loài cây này được biết đến trongcác bài thuốc dân gian chữa cảm mạo, hạ sốt, hạ huyết áp, chữa chứng mồ hôi trộm,

chứng thổ huyết Đặc biệt, lá dâu tằm theo dân gian có khả năng ổn định huyết áp,đường huyết.

Việc nghiên cứu đặc tính sinh dược học của lá cây Dâu tằm nhằm đạt cơ sở khoahọc cho việc sử dụng chúng một cách họp lý, hiệu quả có ý nghĩa thực tiễn rất quantrọng trong sự phát triển của nền y học Việt Nam hiện đại dựa trên các bài thuốc cổ

truyền Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu đặc

tính sinh dược học của dịch chiết từ lá cây Dâu tằm (Morus alba L.)”

2 Mục đích nghiên cún

Tách chiết và nghiên cứu một số đặc tính sinh dược học của dịch chiết từ lá cây

Dâu tằm (Morus alba LJ

3 Nhiệm vụ nghiên cún

- Tách, chiết các phân đoạn từ lá cây Dâu tằm

- Khảo sát thành phần hóa học của lá cây Dâu tằm

- Xây dựng mô hình chuột béo phì thực nghiệm, chuột đái tháo đường type 2

- Đánh giá tác dụng của các phân đoạn dịch chiết đến trọng lượng, một số chỉ sốlipit máu của chuột béo phì thực nghiệm, nồng độ glucose huyết trên mô hìnhchuột đái tháo đường mô phỏng type 2

4 Đóng góp mói của đề tài

Cung cấp một số dẫn liệu khoa học về thành phần hóa học, hàm lượng các nhómhợp chất hữu cơ, khả năng chống BP của phân đoạn dịch chiết từ lá cây Dâu tằm

như: nhóm phenolic, nhóm terpen và nhóm alkaloid.

1.1.1.1 Họp chất phenolic

Dựa vào thành phần và cấu trúc người ta chia họp chat phenolic thành 3 nhómnhỏ [2]

Nhóm hợp chat phenolic đơn giản: Trong phân tử chỉ có một vòng benzene và

một vài nhóm hydroxyl Tùy thuộc vào số lượng nhóm OH mà chúng được gọi là cácmonophenol (phenol), diphenol (pyrocatechin, hydroquynone), triphenol (pyrogalol,oxyhydroquynol

Nhóm hợp chat phenolic phức tạp: Trong thành phần cấu trúc phân tử của chúng

ngoài vòng thơm benzene (C6) chúng còn có dị vòng, mạch nhánh Đại diện nhóm này

có axid cyamic, axid ceramic

Nhóm hợp chất phenolic đa vòng: Là nhóm đa dạng nhất trong các họp chat

phenol, có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc trùng họp của các đơn phân Ngoài gốcphenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng Nhóm này có các phânnhóm: flavonoid, tannin và coumarin

• Phân nhóm Flavonoid thực vật

Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật, phầnlớn có màu vàng

Flavonoid là một chuỗi polyphenolic gồm có 15 nguyên tử cacbon và hai vòngbenzen liên kết bởi một đường thẳng có 3 cacbon.

Flavonoid gồm 2 vòng thơm và một vòng pyran

2' 3'

5

*Hoạt tính sinh học của flavonoid

Tác dụng chống oxy hóa (antioxidant): flavonoid có khả năng kìm hãm các quátrình oxy hóa dây chuyền sinh ra bởi gốc tự do hoạt động Những flavonoid có cácnhóm hydroxyl sắp xếp ở vị trí octo dễ dàng bị oxy hóa dưới tác dụng của các enzymepolyphenoloxydase và peroxydase tạo thành

dạng semiquinon hoặc quinon

02 + Flavonoid (dạng khử)

(dạng Hydroquinon)

H202 + Flavonoid (dạng khử)

(dạng Hydroquinon)

(Semiquinon hoặc Quinon) +H20

- Flavonoid có khả năng điều hòa hoạt động enzyme do khả năng liên kết vớinhóm amin trong phân tử protein, làm thay đổi cấu hình không gian của enzyme

do đó tạo hiệu ứng điều hòa dị lập thế

3'

polyphenoloxydase

► Flavonoid (dạng oxy hóa)

(Semiquinon hoặc Quinon) ► Flavonoid (dạng oxy hóa)

Peroxydaxe

0

- Flavonoid có tĩnh kháng khuấn, kháng virut, tăng khả năng đề kháng của cơ thế

do kích thích lympho bào, tăng sản xuất interferon, ức chế hiện tựơng thoátbọng (digramilation)

- Flavonoid có hoạt tính của vitamin pp, làm tăng tính bền và đàn hồi của thànhmạch, giảm sức sống của mao mạch

- Flavonoid có tác dụng chống ung thư do kìm hãm các enzyme oxy hóa khử, quátrình đường phân và hô hấp, kìm hãm phân bào, phá vỡ cân bằng trong quá trìnhtrao đổi chất của tế bào ung thư

• Phân nhóm Tannin thực vật

Tannin ( tannin , tannoỉd) có mặt trong cấu trúc tế bào thực vật chúng có thể là

một dạng polyphenolic đóng vai trò là họp chất liên kết và kết tủa protein cũng như cáchọp chất hữu cơ khác nhau bao gồm cả axit amin và alkaloids

Các hợp chất tannin được phân phối rộng rãi ở nhiều loài thực vật Chúng đóngmột vai trò quan trọng trong bảo vệ thực vật chống lại sự ăn thịt Đồng thời góp phầnquy định tăng trưởng thực vật Tương tự như vậy, sự phá hủy hoặc sửa đôi của cáctannin với thời gian đóng một vai trò quan trọng trong quá trình chín của trái cây.Tannin được tìm thấy ở các loài trong thế giới thực vật Tannin được tìm thấytrone lá, chồi, hạt, rễ, và các mô sốc Trong tế bào gốc tannin thường được tìm thấytrong các giai đoạn tăng trưởng của cây, chang hạn như phloem và xylem thứ cấp vàlớp giữa vỏ và lóp biểu bì Tannin có thể giúp điều chỉnh sự phát triển của các mô.Các polyphenol có nhiều nhất là tannin cô đặc , được tìm thấy trong hầu như tất

cả các cơ quan thực vật, chiếm 50% trọng lượng khô của lá Tannin có trọng lượngphân tử khác nhau, từ 500 đến hơn 3.000 (axit galic este) và lên đến 20.000(proanthocyanidins) Tannin là không tương thích với chất kiềm , gelatin , kim loạinặng, sắt, nước chanh , muối kim loại, chất oxy hóa mạnh và Sulfat kẽm.

