Nghiên cứu đặc tính hoá sinh, khả năng chống béo phì và rối loạn trao đổi chất của một số hợp chất tự nhiên từ dịch chiết quả phật thủ = (Citrus medica L. var. sarcodactylis (Noot.) Swingle

đặc biệt khả năng hỗ trợ hạ đường huyết các bệnh ĐTĐ thì hầu như chưa được các nhà khoa học ở Việt Nam đề cập nghiên cứu.Xuất phát từ thực tế trên, cùng với mong muốn góp phần vào việc n

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2

NGUYỄN XUÂN HẠNH

NGHIÊN CỨU ĐẢC TÍNH HÓA SINH, KHẢ NĂNG CHỐNG BÉO PHÍ VÀ RÓI LOẠN TRAO ĐỐI CHÁT CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT Tự NHIEN TỪ DỊCH CHIẾT

QUẢ PHẬT THỦ 0Citrus medica L var sarcodactylis (Noot.)

Swingle.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2010

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Bệnh béo phì (Obesity) được tổ chức Y tế Thế giới (WHO) định nghĩa là tình trạng tích luỹ mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng cơ thể hay toàn thân đến mức ảnh hưởng tới sức khoẻ Tổ chức Quốc tế theo dõi bệnh béo phì (Internation Obesity Tast Force - IOTF) cho biết tình trạng béo phì đang tăng lên với tốc độ báo động, không những ở các quốcgia phát triển mà ở cả các quốc gia đang phát triển Hiện nay trên Thế giới có khoảng 1,7 tỷ người thừa cân và mắc bệnh béo phì [3][65] Ớ Việt Nam, theo điều tra mới nhất của Viện Dinh dưỡng cho thấy tình trạng thừa cân (2007), béo phì cũng đang tăng nhanh, trong đó tỷ lệbéo phì ở người trưởng thành, từ 25 - 64 tuổi, lên tới 16,8% [13]

Người bị béo phì ngoài thân hình nặng nề, khó coi còn có nguy cơ mắc nhiều bệnh như rối loạn lipid máu, rối loạn về tim mạch, đột qụy, tăng huyết áp, sỏi mật, xương khớp, ung thư và Đái tháo đường (ĐTĐ) trong đó biến chứng của bệnh tim mạch và đột qụy là yếu tố gây tử vong hàng đầu [3][31]

Do tốc độ phát triển nhanh của bệnh nên nhu cầu về thuốc điều trị cũng tăng nhanh Ngày nay, hàng loạt thuốc điều trị bệnh béo phì đã ra đời và đang được sử dụng nhằm hạn chế sự phát triển của bệnh như: Sibutramine, Orlistat, Metformin , tuy nhiên đây đều là những loại thuốc không rẻ và thường kéo theo nhiều phản ứng phụ của cơ thế [3]

Uỷ ban chuyên gia của WHO đã khuyến nghị nên phát triển và sản xuất các thuốc có nguồn gốc thảo dược vì đây là nguồn dược liệu sẵn có, giá thành rẻ và ít độc [19] [31] [56].Việc nghiên cứu, khảo sát về thành phần hoá học và tác dụng dược lý của các loài cây thuốc có giá trị của Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng một cách hợp

lí, hiệu quả có tầm quan trọng đặc biệt trong Y - Dược học Phật thủ - Citrus medỉca L var sarcodactylis (Noot.) Swingle, thuộc họ Cam - Rutaceae là một cây thuốc quý Trong dân

gian, bộ phận thường dùng là quả, ngoài ra hoa, lá và rễ cũng được dùng, quả Phật thủ có công dụng: Dùng trị các bệnh như: trướng đầy bụng, đau dạ dày; chán ăn, nôn mửa; ho dai dẳng có nhiều đờm [5][18] Tuy nhiên, về tác dụng chống béo phì và rối loạn trao đổi chất,

đặc biệt khả năng hỗ trợ hạ đường huyết các bệnh ĐTĐ thì hầu như chưa được các nhà khoa học ở Việt Nam đề cập nghiên cứu.

Xuất phát từ thực tế trên, cùng với mong muốn góp phần vào việc nghiên cứu, phát hiện thêm các thuốc có nguồn gốc thảo dược để dự phòng và chữa bệnh béo phì, chúng tôi chọn đề tài:

“Nghiên cứu đặc tính hoá sinh, khả năng chống béo phì và rối loạn trao đổi chất

của một số hợp chất tự nhiên từ dịch chiết quả Phật thủ (Citrus medica L var.

sarcodactyỉỉs (Noot.) Swingle.)”

2.3 Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết từ quả Phật thủ lên chỉ so glucose máu của chuột béo phì được tiêm STZ liều thấp (110 * 120mg STZ/kg) để tạo mô hình thực nghiệm ĐTĐ type 2

3 Nhiệm yụ nghiên cún

Dựa trên mục tiêu nghiên cứu chúng tôi xác định các nhiệm vụ cụ thể của luận văn như sau:

3.1 Đưa ra quy trình tách chiết một số họp chất từ quả Phật thủ

3.2 Khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên có trong quả Phật thủ ở các phân đoạn dịch chiết

3.3 Nghiên cún tác dụng của một số phân đoạn dịch chiết từ quả Phật thủ lên sự giảm trọng lượng và một số chỉ số hoá sinh trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm

3.4 Nghiên cún khả năng điều hoà đường huyết của các phân đoạn dịch chiết từ quả Phật thủ trên mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng theo type 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng

4.1.1 Mau thực vật

Quả Phật thủ (Citrus medỉca L var sarcodactylỉs (Noot.) Swingle) Thời gian thu hái:

Được thu mua vào tháng 11 năm 2009 tại Thành phố Hà Nội và Thành phố Hải Phòng

5 Phương pháp nghiên cửu

5.1 Phương pháp chiết xuất

5.2 Phương pháp khảo sát thành phần hoá học

5.2.1 Phương pháp định tính thành phần hoá học của quả Phật thủ

5.2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất bằng kĩ thuật sắc kí lóp mỏng [17]

5.2.3 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin - Ciocalteau (Singleton và cộng sự 1999)

5.3 Phương pháp tạo mô hình động vật thực nghiệm: Chuột béo phì thực nghiệm, chuột ĐTĐ type 2

5.4 Phương pháp định lượng một số chỉ số hoá sinh máu [11][17]

5.5 Phương pháp xử lý thống kê toán học [20]

6 Những đóng góp mới của đề tài

s Đưa ra quy trình tách chiết phân đoạn các họp chất tự nhiên từ quả Phật thủ.

S Đánh giá được tác dụng của một số phân đoạn dịch chiết từ quả Phật thủ đến khả năng

giảm trọng lượng và một số chỉ số hoá sinh của chuột béo phì thực nghiệm

S Đánh giá được khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết lên mô hình

chuột ĐTĐ mô phỏng type 2 thông qua chỉ số glucose huyết

CHƯƠNG 1 TỎNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các họp chất thực vật thứ sinh (Plant secondary metabolỉtes)

1.1.1 Một số khái niệm cơ bản về hợp chất thực vật thứ sinh

Hợp chất thực vật thứ sinh là các sản phẩm của các quá trình trao đổi chất được sinh ra

ở thực vật Chúng là các chất hoá học thứ cấp (Secondary products) được tổng hợp và chuyểnhoá từ các chất trao đổi bậc nhất (primary compotunds) như axit amin, axit nucleic,

carbonhydrate, lipid, peptid, hoặc từ các sản phẩm trung gian của chu trình đường phân, chu trình pentose - phosphate, chu trình axit citric Khác với các chất trao đổi bậc nhất, giữ vai trò trung tâm và tham gia trực tiếp vào các quá trình trao đổi chất của cơ thể, các hợp chất thực vật thứ sinh không phải là các yếu tố đặc biệt cần thiết cho các quá trình sinh trưởng, phát triến, quang hợp và sinh sản [70] Chúng được tạo ra trong các tế bào chuyên biệt với vaitrò điều hoà mối quan hệ qua lại giữa các tế bào trong cơ thể và là các hợp chất phòng thủ giúp thực vật chống chịu lại với các bệnh xâm nhiễm thực vật đối với môi trường sống xung quanh [61]

Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học và các thuộc tính lý học của chúng mà các họp chất thực vật thứ sinh được phân loại thành 3 nhóm chính là: Nhóm terpen, nhóm các hợp chất phenolic và nhóm alkaloid

1.1.1.1 Terpen thực vật

Terpen là nhóm hydrocacbon thực vật lớn và đa dạng nhất, được hình thành từ quá trình polymer hoá các tiếu đơn vị isopren (C5H8), có công thức cấu tạo chung là (C5H8)n Trong thực vật, terpen được tổng hợp thông qua con đường trao đổi chất acetate/mevanolate hoặc con đường glyceraldehydes - 3 - phosphate/pyravate Hầu hết các terpen đều thuộc

nhóm hydrocarbon, tuy nhiên chúng có thể bị khử hoặc bị oxy hoá để hình thành các hợp chấtterpenoid khác nhau như alcohol, ketone, acid và aldehyde Vì vậy, một số tác giả sử dụng thuật ngữ “terpen” để chỉ chung một nhóm lớn các hợp chất bao gồm cả terpen và terpenoid [63].

S Nhóm hợp chất phenolỉc đơn giản: Trong phân tử chỉ có một vòng benzen và một vài

nhóm hydroxyl Tuỳ thuộc vào số lượng nhóm -OH mà chúng được gọi là các monophenol (phenol), diphenol (pyrocatechin, hydroquinone ), triphenol (pyrogalol, oxyhydroquynol )

s Nhỏm họp chất phenolic phức tạp: Trong thành phần cấu trúc phân tử của chúng ngoài

vòng thơm benzen (C6) chúng còn có dị vòng, mạch nhánh Đại diện nhóm này có acid cyamic, acid ceramic

s Nhóm họp chất phenolic đa vòng: Là nhóm đa dạng nhất trong các họp chất phenol, có

cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc trùng họp của các đơn phân Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng Nhóm này có flavonoid, tannin và

coumarin

Hợp chất phenolic được hình thành một cách dễ dàng trong tất cả các cơ quan thực vật từ những sản phấm đường phân và chu trình pentose phosphate qua acid sikimic hay theo

Squalen

con đường acetate manolate qua acetyl-SCoA Trong số các chất polyphenol tự nhiên, flavonoid là nhóm chất quan trọng nhất vì chúng phổ biến ở hầu hết các loài thực vật và mang nhiều đặc tính sinh dược học có giá trị.

1.1.1.2.1 Flavonoid

Flavonoid là những sắc tố, phần lớn có màu vàng (flavus - nghĩa là màu vàng) Tuy nhiên một số sắc tố khác như xanh, đỏ, tím, hoặc không màu cũng xếp vào nhóm flavonoid

vì chúng có chung đặc điếm cấu tạo

* Cấu tạo hoá học và phân loại

về cấu tạo hoá học, khung cacbon của flavonoid là C6-C3-C6, gồm 15 nguyên tử cacbon, hai vòng benzen A và B nối với nhau qua dị vòng c, trong đó A kết họp với c tạo khung chroman [39] [43]

Hình 1.2 Fia van (2 - phenyl chroman)

Tuỳ theo mức độ oxy hoá vòng pyran, sự có mặt hay không có mặt của nối đôi giữa

c2với c3và nhóm cacbonyl ở c4mà có thể phân biệt flavonoid thành các nhóm phụ sau: Flavon và flavonol, flavanol (đihidro flavon), chalcol, aurol, leucoantoxianidin, catechin, isoflavonoid, rotenoid và neoflavonoid [72]

2 ' - 3 '

■O H Glucose

Flavonoid có khả năng kìm hãm các quá trình oxy hoá dây truyền gây ra bởi các gốc

tự do hoạt động Tuy nhiên hoạt tính này mạnh hay yếu còn phụ thuộc vào đặc điểm của từng flavonoid cụ thể

Gốc tự do sinh ra trong quá trình sinh lý bình thường của cơ thế hay do tác động bên ngoài là nguyên nhân gây phá huỷ ADN, protein, lipid làm phát sinh nhiều bệnh tật nguy hiểm và sự lão hoá cho cơ thể Flavonoid có bản chất polyphenol nên dễ dàng biến đổi dưới tác động của các enzyme có trong tế bào động thực vật Đặc biệt flavonoid có nhóm hydroxyl

ở vị trí ortho dễ dàng bị oxy hoá bởi xúc tác của enzym polyphenoloxydase tạo semiquynol hoặc quynol [17] Đây là các gốc tự do bền vững chúng có thể nhận điện tử và trở thành dạng hidroquynol Bởi vậy các chất này có khả năng phản úng với các gốc tự do hoạt động và loại chúng ra khỏi cơ thể Quá trình được tóm tắt qua sơ đồ sau:

02 + Flavonoid (dạng khử) —poiyphenoitKydase > Flavonoid (dạng oxy hoá)

Ngoài ra flavonoid còn có tác dụng bảo vệ các hệ thống sinh học nhờ khả năng tạo phức với các kim loại chuyển tiếp như Fe2+, Cu2+ hoạt hoá enzym chống oxy hoá và ức chế

sự oxy hoá

Tác dụng thay đổi hoạt độ các enzyme

Hợp chat phenol nói chung và flavonoid nói riêng có khả năng tương tác với protein, nhờ tính chất này mà các flavonoid có thế làm thay đối hoạt tính enzyme Năm 1929, A.I Oparin và A.L Kursanop đã phát hiện ra các flavonoid có khả năng ức chế nhiều loại enzymenhưng tính chất này không hoàn toàn đặc hiệu Đây chính là cơ sở hoá sinh để định hướng cho việc sử dụng flavonoid thiên nhiên vào lĩnh vực sinh - y học phục vụ sức khoẻ vào đời sống con người [17]

Tác dụng kháng khuẩn

Nhiều công trình nghiên cứu trong nước và thế giới đã chứng tỏ tác dụng chống viêm nhiễm (anti-inflamatory), chống vi khuẩn (anti-bacterial) và virut (antiviral) [2] [8]

Tác dụng làm bền thành mạch máu

Các dẫn xuất đường của flavonoid có hoạt tính của vitamin p như rutin, hesperidin

có tác dụng làm tăng sức bền và tính đàn hồi của thành mao mạch, giảm sức thẩm thấu của hồng cầu qua thành mao mạch Hoạt tính này được ứng dụng trong chữa trị các rối loạn chức năng tĩnh mạch, giãn hay suy yếu tĩnh mạch, trĩ, rối loạn tuần hoàn tĩnh mạch [19]

Tác dụng giảm béo phì và lipid máu

Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật cho thấy khi chuột béo phì được

điều trị bằng dịch chiết giàu ílavonoid từ lá Bằng lăng (.Lagerstroemỉa specciosa L.) thì có

trọng lượng giảm đáng kể (~ 10%) [68] Thí nghiệm tương tự với ílavonoid từ lá Kim ngân

(Lonỉcera ịaponìca Thunb.) đối với chuột cống trắng uống cholesterol cũng cho thấy có tác

dụng làm giảm các chỉ số cholesterol, triglyceride, LDL-C đồng thời tăng HDL-C [29] Naringin (C17H32O4) và Hesperidin (C28H34O15) là những Aavonoid có hàm lượng cao trên

họ Cam chanh (Rutaceae) đã được nhiều nhà nghiên cún chiết xuất và thử tác dụng trên mô

hình chuột béo phì cho kết quả tốt trong việc làm hạ các chỉ số lipid máu [28] [34]

Tác dụng hạ glucose huyết

Một số ílavonoid được tách chiết từ nguyên liệu thực vật đã được chứng minh là có tác

dụng điều hoà glucose huyết như: Quercetin có trong Đỗ trọng (Eucommia uỉmoides Oliver.) [56], Hesperidin và Naringin có trong các cây thuộc họ Rutaceae [46] [48] Genistein và Daidzein có trong đậu nành (Glycỉne max L.) [11], Myricetin có trong cây Vông vang

(Abelmoschus moschatus) [11] Đã có một số nghiên cứu tác dụng của Naringin của các loài Citrus (họ Cam) có vai trò hạ glucose và lipid máu của bệnh béo phì và tiểu đường [48].

