Nghiên cứu tuyển chọn chủng giống khởi động cho lên men pho mát

Trong ngành công nghiệp sản xuất pho mát, các vi khuẩn lactic với vai trò là giống khởi động được sử dụng nhằm tạo lập các đặc điểm đặc trưng về cảm quan, cấu trúc và dinh dưỡng cho sản

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC BẢNG BIỂU viii

DANH MỤC HÌNH ẢNH ix

BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT x

LỜI MỞ ĐẦU 1

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về pho mát 3

1.1.1 Pho mát 3

1.1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ pho mát trên thế giới và Việt Nam 4

1.1.3 Công nghệ sản xuất pho mát 6

1.1.4 Các quá trình chuyển hóa của vi khuẩn lactic trong sản xuất pho mát 8

1.1.4.1 Quá trình chuyển hóa lactose 9

1.1.4.2 Quá trình chuyển hóa axit lactic 10

1.1.4.3 Quá trình chuyển hóa citrate 11

1.1.4.4 Quá trình phân giải lipit và chuyển hóa axit béo 14

1.1.4.5 Quá trình phân giải protein 16

1.2 Giống khởi động cho sản xuất pho mát 19

1.2.1 Các nhóm vi khuẩn lactic khởi động trong công nghiệp sản xuất pho mát 19

1.2.1.1 Các chủng vi khuẩn lactic ưa ấm 20

1.2.1.2 Các chủng vi khuẩn lactic ưa nhiệt 21

1.2.1.3 Các chủng khởi động “thủ công” 22

1.2.2 Chức năng cần thiết của giống khởi động công nghiệp 23

1.2.2.1 Sản xuất axit 23

1.2.2.2 Tổng hợp enzym phân giải protein 23

1.2.2.3 Tổng hợp exopolysaccharide 24

1.2.2.4 Khả năng tạo hương 25

1.2.3 Tình hình nghiên cứu tạo giống khởi động cho sản xuất pho mát ở Việt Nam 26

Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27

2.1 Hóa chất và thiết bị 27

2.1.1 Hóa chất 27

2.1.2 Thiết bị 27

2.2 Nguồn sữa và chủng vi sinh vật 28

2.3 Môi trường 28

2.2.1 Môi trường MRS 28

2.2.2 Môi trường thử citrate 28

2.2.4 Môi trường thử khả năng đông tụ sữa 29

2.4 Phương pháp nghiên cứu 29

2.4.1 Phương pháp kiểm tra khả năng đông tụ sữa 29

2.4.2 Phương pháp xác định kiểu len men 30

2.4.3 Phương pháp kiểm tra phổ nhiệt độ sinh trưởng 30

2.4.4 Phương pháp kiểm tra khả năng sử dụng citrate 30

2.4.5 Phương pháp định lượng exopolysaccharide 30

2.4.6 Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng số phenol - axit sunfuric 31 2.4.7 Phương pháp kiểm tra hoạt tính enzym protease ngoại bào 32

