QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHUNG: VI SINH VẬT

Không tạo độc tố Các chủng VSV dùng để sản xuất phải tuân theo luật quốc tế. Danh sách các chủng được phép sử dụng trong bảng “Generally recognized As Safe”. Không sinh độc tố thậm chí trong điều kiện thuận lơị cho QT này.

CHƯƠNG 1 QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHUNG

• Không tạo độc tố

 Các chủng VSV dùng để sản xuất phải tuân theo luật quốc tế.

Danh sách các chủng được phép sử dụng trong bảng “Generally recognized As Safe”.

 Không sinh độc tố thậm chí trong điều kiện thuận lơị cho QT này.

• Khả năng tách chiết

Kết thúc quá trình lên men, tiêu diệt VSV này mà vẫn giữ nguyên hoạt độ enzim mong muốn.

1 Các tiêu chí lựa chọn vi sinh vật

1 VI SINH VẬT

• Ổn định gen

Chủng giống phải được bảo quản và tái tạo mãi mà không có bất cứ lạc hướng nào trong quá trình nuôi cấy liên tục.

2 CÁC VI SINH VẬT VÀ ENZIM CHỦ YẾU SỬ

DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP

Danh mục các vi sinh vật và enzim được liệt kê trong bảng

• Sản lượng

 Có khả năng chịu được điều kiện của quá trình lên men công nghiệp.

 Đạt được những mức thể hiện gen cao trong môi trường nuôi cấy.

 Về mặt sinh lý học VSV không gây ra sự tăng độ nhớt đáng kể trong quá trình tăng trưởng của tế bào.

3.Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống VSV

• Phân lập và tuyển chọn giống VSV

 Được phân lập từ đất, nước, không khí, từ một số thực vật

hoặc từ bộ sưu tập giống VSV có sẵn

 Tuyển chọn chủng VSV có khả năng sinh trưởng phát triển

nhanh, sinh tổng hợp enzim mong muốn cao và ổn định

 Với mục đích sử dụng trong CNTP, chế phẩm cần phải

được kiểm tra kỹ trên phương diện Độ độc.

• Cải tạo giống VSV

 mục đích:

 Tăng hiệu suất tăng trưởng và hoạt động đặc hiệu liên quan

tới tổng hợp protein enzim.

 Gây đột biến cấu trúc khi enzim là enzim cảm ứng.

 Cải thiện sức đề kháng tốt với các sản phẩm chuyển hoá.

 Đột biến bằng các tác nhân vật lý hoặc hoá học

• Các tác nhân vật lý: gồm có tia cực tím (tia tử ngoại) tia X

(rơnghen), tia , hoặc bắn phá bằng hạt nơtron, electron Trong

đó thường sử dụng nhất là tia cực tím (UV).

• Các tác nhân hoá học: các hợp chất chứa nitơ như:

nitrozometylguanidin, metyldicloroetylamin, nitrithydroxylamin,

etylmetylsulfonat.

 Đột biến bằng phương pháp sinh học phân tử

• Phương pháp biến nạp: là sự truyền ADN từ tế bào cho đến tế

bào nhận có thể xảy ra trong ống nghiệm khi cho tế bào nhận tiếp xúc với dịch chiết từ tế bào cho mà không cần có sự tiếp xúc trực tiếp giữa các tế bào.

• Phương pháp tiếp hợp gen: vật liệu di truyền (ADN) chỉ được

truyền từ tế bào cho đến tế bào nhận khi hai tế bào tiếp xúc với

nhau, do vậy các VSV có khả năng biến nạp thì không có khả năng tham gia tiếp hợp gen

• Phương pháp tải nạp: vật liệu di truyền ADN được chuyển từ tế

bào cho đến tế bào nhận nhờ vai trò trung gian của thực khuẩn thể (Phage) Trong quá trình tải nạp các đoạn ADN được chuyển từ tế bào cho đến tế bào nhận tiếp hợp với ADN của tế bào nhận do đó làm biến đổi tính chất di truyền của tế bào nhận.