Tannin là các hợp chất phenolic có trọng lượng phân tử cao có chứa các nhóm

hydroxyl và các nhóm chức khác như có khả năng tạo phức với protein và các phân tử lớn khác trong điều kiện môi trường đặc biệt Tannin thường là các họp chất vô định hình, có màu trắng, màu vàng nhạt hoặc gần như không màu, có hoạt tính quang học, vị chát, dễ bị oxy hoá khi đun nóng hay khi để ngoài ánh sáng

Tác dụng sinh học của tannin là chất bảo vệ cây trồng trước sự tấn công của vi sinh vậtgây bệnh và côn trùng ăn lá [44][51] Trong y học, tannin được sử dụng làm thuốc cầm máu, chữa đi ngoài, ngộ độc kim loại nặng, chữa trĩ, viêm miệng, viêm xoang, điều trị cao huyết áp

và đột qụy [1 ]

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của tannin

1.1.1.2.3 Phân nhóm coumarin

Coumarin là các dẫn chất của a-pyrone có cấu trúc C6-C3, dị vòng chứa oxy và có trong nhiều loại cây Coumarin là những chất kết tinh không màu, hoặc có màu vàng nhạt, vị đắng, một số lớn dễ thăng hoa, có mùi thơm giống như mùi thơm của valinin hay của cỏ mới khô [26] về hoá học, coumarin có thể tồn tại trong cây ở dạng aglycon tan nhiều trong các dung môi hữu cơ kém phân cực và dạng kết họp với đường glucose tạo thành glycoside dễ tantrong nước Hiện nay đã có hơn 1500 loại coumarin khác nhau tồn tại trong tự nhiên trong

800 loài thực vật đã được nhận dạng [52] Trong cây, coumarins được coi là một trong số các chất “phòng thủ hoá học hữu hiệu” giúp thực vật tránh được những bất lợi do môi trường và dịch bệnh gây ra Trong đời sống hàng ngày, coumarin được sử dụng làm nước hoa, hương liệu, bán tổng họp các chất hoá học khác nhau, đặc biệt là các chất chống đông máu và chất diệt loài gặm nhấm Trong y học, tác dụng đáng chú ý của dẫn chất coumarin là tác dụng chống co thắt, làm giãn nở động mạch vành, làm bền và bảo vệ thành mạch Nhiều chất coumarin có tính kháng khuẩn, một số khác có tác dụng kháng viêm, kháng nấm, kháng khối

u, trừ giun sán, giảm đau và hạ nhiệt

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của coumarin

Đa số alkaloid không có mùi, vị đắng, một số ít có vị cay, ở dạng chất rắn có màu trắng, trừ một vài chất có màu vàng (berberin, palmatin) về vai trò sinh học, các alkaloid được coi là một trong những “hàng rào phòng thủ hoá học hữu hiệu” bảo vệ cây trước sự tấn công của vi sinh vật gây bệnh và các loại côn trùng, sâu bệnh ăn lá [72] về y học, alkaloid được sử dụng rất đa dạng: làm thuốc gây ức chế, hoặc kích thích hệ thần kinh trung ương, dùng làm thuốc điều hoà huyết áp, chữa loạn nhịp tim, thuốc diệt ký sinh trùng, kháng khuẩn, thuốc chống ung thư và nhiều tác dụng quan trọng khác Dưới đây là 3 dạng alkaloid điển hình:

Hình 1.6 Các dạng alkaloid điển hình 1.1.2 Vai trò của các họp chất thực vật thử sinh

Các họp chất thứ sinh có rất nhiều vai trò quan trọng, mang chức năng sinh thái đặc biệt, giúp cho thực vật sống sót, phát triển và tồn tại:

- Giúp cơ thể chống lại bệnh tật, ký sinh trùng và các vi sinh vật gây nhiễm bệnh

- Giúp cơ thể chống lại các yếu tố bất lợi trong quá trình sinh tồn

- Tạo lợi thế cạnh tranh giữa các loài khác nhau.

- Tạo thuận lợi cho các quá trình sinh sản: Nhiều sắc tố ílavonoid đóng vai trò là chất dẫn dụ động vật và côn trùng tham gia vào việc thụ phấn và phát tán hạt [17][26][56]

1.1.3 ứng dụng của các họp chất thực vật thử sinh

- Công nghệ Y- Dược: Rất nhiều họp chất thứ sinh được sử dụng để sản xuất nhiều loại

thuốc điều trị các bệnh khác nhau như: Quinin dùng làm thuốc trị sốt rét, quinidin dùng làm thuốc trợ tim, daizein dùng làm thuốc chống ung thư [17][18]

- Công nghệ hoả thực phẩm: Dùng làm gia vị, phẩm màu, hương liệu

- Công nghệ hoả mỹ phẩm: Dùng làm nước hoa, xà phòng, mỹ phẩm

- Sản xuất hàng tiêu dùng: Dùng làm dung môi, keo dán, hàng dệt

may

- Dùng làm nguyên liệu sản xuất thuốc bảo vệ thực vật.

1.2 Bệnh béo phì (Obesity)

1.2.1.Khái niệm và phân loại bệnh béo phì

Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) định nghĩa béo phì (obesity) là tình trạng tích luỹ mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng hay toàn bộ cơ thể gây ảnh hưởng tới sức khoẻ

Đe nhận định tình trạng béo gay WHO thường dùng chỉ số khối cơ thể (BMI - Body Mass Index) Chỉ số khối cơ thể được tính theo công thức như sau:

Quá cân >23 > 25 - 29,9

1.2.2 Thực trạng béo phì trên Thế giới và Việt Nam

Theo tổ chức Y tế Thế giới, hiện nay số người béo phì trên thế giới đã lên đến hơn 1,7

tỉ người Trên thế giới cứ 4 người trưởng thành thì có một người béo phì, tức là số người béo phì ở độ tuối trưởng thành trên thế giới chiếm 25% [3] Tình trạng béo phì đang tăng lên với tốc độ báo động, không những ở các quốc gia phát triển mà ở cả các quốc gia đang phát triến

Tỉ lệ người béo phì ở Mỹ chiếm tới hơn 30%, Trung Quốc có hơn 20% số người thừa cân và béo phì số người béo phì cũng đang báo động ở châu Âu, đúng đầu bảng là nước Anh với hơn 23% số người béo phì, và châu Âu hiện có tới hon 14 triệu trẻ em thừa cân và béo phì Còn ở châu Mỹ thì Braxin cũng là nước có tỉ lệ người dân bị béo phì cao (chiếm 16%) [3]

Theo tiêu chuẩn châu Á, Việt Nam hiện có 16,8% số người ở độ tuổi từ 25 - 64 đã thừa cân, béo phì Theo đó thì cứ 100 người trong độ tuổi trưởng thành thì có 17 người béo phì, và tỉ lệ người béo phì ở thành phố gấp 3 lần ở nông thôn Tình trạng thừa cân béo phì tăng nhanh ở tuối ngoài 45 (chiếm 2/3 số người béo phì) và nữ giới có tỉ lệ béo phì cao hơn nam giới Còn đối với trẻ em thì tình trạng béo phì cũng ở mức đáng ngại Theo kêt quả điều tra của Viện dinh dưỡng: Ở Hà Nội có tới 4,9% số trẻ ở độ tuổi từ 4 - 6 bị thừa cân béo phì