1

• Phân nhóm Coumarin

Coumarin là chất của a-purone có cấu trúc c6 - c3 dị vòng chứa oxy Coumarinkết tinh không màu hoặc màu vàng nhạt, vị đắng, cay, có mùi thơm Tính chất hóa họcđặc trưng là dễ dàng kết họp với đường glucose tạo thành glycosid dễ tan trong nước

Coumarin sử dụng trong đời sống hằng ngày như làm nước hoa, hương liệu, làmchất chống đông máu và chất diệt loài nhặm nhấm Trong y học dẫn xuất của coumarin

có tác dụng chống co thắt, giãn nở động mạch vành, làm bền và bảo vệ thành mạch,ngăn cản đột quỵ Một số coumarin khác có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, khángkhối u, trừ giun sán và giảm đau

1.1.1.2 Alkaloid

Các đơn vị cấu thành chính của tanin

2

Alkaloid là hợp chất chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng và

có tính kiềm, thường gặp ở thực vật và động vật Đa số cácalkaloid thành phần chứa oxy ởthể rắn (cafein), không có oxy thường ở thể lởng dễ bay hơi (nicotin) Alkaloid

thường không có màu, không mùi và vị đắng Một số alkaloid

có màu vàng như berberin, palmitin Các alkaloid ở dạng base thường không tan trong nước

Alkaloid có tính kiềm yếu, do các mạch cacbon chứa nitơ quyết định Chúngphản ứng với một số thuốc thử đặc trưng như: Bouchardat (kết tủa nâu sẫm), Vans-Mayer (kết tủa trắng vàng) hay Dragendroff (cam) Có khoảng 20% loài thực vật có hoa

có khả năng sinh alkaloid Trong y học nhiều thuốc chữa bệnh có thành phần alkaloidnhư thuốc gây kích thích hoặc ức chế hệ thần kinh trung ương, thuốc điều hòa huyết áp,chữa rối loạn nhịp tim Một số nghiên cứu gần đây cho thấy các alkaloid chiết từ thựcvật cũng có tác dụng hạ glucose huyết

1.1.1.3 Steroid

Steroid là một loại hợp chất hữu cơ có chứa một sự sắp xếp đặc trưng của bốnvòng cycloalkane được nối với nhau Vĩ dụ về các steroid bao gồm các chất béo ăncholesterol, hormon sinh dục estradiol, testosterone, và thuốc chống viêmdexamethasone

CH,

T

N.

Lõi của steroid bao gồm 20 nguyên tử cacbon liên kết với nhau mang hình thứccủa bốn vòng hợp nhất: ba vòng cyclohexane (được xem như là vòng A, B, và C) vàmột vòng cyclopentane (vòng D) Các steroid khác nhauđối với từng nhóm chức nănggắn liền với cốt lõi bốn vòng và oxi hóa của các vòng.

Steroid là các hợp chất béo hữu cơ hòa tan có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng họp,

có công thức từ 17 nguyên tử cacbon sắp xếp thành 4 vòng và bao gồm cả các sterol vàaxit mật, thượng thận, và kích thích tố giới tính Một số steroid có nguồn gốc thiênnhiên như: hợp chat digitalis và các tiền chất của một số loại vitamin nhất định Steroidrất đa dạng và phong phú, bao gồm các dạng như vitamin D, digitalis, sterol Các sterol

là các dạng đặc biệt của các steroid, với một nhóm hydroxyl tại vị trí 3 và một khunglấy từ cholestane Hàng trăm steroid riêng biệt được tìm thấy ở thực vật, động vật vànấm Tất cả các steroid được sản xuất ở các tế bào từ các sterol lanosterol (động vật vànấm) hoặc từ cycloartenol (thực vật) Cả lanosterol và cycloartenol lấy từ cyclizationcủa triterpene squalene

I.I.I.4 Terpen thực vật

Terpen là nhóm hydrocacbon thực vật lớn và đa dạng nhất, được hình thành từquá trình polymer hóa các tiếu đơn vị isopren 5C (C5H8) ,có công thức cấu tạo chung là(C5H8)n Trong thực vật terpen được tổng hợp thông qua con đường trao đổi chấtacetate)/mevalonate hoặc con đường glyceraldehydes

3- phosphate/pyruvate Hầu hết các terpen đều thuộc nhóm hydrocarbon, tuy nhiênchúng có thể bị khử hoặc bị oxy hóa để hình thành các họp chất terpenoid khác

4

nhau như alcohol, ketone, acid và aldehyd.

1.1.2 Vai trò của các họp chất thứ sinh thực yật

Các họp chất thứ sinh thực vật có nhiều vai trò quan trọng, mang chức năng sinhthái đặc biệt, giúp cho thực vật sống sót, phát triển và tồn tại:

- Giúp cơ thế chống lại bệnh tật, kí sinh trùng, các vi sinh vật gây nhiễm bệnh,

- Giúp cơ thể chống lại các yếu tố bất lợi trong quá trình sinh tồn

- Tạo lợi thế cạnh tranh giữa các loài khác nhau

- Với quá trình sinh sản: Nhiều sắc tố flavonoid đóng vai trò là chất dẫn dụ độngvật và côn trùng tham gia vào quá trình thụ phấn và phát tán

1.1.3 ứng dụng của các họp chất thứ sinh thực yật

- Công nghệ y dược: rất nhiều hợp chất thứ sinh được sử dụng để sản xuất nhiềuloại thuốc điều trị các bệnh khác nhau

- Công nghệ hóa thực phẩm: dùng làm gia vị, phẩm màu, hương liệu

- Công nghệ hóa mỹ phẩm: dùng làm nước hoa, xà phòng, đồ mỹ phấm

- Sản xuất hàng tiêu dùng: dùng làm dung môi, keo dán, hàng dệt

may

- Sản xuất thuốc bảo vệ thực vật: thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng

1.2 Bệnh béo phì (Obesity)

1.2.1 Khái niệm và phân loại bệnh béo phì

Bệnh béo phì (obesity) được tổ chức y tế thế giới WHO định nghĩa là: tình trạngtích luỹ mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng cơ thể hay toàn thân tới mứcảnh hưởng tới sức khỏe Tổ chức này dùng chỉ số khối cơ thể BMI (Body Mass Index)

