Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus. Có khả năng xử lý nước thải nhà máy chế biến tinh bột sắn Quế Cường - Quế Sơn - Quảng Nam

Trên cơ sở lý thuyết này, nhằm tuyển chọn được các chủng VK có tiềm năng ứng dụng vào trong quy trình xử lý nước thải tinh bột, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn các chủ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG

LÊ THỊ DŨNG

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI

KHUẨN BACILLUS SP CÓ KHẢ NĂNG XỬ LÝ

NƯỚC THẢI NHÀ MÁY CHẾ BIẾN TINH BỘT SẮN QUẾ CƯỜNG – QUẾ SƠN – QUẢNG NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đà Nẵng - Năm 2015

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH MÔI TRƯỜNG

LÊ THỊ DŨNG

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI

KHUẨN BACILLUS SP CÓ KHẢ NĂNG XỬ LÝ

NƯỚC THẢI NHÀ MÁY CHẾ BIẾN TINH BỘT SẮN QUẾ CƯỜNG – QUẾ SƠN – QUẢNG NAM

Chuyên ngành: Quản lý tài nguyên và môi trường

Người hướng dẫn khoa học: ThS Nguyễn Thị Lan Phương

Đà Nẵng - Năm 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn

Bacillus sp có khả năng xử lý nước thải nhà máy chế biến tinh bột sắn Quế Cường - Quế Sơn - Quảng Nam” là kết quả nghiên cứu của tác giả

Các số liệu nghiên cứu, kết quả điều tra, kết quả phân tích trung thực, chưa từng được công bố Các số liệu liên quan được trích dẫn có ghi chú nguồn gốc

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm nếu kết quả là sản phẩm kế thừa hoặc đã công bố của người khác

Đà Nẵng, tháng 5 năm 2015

Tác giả

Lê Thị Dũng

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này em bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến cô Nguyễn Thị Lan Phương người đã trực tiếp hướng dẫn chỉ bảo tận tình em suốt thời gian thực hiện đề tài Em xin chân thành cảm ơn Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh – Môi trường, các thầy cô giáo và giám đốc công ty Cổ phần FOCOCEV Quảng Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em thực hiện khóa luận của mình Cuối cùng xin cảm ơn bạn bè và gia đình đã động viên và giúp đỡ kịp thời

Đà Nẵng, ngày 06 tháng 5 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Lê Thị Dũng

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

4.1 Ý nghĩa khoa học 3

4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme amylase 4

1.1.1 Tổng quan về enzyme amylase và các ứng dụng của enzyme amylase 4

1.1.2 Tổng quan về vi sinh vật sinh tổng hợp amylase 5

1.2 Một số nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus phân giải tinh bột 6

1.2.1 Một số nghiên cứu trong nước 7

1.2.2 Một số nghiên cứu ngoài nước 8

1.3 Tổng quan về các phương pháp xử lý nước thải 8

1.3.1 Phương pháp xử lý cơ học 9

1.3.2 Phương pháp xử lý hóa học và hóa lý 10

1.3.3 Phương pháp xử lý sinh học 10

1.4 Thực trạng xử lý nước thải tinh bột sắn ở Việt Nam và trên địa bàn tỉnh Quảng Nam 11

1.4.1 Thực trạng xử lý nước thải tinh bột sắn ở Việt Nam 11

1.4.2 Thực trạng xử lý nước thải tinh bột sắn Quảng Nam 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.2 Địa điểm, phạm vi và thời gian nghiên cứu 14

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 14

2.2.2 Phạm vi nghiên cứu 14

2.2.3 Thời gian nghiên cứu 15

2.3 Vật liệu và phương pháp 15

2.3.1 Vật liệu 15

2.3.2 Các phương pháp nghiên cứu 16

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 24

3.1 Kết quả phân lập và xác định VK từ nước thải chế biến tinh bột sắn 24

3.2 Test nhanh với KOH 25

3.3 Kết quả nhuộm Gram 26

3.4 Kết quả nhuộm bào tử 26

3.5 Kết quả xác định chủng VK có hoạt tính amylase 27

3.6 Kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 30 3.6.1 Ảnh hưởng của pH 30

3.6.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 31

3.6.3 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh hoạt tính enzyme của VK 32 3.7 Kết quả xác định mật độ vi khuẩn cho vào bể xử lý sinh học hiếu khí 34

3.8 Kết quả xử lý nước thải tinh bột sắn bằng bể xử lý sinh học hiếu khí 35

3.8.1 pH 36

3.8.2 COD 37

3.8.3 BOD 5 38

3.8.4 Chất rắn lơ lửng (SS) 40

3.8.5 Nitơ tổng 41

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

4.1 Kết luận 44

4.2 Kiến nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

TIẾNG VIỆT 45

TIẾNG ANH 46 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BOD (Biochemical Oxygen Demand) Nhu cầu oxy sinh hóa COD (Chemical Oxygen Demand) Nhu cầu oxy hóa học

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Số hiệu

bảng

Bảng 1.1 Phương pháp xử lý theo tinh chất của nước thải 9

Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc các chủng VK phân lập được 25

Bảng 3.2 Vòng phân giải của các chủng VK Bacillus có hoạt tính

Bảng 3.5 Giá trị COD của nước thải qua 7 ngày xử lý 38

Bảng 3.6 Giá trị BOD5 của nước thải qua 7 ngày xử lý 39

Bảng 3.8 Giá trị Ntổng của nước thải qua 7 ngày xử lý 42

Bảng 3.9 Giá trị các chỉ tiêu của nước thải sau 7 ngày xử lý 43

DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

Hình 3.1 Hình ảnh ống giống 16 chủng VK phân lập được từ nước

thải chế biến tinh bột sắn

Hình 3.7 Đường kính vòng phân giải tinh bột của chủng VK D2, D5

và D15 tương ứng với thời gian nuôi cấy

34

Hình 3.9 Sự thay đổi pH trong nước thải qua 7 ngày xử lý 36

Hình 3.10 Sự thay đổi của COD trong nước thải qua 7 ngày xử lý 37

Hình 3.11 Sự thay đổi của BOD5 trong nước thải qua 7 ngày xử lý 38

Hình 3.12 Sự thay đổi của SS trong nước thải qua 7 ngày xử lý 39

Hình 3.13 Sự thay đổi của Ntổng trong nước thải qua 7 ngày xử lý 40

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Trong bối cảnh quốc tế hiện nay, công nghiệp hóa - hiện đại hóa được xem là