Ớ Thành phố Hồ Chí Minh tỉ lệ này còn cao hơn nhiều, có tới 6% số trẻ dưới 5 tuổi và 22,7%

số trẻ đang học ở cap I bị thừa cân béo phì Đây thật sự là mối đe dọa tiềm ẩn trong tương lai, ảnh hưởng lớn đến sức khỏe của mỗi người và sự phát triển của kinh tế và xã hội [3]

1.2.3 Nguyên nhân gây ra bệnh béo phì

Mọi người đều biết cơ thể giữ được cân nặng on định là nhờ trạng thái cân bằng giữa năng lượng do thức ăn cung cấp và năng lượng tiêu hao cho lao động và các hoạt động khác của cơ thể Cân nặng của cơ thể tăng lên có thể do chế độ ăn dư thừa vượt quá nhu cầu hoặc

do nếp sống làm việc tĩnh tại ít tiêu hao năng lượng

Khâu phần ăn và thói quen ăn uống: Năng lượng (calorie) được đưa vào cơ thể qua

thức ăn, thức uống được hấp thụ và được oxy hoá đế tạo thành nhiệt lượng Năng lượng ăn quá nhu cầu sẽ được dự trữ dưới dạng mỡ

Chế độ ăn giàu chất béo (ỉỉpỉđ) có liên quan chặt chẽ với gia tăng tỉ lệ béo phì Các

thức ăn giàu chất béo thường ngon nên người ta ăn quá thừa mà không biết Vì vậy, khấu phần ăn có nhiều mỡ, dù số lượng nhỏ cũng có thể gây thừa calorie và tăng cân Không chỉ ănnhiều mỡ, thịt mà ăn nhiều chất bột, đường, đồ ngọt đều có thể gây béo

Việc thích ăn nhiều đường, ăn nhiều món xào, rán, những thức ăn nhanh nấu sẵn và miễn cưỡng ăn rau quả là một đặc trưng của trẻ béo phì Thói quen ăn nhiều vào bữa tối cũng

là một điếm khác nhau giữa người béo và người không béo

Vận động thế lực kém: Cùng với yếu tố ăn uống, sự gia tăng tỉ lệ béo phì song song

với sự giảm hoạt động vận động thể lực trong một lối sống tĩnh tại hon, thời gian dành cho xem tivi, đọc báo, làm việc bang máy tính, nói chuyện qua điện thoại nhiều hơn

Kiểu sống tĩnh tại cũng giữ vai trò quan trọng gây nên béo phì Những người ít hoạt động thể lực, thường ăn những thức ăn giàu năng lượng, khi họ thay đổi lối sống và hoạt độngnhưng vẫn giữ thói quen ăn nhiều cho nên họ bị béo phì Điều này giải thích béo phì biểu hiện

ở tuổi trung niên, hiện tượng béo phì ở các vận động viên sau khi giải nghệ và công nhân lao động chân tay có xu hướng béo phì khi về hưu.[3][27][31]

Yeu to di truyền: Đáp ứng phát sinh nhiệt kém có thể do yếu tố gen di truyền Yeu tố

di truyền có vai trò nhất định đối với những trẻ béo phì thường có cha mẹ béo và đã được nghiên cún trên chuột vói các gen ob ob Tuy vậy nhìn trên đa số cộng đồng thì yếu tố này không lớn

Yeu tố kỉnh tế xã hội: Ở các nước đang phát triển, tỉ lệ người béo phì ở tầng lóp nghèo

thường thấp (thiếu ăn, lao động chân tay nặng, phương tiện đi lại khó khăn) và béo phì thường được coi là một đặc điểm của người giàu có Ở các nước đã phát triển, khi thiếu ăn không còn phổ biến nữa thì tỉ lệ béo phì lại thường cao ở tầng lớp nghèo, do thói quen ăn uống thiếu khoa học của họ

1.2.4 Tác hại và những nguy cơ của bệnh béo phì

Mất thoải mải trong cuộc sống: Người béo phì thường có cảm giác khó chịu về mùa

hè do lớp mỡ dày như một hệ thống cách nhiệt Người béo phì cũng thường xuyên cảm thấy mệt mỏi chung toàn thân, hay nhức đầu, tê buốt ở hai chân làm cho cuộc sống thiếu thoải mái

Giảm hiệu suất lao động: Người béo phì làm việc chóng mệt, nhất là ở môi trường

nóng Mặt khác do khối lượng cơ thể quá nặng nề nên để hoàn thành một động tác, một công việc trong lao động, người béo phì mất nhiều thì giờ hơn và mất nhiều công sức hơn Hậu quả

là hiệu suất lao động của người béo phì giảm rõ rệt hơn so với người bình thường

Kém lanh lợi: Người béo phì thường phản ứng chậm chạp hơn so người bình thường

trong sinh hoạt cũng như trong lao động Hậu quả là rất dễ bị tai nạn xe cộ cũng như tai nạn lao động [27]

Hai nguy cơ rõ rệt ở người béo phì:

Tỉ lệ bệnh tật cao, béo phì là một trong các yếu tố nguy cơ chính của các bệnh mãn tính không lây như rối loạn lipid máu, bệnh mạch vành, đái tháo đường không phụ thuộc insulin (thường gọi là ĐTĐ type 2), sỏi mật Ớ phụ nữ mãn kinh, các nguy cơ ung thư túi mật, ung thư vú và ung thư tử cung tăng lên, còn ở nam thì bệnh ung thư thận và ung thư tuyến tiền liệt hay gặp hơn.[31]

Tỉ lệ tử vong cũng cao hơn, nhất là trong những bệnh kể trên [53][55]

1.2.5 Giải pháp phòng và điều trị bệnh béo phì

Nguyên tắc cần thiết để phòng và điều trị bệnh béo phì là: Thực hiện một chế độ ăn uống họp lý và hoạt động thể lực đúng mức để duy trì sự ổn định cân nặng của cơ thế Các biện pháp cụ thể là:

- Chế độ ăn: Đảm bảo đủ năng lượng, ít đường, ít chất béo, đủ đạm, vitamin, nhiều rauquả

- Luyện tập thể dục thường xuyên ở môi trường thoáng đãng

- Xây dựng nếp sống năng động, tăng cường các hoạt động thể lực

Đối với những bệnh nhân béo phì, ngoài các biện pháp kể trên còn kết

họp với sử dụng thuốc hoặc phẫu thuật

- Sử dụng thuốc: Thuốc giảm cân không được sử dụng vì mục đích thẩm mỹ, mà chỉ

được sử dụng cho những bệnh nhân có BMI lớn hon 27 và có các vấn đề về sức khoẻ mà phảigiảm cân thì mới cải thiện được Các loại thuốc thường được sử dụng hiện nay là:

+ Metformin: Có tác dụng giảm mỡ máu dẫn đến giảm trọng lượng, tuy nhiên nó cũnghay gây tác dụng phụ là buồn nôn, tiêu chảy, gây toan máu

+ Orlistat (Xenical): Làm ức chế lipase và sự hấp thu mỡ ở một, tác dụng phụ của orlistat là làm suy giảm khả năng hấp thụ vitamin tan trong mỡ

+ Các thuốc ức chế sự thèm ăn như: Ephedrine, caffeine [3][31 ]

Tuy nhiên sử dụng thuốc cũng thường gây ra những tác dụng phụ không mong muốn, nên cần hết sức thận trọng khi sử dụng thuốc

- Phẫu thuật để giảm cân: áp dụng đối với những bệnh nhân có BMI trên 35, kèm theo các bệnh lý và rối loạn liên quan Phẫu thuật mang lại thành công rất lớn, nhiều người giảm được đến 50% cân nặng trong vòng 1 - 2 năm đầu sau phẫu thuật, tuy nhiên nó cũng gây ra nhiều tác dụng phụ như suy nhược, khô da, rụng tóc tạm thời [3][65]