2 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

1 Các tiêu chí lựa chọn nguyên liệu

Đáp ứng được các luật hiên hành ở các nước tiên tiến: không có các chất sát trùng, kháng sinh, thuốc trừ sâu, kim loại nặng …

Nguồn cung cấp ổn định về số lượng và chất lượng suốt trong năm

Giá cả rẻ nhất có thể được bao gồm cả bảo quản và vận chuyển

Trong thực tế tất cả các sản phẩm được sử dụng làm môi trường thường được lấy từ các nhà máy nông sản thực phẩm Nguyên liệu của môi trường lên men bao gồm :

• Nguồn cacbon: bột ngũ cốc, bột đậu, bột ngô, khoai tây, cám mì hoặc

cám gạo, tinh bột, maltodextrin, xenluloza, glucoza, sacaroza, … nguồn phi gluxit như glyxerol, axit béo

•Nguồn nitơ: tách chiết nấm men, casein (13% nitơ), bột cá, khô lạc, khô

đậu, sản phẩm thuỷ phân của casein (nguồn nitơ hữu cơ) Các muối

amôn và nitrat … (nguồn nitơ vô cơ)

•Các muối vô cơ: mang lại một lượng tối thiểu các kim loại như Mg, Ca,

K, Fe, Mn, Zn … Photpho dưới dạng muối photphat và lưu huỳnh dưới dạng muối sulfat

•Các chất tăng trưởng và các chất kích thích tăng trưởng: chất cảm

ứng; các coenzym (thiamin tăng sản xuất pyruvat cacboxylase); sản phẩm của phản ứng enzym (maltodextrin đối với a-amylase, maltoza đối với

pullulanase)

2 Chuẩn bị và thanh trùng môi trường

 Nguyên tắc chung

• Vệ sinh môi trường nuôi cấy phải được duy trì cho tới thời điểm thu hồi VSV, xử lý tách enzim

• Không nên thanh trùng tạo ra các sản phẩm bất lợi cho sự tăng

trưởng của VSV và tổng hợp enzim (phản ứng Maillard)

 Đối với phương pháp nuôi cấy bề mặt

• Gồm các nguyên liệu tự nhiên: cám gạo, khô cám, cám mỳ, tấm gạo, ngô (chiếm 90 – 95%)

• Bổ sung trấu nhỏ hoặc mùn cưa (5 – 10%) để làm xốp canh trường

• Trước khi gieo VSV, môi trường cần được làm ẩm đến 50 – 65% và

thanh trùng 1 at ở 120oC để diệt VSV lạ, sau đó hạ nhiệt độ xuống 30 –

40oC và tiến hành gieo cấy VSV

 Đối với phương pháp nuôi cấy chìm

• Dịch dinh dưỡng được cho vào thùng lên men Sau đó đưa trực tiếp hơi nước nống vào thanh trùng ở nhiệt đô 118 – 125oC trong 45 – 60 phút

• Hạ nhiệt độ và bổ sung VSV

3 QUÁ TRèNH LấN MEN

1 Cỏc phương phỏp lờn men được sử dụng

 Phươngưphápưlênưmenưbềưmặt

• Nguyờn tắc: sử dụng một chất mang rắn, trờn đú nuụi cấy VSV (thường là

nấm sợi)) Quỏ trỡnh nuụi cấy diễn ra trong thiết bị dạng giàn làm ẩm hay dạng thựng quay

Canh trường sau khi sấy khụ vận chuyển được dễ dàng Trỏnh được

nhiễm trựng toàn khối canh trường và ớt tốn điện năng

• Nhược điểm: năng suất thấp, khụng nõng cao được năng suất thiết bị

Tốn nhiều cụng lao động thủ cụng Khú điều chỉnh thành phần mụi trường Khú cơ giới hoỏ và tự động hoỏ

 Phươngưphápưlênưmenưbềưsâu

• Nguyờn tắc: sử dụng mụi trường lỏng trong thiết bị phản ứng để nuụi cấy

VSV Tất cả cỏc thụng số của quỏ trỡnh lờn men được kiểm tra và điều chỉnh trong suốt quỏ trỡnh

• Ưu điểm: Chủ động điều khiển quỏ trỡnh lờn men Dễ cơ giới hoỏ, tự động

hoỏ Năng suất cao Cú tớnh liờn tục tiết kiệm được diện tớch sản xuất Sử dụng hợp lý cỏc chất dinh dưỡng của mụi trường độ đồng nhất trong mụi trường lờn men tốt, thuận lợi cho quỏ trỡnh tỏch chiết