xu hướng chung của các nước đang phát triển Cùng với mục tiêu phát triển nền công nghiệp và dịch vụ để hiện đại hóa đất nước, chúng ta không thể quên tầm quan trọng của nền nông nghiệp là chìa khóa để phát triển kinh tế, nâng cao đời sống nhân dân và ổn đinh xã hội [20] Mặt khác, nhiều sản phẩm nông nghiệp cũng đồng thời trở thành nguồn nguyên liệu cho các ngành công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp chế biến Sắn là loại cây nông nghiệp dễ trồng, có khả năng chống chịu tốt, năng suất sinh học cao và phù hợp với những vùng có khí hậu nhiệt đới như các nước Đông Nam Á Ở miền Trung Việt Nam, cây sắn là một trong những loại cây lương thực chủ lực của bà con nông dân theo xu thế tái cấu trúc cơ cấu kinh tế đồng thời, nó cũng trở thành nguồn nguyên liệu chính của nhà máy chế biến tinh bột sắn Hiện nay, nhiều cơ sở, nhà máy chế biến hoạt động với sản lượng khoảng 800.000 – 1.200.000 tấn tinh bột sắn mỗi năm, trong đó trên 70% xuất khẩu và gần 30% tiêu thụ trong nước Theo thống kê năm 2009 xuất khẩu tinh bột sắn được Bộ công thương xếp vào một trong những mặt hàng xuất khẩu chủ lực, đem lại công ăn việc làm và thu nhập cao cho người dân [23]

Tuy vậy, song song với sự phát triển mang lại lợi ích kinh tế xã hội cao thì ngành công nghiệp chế biến mặt hàng này cũng gây áp lực lớn đến môi trường, mà một trong những vấn đề nổi cộm nhất là xử lý nước thải (XLNT) sau sản xuất Nước thải từ nhà máy chế biến tinh bột sắn được đánh giá là tác nhân gây ô nhiễm lớn đến nguồn nước tự nhiên với nhiều thành phần hữu cơ như tinh bột, xenlulo, pectin, đường, protein có trong nguyên liệu củ sắn tươi giàu nitơ, photpho,…[29] Bên cạnh đó, sự phân giải các thành phần này trong điều kiện tự nhiên gây ra mùi hôi rất khó chịu, ảnh hưởng đến chất lượng môi trường không khí xung quanh Nước thải xử lý chưa đạt tiêu chuẩn xả thải nếu được đưa vào môi trường sẽ là nguồn tác động xấu đến sức khỏe con người và hệ sinh thái Với tính chất và thành phần như thế, trong việc lựa chọn các biện pháp xử lý chất thải, các nhà quản lý

luôn cân nhắc giữa việc sử dụng các biện pháp hóa lý với các biện pháp sinh học

Xử lý chất thải bằng các tác nhân sinh học đã được nghiên cứu và chứng minh là đem lại hiệu quả cao, giảm chi phí và ưu điểm nhất là thân thiện với môi trường

Vi khuẩn (VK) Bacillus thuộc nhóm VK Gram dương, hình que, sinh trưởng

trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc và có khả năng sinh bào tử, do

đó chúng có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau VK

Bacillus rất phổ biến trong tự nhiên và đồng thời tham gia vào nhiều quá trình

chuyển hóa vật chất, phân giải các hợp chất hữu cơ cao phân tử gây ô nhiễm nhờ khả năng sinh tổng hợp mạnh các enzyme ngoại bào [16] Đây cũng là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu sản xuất và chế tạo các chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp và xử lý môi trường Trên cơ sở lý thuyết này, nhằm tuyển chọn được các chủng VK có tiềm năng ứng dụng vào trong quy trình xử lý nước thải tinh bột,

chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus

sp có khả năng xử lý nước thải nhà máy chế biến tinh bột sắn Quế Cường - Quế

Sơn - Quảng Nam”

2 Mục tiêu của đề tài

Mục tiêu chính của đề tài là xác định được các chủng VK Bacillus sp có khả

năng sinh tổng hợp ezyme amylase và nghiên cứu ứng dụng các chủng có hoạt tính tốt vào quy trình xử lý nước thải nhà máy tinh bột sắn bằng bể aerotank

3 Nội dung nghiên cứu

Đề tài tập trung nghiên cứu các nội dung sau:

- Nghiên cứu tổng quan tài liệu về vi sinh vật (VSV) sinh tổng hợp enzyme amylase, thực trạng và phương pháp xử lý nước thải tinh bột sắn

- Phân lập, xác định các chủng VK Bacillus sp có khả năng phân giải tinh bột

cao từ nước thải của nhà máy FOCOCEV ở Quế Cường - Quế Sơn – Quảng Nam

- Tuyển chọn chủng VK sinh tổng hợp enzyme amylase mạnh nhất để nghiên cứu các đặc điểm sinh học và điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh hoạt tính của chúng

- Nghiên cứu thử nghiệm xử lý nước thải chế biến tinh bột sắn bằng các chủng

VK Bacillus sp đã tuyển chọn được ở quy mô phòng thí nghiệm

- Xử lý số liệu thực nghiệm

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

4.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả của đề tài sẽ là nguồn dẫn liệu bổ sung cho các nghiên cứu trước về

các chủng VK Bacillus có hoạt tính sinh học mạnh phân bố ở địa điểm nghiên cứu

Đồng thời tạo tiền đề cho việc nghiên cứu chế tạo các chế phẩm sinh học từ các chủng VK này

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Các chủng VK có khả năng phân giải tinh bột mạnh được tuyển chọn có thể được sử dụng để sản xuất các chế phẩm sinh học xử lý chất thải rắn, làm phân vi sinh, phân hữu cơ vi sinh và XLNT giàu chất hữu cơ tinh bột như nước thải nhà máy chế biến tinh bột sắn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về VSV sinh tổng hợp enzyme amylase