1.2.6 Rối loạn trao đối lipid máu

Huyết thanh người bình thường có 5 - 7 g/1 lipid toàn phần bao gồm acid béo tụ’ do, triglyceride, cholesterol toàn phần với hai dạng cholesterol tự do và cholesterol este, các photpholipid Vì không tan trong nước nên lipid được vận chuyển trong máu dưới dạng kết họp với các protein đặc hiệu Các acid béo tự do được vận chuyển chủ yếu bởi albumin, các lipid khác được lưu hành trong máu dưới dạng phức hợp lipoprotein như: các hạt

chymomicron, VLDL, HDL, IDL, LDL Các lipoprotein này có kích thước, thành phần, tỉ trọng và chức năng khác nhau trong quá trình chuyển hoá lipid [9] [24] [53] [73]

Đe đánh giá lượng mỡ trong máu người ta làm xét nghiệm với các chỉ

Tình trạng rối loạn hoặc tăng nồng độ các thành phần lipid trong máu, hậu quả là sự tạo thành các mảng xơ vữa gây tắc mạch làm tăng nguy cơ biến chứng tim mạch và đột qụy, tăng các biến chứng mạch máu khác, hậu quả nặng nề nhất là dẫn đến tử vong hoặc tàn phế gọi là rối loạn chuyển hoá [3] Ngày nay người ta đã xem là có rối loạn lipid máu ngay từ khi

tỉ lệ thành phần của lipid máu có sự thay đổi Khái niệm này chỉ rõ rối loạn lipid máu có thể xảy ra từ rất sớm, ngay cả khi chưa có tăng các giá trị tuyệt đối nồng độ của các thành phần trong máu [3] Rối loạn này có thể tiên phát do di truyền hoặc thứ phát sau các bệnh khác như: Béo phì, ĐTĐ, nghiện rượu, suy giáp trạng

Fredrickson căn cứ vào kĩ thuật điện di và siêu ly tâm với các thành phần huyết thanh đã phânloại chứng tăng lipid máu thành 5 type dựa trên những thay đổi thành phần lipoprotein Cách phân loại này đã được WHO chính thức sử dụng vào năm 1970 [23] Nhiều nghiên cún đã chứng minh người mắc bệnh béo phì có nguy cơ cao mắc các bệnh rối loạn lipid máu dẫn đến

xơ vữa động mạch (liên quan chủ yếu đến các lipoprotein) hoặc hiện tượng “nhiễm độc mỡ tếbào” [19][23]

1.2.7 Mối quan hệ giữa béo phì và đái thảo đường

Béo phì và ĐTĐ là hai bệnh không truyền nhiễm nguy hiếm nhất của thế kỷ 21 Hai căn bệnh này có mối quan hệ chặt chẽ với nhau thế hiện ở chỗ tỉ lệ người béo phì luôn tăng tương đương với số bệnh nhân bị ĐTĐ Một cuộc khảo sát của Mỹ gần đây đã chỉ ra rằng có tói 58% số người bị ĐTĐ type 2 được quy cho là do béo phì Béo phì liên quan tới ĐTĐ type

2 thông qua sự đề kháng insulin Nồng độ acid béo tự do cứ tăng 100|jM thì mức đề kháng insulin tăng khoảng 5 - 10% [3] Thiếu insulin dẫn đến sự tăng trọng lượng cơ thể, tăng đường máu, cuối cùng dẫn đến bệnh ĐTĐ type 2

Có nhiều nhân tố ảnh hưởng tới mối quan hệ giữa béo phì và bệnh ĐTĐ type 2 bao gồm: Chỉ số khối cơ thể, thời gian béo phì, chế độ dinh dưỡng, sự vận động thân thể Một thống kê đã chỉ ra rằng những người có chỉ số khối cơ thế lớn hơn 30 kg/m2 trong 10 năm có nguy cơ mắc bệnh ĐTĐ type 2 cao gấp 2 lần người bị béo phì dưới 5 năm và nếu trọng lượng tăng 1 kg thì rủi ro về bệnh ĐTĐ type 2 tăng 4,5% [31] Đây chính là cơ sở để Reed và cộng

sự đưa ra phương pháp gây mô hình ĐTĐ thực nghiệm ở động vật bằng cách tiêm STZ liều đơn cho chuột đã được vỗ béo nhiều ngày [60][67] Tại Việt Nam, Trần Thị Chi Mai đã áp dụng phương pháp này và đạt hiệu quả 90% chuột xuất hiện ĐTĐ với nồng độ glucose máu >

là sự tăng triglyceride, giảm HDL -c và LDL-C vẫn nằm trong giới hạn bình thường Tuy nhiên ở ĐTĐ type 1 rối loạn tăng triglyceride sẽ mất đi khi kiểm soát được glucose máu khácvới type 2, rối loạn này có thể vẫn kéo dài mặc dù có sự điều trị giảm glucose máu thích hợp LDL-C của type 2 cũng có thế tăng nhẹ và xuất hiện nhiều LDL-C với kích thước nhỏ và nặng hơn khi việc kiếm soát glucose kém Đây chính là yếu tố làm tăng nguy cơ bệnh xơ vữa động mạch [19]

1.3 Bệnh đái tháo đường

1.3.1 Khái niệm và phân loại

Danh từ đái tháo đường (diabetes mellitus) có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp (diabetes: nước chảy trong ống syphon) và tiếng Latinh (mellitus: ngọt) [73] Khoảng 1550 năm trước công nguyên các thầy thuốc Hy Lạp đã mô tả bệnh này với các triệu chứng ăn nhiều, uống nhiều, tiếu nhiều, nước tiểu có đường và sút cân nhanh [3] PGS.TS Tạ Văn Bình thì định nghĩa ĐTĐ là một hội chứng có đặc tính biểu hiện bằng tăng đường máu, do hậu quả của việcmất hoàn toàn insulin hoặc là do có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết và hoạt động của insulin Bệnh ĐTĐ được xác định dựa vào những tiêu chí trong bảng 1.2 [3]

Bảng 1.2 Các tiêu chí để chuẩn đoán ĐTĐ theo WHO [3]

Kết Luận Đường huyết

lúc đói (mmol/1)

Đường huyêt 2 giờ sau khi làm nghiệm pháp tăng đường huyết (mmol/1)

Đường huyêt tại thòi điểm bất kì (mmol/1)

>11,1 kèmtriệu chứnguống nhiều,đái nhiêu vàgầy sút

Rôi loạn dung

♦♦♦ ĐTĐ type 1: Thường xảy ra ở trẻ em và thanh thiếu niên, khởi phát ở các cá thế

có tính mẫn cảm về di truyền với bệnh Nguyên nhân chính của bệnh là tế bào p đảo tụy Langerhans bị phân huỷ dẫn đến mất khả năng sản xuất insulin - một hormone điều hoà lượng đường trong máu Quá trình huỷ hoại tế bào (3 do cơ chế tự miễn [3][25] Người ta đã biết đến 18 vùng gen liên quan đến type này được ký hiệu từ IDDM1 đến IDDM18 Các gen này chủ yếu liên quan đến những yếu tố kháng nguyên bạch cầu người HLA hoặc gen mã hoáinsulin [11]

❖ ĐTĐ type 2: Chiếm 80% - 90% bệnh nhân, có tính quy tụ gia đình và hay gặp ở những người trên 30 tuối Hai yếu tố chính đóng vai trò quan trọng trong cơ thể sinh ĐTĐ type 2 là khiếm khuyết chức năng tế bào (3 tuyến tụy và tình trạng kháng insulin [3][31] Hai yếu tố này luôn có tác động qua lại với nhau và không thể kết luận yếu tố nào xuất hiện trước.Kháng insulin có thể do bất thường ở hậu thụ the insulin, bất thường về số lượng receptor insulin hoặc ái lực gắn hormone của insulin và cũng có thể do acid béo tự do tăng cao gián tiếp làm ảnh hưởng quá trình truyền tin nội bào của insulin ở tế bào đích Bởi vậy, bệnh béo bệu là một trong những nguyên nhân môi trường được đề cập đến nhiều nhất vì chính béo bệu làm gia tăng tình trạng kháng insulin [11]

Sinh bệnh học ĐTĐ type 2 diễn biến qua ba giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Mặc dù nồng độ glucose trong máu vẫn bình thường, nhưng có hiện

tượng kháng insulin vì insulin tăng cao hơn mức bình thường trong máu.