để đánh giá tình trạng dư thừa hay thiếu hụt mỡ của mỗi người

Chỉ số khối cơ thể được tính theo công thức sau:

Mức độ thê trọng Người trưởng thành châu Au Người trưởng thành châu A

Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), năm 2005 trên thế giới có khoảng 1,6

tỷ người bị thừa cân, trong đó có hơn 400 triệu người bị BP và dự đoán sẽ lên đếnkhoảng 2,3 tỷ người bị thừa cân với hơn 700 triệu người bị BP vào năm 2015 [9].Theo số liệu 2010, khoảng 171 triệu trẻ em trên thế giới bị còi do thiếu ăn, chế độthiếu vitamin và khoáng chất, chăm sóc trẻ không đầy đủ và bệnh tật Tại châu Á

tỉ lệ thừa cân BP ở một số nước như: Thái Lan 3.5%, Philipin 4.27%, Malaysia3.01%, Nhật 3%, Trung Quốc 2%, Hồng kông 3% [14]

6

1.2.3 Nguyên nhân gây béo phì

Béo phì do nhiều nguyên nhân khác nhau, có thể kể đến những nguyên nhân chủyếu sau:

- Thói quen ăn uống

- Lười vận động

- Yếu tố “di truyền”

1.2.4 Tác hại của bệnh béo phì

Tình trạng thừa cân và BP đã và đang trở thành một nguy cơ của sức khỏe Tạicác nước đang phát triển trong đó có Việt Nam, tình trạng này đang tăng lên nhanhchóng trong những năm gần đây nhất là ở trẻ em bên cạnh một số lượng không nhỏ cácbệnh nhân bị suy dinh dưỡng

Thừa cân BP là nguyên nhân làm gia tăng bệnh lý mạn tính nguy hiểm như timmạch, tăng huyết áp, ĐTĐ trong đó hệ xương khớp là một trong những căn bệnh chịutác hại nghiêm trọng của tình trạng này

1.2.5 Giải pháp và điều trị bệnh béo phì

Đe phòng bệnh BP có hiệu quả, mỗi cá nhân cần nâng cao nhận thức về dinhdưỡng và hoạt động thể lực Trên phạm vi xã hội, việc phòng bệnh cần tập trung vàonhóm có nguy cơ mắc bệnh này

Điều trị thừa cân BP dựa trên nguyên tắc kết hợp giữa chế độ ăn uống, luyện tập

và dùng thuốc Trong đó thuốc và phẫu thuật chỉ dùng trong trường hợp bắt buộc

1.2.6 Rối loạn trao đỗi lỉpỉd

1.2.6.1 Khái niệm

Rối loạn lipid máu là tình trạng tăng cholesterol, triglycerides (TGs) huyết tươnghoặc cả hai, hoặc giảm nồng độ lipoprotein phân tử lượng cao, tăng nồng độ lipoproteinphân tử lượng thấp làm gia tăng quá trình xơ vỡ động mạch Nguyên nhân có thể (do ditruyền) hoặc thứ phát Chẩn đoán bằng xét nghiệm cholesterol, triglycerides và cácthành phần lipoprotein máu Điều trị bằng thay đổi chế độ ăn uống, hoạt động thể lực

7

và dùng thuốc hạ lipid máu.

1.2.6.2 Phân loại

Trên thực hành lâm sàng, phân loại rối loạn lipid máu dựa trên những rối loạntiên phát hoặc thứ phát và tính chất tăng lipid máu, ví dụ tăng cholesterol đơn thuần,tăng TGs đơn độc hay tăng cả cholesterol và TGs (tăng lipid máu hỗn hợp) Phân loạinày có bất cập là không tính đến các bất thường của lipoprotein (ví dụ giảm HDL hoặctăng LDL) mà đây là những rối loạn có thể gây ra các biến cố tim mạch mặc dùcholesterol và TGs máu bình thường [7]

1.2.6.3 Nguyên nhân và triệu trứng rối loạn lipid

- Nguyên nhân gây rối loạn lipid máu có thể là nguyên phát (do các bệnh về gen)hoặc thứ phát (do thói quen ăn uống, sinh hoạt hoặc một số bệnh lý)

- Rối loạn lipid máu thường không có triệu chứng đặc trưng Hầu hết là nhữngtriệu chứng “mượn” của các cơ quan khác vì xơ vỡ động mạch là một bệnh toànthân Bệnh nhân có thể biểu hiện bằng các triệu chứng của bệnh tim mạch nhưbệnh mạch vành (BMV), bệnh mạch máu ngoại biên, bệnh động mạch cảnh.Nồng độ TGs cao (> 1000 mg/dL [> 11.3 mmol/L]) có thể gây viêm tụy cấp.LDL-C có thể gây ra u mỡ vàng bám ở mi mắt; giác mạc, gân Achilles, khuỷutay, khớp gối Rối loạn betalipoprotein có thế có u mỡ vàng ở lòng bàn tay hoặcthân người Triglycerides máu tăng quá cao (> 2000 mg/dL [> 22.6 mmol/L])còn có thể gây ra những mảng trắng như kem ở động, tĩnh mạch võng mạc Ởmức độ cực kỳ cao, TGs có thể làm huyết tương trắng như sữa [5] Triệu chứng

có thế gặp là bệnh nhân khó thở, lẫn lộn, dị cảm

I.2.6.4 Chấn đoán và điều trị

Rối loạn lipid máu được đặt ra ở những bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng hoặcbiến chứng của rối loạn lipid máu (ví dụ bệnh xơ vỡ động mạch) Rối loạn lipid tiênphát được nghi ngờ ở những bệnh nhân có dấu hiệu lâm sàng của rối loạn lipid máu,bệnh xơ vỡ động mạch xuất hiện sớm (trước 60tuổi), tiền sử gia đình có người mắcbệnh động mạch hoặc cholesterol máu > 240 mg/dL (> 6.2mmol/L) Chẩn đoán xác

8

định bằng xét nghiệm các thành phần lipid máu: cholesterol toàn phần (TC), cholesterol (HDL-c) và LDL-cholesterol (LDL-c).