1.1.1 Tổng quan về enzyme amylase và các ứng dụng của enzyme

amylase

Enzyme là chất xúc tác sinh học đóng vai trò xúc tác cho các phản ứng sinh hóa diễn ra trong tế bào Enzyme có bản chất là protein nên chúng cũng mang những tính chất của protein như:

- Hòa tan trong nước, tạo dung dịch keo với những tính chất đặc trưng như khuếch tán kém, áp suất thẩm thấu thấp, độ nhớt cao,…

- Có tính lưỡng cực

- Mỗi enzyme có một điểm đẳng điện nên tại điểm đó có độ hòa tan thấp nhất

- Dễ bị phá hủy bởi các tác nhân khác như enzyme tiêu hóa (pepsin, tripsin,…)

- Enzyme không chịu đươc nhiệt độ cao, dễ mất hoạt tính xúc tác và dễ bị biến tính

Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, trong điều kiện có nước, chúng xúc tác cho sự phân giải các liên kết nội phân tử nhóm polysaccharide

R.R’ + H-OH  RH + R’OH

Amylase có trọng lượng phân tử rất lớn từ 20.000 – 1.000.000 Dalton [8], được cấu tạo từ 200 – 1000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside tạo thành một mạch xoắn dài không phân nhánh

Vì có nhiều ứng dụng quan trọng trong đời sống và sản xuất nên enzyme amylase đã được nghiên cứu và khảo sát một cách có hệ thống về các đặc điểm cũng như phương pháp phân lập, tách chết từ nhiều nguồn khác nhau từ VSV (VK

Bacillus subtilis, nấm Aspegillus oryzae…), từ thực vật (mầm mạch, mầm đậu

tương…)

Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase (enzyme nội bào) và exoamylase (enzyme ngoại bào) [27]

Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại: Khử trực tiếp là Pullulanase (hay α-dextrin 6 – glucosidase); khử gián tiếp là Transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) và maylo-1,6-glucosidase Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide

Exoamylase gồm có β-amylase và γ-amylase Đây là những enzyme thủy phân tinh bột của chuỗi polysaccharide

Hình 1.1 Một số loại enzyme amylase

(Nguồn: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure)

1.1.2 Tổng quan về VSV sinh tổng hợp amylase

Hiện nay người ta đã phát hiện được trên 2000 enzyme khác nhau, nhưng chỉ

có khoảng 140 enzyme có thể được sử dụng cho mục đích thương mại Trong đó, enzyme amylase được sử dụng nhiều trong công nghiệp và sản xuất với số lượng lớn Ngoài việc sử dụng các enzyme có nguồn gốc từ thực vật thì nhiều nhóm VSV

cũng được biết đến như các “nhà máy” sản xuất amylase, ví dụ như các VK, nấm mốc và nấm men [8]

1.1.2.1 Nấm mốc

Các nấm mốc sinh enzyme amylase mạnh có thể được kể đến như là các mốc

thuộc chi Aspergillus, Penicillium, Mucorsnr, Neurospora, Rhizopus sp, Rhizopus

japanicus Trong đó, chế phẩm enzyme amylse được thu từ hai loài nấm

mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori ứng dụng nhiều trong sản xuất bánh

mì

1.1.2.2 Nấm men

Đã từ lâu một số chi nấm men đã được nghiên cứu có khả năng sinh enzyme

amylase như: Candida, Saccharomyces, Endomycopsis, Endomyces (Gratrova,

1975; Conovalov, 1972; Fukumoto, 1962; Hattori, 1961) Theo đó, người ta ứng

dụng các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae trong ngành sản xuất rượu để lên men rượu nhờ khả năng sinh enzyme amylase của chúng [12]

1.1.2.3 Vi khuẩn

Nhiều nhóm vi khuẩn được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sản xuất enzyme

do năng suất cao, ổn định hóa học và chi phí sản xuất thấp Sản lượng enzyme

amylase từ VK được sản xuất trên thế giới là 50 tấn/năm Nhiều loài Bacillus như

Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus licheniformis được sử dụng

để sản xuất một loạt các enzyme trong nhiều thập kỷ qua Các chi Bacillus đã sản

sinh ra một lượng lớn các enzyme ngoại bào mà trong đó enzyme amylase có tầm quan trọng đặc biệt trong công nghiệp [28] Riêng ở Nhật, hàng năm người ta sản

xuất tới hàng chục nghìn tấn chế phẩm amylase từ VK bacillus sp [11].Bên cạnh đó

có một số loài VK khác như Lactobacillus, Micrococus, Pseuclomonas,

Arthrobacter, Proteus, Seratia cũng có khả năng sinh enzyme amylase

1.2 Một số nghiên cứu về VK Bacillus phân giải tinh bột

Bacillus là VK Gram dương, chúng có khả năng sinh enzyme ngoại bào:

amylase, protease kiềm, cellulose,… và các enzyme này được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, bảo vệ môi trường, nông nghiệp,…[4] Đến nay, đã có nhiều

công trình nghiên cứu về đối tượng VK Bacillus sp ở trong nước cũng như nước

ngoài

1.2.1 Một số nghiên cứu trong nước

Trên Tạp chí Khoa học ĐHQGHN năm 2009, Ngô Tự Thành, Bùi Thị Việt Hà*, Vũ Minh Đức, Chu Văn Mẫn đã tiến hành nghiên cứu phân lập được 236

chủng Bacillus từ các mẫu đất và nước thải khác nhau Theo đó, khi khảo sát hoạt

tính enzyme ngoại bào như amylase, protease và CMC – aza của 236 chủng trên thì

có 3 chủng có khả năng sinh enzyme mạnh và XLNT hiêu quả

Một nghiên cứu khác của Phạm Trần Thùy Hương và Đỗ Thị Bích Thủy (2012) tập trung vào khảo sát sự ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình thu nhận

chế phẩm amylase ngoại bào trên đối tượng Bacillus subtilis DC5 Trong nghiên

cứu này, cùng với việc đã xác định được thành phần môi trường thích hợp để nuôi

cấy chủng Bacillus subtilis DC5 là pepton 1%; cao thịt 0,3%; NaCl 0,5%; lactose

0,25%, nhiệt độ 35oC và pH 5, tác giả cũng xác định được sau 24 giờ nuôi cấy cũng

là thời điểm tốt nhất cho khả năng sinh tổng hợp amylase ngoại bào

Cũng với VK lactic, VK Bacillus cũng được xác định là những VK có đặc tính

probiotic được áp dụng nhiều trong các chế phẩm sinh học Để tăng khả năng đề

kháng của tôm, tác giả Khuất Hữu Thanh; Nguyễn Đăng Phúc Hải; Bùi Văn Đạt;