- Giai đoạn 2: Tình trạng kháng insulin có xu hướng nặng dần do có hiện tượng tăng glucose huyết sau ăn

- Giai đoạn 3: Kháng insulin không đổi nhưng bài tiết insulin suy giảm gây tăng glucose huyết lúc đói, bệnh ĐTĐ biểu hiện ra bên ngoài

❖ Ngoài ra còn có ĐTĐ thai nghén và một số type ĐTĐ đặc biệt khác như thiếu hụt chứcnăng tế bào (3, thiếu hụt di truyền về tác động của insulin, bệnh tụy ngoại tiết,

1.3.2 Thực trạng đái thảo đường Thế giới và Việt Nam

Cùng với các bệnh không lây nhiễm khác, bệnh ĐTĐ đang phát triến với tốc độ nhanh chóng cùng sự phát triển của nền kinh tế xã hội Năm 1994, toàn Thế giới có 110 triệu người mắc ĐTĐ Năm 1995 đã tăng lên 135 triệu người chiếm 4% dân số thế giới Dự đoán đến năm 2010 có khoảng 221 triệu và năm 2025 có khoảng 300 triệu bệnh nhân chiếm 5,4% dân

số thế giới Đặc biệt ngày nay tỉ lệ người mắc bệnh ở châu Á đã vượt xa châu Âu - nơi vẫn được xem là 0 bệnh [1] Tại Tây Thái Bình Dương có 12 quốc gia có tỉ lệ ĐTĐ type 2 trên

8%, cá biệt có quốc đảo có tỉ lệ bệnh vượt 40% [13]

Việt Nam hiện nay ĐTĐ đang gia tăng rất nhanh Năm 1990, Hà Nội có tỉ lệ mắc bệnh

là 1,2%, Huế 0,96%, Thành phố Hồ Chí Minh là 2,52%

Theo điều tra quốc gia năm 2002 cho thấy tỉ lệ người mắc bệnh ĐTĐ lứa tuổi từ 30 - 64 trong toàn quốc là 2,7% (khu vực đô thị và khu công nghiệp tỉ lệ tới 4,4%) Đặc biệt bệnh này trongnhóm người có yếu tố nguy cơ là rất cao (10,3%)- Hiện nay, có khoảng 2 triệu người mắc bệnh ĐTĐ nhưng có tới 65% số đó không biết mình đã mắc bệnh Theo PGS TS Tạ Văn Bình: ĐTĐ type 2 ở lứa tuối thanh thiếu niên ngày một tăng nhanh, đây là một vấn đề rất đáng lưu tâm

gây mù loà (1,1%) Bệnh về võng mạc tăng dần theo thời gian phát hiện bệnh.

- Biến chúng thận như: Microalbumin niệu (11,6%), macroalbumin (3%), suy thận từ

- Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin như Sulfonflurea, Nateglinid

1.3.5 Đái tháo đường với y học cố truyền

Theo quan niệm đông y ĐTĐ thuộc phạm vi chứng tiêu khát với ba triệu chứng chính

là ăn nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều do ăn quá nhiều các chất cay, béo, ngọt làm mất cân bằng

âm dương trong cơ thể tạo thành hoả nhiệt, uất nhiệt làm phần âm của phủ tạng như âm, vị, thận bị hao tổn Hoả nhiệt làm phế hư gây chứng tiêu khát, vị âm gây chứng gầy đói, thận hư gây tiểu nhiều và tiểu ra đường Xuất phát từ quan niệm đó nên phương pháp điều trị chủ yếu

là dưỡng âm, thanh nhiệt sinh tân dịch làm cơ thể lập lại cân bằng âm dương trong cơ thể Thảo dược hay dùng là sinh địa, cỏ ngọt, mưóp đắng, hoàng kỳ, huyền sâm [5][18]

1.3.6 Chuyển hoá glucose và sự điều hoà glucose huyết

Glucose trong cơ thể có nguồn gốc chủ yếu từ thức ăn thông qua quá trình tiêu hoá Vào các thời điểm xa bữa ăn hoặc khi glucid thức ăn không đủ, cơ thể sẽ huy động nguồn glucose thứ hai nhờ sự thoái hoá glycogen ở gan, cơ Ngoài ra glucose còn có được nhờ quá trình tân tạo glucose nhò' hệ thống enzyme đặc hiệu riêng biệt (xảy ra ở gan, thận, ruột) từ pyruvat, lactat hay các sản phẩm trung gian của chu trình Krebs

Glucose sau khi được hấp thu hoặc tạo thành trong cơ thể sẽ tan trong máu và được vận chuyển vào trong tế bào nhờ các protein vận chuyến Cuối cùng glucose sẽ thoái hoá đế tạo năng lượng hay các sản phẩm trung gian thông qua quá trình đường phân, chu trình pentose phosphate hay con đường tạo uronic và ascorbic Glucose dư thừa khi nhu cầu năng lượng của cơ thể thấp lại được chuyển thành dạng glucid dự trữ là glycogen ở gan [24]

Đe duy trì nồng độ glucose ổn định trong máu cơ thể phải huy động nhiều cơ chế, có

sự xúc tác của nhiều loại enzym khác nhau nhằm cân bằng giữa lượng glucose đi vào máu và lượng glucose được thu nạp bởi các tổ chức Trong đó quan trọng nhất là việc điều hoà quá trình tân tạo glucose và quá trình thoái hoá glucose có sự tham gia của nhiều protein vận chuyển glucose qua màng tế bào (các GLUT)

Glucose trong cơ thể được điều hoà ổn định bởi các hormone mà chủ yếu là các hormone tuyến tụy nội tiết Insulin là hormon tiết bởi các tế bào ß của đảo tụy Langerhans có tác dụng làm giảm glucose máu do làm tăng dự trữ glycogen ở gan, cơ, ức chế quá trình tân tạo đường mới Glucagon là hormon tiết bởi tế bào a đảo tụy, có tác dụng ngược với insulin, nghĩa là làm tăng sự phân giải glycogen và tăng tân tạo đường mới do đó tăng glucose huyết

1.4 Cây Phật thủ [5]

Phật thủ: Citrus medica L var sarcodactyỉis (Noot.) Swingle, thuộc họ Cam -

Rutaceae.

1.4.1 Mô tả: Cây bụi hay cây gỗ nhỏ, cao 3- 4m, có gai Lá hình trúng, chóp hơi tròn, có khi

lõm, gốc thuôn, cuống ngắn Hoa trắng Quả dài, vỏ mầu vàng sẫm, có nhiều múi chạy dọc theo quả, phía ngọn tách ra trông như những ngón tay chụm lại; cùi dày đặc, giòn và có mùi thơm phức

Cây ra hoa đầu mùa hạ, quả chín vào mùa đông ỉ.4.2 Bộ phận dùng: Quả - Fructus

Citrỉ Sarcoclactylis, thường gọi là Phật thủ (tay phật) Hoa, lá và rễ cũng được dùng.