HDL-1.3 Bệnh đái tháo đường

1.3.1 Khái niệm và phân loại

1.3.1.1 Khái niệm

Theo WHO, ĐTĐ là một hội chứng rối loạn chuyển hóa cacbohydrat có đặc tínhbiểu hiện bằng tăng glucose máu do hậu quả của việc thiếu hoặc mất hoàn toàn insulinhoặc do có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết và hoạt động của insulin

ĐTĐ là một nhóm các bệnh chuyển hóa có đặc điểm là tăng glucose trong máu,hậu quả của sự thiếu hụt bài tiết insulin, khiếm khuyết trong hoạt động của insulin hoặc

cả hai Tăng glucose máu mạn tính thường kết hợp với sự hủy hoại, sự tăng rối loạnchức năng và sự suy yếu chức năng của nhiều cơ quan đặc biệt là mắt, thận, thần kinh,tim và mạch máu [5]

ĐTĐ trong giai đoạn mới phát thường làm bệnh nhân đi tiểu nhiều, tiểu ban đêm

và do đó làm khát nước Bệnh tiếu đường là một trong những nguyên nhân chính củanhiều bệnh hiếm nghèo, điến hình là bệnh tim mạch vành, tai biến mạch máu não, mùmắt, suy thận, liệt dương, hoại thư, cắt cụt chi

WHO đã nhận định rằng: “Thế kỷ XXI là thế kỷ của các bệnh nội tiết và rối loạnchuyển hóa mà điển hình là bệnh ĐTĐ Những gì mà đại dịch HIV/AIDS đã hoànhhành 20 năm cuối thế kỷ XX, thì đó sẽ là ĐTĐ trong 20 năm đầu thế kỷ XXI”

1.3.1.2 Phân loại

Dựa vào những hiểu biết về nguyên nhân phát sinh bệnh, ủy ban chuyên gia vềchuẩn đoán và phân loại ĐTĐ của WHO chia ĐTĐ thành các loại như sau:

ĐTĐ type 1: Thường xảy ra ở trẻ em và thanh thiếu niên, khởi phát ở các cá thể

có thính mẫn cảm về di truyền với bệnh Nguyên nhân chính của bệnh là tế bào p đảotụy Langerhans bị phân hủy dẫn đến mất khả năng sản xuât insulin, một hormone điêuhòa lượng đường trong máu Quá trình hủy hoại tế bào p do cơ chế tự miễn Người ta

đẫ biết đến 18 vùng gen liên quan đến type này và được ký hiệu từ IDDM1 đến

9

IDDM18 Các gen này chủ yếu liên quan đến những yếu tố kháng nguyên bạch cầungười HLA hoặc là gen mã hóa insulin.

ĐTĐ type 2: Chiếm 80% - 90% bệnh nhân, có tính quy tụ gia đình và hay gặp ởnhững người trên 30 tuổi Hai yếu tố chính đóng vai trò quan trọng trong cơ chế sinhĐTĐ type 2 là khiếm khiết chức năng tế bào p tuyến tụy và tình trạng kháng insulin, bấtthường về số lượng receptor insulin hoặc ái lực gắn hormone của insulin và cũng có the

do acid béo tự do tăng cao gián tiếp làm ảnh hưởng quá trình truyền tin nội bào củainsulin ở tế bào đích Bởi vậy, bệnh BP là một trong những nguyên nhân môi trườngđược đề cập đến nhiều nhất vì chính BP làm gia tăng tình trạng kháng insulin

1.3.2 Thực trạng đái tháo đường trên thế giới và Việt Nam

* Ở Việt Nam:

Tại Việt Nam, cùng với sự tăng trưởng của nền kinh tế xã hội, tỷ lệ mắc bệnhĐTĐ trong 10 năm qua có xu hướng gia tăn Tỷ lệ người mắc bệnh đái tháo đường năm

2002 chiếm 2.7%, đến 2008 đẵ tăng lên 5.7% dân số

Nghiên cứu của bệnh viện Nội tiết Trung ương trên phạm vi toàn quốc năm 2001thì tỷ lệ ĐTĐ tại 4 tỉnh TP lớn của Việt Nam (Hà Nội, Hải Phòng, Đà Nang, TP Hồ ChíMinh) trong lứa tuổi 30-64 là 4.0%, tỷ lệ rối loạn dung nạp Glucose là 5.1%, riêng quậnHoàn Kiếm (Hà Nội) lên tới 7% Tỷ lệ đối tượng điều tra có các yếu tố nguy cơ củabệnh ĐTĐ là 38.5% Cũng qua số liệu điều tra, số bệnh nhân ĐTĐ không được chẩnđoán là 44% Phần lớn người bệnh phát hiện và điều trị muộn Vì vậy, mỗi năm có trên

0

70% bệnh nhân không được phát hiện và điều trị kịp thời.

Ở nước ta, đối tượng mắc bệnh ĐTĐ thường ở độ tuổi từ 30-65, tuy nhiên hiệnnay có những bệnh nhân ĐTĐ mới chỉ 9-10 tuổi, điều này phản ánh sự trẻ hóa về bệnhnày Bên cạnh đó, biến chứng tim mạch do bệnh ĐTĐ luôn là biến chứng phổ biến và lànguyên nhân gây đột quỵ và tử vong hàng đầu ở người bệnh ĐTĐ VI thế, ĐTĐ khôngchỉ là mối quan tâm của ngành Y tế mà còn thu hút cả sự chú ý của các nhà quản lý xãhội

1.3.3 Cơ chế sinh bệnh của ĐTĐ

Năm 1997, WHO đã đề nghị phân loại ĐTĐ mới dựa trên những tiến

bộ khoa học trong nhũng năm gần đây Phân loại này dựa vào hiểu biết vềnguyên nhân sinh bệnh:

a) Đái tháo đưòng type 1 (ĐTĐ phụ thuộc insulin)

Đái tháo đường type 1 là tình trạng tăng đường huyết mãn tính do hậu quả củatình trạng thiếu hụt insulin tuyệt đối hoặc tương đối kèm theo các rối loạn chuyến hóaprotein, lipid Các rối loạn này có thể đưa đến các biến chứng cấp tính và mãn tính

+ Cơ chế sinh bệnh

Do yếu tố di truyền kém sản xuất insulin, phát bệnh tự nhiên, ít phụ thuộc vàođiều kiện môi trường Bệnh gặp ở 0.2-0.5 % số người trong quần thể và chiếm 5-10%

số người mắc bệnh tiểu đường

Các giai đoạn trong ĐTĐ type 1:

- Giai đoạn 1: Bản chất di truyền-nhạy cảm gene

- Giai đoạn 2: Khởi phát quá trình tự miễn

- Giai đoạn 3: Phát triển một loạt các kháng thể

- Giai đoạn 4: Tổn thương chức năng tế bào p đảo tụy

- Giai đoạn 5: Đái tháo đường lâm sàng, phá hủy hoàn toàn hoặc gần như hoàntoàn tế bào [3 đảo tụy Biểu hiện lâm sàng là ĐTĐ phụ thuộc insulin có kèmbiến chứng

+ Đặc điêm lâm sàng

1

Bệnh nhân ĐTĐ type 1 có đặc điểm lâm sàng phức tạp Thiếu hụt insulin tuyệtđối làm tăng đường huyết và axit béo quá mức dẫn tới tăng áp lực thấm thấu Bệnh nhânthường đi tiểu nhiều, khát nhiều, sụt cân, mờ mắt, mệt mỏi Bệnh nhân ĐTĐ typel bắtbuộc phải điều trị bằng insulin.

b) Đái tháo đường type 2 (ĐTĐ không phụ thuộc insulỉn)

Đái tháo đường type 2 là tình trạng tăng đường huyết do hậu quả của khánginsulin ở cơ quan đích kèm theo suy giảm chức năng tế bào Ị3 hoặc do suy giảm chứcnăng tế bào p kèm theo kháng insulin của cơ quan đích Đây là đạng ĐTĐ thường gặpnhất Thường gặp ở bệnh nhân lớn tuổi

+ Cơ chế sinh bệnh

Sinh bệnh học ĐTĐ type 2 diễn biến qua 3 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Nồng độ glucose trong máu vẫn ở mức bình thường, nhưng có hiệntượng kháng insulin vì mức insulin tăng cao hơn mức bình thường trong máu

- Giai đoạn 2: Tình trạng kháng insulin có xu hướng nặng dần và xuất hiện tăngglucose huyết sau bữa ăn

- Giai đoạn 3: Sự kháng insulin không thay đổi, nhưng bài tiết insulin suy giảm

và gây tăng glucose huyết lúc đói Bệnh ĐTĐ biểu hiện qua bên ngoài

+ Đái tháo đường thai kỳ

Đây là dạng đái tháo đường xảy ra ở một số phụ nữ mang thai và sẽ biến mất saukhi sinh Có thể gây ra các biến chứng cho mẹ và con trong quá trình mang thai Phụ nữ

bị ĐTĐ thai kỳ có nhiều khả năng phát triến thành bệnh đái tháo đường type 2 sau này

từ độ 1 đến độ 4 (3.5%)

2

Biến chứng thần kinh ngoại vi: giảm hoặc mất phản xạ gân xương hoặc cảm giácrung

Tổn thương bàn chân: tùy từng mức độ như phỏng rộp, biến dạng, loét, hoại thư,cắt cụt,

Biến chứng mạch máu lớn: mạch vành có tới (38%), đột quỵ (1.2%), tăng huyết

1.3.6 Đái tháo đưòng với y học cổ truyền

Theo Đông Y, bệnh ĐTĐ thuộc phạm vi chứng tiêu khát, với ba triệu chứng chủyếu là ăn nhiều, uống nhiều và tiểu nhiều Do ăn nhiều các chất cay, béo ngọt làm mấtcân bằng âm dương trong cơ thể, tạo thành hỏa nhiệt, uất nhiệt, làm phần âm của phủtạng như âm, vị thận bị hao tổn Hỏa nhiệt làm phế hư gây chứng tiêu khát, vị âm gâychứng gầy đói, thận âm hư gây tiểu nhiều và tiếu ra đường Xuất phát từ quan niệmtrên, nên phương pháp điều trị chủ yếu là dưỡng âm, thanh nhiệt sinh tân dịch làm cơ sở

để lập lại cân bằng âm dương trong cơ thể

Việt Nam là nước có nguồn dược liệu rất phong phú Bên cạnh chế độ ăn uống

và tập luyện họp lý thì việc sử dụng thảo mộc trong điều trị bệnh ĐTĐ từ lâu đã đượcbiết đến vói nhiều tác dụng tích cực Các thuốc điều trị bệnh ĐTĐ của Đông Y chủ yếu

là các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu Một số thảo mộc rất sẵn trong nước có tác dụng

hỗ trợ điều trị bệnh ĐTĐ như: Bầu đắng, tỏi, nghệ, quế, hành tây, bí đao, mưóp đắng,khế, rau muống, cây dâu [12]

3

1.4 Mối quan hệ giữa béo phì và đái tháo đường

BP và ĐTĐ là hai bệnh không truyền nhiễm nguy hiếm nhất của thế kỉ 21 Haicăn bệnh này có mối liên quan chặt chẽ với nhau thể hiện ở chỗ tỉ lệ người BP luôn tăngtương đương với số bệnh nhân bị ĐTĐ Một cuộc khảo sát của Mỹ gần đây đã chỉ rarằng có tới 58% số người bị ĐTĐ type 2 được quy cho là do BP BP liên quan tới ĐTĐtype 2 thông qua sự đề kháng insulin

Ket quả của nhiều nghiên cứu cho thấy acid béo tự do có vai trò trong bệnh sinhĐTĐ type 2 Phần lớn người BP có nồng độ acid béo trong huyết tương tăng cao Sựtăng này ức chế quá trình hấp thu glucose ngoại vi dưới tác dụng của insulin, ức chế sửdụng glucose

Có nhiều nhân tố ảnh hưởng tới mối quan hệ giữa BP và bệnh ĐTĐ type 2 baogồm: chỉ số khối cơ thể, thời gian BP, chế độ dinh dưỡng, sự vận động thân thể Mộtthống kê đã chi rằng những người có chỉ số khối cơ thể lớn hơn 30kg/m2 trong 10 năm

có nguy cơ mắc bệnh ĐTĐ type 2 cao gấp hai lần người bị BP dưới 5 năm và nếu trọnglượng cơ thể tăng một kilogram thì rủi ro về bệnh ĐTĐ type 2 tăng 4.5% [10] Ket quảcủa nhiều nghiên cứu cho thấy acid béo tự do có vai trò trong bệnh sinh ĐTĐ type 2.Phần lớn người BP có nồng độ acid béo trong huyết tương tăng cao Sự tăng này ức chếquá trình hấp thu glucose ngoại vi dưới tác dụng của insulin, ức chế sử dụng glucosecủa toàn cơ thể, ức chế oxy hóa glucose ở cơ

Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã thấy rằng thừa cân và BP có một mối liên quanchặt chẽ đến tính kháng insulin và bệnh ĐTĐ type 2 và điều đó cũng không loại trừ ởcác bệnh nhân ĐTĐ Việt Nam ĐTĐ đặc trưng bởi sự rối loạn chuyến hóa glucid, sự rốiloạn này ảnh hưởng đến môi trường nội môi do đó kéo theo hoặc làm quá trình rối loạnchuyển hóa lipit ở mỗi loại ĐTĐ mang những đặc trưng riêng Đặc trung chung của rốiloạn chuyển hóa lipit trong ĐTĐ là sự tăng triglyceride, giảm HDL-C và LDL-C vẫnnằm trong giới hạn bình thường Tuy nhiên ở ĐTĐ typel rối loạn tăng triglyceride sẽmất đi khiểm soát được glucose máu khác với type 2, rối loạn này có thể vẫn kéo dàimặc dù có sự điều trị giảm glucose máu thích hợp LDL-C của type2 cũng có thế tăng

4

nhẹ và xuất hiện nhiều LDL-C với kích thước nhỏ và nặng hơn khi việc kiểm soátglucose kém Đây chính là yếu tố làm tăng nguy cơ bệnh xơ vỡ động mạch [10].

1.5. Vài nét chung về cây Dâu tằm (Morus alba L.)

phiến, đôi gân bên tận cùng ở Vi chiều dài phiến lá Mặt trên của lá màu lục sẫm hay

lục xám, mặt dưới màu lục nhạt hơn, nổi rõ các gân lớn chạy từ cuống lá và nhiều gânnhỏ hình mạng lưới, có lông tơ mịn rải rác trên gân lá Cuống dài 2-4 cm, mảnh, cólông thưa Lá hàng năm rụng vào mùa đông Lá kèm còn non hình tam giác nhọn, khigià xoắn lại thành hình dải đầu nhọn [13]

Cây Dâu tằm {Morus alba L.) tại Việt Nam gọi đơn giản là cây dâu, hay cây dâu

5

trắng có nguồn gốc ở khu vực phía Đông Châu Á Cây dâu ưa khí hậu mát và khoẻ nênmọc được ở nhiều vùng đất, mọc nhiều ở vùng nhiệt đới, còn vùng ôn đới thì mọc vàomùa hè.

1.5.2 Thành phần hóa học

Lá dâu tàm chứa các thành phàn bay hơi như tinh dầu (0,0035%), các thành phầnkhông bay hơi gồm protein, carbohydrat, flavonoid, coumarin, vitamin Các flavonoid:rutin, quercetin, moracetin (quercetin-3-triglucosid), quercitrin (quercetin 3-rhamnosid), isoquercitrin (quercetin-3- glucosid) Các dẫn chat coumarin: umbeliferon,scopoletin, scopolin Các vitamin B, c, D, caroten Các sterol: Ị3-sitosterol,campesterol, P-sitosterol glycosid, P- ecdyson và inokosterol Các acid hữu cơ: oxalic,malic, tartric, citric, fumaric, palmitic và ester ethyl palmitat [1]

1.5.3 Một số tác dụng Sinh - dược và công dụng của lá cây Dâu tằm.

Lá cây Dâu tằm (Đông y gọi là Tang diệp) có vị đắng ngọt, tính hàn, có cônghiệu mát gan sáng mắt, thư phong tán nhiệt, lợi ngũ tạng, thông khớp xương, làm mượttóc, dưỡng tân dịch, dùng chữa cảm sốt, ho, đau đầu, chóng mặt, đau sưng họng, mắtđau sưng đỏ, xuất huyết do chấn thương, rết cắn, chân phù [3]

Trong Đông y, lá dâu có một phạm vi ứng dụng lâm sàng rộng rãi

Người Trung Quốc đã sử dụng lá dâu tằm trong các bài thuốc Đông y từ rất lâu,trước khi y học có được bảng phân thích thành phần Lá dâu tằm hãm lấy nước uống đểchống mệt mỏi, suy nhược, mất ngủ, suy giảm miễn dịch, hỗ trợ hạ đường huyết Dâutằm còn chứa nhiều sắt, rất tốt cho những người thiếu máu do sắt và phụ nữ mang thai.Một số thực nghiệm lâm sàng cho thấy ăn lá dâu hằng ngày (canh lá dâu, canh hến ládâu hoặc xào với trứng) hoặc nước hãm lá dâu có khả năng ổn định huyết áp, nhịp tim,đường huyết, làm giảm đáng kể nguy cơ đột quỵ ở nhóm người tăng huyết áp và biếnchứng ở người tiểu đường

Tác dụng chữa bệnh: lá dâu (tang diệp) có tác dụng hạ sốt, chữa cảm mạo, hạhuyết áp, làm sáng mắt, chữa chứng mồ hôi trộm ở trẻ nhỏ, chứng thổ huyết, làm lànhvết thương [1],[3]

6

Chương 2

2.1 Đối tưọng nghiên cún

2.1.1 Mẩu thực yật

+ Lá cây Dâu tằm (Morus alba LJ + Bộ phận sử dụng: lá

+ Địa điểm, thời gian thu mẫu: Lá Dâu tằm được thu vào tháng 8 năm

Hình 2.1 Cây Dâu tằm (Morus alba L.)

2.1.2 Mẩu động vật

Chuột bạch chủng Swiss nặng từ 14 - 16g được nuôi BP và gây ĐTĐ type 2

do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp

2.1.3 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm

* STZ (streptozotocin) Sigma, ST.Louse

* Ethanol 90°, Hóa chất dùng cho quá trình tách chiết, định tính, định lượng như

n-hexan, ethylacetate

* Máy đo đường huyết tự động One Touch Ultra

* Bộ kít thử Medisense optium blood glucose electrodes

* Cân phân tích, máy ly tâm, lò vi sóng, máy lắc vontex, pipetman Các thiết

bị đều đảm bảo tiêu chuẩn về độ chính xác và an toàn

2.2 Phương pháp nghiên cún

2.2.1 Phương pháp tách chiết mẫu nghiên cún

Chiết cao tổng số: Dùng 3kg bột mẫu thực vật khô được chiết 3 lần với ethanol

80% Sau khi cho dung môi chiết vào mẫu (tỉ lệ mẫu : dung môi = 1:3), khuấy đều vàtiến hành siêu âm trong lạnh với tần suất 15Hz/30 phút và tiếp tục được ngâm trongvòng 1 tuần có lắc liên tục Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc Whatman No.l, gom cácdịch lọc, thu loại dung môi trên máy cô chân không ở 30 - 40°c thu được cao tổng số

Chiết phân đoạn các hợp chất tự nhiên : Hòa tan cao tổng số trong một thể tích

tối thiểu nước ấm cho tới khi tan hoàn toàn, sau đó tiến hành chiết phân đoạn qua cácdung môi với độ phân cực tăng dần: n- hexan; ethylaxetat Mỗi phân đoạn được chiết 3lần và tính kết quả trung bình Khối lượng các phân đoạn dịch chiết trong các thínghiệm được tính gián tiếp từ thành phần phần trăm của mẫu khô tuyệt đối.