Võ Văn Nha (2009) đã phân lập được 12 chủng VK Bacillus và 18 chủng VK lactic

có hoạt tính đối kháng VK Vibrio và VK kiểm Kết quả nghiên cứu trên cho thấy chế phẩm probitic tạo được có hiệu quả tăng sức kháng bệnh của tôm sú ở điều kiện

phòng thí nghiệm

Phạm Thị Xòe (2012), tiến hành phân lập được 35 chủng VK có hoạt tính kitinaza và một số đặc tính của enzyme từ mẫu đất làm giàu Theo đó, chọn lọc được 2 chủng VK sinh kitinaza cao nhất xác định được nhiệt độ và pH tối ưu cho sự phát triển là chủng HD1 ở 40oC, pH 7 và chủng HD5 ở 35oC, pH 7,5 Đồng thời,

khẳng định 2 chủng VK trên là Bacillus

Một nghiên cứu của Nguyễn Hữu Hiệp và Nguyễn Thị Hải Lý (2012), từ nước thải làng nghề sản suất bột gạo đã tiến hành phân lập được 13 dòng VK thuộc gram

âm và 10 dòng VK thuộc gram dương và các VK này đều có hoạt tính enzyme amylase từ 72,44 U/ml đến 910,89 U/ml sau thời gian là 72 giờ nuôi cấy và xác

định đó là Bacillus

1.2.2 Một số nghiên cứu ngoài nước

Kết quả nghiên cứu cho biết khả năng sinh enzyme phân giải tối ưu ở pH 8,5

và 45°C Ổn định nhiệt của nó giữa 20-50°C là khoảng 89,5% trong 30 phút Sự ổn định độ pH đã được quan sát giữa pH 7 và 10 với mức trung bình 84,9% của duy trì hoạt động trong 15 phút [24]

Để khảo sát sự ảnh hưởng của pH và nhiệt độ tối ưu về khả năng sinh hoạt tính amylase của VK thì P Ruban, T Sangeetha and S Indira (2013) đã tiến hành phân

lập VK Bacillus subtilis và Aspergillus niger từ hai loại chất thải tinh bột khác nhau

(chất thải cao lương và lúa mì cám), đồng thời đã xác định với pH 7, nhiệt độ ổn định 37oC và pH 5 nhiệt độ ổn định 20oC là thích hợp cho khả năng sinh hoạt tính mạnh nhất [29]

Năm 1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm kumura

từ Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc

Aspergillus flavus, Aspergillus paraciticus [11]

Các công trình nghiên cứu nói chung đã góp phần vào việc xác định môi trường phân lập và điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của các chủng

VK Bacillus Theo đó cũng đã khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố môi trường và

xác định được điều kiện môi trường tối ưu cho hoạt động sinh hoạt tính enzyme phân giải của VSV nhằm góp phần tạo ra các chế phẩm sinh học ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp, sản xuất probiotic phòng bệnh,… Trong khi đó, những nghiên cứu về ứng dụng khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ của VSV vào quá trình XLNT, đặc biệt là nước thải giàu tinh bột còn tương đối hạn chế Như vậy, trên nền tảng của những nghiên cứu trước, chúng tôi tiến hành đề tài này với mong muốn phát triển hơn nữa những ứng dụng của VSV vào thực tiễn cuộc sống

1.3 Tổng quan về các phương pháp XLNT

Đối với các hoạt động công nghiệp, nước thải được thải ra môi trường nếu bị lưu đọng hoặc xử lý chưa đạt yêu cầu sẽ gây ô nhiễm môi trường, đặc biệt đối với

nguồn nước tiếp nhận, hậu quả kéo theo gây tác động xấu đến vệ sinh môi trường

và sức khoẻ con người Do đó, quy trình XLNT được áp dụng rất nhiều phương pháp nhằm đạt hiệu quả xử lý cao Thông thường, hệ thống xử lý nước thải bao gồm tổng hợp các phương pháp lý học (cơ học), hoá học và sinh học [15]

Việc áp dụng các phương pháp trên ngoài sự phụ thuộc vào tính chất nước thải (bảng 1.1), lưu lượng nước thải còn phụ thuộc vào hàng loạt các yếu tố khác như: kinh phí, diện tích dành cho hệ thống xử lý, đặc điểm địa hình, hệ thống thoát nước, mục đích sử dụng của nguồn nước tiếp nhận v.v

Bảng 1.1 Phương pháp xử lý theo tinh chất của nước thải

Chất hữu cơ tan

- Phương pháp sinh học hiếu khí (bùn hoạt tính, hồ làm thoáng, lọc sinh học, hồ ổn định)

- Phương pháp sinh học trong điều kiệm yếm khí (hồ yếm khí, bể metan) bơm xuống lòng đất UASB

- Lắng, tuyển nổi và lưới lọc, song chắn

- Hấp phụ bằng than, bơm xuống lòng đất

- Hồ, sục khí, nitrat hóa, khử nitrat, trao đổi ion

- Kết tủa bằng vôi, bằng muối sắt, nhôm

- Kết tủa kết hợp sinh học, trao đổi ion

- Trao đổi ion, kết tủa hóa học

- Trao đổi ion, bám thấm

Một số phương pháp áp dụng XLNT như sau:

1.3.1 Phương pháp xử lý cơ học

Áp dụng phương pháp xử lý cơ học nhằm loại bỏ tất cả các tạp chất có thể gây

sự cố trong quá trình vận hành hệ thống XLNT như tắc ống bơm, đường ống hoặc

ống dẫn Xử lý cơ học là khâu sơ bộ chuẩn bị cho quá trình xử lý sinh học tiếp theo Một số công trình và thiết bị được áp dụng trong XLNT bằng phương pháp cơ học như lưới chắn rác, bể điều hòa, bể lắng cát, lọc, …

1.3.2 Phương pháp xử lý hóa học và hóa lý

Bản chất của quá trình XLNT bằng phương pháp hóa học và hóa lý là áp dụng các phản ứng hóa học và vật lý khi bổ sung các hợp chất khác nhau vào để loại bỏ bớt các chất ô nhiễm, các quá trình thường được áp dụng trong phương pháp xử lý hóa học và hóa lý bao gồm [6]:

- Phương pháp đông tụ: để tăng nhanh quá trình lắng các chất lơ lửng phân tán nhỏ, keo,…

- Phương pháp trung hòa: Nước thải sản xuất trong nhiều lĩnh vực có chứa nhiều axit hoặc kiềm Ðể ngăn ngừa hiện tượng xâm thực ở các công trình thoát nuớc và tránh cho các quá trình sinh hóa ở các công trình làm sạch và trong hồ, sông không bị phá hoại, nguời ta phải trung hòa các loại nước thải đó Trung hòa còn với mục đích làm cho một số muối kim loại nặng lắng xuống và tách ra khỏi nước

- Phương pháp oxy hóa – khử

- Phương pháp hấp phụ

1.3.3 Phương pháp xử lý sinh học

Phương pháp dựa trên cơ sở: Hoạt động của VSV để phân hủy các chất hữu cơ gây nhiễm bẩn trong nước thải Các VSV sử dụng các chất hữu cơ và một số chất khoáng làm chất dinh dưỡng và tạo năng lượng Chúng nhận các chất dinh duỡng để xây dựng tế bào, sinh truởng, sinh sản nên sinh khối của chúng tăng lên Quá trình phân hủy các chất hữu cơ nhờ VSV gọi là quá trình oxy hóa sinh hóa Nước thải đuợc xử lý bằng phương pháp sinh học sẽ được đặc trưng bằng chỉ tiêu COD và BOD5 Đặc biệt quá trình tự làm sạch do trong môi trường có các VK giúp cho quá trình chuyển hóa, phân hủy chất hữu cơ nên khi XLNT cần xem xét nước có các VSV hay không để lợi dụng sự có mặt của nó và nếu có thì tạo diều kiện tốt nhất cho các VSV phát triển Do đó, đối với dòng nước thải chứa nhiều hợp chất hữu cơ thì phương pháp xử lý sinh học là tối ưu nhất [15], [6]

Hiện nay, người ta xử lý các nước thải hữu cơ bằng hai nhóm phương pháp:

Thứ nhất: Xử lý nước thải hữu cơ bằng phương pháp sinh học hiếu khí được

dựa trên sự oxy hóa các chất hữu cơ có trong nước thải nhờ oxy tự do hòa tan Nếu oxy được cung cấp bằng thiết bị hoặc nhờ cấu tạo công trình, thì đó là quá trình sinh học hiếu khí trong điều kiện nhân tạo Ngược lại, nếu oxy vận chuyển và hòa tan nhờ các yếu tố tự nhiên thì đó là quá trình xử lý sinh học hiếu khí trong điều kiện tự nhiên Các công trình xử lý sinh học hiếu khí nhân tạo như bể lọc sinh học nhỏ giọt,

bể lọc sinh học cao tải, đĩa lọc sinh học, bể lọc sinh học có vật liệu lọc ngập trong nước (bể bioten), kênh oxy hóa tuần hoàn, bể Aerotank hoạt động gián đoạn theo

mẻ (Sequencing Batch Reactor – SBR) Bênh cạnh đó còn có một số công trình xử

lý sinh học hiếu khí trong điều kiện tự nhiên như: cánh đồng ngập nước tự nhiên, cánh đồng ngập nước nhân tạo (gồm cánh đồng ngập nước bề mặt và cánh đồng ngập nước phía dưới), hồ sinh học Theo đó, có một số công trình xử lý sinh học hiếu khí được áp dụng cho xử lý nước thải tinh bột như: bể Aerotank, lọc sinh học hiếu khí, lọc sinh học nhỏ giọt, đĩa quay sinh học,… cũng góp phần làm giảm đáng

kể lượng hợp chất hữu cơ [5]

Thứ hai: XLNT hữu cơ bằng phương pháp sinh học kỵ khí là quá trình xử lý

dựa trên cơ sở phân hủy các chất hữu cơ nhờ quá trình lên men kỵ khí Một số hệ thống XLNT tinh bột vừa và nhỏ người ta thường áp dụng phương pháp sinh học kỵ khí này và đồng thời tiến hành thu khí Biogas [29]

1.4 Thực trạng XLNT tinh bột sắn ở Việt Nam và trên địa bàn tỉnh

Quảng Nam

1.4.1 Thực trạng XLNT tinh bột sắn ở Việt Nam

Ngành chế biến tinh bột sắn là ngành phát sinh một lượng lớn nước thải, trung bình lượng nước thải ra trong quá trình chế biến là 10 – 30m3/tấn sản phẩm Đặc trưng của dòng nước thải này là hàm lượng chất hữu cơ cao thể hiện qua hàm lượng chất rắn lơ lửng (SS), các chất dinh dưỡng N, P, K và nhu cầu oxy sinh hóa học (BOD), nhu cầu oxy hóa học (COD) có nồng độ cao, đặc biệt là hàm lượng tinh bột trong củ cao (62 – 65% lượng chất khô) sẽ là nguyên nhân chủ yếu làm cho dòng nước thêm ô nhiễm [9], [1] Vì vậy, phương pháp sinh học là lựu chọn tối ưu nhất

cho quá trình xử lý, nhưng do tính đặc thù của quy trình chế biến là phải loại bỏ các phần vỏ và đất của sắn nên tách riêng dòng nước thải ra là không thể thiếu nhằm nâng cao hiệu quả xử lý