1.4.3 Noi sống và thu hái: Là cây trồng lấy quả dùng trang trí mâm quả ngày Tet Thu hái

quả vào mùa thu đông khi quả chuyển sang mầu vàng Thái dọc thành từng miếng mỏng rồi phơi hay sấy khô Thu hái rễ vào mùa thu Lá thu hái quanh năm

1.4.4 Thành phần hoá học: Trong phật thủ có tinh dầu và mầu flavonoid, gọi là hesperidin

vỏ quả chứa tinh dầu vỏ quả trong chứa limettin; ngoài ra còn diosmin và hesperidin [54]

1.4.5 Tính vị, tác dụng: Quả có vị cay, chua và đắng, tính ấm, có tác dụng hành khí chỉ

thống, kiện vị, hoá đàm

1.4.6 Công dụng: Dùng trị: 1 Trướng đầy bụng, đau dạ dày; 2 Chán ăn, nôn mửa; 3 Ho dai

dẳng có nhiều đờm

1.4.7 Cách dùng: Cũng sử dụng như Thanh yên.

Liều dùng 3 - lOg cùi quả khô, dạng thuốc sắc hoặc dùng với quả ngâm rượu uống

1.4.8 Đơn thuốc:

1 Viêm dạ dày mạn tính, đau dây thần kinh bụng: Dùng quả tươi 1 0 - 1 5 g (hoặc 6g khô), ngâm trong nước sôi và uống thay trà

2 Ho có đờm, viêm khí quản mạn tính: Nhai cùi cả vỏ nuốt nước; hoặc phối hợp với Bán

hạ (đã xử lý với gừng), mỗi vị 6g, sắc uống, pha them đường kính uống [5][ 18]

Cũng như Thanh yên, ta có thể dùng hoa, lá và rễ thay thế khi không có

quả

2.1 Đối tượng nghỉên cứu

2.1.1 Mầu thực vật

Quả Phật thủ (Citrus medỉca L var sarcodactylỉs (Noot.) Swingle) Thời gian thu hái:

Được thu mua vào tháng 11 năm 2009 tại Thành phố Hà Nội và Thành phố Hải Phòng

A B

Hình 2.1 Quả và cây Phật thủ (A); Quả Phật thủ chín (B)

Xử lí mẫu: Quả tươi được rửa sạch, loại bỏ chất bảo quản bằng máy tạo ozone khử độc Nonan, đế ráo nước, thái mỏng, sấy khô ở 50°c, sau đó tán thành bột mịn và bảo quản trong dung dịch ethanol 80% Tên khoa học được xác định theo Tiến sĩ phân loại thực vật Võ Văn Chi

2.1.2 Mầu động vật

Chuột nhắt trắng chủng Swiss (14 - 16g) 4 tuần tuổi được mua tại Viện Vệ sinh Dịch tễTW

Thức ăn tiêu chuấn được mua tại Viện Vệ sinh Dịch tễ TW

Thức ăn giàu lipid được trộn từ nhiều thành phần khác nhau như: Ngô, sữa bột nguyên kem, lạc, lòng đỏ trứng, mỡ lợn, phối trộn theo tài liệu

[60] [71] và dựa theo bảng trích dẫn, phân tích của Viện Dinh Dưỡng Quốc gia [13]

2.2.1 Phương pháp tách chiết mẫu nghiên cứu

Quả Phật thủ thái mỏng, sấy khô ở 50°c, sau đó tán thành bột mịn, rồi tiến hành ngâm lạnh trong EtOH 80% Chiết rút dịch chiết 3 lần với EtOH 80% (lần 1 ngâm trong 3 tuần, 2 lần sau mỗi lần ngâm 1 tuần) thu được dịch chiết Dịch chiết thu được đem lọc 3 lần bằng giấy lọc để loại bỏ cặn, sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao EtOH Cao EtOH hoà

tan trong nước nóng rồi tiếp tục chiết qua các dung môi có độ phân cực tăng dần là

n-hexan, CHCI3, EtOAc, các dịch chiết cũng được loại dung môi thành các cao tương

ứng

2.2.2 Phương pháp khảo sát thành phần hoá học của quả Phật thủ

2.2.2 L Định tỉnh

Cao các phân đoạn được hoà tan trong dung môi thích hợp với từng loại phản

ứng định tính Các nhóm phản ứng được trình bày tóm tắt trong bảng sau:

Flavonoid Shinoda Mg/HCl Màu đỏ, hồng, da cam xuất hiện chứng tỏ sự có

mặt của flavon, flavonol và các dẫn xuất hydro của chúng.

Acid sulfuric

H 2 SO 4

của flavon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy

sự có mặt của chalcon và auron.

catechin.

Dung dịch 5% Gelatin/1%

NaCl

Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết tủa.

Polyphenol

khác

xanh,đen.

bề mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng

2.2.2.2 Định lượngpolyphenol tống số theo phương pháp F'olin-Ciocalteau

Nguyên tắc dựa trên phản úng của các hợp chất polyphenol (trong mẫu) với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam Soi màu trên máy quang phổ uv VIS 1000 ở

bước sóng X = 765nm, dùng chất chuẩn là acid gallic [66]

Các bước tiên hành như sau:

❖ Chuẩn bị mẫu định lượng và hoá chất

- Dung dịch acid gallic: 0,5g acid gallic + 10 ml C2H5OH + 90 ml H20

bảo quản lạnh Như vậy dịch chuấn gốc acid gallic có nồng độ 5mg/ml

- Dung dịch Na2C03: 200g Na2C03 + 800ml H20 đun sôi Thêm một vài tinh thể

Na2CƠ3, sau 24 giờ đem lọc và dẫn nước cất tới lOOOml

- Dung dịch mẫu cần định lượng.

❖ Tiến hành xây dựng đường chuẩn acid gallic

Chuẩn bị cóng định lượng theo số lượng dung dịch gốc như sau: 0, 1 , 2 ,

3, 5 và lOml sau đó dẫn nước cất tới lOOml ta thu được các nồng độ 0, 50, 100, 150, 250 và

500 mg/1 acid gallic

Cho vào mỗi cuvert 20|Lil mẫu thử (dung dịch gallic chuẩn ở các nồng độ hoặc dịch chiết các phân đoạn) + l,58ml H20 + lOOịil thuốc thử Folin- Ciocalteau sau từ 3 đến 5 phút cho thêm 300|J,1 Na2CƠ3 Đe hỗn hợp dung dịch phản úng trong 2 giờ ở 20°c rồi xác định ởbước sóng 765nm Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn

❖ Dụng đường chuẩn acid gallic.

ST

T mgacid /1

gallic

OD765nm

Săc kí lóp mỏng (TLC-thin layer choromatography) là kĩ thuật săc kí khá nhanh gọn

và tiện lợi Nó giúp nhận biết nhanh được số lượng thành phần có trong mẫu nghiên cứu Trong phương pháp sắc kí lớp mỏng, thành phần trong hỗn hợp được xác định nhờ so sánh hệ

số lưu của hỗn hợp (Rf) và hệ số lưu của 1 số chất đã biết

Nguyên tắc: Kĩ thuật này dựa vào mức độ tương tác của các chất khác nhau với pha

tĩnh (bản mỏng) và pha động (hệ dung môi chạy sắc kí) Pha tĩnh có thế là silicagel, bột AI2O3

hoặc polyamide Pha động là một hỗn họp từ 2 dung môi trở lên với các độ phân cực khác nhau tuỳ thuộc vào mẫu phân tích

Phương pháp: Các mẫu (đã pha trong dung môi thích họp) được tiến hành chạy sắc kí

trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F2 54 (Merck 1,05715) kích thước phù họp trên các hệ dung môi khác nhau để lựa chọn ra hệ dung môi phù hợp nhất Một số hệ dung môi được sử dụng:

- TEAF: 5:3:1:1 (Toluen - ethyl acetate - acetone - acid formic)

- Toluen: Ethylacetate: Acid formic = 5:4:1

- Ethylacetate: Acid formic: Nước = 8:1:1

Hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% Xác định hệ số lưu (Rf) theo công thức: Rf = a/b Trong đó a là khoảng di chuyển của chất nghiên cứu, b là khoảng di chuyển của dung môi