2.2.2. Phương pháp khảo sát thành phần hóa học của cây Dâu tằm (Morus

8

Diazo hóa Diazo

Phản ứng cho màu da cam là dươngtính

sự có mặt của chalcon và auron

9

2.2.2.2 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin Ciocalteau

Nguyên tắc: dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol (trong mẫu) vớithuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phấm màu xanh lam So màu trên máy quang phố

uv VIS 1000 ở bước sóng X = 765 nm, dùng chất chuấn là acid gallic

Các bước tiến hành như sau:

* Chuấn bị mâu định ỉượng và hóa chât.

Dung dịch acid gallic; 0.5 g acid gallic + lOml C2H5OH + 90ml H20 bảo quảnlạnh Như vậy dịch chuẩn gốc aid gallic có nồng độ 5mg/ml

Dung dịch Na2C03; 200g Na2C03+800ml H20 đun sôi Thêm một vài giọt tinhthể Na2C03, sau 24 giờ đem lọc và dẫn nước cất tới lOOOml

Dung dịch mẫu cần định lượng

0

* Tiến hành xây dựng đường chuẩn acỉd gallỉc.

Chuẩn bị cốc định lượng theo số lượng dung dịch gốc như sau: 0,1, 2,

3, 5 và lOml sau đó dẫn nước cất tới lOOml ta thu được các nồng độ 0, 50, 100,

150, 250, và 500mg/l acid gallic

Cho vào mỗi cuvert 20 |jl mẫu thử (dung dịch gallic chuẩn ở các nồng độ hoặcdịch chiết các phân đoạn ) + 1.58 ml H20 + 100 ịalthuốc thử Folin- Ciocalteau sau 30giây đến 8 phút cho thêm 300 |al Na2C03 Đẻ hỗn hợp dunh dịch phản ứng trong hai giờ

ở 20°c rồi xác định ở bước sóng 765 nm Tiến hành định lượng acid gallic để dựngđường chuẩn

* Ket quả xây dựng đường chuấn acid gallỉc

Bảng 2.2 Kết quả đường chuẩn gallic

Định lượng polyphenol tổng số:

Cân 10 mg mẫu thử thuộc mỗi phân đoạn dịch chiết hòa tan trong 1 ml ethanol90%, bổ sung thêm nước cất vào cho đủ 10 ml dung dịch để thu được dung dịch gốc cónồng độ chất tan là 10.000 mg/1 Lấy 1 ml dung dịch gốc hòa với 9 ml nước cất thuđược dung dịch cao có nồng độ 1000 mg/1

Tiến hành thí nghiệm tương tự như đối với dung dịch acid gallic, xác định giá trị

OD, từ đó tính nồng độ polyphenol trong dung dịch và thành phần phần trăm về khốilượng polyphenol trong mỗi phân đoạn dịch chiết

Theo đó:

Hàm lượng polyphenol trong dung dịch = 1000 X (OD - 0,0128) (mg/1)

2.2.3 Nghiên cún tác dụng của dịch chiết các phân đoạn lá cây Dâu tằm lên trọng lượng và một số chỉ số hóa sinh máu của chuột BP thực nghiệm

2.2.3.I Xây dụng mô hình chuột BP thực nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, sau khi mua về chuột được chăm sóc bình thườngtrong 3-4 ngày để thích ứng với môi trường mới sau đó tiến hành phân chuột thành 2

nhóm với hai chế độ dinh dưỡng như sau [17]:

Nhóm 1 - Nhóm đối chúng' Các con chuột tiếp tục được chăm sóc bằng thức ăn

bình thường (do viện Vệ sinh Dịch tễ cung cấp)

Nhóm 2 - Nhóm nuôi béo: Các con chuột được chăm sóc bằng chế độ thức ăn

giàu lipid và cholesterol

Bảng 2.3 Thành phần thức ăn giàu lipid

được kiếm tra hàng tuần Vào tuần cuối cùng thời gian thí nghiệm, sau khi xác địnhtrọng lượng, chúng tôi tiến hành lựa chọn ngẫu nhiên từ mỗi nhóm ra 10 con chuột, lấymáu tổng số và phân tích một số chỉ số lipid máu Các số liệu được thu thập và tiếnhành xử lý thống kê.

2.23.2. Thử độc tính cấp, xác định LD50

Xác định độc tính cấp với liều lượng hóa chất gây chết cho 50% động vật thửnghiệm (LD50) của dịch chiết lá cây Dâu tằm theo phương pháp Lorke [16] Chuột nhịnđói trước 16 giờ làm thí nghiệm, được phân lô ngẫu nhiên N=10 và cho uống theo liềutăng dần cho đến 8g/kg (liều tối đa cho phép) Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong

72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết

2.2.4 Nghiên cún tác dụng hạ đưòng huyết của dịch chiết lá cây dâu tằm lên chuột nhắt gây ĐTĐ bằng STZ

Đe tìm hiểu tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết lá cây Dâu tằm trước tiênchúng tôi tiến hành gây mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2 dựa trên chế độ ăn giàuchất béo kết hợp vói STZ liều thấp [17], [18]

2.2.4.I Phương pháp gây ĐTĐ thực nghiệm mô phỏng type 2

Chuột nuôi BP được gây ĐTĐ type 2 bằng tiêm STZ (1 lOmg/kg pha trong đệmcitrate 0.0IM, pH = 4.3) dưới màng bụng, gây rối loạn trao đổi glucose máu của chuột

BP thực nghiệm nhằm tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2 phát triển từ BP Trước khi thínghiệm cho chuột nhịn đói 16h Sau đó chúng được uống nước và ăn bình thường Sau

từ 3- 4 ngày những con chuột này bị bệnh với nồng độ glucose huyết được xác định

>18 mmol/1 Tiến hành phân các lô chuột (mỗi lô gồm 5 con) đã bị bệnh để nghiên cứukhả năng hạ đường huyết khi sử dụng các phân đoạn dịch chiết từ lá cây Dâu tằm

Lô 1: Lô STZ nhóm đối chứng không điều trị

Lô 2: Lô STZ điều trị bằng phân đoạn EtOH Lô 3:

Lô STZ điều trị bằng phân đoạn n-hexan Lô 4: Lô

STZ điều trị bằng phân đoạn EtOAc

Chuột bị bệnh uống điều trị các phân đoạn dịch chiết từ lá cây Dâu tằm được tiến

3

hành đo nồng độ glucose huyết của chuột ở các thời điểm khác nhau và tiến hành cácxét nghiệm tiếp theo Sau đó tiếp tục điều trị cho chuột trong vòng 21 ngày (3 tuần).