Hiện nay, tại Việt Nam công nghệ phổ biến được áp dụng trong xử lý là công nghệ hồ sinh học kỵ khí dạng hở (open anaerotic lagoons) Một số nhà máy tinh bột sắn áp dụng bể CIGAR (bể được tạo thành bằng cách phủ bạt toàn bộ mặt hồ kỵ khí) và công nghệ UASB (kỵ khí kiểu chạy ngược qua lớp bùn yếm khí) kết hợp thu khí metan (CH4) Đối với phương pháp kỵ khí kết hợp thu khí CH4 tại 13 nhà máy ở nước ta được công nhận là dự án CDM (CDM – clean Development Mechansm) Quá trình xử lý nước thải tinh bột sắn của một số nhà máy được áp dụng như sau:

- Nước thải từ quy trình công nghệ dẫn qua song chắn rác để loại bỏ tạp chất thô rồi được dẫn qua bể gạn bột để thu hồi tinh bột, từ đó được dẫn qua bể lắng cát

và qua bể axit hóa để khử CN- nhằm tạo môi trường thuận lợi cho quá trình xử lý sinh học phía sau Nước thải sẽ được dẫn vào hai mương với hai dòng nước thải khác nhau

- Quy trình xử lý sinh học ở các bể hiếu khí và kỵ khí là giai đoạn mà nước thải tiếp tục đưa qua bể UASB (kỵ khí) sau đó dẫn qua bể Aeroten (hiếu khí), ở đây sục khí liên tục và các vi sinh vật dạng hiếu khí sẽ phân hủy các chất hữu cơ còn lại trong nước thải thành các chất vô cơ đạng đơn giản hơn nhằm nâng cao hiệu quả xử

lý

- Bùn dư được bơm vào bể nén bùn trọng lực để giảm thể tích sau đó bơm đến ngăn khuấy trộn của máy lọc ép băng, đóng thành bánh đem đi chôn lấp hoặc sử dụng làm phân bón Các quá trình xử lý nước thải đầu ra sẽ đạt QCVN: 2008 loại B

1.4.2 Thực trạng xử lý nước thải tinh bột sắn Quảng Nam

Hiện nay, trên địa bàn tỉnh Quảng Nam có 1 cơ sở sản xuất tinh bột sắn nhỏ lẻ (Công ty TNHH sản xuất tinh bột sắn Cẩn Tuyết thuộc huyện Quế Sơn) và 1 công

ty cổ phần FOCOCEV Quảng Nam đóng trên địa bàn xã Quế Cường, huyện Quế Sơn (Quảng Nam) có công suất 150 tấn sắn tươi/ngày đêm, bình quân sử dụng và thải ra ngoài môi trường khoảng 150 nghìn m3 nước thải/ngày đêm Năm 2008, chủ tịch UBND xã Quế Cường cho biết, tình trạng ô nhiễm môi trường do Nhà máy sản

xuất tinh bột sắn gây ra làm ảnh hưởng đến gần 200 hộ dân trong xã Vừa qua, khoảng 3 ha lúa đông xuân 2008 bị hư hại (rụi rục) Bên cạnh đó, mùi hôi từ nước thải xả ra môi trường được người dân phản ánh rất gây gắt

Hệ thống XLNT tinh bột sắn trên địa bàn tỉnh Quảng Nam được xử lý như sau:

- Hồ tùy tiện: Là công trình xử lý nước thải TBS trong điều kiện tự nhiên,

trong hồ xẩy ra các quá trình phân hủy hiếu khí, kỵ khí và tùy tiện

- Bể biogas (CIGAR): Đây là công trình kiểm soát, để khắc phục một số nhược

điểm của hồ kỵ khí, người ta tiến hành phủ cho hồ kỵ khí lớp lót đáy hồ và bề mặt nhằm tạo ra hệ kỵ khí tuyệt đối và ngăn không cho nước thấm vào đất gây ô nhiễm

nước ngầm

Đối với tỉnh Quảng Nam có ít cơ sở chế biến tinh bột sắn và quá trình xử lý nước thải ở đây chủ yếu là xử lý kỵ khí bằng phương pháp phủ bạc HPDE, trước khi nước thải vào hồ kỵ khí thì được lưu lại tại bể tùy nghi để thực hiện quá trình lắng và phân hủy hiếu khí Tuy nhiên, quá trình xử lý của các nhà máy, cơ sở sản xuất chưa thực sự hiệu quả

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Các chủng Bacillus sp sinh enzyme amylase có trong nước thải chế biến

tinh bột sắn

- Nước thải chế biến tinh bột sắn

- Mô hình thử nghiệm XLNT

2.2 Địa điểm, phạm vi và thời gian nghiên cứu

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

* Địa điểm thu mẫu ngoài thực địa

Quá trình thu mẫu nước để phân lập và xác định các chủng vi khuẩn Bacillus

sp được thực hiện tại Công ty cổ phần FOCOCEV thuộc xã Quế Cường – Quế Sơn – Quảng Nam

* Địa điểm tiến hành thí nghiệm

Quá trình phân lập, xác định hoạt tính, nghiên cứu đặc điểm sinh học, sử dụng

vi khuẩn Bacillus sp để nghiên cứu thử nghiệm xử lý nước tinh bột sắn và phân tích

các chỉ số được tiến hành ở các phòng thí nghiệm khoa Sinh – Môi trường, trường

Đại học Sư Phạm Đà Nẵng:

- Phòng thí nghiệm Sinh lý – Hóa sinh – Vi sinh

- Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học

- Phòng thí nghiệm Phân tích môi trường

2.2.2 Phạm vi nghiên cứu

Trong giới hạn nghiên cứu của đề tài, chúng tôi tập trung vào đối tượng các

VK Bacillus sp là loại VSV hiếu khí được tuyển chọn từ nước thải của các nhà máy

chế biến tinh bột sắn ở khu vực huyện Quế Sơn - Quảng Nam, đồng thời chú trọng nghiên cứu đến khả năng sinh hoạt tính phân giải tinh bột là thành phần hữu cơ chủ yếu trong nước thải chế biến tinh bột sắn và thử nghiệm XLNT bằng biện pháp sinh học hiếu khí