2.2.3 Nghiên cún tác dụng của dịch chiết các phân đoạn quả Phật thủ lên trọng lượng

và một số chỉ số hoá sinh máu của chuột béo phì thực

2.2.3.2 Nghiên cứu tác dụng chống béo phì của các phân đoạn dịch chiết

2.2.3.2.1 Mô hình chuột béo phì thực nghiêm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss (khối lượng banđầu là 14 - 16g)được

chia làm nhiều lô, mỗi lô gồm 6 con

- Lô nuôi thường: Cho ăn chế độ bình thường (thức ănchuẩn của

Viện Vệ sinh Dịch tễ TW)

- Các lô còn lại: Cho ăn thức ăn giàu lipid với thành phần được trộn

từ nhiều loại thức ăn khác nhau như: ngô, sữa bột, đậu tương, lòng đỏ trứng,

lạc, mỡ nước

- Thời gian nuôi chuột theo hai chế độ ăn là 6 tuần

Bảng 2.2 Thành phần thức ăn giàu lipiđ

Vitamin & axit amin 2

Thành phần thức ăn được tính toán dựa trên thành phần dưỡng chất của từng loại hỗn hợp thức ăn phối trộn, theo tài liệu chuẩn của Viện dinh dưỡng Quốc gia Việt Nam và theo tàiliệu [67][71]

Sau 6 tuần nuôi, tiến hành cân đo trọng lượng và xét nghiệm một số chỉ số hoá sinh như: Glucose máu, cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL-C, LDL-C, lipase (EC 3.1.1.34)

đế xác định mức độ khác nhau của các lô theo 2 chế độ ăn

2.23.2.2 Anh hưởng của các phân đoạn dịch chiết đến một số chỉ số hoả sinh trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm

Chuột sau khi nuôi bằng mô hình gây béo phì thực nghiệm, chúng tôi tiến hành làm thínghiệm tiếp Chuột béo phì được chia làm 5 lô, mỗi lô gồm 6 con, cao của các phân đoạn dịch chiết từ quả Phật thủ được hoà vào nước cất rồi cho chuột uống hàng ngày vào buổi sáng:

- Lô 1: Chuột béo phì không điều trị, chỉ cho uống nước muối sinh lý (0,9% NaCl),(lô đối chứng)

- Lô 2: Chuột béo phì cho uống cao phân đoạn EtOH (1000mg/kg)

- Lô 3: Chuột béo phì cho uống cao phân đoạn n-hexan (1000mg/kg)

- Lô 4: Chuột béo phì cho uống cao phân đoạn EtOAc (1000mg/kg)

- Lô 5: Chuột béo phì cho uống Metformin - một loại thuốc chữa béo phì, tiểu đường

type 2 hiện đang bán trên thị trường với liều 500mg/kg thể trọng [3].

Thời gian điều trị chuột là 21 ngày

Sau 21 ngày cho uống các phân đoạn dịch chiết, chúng tôi tiến hành xác định trọng lượng và lấy máu chuột đế phân tích một số chỉ số hoá sinh: Glucose, cholesterol, triglycerid, HDL-C, LDL-C, lipase

2.2.4 Phương pháp gây rối loạn trao đổi glucose máu của chuột béo phì thưc nghiêm bằng STZ liều thấp

Đe tìm hiểu tác dụng của dịch chiết quả Phật thủ lên đường huyết, trước tiên chúng tôi tiến hành gây mô hình chuột đái tháo đường mô phỏng type 2 dựa trên chế độ ăn giấu chất béo kết hợp với STZ liều đơn của Srinivasan [67] Sau đó chuột được phân lô và điều trị 21 ngày, theo dõi đường huyết và phân tích một số chỉ số hoá sinh như: Cholesterol, HDL-C, LDL-C, triglycerid, lipase

2.2.4.I Tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2

Đe có mô hình ĐTĐ mô phỏng type 2, chuột nuôi với chế độ ăn giàu chất béo và cholesterol sau 6 tuần nuôi, được tiêm màng bụng liều đơn STZ (110mg/kg pha trong đệm citrate 0,0IM, pH = 4,3)

Đo đường huyết tại các thời điểm 0 giờ (trước khi tiêm STZ), 24 giờ, 48 giờ (sau khi tiêm STZ) và 72 giờ Chuột nào có đường huyết cao (>18mmol/l) và ổn định được lựa chọn

để cho uống cao các phân đoạn dịch chiết trong vòng 21 ngày Đường huyết trong các trường hợp trên đều được đo sau khi cho chuột nhịn qua đêm (12h), chỉ cho uống nước

2.2.4.2 Thử khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết

Các lô chuột ĐTĐ type 2 (6 con/lô) được ăn thức ăn thường và điều trị hàng ngày bằng cách cho uống cao các phân đoạn Đường huyết của các con chuột được đo vào cùng một thời điểm trong ngày và sau khi nhịn đói 12 giờ ở các ngày thứ 0 (trước khi điều trị), ngày thứ 7, ngày thứ 14, ngày thứ 21 khi điều trị

- Lô 1: Lô STZ nhóm đối chứng cho uống nước cất

- Lô 2: Lô STZ điều trị bằng phân đoạn EtOH (1000mg/kg)

- Lô 3: Lô STZ điều trị bằng Metformin (500mg/kg)

2.2.5 Phương pháp định lượng một số chỉ số hoá sinh

Các chỉ số hóa sinh máu như nông độ glucose, LDL-C, triglicerid, HDL-C,

cholesterol, lipase đều được xác định bằng máy phân tích tự động Hóa sinh của Nhật Bản ( Olympus AU400 Japan)

2.2.5.1 Phương pháp định lượng glucose máu [49]

Máu sử dụng để định lượng glucose huyết là máu toàn phần lấy từ đuôi chuột Định lượng glucose huyết bằng máy đo đường huyết tự động và bộ kít thử tương ứng (Onetouch Ultra, Johnson & Johnson, USA) Nguyên tắc của phương pháp dựa trên phản ứng đặc hiệu của glucose oxidase (GOD) có trong kit thử với glucose trong máu tạo thành axit gluconic và

H2Ơ2 (phản ứng 1) H202 tạo thành được peroxydase phân hủy giải phóng oxy, oxy hoá O- Dianisidin tạo phức chất màu vàng nâu (phản ứng 2)

Glucose + H202 + 02 -► axit gluconic + H2O2 (1)

O-Dianisidin + H2O2 -► phức hợp nâu vàng + H2O2 (2)

Cường độ mầu được xác định theo phương pháp đo quang tương ứng với lượng glucose trong máu cần định lượng

2.2.5.2 Định lượng một so chỉ số lipid trong huyết thanh

Các chỉ số lipid huyết thanh (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL-C, LDL-c) và lipase được xác định trên máy xét nghiệm sinh hoá tự động (Phòng hoá sinh - Bệnh viện Hữu nghị Việt - Xô) Nguyên tắc xác định của mỗi chỉ số như sau:

2.2.5.2 J Định lượng trỉglycerỉd huyết thanh [4] [14]

Nguyên ỉý: Thuỷ phân triglycerid bang enzyme lipase, định lượng glycerol giải phóng

ra bằng phương pháp đo màu của quinonimin tạo thành từ aminoantipyryl và

4-chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo các phản ứng sau:

Triglycerid - -> Glycerol + acid béo

Glycerol + ATP —sb'ceroiknase ^ Glycerol-3-phosphate + ADP

Nguyên ỉý: Thuỷ phân cholesterol este bằng enzyme cholesterol esterase (CHE) và oxy

hoá bang cholesterol oxydase (CHO) Đo mật độ quang của quinonimin tạo nên từ phản ứng của hydrogen peroxide với 4- aminophenazone và phenol nhờ xúc tác của peroxidase Các phản ứng!

2H202 + 4 - aminophenazone + phenol Quinonimin + H20

Tính kết quả : So mật độ quang của Quinonimin với ống chuấn

Bước 2: HDL Surfactant đặc hiệu Cholestenon + H2O2

H2O2 + Chromogen — Peroxidase » sắc tố quynon