2.2.4.2 Thử khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết từ lá cây Dâu tằm trên mô hình chuột ĐTĐ type 2

Các lô chuột ĐTĐ type 2 (5 con/lô) được ăn thức ăn thường và điều trị hằngngày bằng cách cho uống phân đoạn dịch chiết từ lá cây Dâu tằm với liều 2000mg/kg.Đường huyết của các con chuột được đo vào cùng một thời điểm trong ngày và sau khinhịn đói 12 giờ ở các ngày thứ 0 (trước khi điều trị), ngày thứ 5, 10, 15, 21 khi điều trị

Bảng 2.4 Mô hình nghiên cún khả năng hạ glucose của các phân đoạn

dịch chiết từ lá cây Dâu tằm

Z Điều trị cao phân đoạn ethylacetate (2000mg/kg)

2.2.5 Sử dụng phương pháp hóa sinh - y dược

2.2.5.1 Phưong pháp định lượng glucose huyết

+ Phản ứng 2: Hydro peroxide vừa tạo ra sẽ phản ứng với O-Dianisidin tạo phứcmàu và được thiết bị đo quang học trong máy One Touch Ultra chuyển hóa định lượng

4

biểu thị bằng số mmol/L hoặc mg/dl glucose.

* Tiến hành: Ân nút điều khiến đế khởi động máy Gắn que thử vào máy Dùngkim châm chuyên dụng châm vào mạch máu ở đuôi chuột, để máu chảy tựnhiên, thấm bỏ giọt đầu tiên, lấy giọt máu thứ 2 Mầu máu dùng cho việc đo là1ịjL, phải là giọt máu tròn đầy, phủ kín giọt máu lên vùng phản ứng của quethử Sau 5 giây, kết quả nồng độ đường huyết sễ hiến thị trên màn hình

2.2.5.2 Định lượng một số chỉ số lipid trong huyết thanh

Các chỉ số lipid huyết thanh (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL-C, LDL-c)được xác định trên máy xét nghiệm sinh hóa tự động (Phòng hóa sinh - Bệnh viện Hữunghị Việt - Xô) Nguyên tắc xác định của mỗi chỉ số như sau:

b) Định lượng cholesterol toàn phần

Thuỷ phân cholesterol este bang enzyme cholesterol esterase (CHE) và oxy hoábang cholesterol oxydase (CHO) Đo mật độ quang của quynonimin tạo nên từ phảnứng của hydrogen peroxide với 4-aminophenazone với phenol nhờ xúc tác củaperoxydase Các phản ứng:

5

Cholesterol este + H^o CHE I Cholesterol + acid béo

Cholesterol + O2 CHO » Chlesterol-3-one + H20 H2O2 +

4-aminophenazone + Phenol _Peroxỵdase ^ Quynonimin + H20

Đo mật độ quang của Quynonimin ở bước sóng 546nm (bằng máy OlympusAU400), so với ống chuẩn để tính kết quả

c) Định lượng HDL-C

Nguyên tắc: Xét nghiệm gồm hai bước đặc hiệu Bước thứ nhất cholesterol trong

chylomicron, VLDL, LDL bị loại bỏ và phá hủy bằng các phản ứng enzyme đặc hiệu.Bước thứ hai cholesterol trong HDL được định lượng bằng phản ứng enzyme với sự cómặt của chat surfactant đặc hiệu cho HDL

bằng thuật toán t- test student với p < 0.05 có ý nghĩa thống kê.

* Tỷ lệ hạ glucose huyết, (CHL, HDL-C, LDL-C, TG) được tính theo công thức dưới đây

A - Chỉ số glucose huyết tại thời điểm ban đầu B -

Chỉ số glucose huyết tại thời điểm đánh giá

Sự khác biệt được kiểm định bằng thuật toán t- test student với p< 0.05 có ý nghĩa thống kê

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẲO LUẬN

3.1. Tách chiết các phân đoạn dịch chiết lá cây Dâu tằm (Morus alba L.)

3.1.1 Quy trình tách chiết các phân đoạn dịch chiết lá cây Dâu tằm

7

Hình 3.1 Quy trình chiết xuất các chất tự nhiên từ lá cây Dâu tằm

Từ 3 kg bột ỉá cây Dâu tằm khô được ngâm kiệt 3 lần trong ethanol 80%, loạidung môi dưới áp suất giảm thu được tống khối lượng mẫu cao cồn tổng số là 200g.Giữ lại 50g dùng cho quá trình phân tích và điều trị cho chuột, khối lượng cao cồn cònlại (150g) dùng đế tách chiết qua các dung môi hữu cơ có độ phân cực khác nhau.Khối lượng mẫu thu được khi lần lượt chiết qua các dung môi của lá cây Dâu tằmđược trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Khối lượng cao thu được khi chiết qua các phân đoạn và hiệu suất

8

PĐ Mầu ban đầu (g) Mẩu khô

(Tính theo nguyên liệu khô ban đầu)

Từ phương pháp chiết rút được trình bày ở hình 3.1, chúng tôi đã thu được một

số cao phân đoạn tan trong các dung môi hữu cơ có độ phân cực khác nhau để sử dụngcho các nghiên cún tiếp theo

3.1.2 Kết quả định tính các họp chất tự nhỉên trong các phân đoạn dịch chiết từ lá cây Dâu tằm

Chúng tôi tiến hành định tính thành phần một số hợp chất tự nhiên thông quacác phản ứng hóa học và một số thuốc thử tương ứng Ket quả được trình bày ở bảng3.2

Bảng 3.2 Bảng kết quả định tính một số họp chất tự nhiên trong các phân đoạn

dịch chiết từ lá cây Dâu tằm Nhóm chất Phản úng nhân biết Lá cây Dâu tăm