2.2.3 Thời gian nghiên cứu

Ống nghiệm Đĩa petri

H2SO4 đặc Thuốc nhuộm xanh metylen Leoeffler

2.3.1.3 Môi trường phân lập, giữ giống và nuôi cấy

Chúng tôi tiến hành thực hiện trên môi trường LB Broth (Luria-Bertani broth) [2]

Peptone 10g

Khử trùng ở 121oC và trong thời gian 20 phút

2.3.1.4 Môi trường định tính sinh tổng hợp enzyme amylase

2.3.2 Các phương pháp nghiên cứu

2.3.2.1 Phương pháp lấy mẫu nước phân lập

Về nguyên tắc cần thu mẫu sao cho mẫu thu được có tính đại diện cho khối lượng nước cần phân tích Quá trình lấy mẫu chúng tôi sử dụng bình thu mẫu loại dùng một lần hoặc có thể dùng nhiều lần Trường hợp dùng bình chứa sử dụng nhiều lần, chất liệu bình phải cho phép khử trùng lặp lại nhiều lần mà không tạo ra các tạp chất ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật Tránh gây tạp nhiễm mẫu trong lúc thu, bảo quản và vận chuyển mẫu Mẫu nước được thu vào bình đã khử trùng, cần chừa môt khoảng không khí đủ lớn giữa mặt nước và nắp bình Chọn ở

độ sâu 20 – 30cm để thu mẫu Trên mỗi bình chứa mẫu cần ghi chú rõ ràng, đầy đủ các thông tin cần thiết (địa điểm, thời gian, mục đích,…) Mẫu bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4oC trong thùng xốp vận chuyển về phòng thí nghiệm phân tích liền hoặc trường hợp chưa thể phân tích được chúng ta bảo quản mẫu trong tủ lạnh ở 4oC [19]

2.3.2.2 Phương pháp phân lập

Phân lập các mẫu dựa trên phương pháp phân lập của Egorov [25]

Cách tiến hành:

- Lấy 1ml dung dịch mẫu cho vào ống nghiệm có chứa 9ml nước cất, lắc đều,

ta có độ pha loãng 10-1 Hút ra 1ml cho tiếp tục vào ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước cất, lắc đều, ta có độ pha loãng 10-2 Tiếp tục pha loãng cho đến nồng độ cần thiết

- Dùng pipet vô trùng hút dịch pha loãng ở nồng độ từ 10-2 - 10-6 khoảng 0.1ml nhỏ vào hộp lồng chứa môi trường phân lập đã vô trùng, dùng que gạt trang đều trên mặt thạch Sau đó, bao gói cẩn thận và nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 35-39oC Sau

3 – 7 ngày nuôi cấy, chọn những khuẩn lạc riêng lẽ, mọc mạnh, cấy sang ống thạch nghiên chứa cùng môi trường phân lập cho đến khi thần chủng

2.3.2.3 Một số phương pháp nghiên cứu định danh VSV

(a) Phương pháp nhuộm Gram

Để quan sát khả năng bắt màu nhằm phân biệt đó là VK Gram âm hay Gram dương, đồng thời có thể nhận diện được hình dạng của các chủng VK chúng tôi tiến hành nhuộm Gram theo phương pháp sau [18]:

Bước một, làm vết bôi và cố định tiêu bản:

Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng hoà vào

1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí, hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính Cố định vết bôi bằng cách nhỏ lên vết bôi 1-2 giọt cồn 95o Đốt cháy và dập tắt ngay khoảng 10 giây Cố định vết bôi nhằm mục đích gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính và làm vết bôi bắt màu tốt hơn

Bước hai, nhuộm màu: nhuộm vết bôi bằng dung dịch tím kết tinh trong 30

giây đến 1 phút, rửa nước; nhuộm tiếp với dung dịch lugol và giữ trong 1 phút, rửa nước; tiếp theo, tẩy màu bằng cồn 96o trong 15 - 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước; cuối cùng, nhuộm với dung dịch safranin hoặc fuchsin trong 1 phút, rửa nước, để khô Lần nhuộm này cả hai nhóm VK đều bắt giữ thuốc nhuộm, nhưng vi khuẩn Gram dương không bị thay đổi màu nhiều, trong khi VK Gram âm trở nên đỏ vàng (nhuộm safranin) hay đỏ tía (fuchsin)

Kết quả: Quan sát

màu xanh đen hay tím, Gram âm b

(fuchsin) [10], [17]

Để có kết quả nhanh chúng tôi c

hucker cải tiến dùng KOH 3% đ

được trong 30s Dùng que tăm nh

không có sự xuất hiện các s

phá vỡ, thoát ra ngoài Đó là các VK Gram

xuất hiện chứng tỏ VK thu

(b) Phương pháp nhu

Tiến hành nhuộm bào t

- Làm vết bôi vớ

bôi khô tự nhiên

- Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên v

giữ 2 phút rồi rửa nước

c trong 30s Dùng que tăm nhỏ nhúng vào dịch huyền phù này và nh

n các sợi nhày nhớt, là kết quả của các sợi ADN trong nhân b, thoát ra ngoài Đó là các VK Gram dương (+) Nếu các s

VK thuộc nhóm Gram âm (-)

Phương pháp nhuộm bào tử

m bào tử theo phương pháp Ôgietska [18],

ới VK đã nuôi cấy 2 tuần tuổi trên ống nghiên th

t HCl 0,5% lên vết bôi, hơ nóng trên ngọn đèn c

c

t bôi miếng giấy lọc rồi nhỏ Fuchsin Ziehl, hơ nóng cho đ

c nhuộm cạn phải bổ sung ngay và giữ trong 5 phút

ửa lại vết bôi bằng nước

t bôi bằng xanh metylen Loeffler trong 5 – 15 phút

khô tự nhiên vết bôi

ản trên kính hiển vi với vật kính dầu

VK Gram dương bắt

m safranin) hay đỏ tía

ện theo phương pháp

a các chủng VK phân lập

n phù này và nhấc lên thấy

i ADN trong nhân bị

u các sợi nhày nhớt này

- Kết quả: Bào tử màu đỏ, tế bào chất màu xanh

2.3.2.4 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng

phát triển của VSV

(a) Khảo sát ảnh hưởng của pH

Để xác định giá trị pH mà tại đó sự sinh trưởng của vi sinh vật đạt tối ưu, chúng tôi tiến hành như sau:

- Nuôi cấy lắc chủng VSV được chọn

- Pha môi trường nuôi cấy lỏng có thành phần tương tự môi trường phân lập VSV, cho vào 9 bình tam giác khác nhau có cùng thể tích là 100ml dung dịch trên

- Chuẩn độ pH bằng máy đo pH với các giá trị lần lược 5 đến 8,5

- Hấp khử trùng môi trường ở 1210C trong 20 phút

- Bổ sung 100µL dung dịch nuôi cấy lỏng VSV lần lược vào 9 bình tam giác trên

- Nuôi lắc trong 24h

- Đếm số lượng tế bào CFU 9 mẫu theo từng giá trị pH

Xác định khoảng pH mà tại đó chỉ số nhất (VSV nhiều nhất), đó chính là khoảng pH thích hợp cho sự sinh trưởng của VSV

(b) Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ

Tương tự như đối với khảo sát ảnh hưởng của pH, tiến hành đặt dung dịch nuôi cấy lỏng đã cấy VSV ở các môi trường nhiệt độ khác nhau: 250C, 280C, 300C,

320C, 350C, 400C Sau 48h, tiến hành đếm số lượng CFU Ở khoảng nhiệt độ mà chỉ

số CFU đạt giá trị cao nhất (số lượng VSV nhiều nhất) thì đó là khoảng nhiệt độ tối

ưu cho sự sinh trưởng phát triển của VSV

(c) Phương pháp khảo sát thời gian sinh hoạt tính amylase mạnh nhất

Tương tự như “Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh hoạt tính protease của VSV”, tiến hành nuôi cấy lắc VSV trên môi trường lỏng, sau đó theo các mốc thời gian 24h, 48h, 72h lần lượt cho dung dịch nuôi cấy vào lỗ cấy Sau đó tiến hành các bước tiếp theo như phương pháp trên rồi dựa vào hiệu số đường kính thủy phân và đường kính lỗ thạch (D – d, mm) để xác định được hoạt tính của chủng VSV Quan

sát (D-d) của các mốc thời gian sinh trưởng, (D-d) càng lớn thì chủng đó có hoạt tính càng mạnh vào thời điểm sinh trưởng đó

- Pha loãng mẫu dung dịch nuôi cấy lỏng với các nồng độ 10-2 đến 10-10

- Nhỏ 1ml dung dịch ở mỗi độ pha loãng vào đĩa petri, dùng que trang đã khử trùng trang đều trên bề mặt đĩa Lặp lại thao tác, 3 đĩa petri ứng với mỗi nồng độ

pha loãng

- Đậy nắp đĩa petri và nuôi cấy trong tủ ấm 30 oC – 40oC

- Sau 48 – 72h lấy đĩa petri ra và chọn những đĩa petri ở nồng độ pha loãng mà

tại đó, số khuẩn lạc trên đĩa petri dao động từ 25 – 250

- Tính số lượng CFU (Colony Forming Unit: đơn vị hình thành khuẩn lạc)

trong 1ml mẫu dung dịch ở mỗi độ pha loãng theo công thức:

= (CFU/ml)

Trong đó:

Mi: tổng số CFU trong 1ml dung dịch ở mỗi độ pha loãng

Ai: số khuẩn lạc trung bình/ đĩa

Di: độ pha loãng mẫu

V: dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)

Mật độ tế bào trung bình M trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các nồng độ pha loãng khác nhau

2.3.2.6 Phương pháp bố trí thử nghiệm xử lý nước thải

Thí nghiệm XLNT bằng VSV được tiến hành trên bể xử lý sinh học Aeroten – pilot KT 11 với tích: Tiến hành pha loãng mẫu 6 lần với nước cất đã chuẩn bị sẵn với dung tích bể đạt 35 lít nước (nước thải + nước cất)

- Cấp khí: dùng 1 bơm thổi khí với công suất 40L/phút đảm bảo lượng oxy hòa tan tối ưu cho quá trình oxy hóa

- Vận tốc dòng chảy được điều chỉnh nhờ một bơm định lượng sao cho phù hợp với tốc độ oxy hóa, đảm bảo dòng ra đạt tiêu chuẩn thải:

(COD < 150mg/l, BOD5< 50mg/l)

Sau khi bổ sung dung dịch nuôi cấy lắc của chủng VK Bacillus được chọn vào

hệ thống xử lý sinh học hiếu khí với tỉ lệ số lượng VK/Vnước thải đã được xác định

2.3.2.7 Phương pháp phân tích trong quá trình xử lý nước thải

 Xác định pH trong nước thải

Đối với chỉ số này, tiến hành xác định bằng máy đo nhanh tự động

 Xác định BOD5 trong nước thải

Xác định BOD5 của mẫu nước thải bằng: Bộ xác định BOD 6 vị trí – BOD Sensor system 6 – Velp

Cách tiến hành:

- Cho vào lọ ủ BOD5 100ml mẫu nước thải/nước cất

- Thả cục khuấy từ vào lọ và lắp đầu xác định BOD5

- Cài đặt với thông số thích hợp (1000mg/l đối với 100ml mẫu)

- Nhấn Start để chạy chương trình đo tự động

- Sau 5 ngày đọc chỉ số BOD5 thật bằng công thức:

Real BOD5 = (a-b) × c (mg/l)

Trong đó: a: chỉ số BOD5 của mẫu nước thải

b: chỉ số BOD5 của mẫu nước cất c: độ pha loãng mẫu nước thải

 Phương pháp đo COD trong nước thải

Để xác định COD chúng tôi tiến hành theo phương pháp Hồi lưu kín – Trắc

quang (theo: Standar Method, 1999)

 Phương pháp xác định Nitơ tổng trong nước thải

Để xác định hàm lượng Nitơ tổng, chúng tôi tiến hành theo phương pháp Kjeldahl (phương pháp chưng cất đạm)