• Nhược điểm: Nồng độ enzim trong canh trường thấp Phải cụ đặc nờn giỏ

thành cao Tốn điện năng do sục khớ liờn tục Khi khụng đảm bỏo vụ trựng tuyệt đối dễ bị nhiễm toàn bộ mụi trường

2 Quá trình lên men chính

2.1 Khía cạnh sinh học

• Khi nuôi VSV tạo enzim có hai quá trình liên quan mật thiết với

nhau: sinh khối VSV và tích tụ enzim Hai quá trình này không phải lúc nào cũng trùng khớp nhau về mặt thời gian.

• Theo lý thuyết hiện đại giữa vận tốc ST và vận tốc STH enzim có mối tượng quan phụ thuộc Hai kiểu phụ thuộc giữa các quá trình này:

 Kiểu 1: vận tốc ST của VSV hoàn toàn phù hợp chính xác với

vận tốc STH enzim.

 Kiểu 2: Sự không trùng khớp của 02 giai đoạn này được xác

định bằng « tuổi thọ » của axit ribonucleic thông tin hay axit axit ribonucleic khuôn.

• Theo lý thuyết về các quá trình đồng hoá và dị hoá Ba dạng biểu hiện tương quan các quá trình này:

Dạng 1 Dạng 2 Dạng 3

• Dạng 1: Tăng trưởng VSV và STH enzim đi đôi với nhau (hình 1a)

Enzim tạo nên bằng con đường dị hoá, cơ chất chính của lên men cũng là chất cảm ứng enzim.

• Dạng 2: sản xuất enzim liên tục, thậm chí sau pha tăng trưởng

(hình 1b) Enzim tạo nên bằng con đường dị hoá, nhưng cơ chất chính của lên men và chất cảm ứng enzim là khác nhau.

• Dạng 3: Một giai đoạn lệch pha giữa pha tăng trưởng VSV và STH

enzim (hình 1c) Enzim tạo nên bằng con đường đồng hoá Sự kìm hãm ngừng lại khi nồng độ của chất kìm hãm đã bị giảm xuống do

sự tăng trưởng của VSV.

2.2 Khía cạnh hoá sinh

 Các tế bào VSV sử dụng oxy (3 – 10 tấn oxy tinh khiết/ ngày/ thiết bị LM 100m3); sử dụng các chất dinh dưỡng của môi trường lên men

 Sản sinh ra sinh khối (tăng trưởng từ 1 tới 108 chỉ trong 5 – 10 ngày); CO2, nhiệt (2106kj/h); tiết ra các sản phẩm trao đổi chất và enzim

2.3 Các phương pháp lên men bề sâu

Trong QTLM với việc lấy mẫu vô trùng môi trường cho phép xác định:

• Sự tăng trưởng của VSV (sinh khối; độ nhớt)

• Nồng độ enzim (hoạt độ enzim)

• Tiêu thụ cơ chất

• Tỷ lệ protein

Với các bộ phận thu nhận tín hiệu cho phép đo hay điều chỉnh:

• pH, bởi điện cực được gắn trên bình lên men và thùng chứa axit hay bazơ

• Nhiệt độ, bởi lưu lượng nước lạnh chảy bên ngoài hay trong ống xoắn

• Mức độ bọt, bởi một bộ phận có chứa chất chống tạo bọt thực phẩm.

• Áp suất, bởi van an toàn nằm giữa 1 – 3 bar.

• Hệ số hô hấp QR (CO2 sinh ra/ O2 tiêu thụ).

• Tỷ lệ tiêu thụ oxy.

2.3.1 Phương pháp không tiếp nguyên liệu

Trước khi cấy giống tất cả các thành phần môi trường được chuẩn bị trong thiết bị lên men Sau khi cấy giống QT lên men chính bắt đầu và tiếp tục cho tới khi kết thúc

Việc quyết định dừng QT lên men chính thường gắn với sự cạn kiệt của một trong số các cơ chất

Trong một số trường hợp giá trị pH thay đổi quá giới hạn về cả hai phía cũng

là một tiêu chuẩn để dừng lên men

2.3.2 Phương pháp tiếp nguyên liệu

“Phần nền của thùng LM” chỉ gồm một phần (10 – 30%) thể tích thùng, cung cấp dinh dưỡng cho lượng giống được cấy vào

Thiết bị LM sau đó được cung cấp phần còn lại của MT QT cung cấp NL có thể lặp lại nhiều lần

Thời điểm dừng LM phải được dự đoán vào thời điểm đổ đầy dịch vào thùng LM

Phương pháp cho phép sử dụng tốt nhất thể tích TB và năng suất LM cao hơn

2.3.3 Phương pháp lên men liên tục

• Cung cấp NL và rút dịch môi trường LM được thực hiện liên tục.

• Điều chỉnh lưu lượng dòng chảy vào và ra đảm bảo nhận được nồng độ enzim mong muốn tối ưu và ổn định

Phương pháp này đòi hỏi phải có các thiết bị phù hợp để xử lý

liên tục và hài hoà giữa tách chiết và nuôi cấy.

2.4 Các thông số vật lý và sinh lý ảnh hưởng tới QTLM

2.4.1 Các thông số vật lý

• Nhiệt độ: Lượng nhiệt giải phóng có thể đạt 2106kcal/h Cần phải làm nguội.

• pH: pH phải được điều chỉnh liên tục nhờ các điện cực bằng các chất kiềm

(NaOH, KOH, …) hoặc các chất đệm photphat hoặc axit vô cơ (photphoric,

sulfuric…)

• Bọt: Khi khuấy trộn môi trường giàu protein sinh ra bọt Bổ sung các chất

chống tạo bọt là các dầu thực vật, động vật và silicon Các chất này ảnh

hưởng không tốt tới sự vận chuyển oxy và đối với VSV

2.4 Các thông số vật lý và sinh lý ảnh hưởng tới QTLM

• Oxy hoá môi trường: thông số đặc trưng đặc biệt khó điều khiển trong

qui mô công nghiệp Khó khăn ở chỗ các cấu phần chung “lên men - thiết

bị lên men” tuân theo các luật tự nhiên khác nhau: QT vật lý (chuyển

khối), QT sinh lý (các VSV), QT hỗn hợp khi có sự tương tác giữa hai QT trên:

– Phương thức chuyển dịch: trong một hệ thống cân bằng tỷ lệ chuyển

dịch oxy (TCO) tỷ lệ tuyến tính với các nồng độ khác nhau của oxy trên bề mặt khí - lỏng Trong QTLM toàn bộ tổng thể khuấy trộn - sục khí – môi trường tương tác với giá trị hệ số chuyển dịch thể tích

TCO = KLa (C* – CL)

C* trong màng khí; CL trong pha lỏng; KLa hệ số chuyển dịch thể tích

– Tương tác với hình thái của VSV: trong QTLM các sợi nấm biểu thị

những biến đổi hình thái phức tạp Độ nhớt biểu kiến cao sẽ gây trở ngại cho sự chuyển khối Sự cọ xát có xu hướng phá vỡ các sợi khi tốc độ ngoại vi đạt 5.10 m/s trong thiết bị LM có dung tích lớn

– Độ hoà tan của oxy trong nước ở 25oC, dưới áp suất 1at (oxy tinh

khiết) chỉ là 1,29mM (hoặc 0,041g/l) và giảm xuống khi nhiệt độ tăng lên

2.4.2 Các thông số sinh lý

• Cân bằng năng lượng: Một lượng lớn năng lượng phát tán dưới dạng

nhiệt cần phải loại bỏ bằng hệ thống làm nguội của thiết bị Cần phải hướng việc sử dụng năng lượng này cho sự tổng hợp enzim

• Áp suất CO 2 : Khí CO2 có mặt trong tất cả các QTLM với tỷ lệ dao động Nó đóng vai trò quan trọng trong các phản ứng cacboxyl hoá và sự tổng hợp một vài loại enzim Trong trường hợp này sục khí quá mạnh sẽ không có lợi

• Áp suất O 2 : Oxy có tác dụng khác nhau trong các giai đoạn sinh trưởng hay tổng hợp enzim:

– Tổng hợp penicilinaxylase bởi E coli: Tỷ lệ oxy hoà tan cao tạo điều

kiện thuận lợi cho sinh trưởng, nhưng không thuận lợi cho STH enzim

– Tổng hợp glucooxydase bởi Asp Niger: tăng áp suất oxy liên quan tới

tăng độ tăng trưởng và phân tiết đạt giá trị cực đại; nhưng lại giảm

xuống nếu tiếp tục tăng áp suất oxy

• Cảm ứng - ức chế: Trong một số QTLM người ta cần một chất cảm ứng

Một số trường hợp khác phải tránh sự có mặt của các chất ức chế vào thời điểm ban đầu hay sự xuất hiện của chúng trong QTLM

4 QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT ENZIM

1 Làm lạnh môi trường nuôi cấy ngay khi QTLM kết

thúc tới 3 – 5oC

• Tránh vô hoạt enzim.

• Tránh nguy cơ nhiễm tạp VSV.

2 Phân tách pha chứa enzim

Đối với enzim ngoại bào

• Điều chỉnh pH môi trường tới giá trị pH tối ưu của enzim và duy

trì suốt trong QTTC.

• Bổ sung các chất trợ lắng như bột diatomit, silic, xenluloza

• Phân tách các vật liệu tế bào và các vật liệu không hoà tan: vi lọc,

ly tâm, lọc màng.

• Siêu lọc dung dịch protein vô trùng để thu nhận được tối đa

enzim mong muốn với ngưỡng cắt màng và lưu lượng dòng chảy được lựa chọn Nồng độ enzim nhận được tăng 20 – 40 lần.

4 QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT ENZIM

Đối với enzim nội bào

bởi peptido glucan

- Enzim ngoại bào: Enzim được STH trong tế bào và được tiết ra bên ngoài môi trường trong QTLM.

- Enzim nội boà: Enzim được STH và sử dụng hoàn toàn bên trong tế bào Chúng tồn tại dưới dạng liên hợp, dạng liên kết hay dạng “bị nhốt trong các bào quan của tế bào.

- Enzim périplasmique: Enzim nzừm ngoài màng sinh chất nhưng bên trong tế bào.

• Tự phân.

• Phân giải bằng các chế phẩm enzim (chitinase, mananase, protease…).

• Lysozim của lòng trắng trứng.

• Sốc áp suất thẩm thấu đối với enzim periferique

• Sóng siêu tần (20 MHz).

• …

ngoại bào.

5 QUÁ TRÌNH TINH CHẾ ENZIM

Thành phần của dịch chứa enzim: nhiều loại enzim; protein; các tạp chất khác.

Quá trình phân tách được phân ra 03 giai đoạn:

– Giai đoạn 1: Trích ly cho phép nhận được hỗn hợp phân tử dưới dạng hoà tan có các tính chất lý hoá học rất gần nhau.

– Giai đoạn 2: Phân đoạn hỗn hợp dựa vào độ hoà tan khác nhau

để nhận được một họ các phân tử.

– Giai đoạn 3: Tinh sạch bằng các phương pháp lý hoá học và

đặc hiệu sinh học tinh tế hơn để nhận được một phân tử enzim tinh khiết.

6 QUÁ TRÌNH CÔ ĐẶC VÀ HOÀN THIỆN

SẢN PHẨM

Cô đặc

– Siêu lọc: màng bán thấm dạng sợi xốp hay sợi màng; lọc ở

áp suất cao (vài atm); các phần tử nhỏ đi qua màng bán thấm (nước và muối vô cơ).

– Làm bay hơi nước ở áp suất thấp (cô đặc chân không).

– Làm bay hơi nước ở nhiệt độ cao trong thời gian ngắn (sấy

phun).

Hoàn thiện sản phẩm

– Dạng bột: bổ sung các chất nền để điều chỉnh nồng độ hoạt

độ enzim của chế phẩm.

– Dạng lỏng: Bổ sung các chất bảo quản NaCl, socbitol,

glyxerol, benzoat.

7 KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM

Chất lượng sản

phẩm

Hoạt độ enzim

Chất lượng

VSV (Không có các

mầm bệnh)

Độ ổn định của enzim trong bảo quản