2.4.8 Xác định hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp DPPH 32

2.4.9 Phương pháp xác định hoạt tính X – prolyl – dipeptidyl aminopeptidase 33

2.4.10 Định lượng protein bằng phương pháp Lowry 35

2.4.11 Phương pháp kiểm tra khả năng sử dụng nguồn cacbon 36

2.4.12 Phương pháp kiểm tra hoạt tính enzym 37

2.4.13 Phương pháp xác định tên loài bằng trình tự 16S rDNA 39

2.4.14 Phương pháp sản xuất pho mát tươi 40

2.4.15 Tách hợp chất dễ bay hơi bằng phương pháp chưng cất 41

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 42

3.1 Nghiên cứu đặc điểm của giống khởi động cho sản xuất pho mát 42

3.1.1 Khả năng đông tụ sữa 43

3.1.2 Phổ nhiệt độ sinh trưởng 45

3.1.3 Kiểu lên men lactic 46

3.1.4 Khả năng chuyển hóa citrate 47

3.1.5 Khả năng tổng hợp exopolysaccharide 49

3.1.6 Hoạt tính protease ngoại bào 50

3.1.7 Khả năng tổng hợp enzym X – prolyl – dipeptidyl aminopeptidase 51

3.1.8 Khả năng tạo hương thơm của các chủng vi khuẩn lactic trên mẫu pho mát tươi 52

3.1.9 Hoạt tính chống oxy hóa 52

3.2 Hồ sơ bộ chủng giống tuyển chọn 54

3.2.1 Định tên chủng 54

3.2.2 Khả năng sử dụng các nguồn đường 55

3.2.3 Phổ hoạt tính enzym 58

3.3 Phối trộn 2 chủng M11 và T21 60

3.3.1 Thời gian đông tụ và đặc tính của sữa lên men bởi hỗn hợp chủng M11 và T21 60

3.3.2 Khả năng tạo các hợp chất dễ bay hơi của hỗn hợp chủng M11 và T21 trong lên men sữa 62

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

PHỤ LỤC 73

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Phân loại pho mát theo độ ẩm 3

Bảng 1.2: Mô tả vị và ngưỡng giá trị của vị của một số axit amin của pho mát Cheddar (ủ chín 6 tháng) 16

Bảng 1.3: Các hợp chất hương hình thành từ quá trình chuyển hóa axit amin qua axit α – keto theo con đường chuyển hóa transaminase 19

Bảng 1.4: Các giống khởi động của một số loại pho mát 19

Bảng 2.1: Các nguồn cacbon của bộ kit API 50 CHL 36

Bảng 2.2: Enzym và cơ chất của bộ kit API ZYM 37

Bảng 3.1 Thống kê các chủng vi khuẩn lactic được khảo sát 42

Bảng 3.2: Khả năng đông tụ sữa của vi khuẩn lactic 44

Bảng 3.3: Dải nhiệt độ sinh trưởng của các vi khuẩn lactic 46

Bảng 3.4: Kiểu lên men lactic của các vi khuẩn lactic 47

Bảng 3.5: Khả năng chuyển hóa citrate của các vi khuẩn lactic 48

Bảng 3.6: Hàm lượng exopolysaccharide được tổng hợp bởi các vi khuẩn lactic 49

Bảng 3.7: Hoạt tính protease ngoại bào của các vi khuẩn lactic 50

Bảng 3.8: Hoạt lực X – prolyl – dipeptidyl aminopeptidase của các vi khuẩn lactic 51

Bảng 3.9: Cảm quan hương thơm của mẫu pho mát 52

Bảng 3.10: Khả năng giảm gốc DPPH của sữa lên men bởi các vi khuẩn lactic 53

Bảng 3.11: Khả năng sử dụng đường 55

Bảng 3.12: Phổ hoạt tính enzym của chủng M11 và T21 58

Bảng 3.13: Thời gian đông tụ của sữa lên men bởi chủng M11, T21 61

Bảng 3.14: Đặc tính của sữa lên men bởi hỗn hợp chủng 61

Bảng 3.15: Các cấu tử trong thành phần các hợp chất dễ bay hơi của pho mát tươi .62

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Sản lượng pho mát trên thế giới giai đoạn 2000 – 2010 5

Hình 1.2: Tỉ trọng kim ngạch nhập khẩu sữa và các sản phẩm từ sữa 6

của Việt Nam, năm 2009 6

Hình 1.3: Sơ đồ sản xuất pho mát Cheddar (a) và Emmental (b) 8

Hình 1.4: Các con đường lên men hexose (glucose) chính ở vi khuẩn lactic 9

Hình 1.5: Các con đường chuyển hóa lactate trong giai đoạn ủ chín pho mát 10

Hình 1.6: Các con đường chuyển hóa citrate của các chủng Cit+ thuộc Lactococcus và Leuconostoc sp 12

Hình 1.7: Con đường tiềm năng tổng hợp succinate của các chủng Lactobacillus 13

Hình 1.8: Các con đường chuyển hóa axit béo tự do 15

Hình 1.9: Khái quát các con đường chuyển hóa protein tạo hương ở các sản phẩm sữa lên men 18

Hình 1.10: Vị trí của polysaccharide được tổng hợp bởi các vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) trên tế bào 25

Hình 3.1: Khả năng đông tụ sữa của VNC1 và T21 sau 24 giờ 45

Hình 3.2: Khả năng sử dụng citrate 48

Hình 3.3: Hoạt tính phân giải casein của các vi khuẩn lactic 51

Hình 3.4 : Hình thái tế bào hai chủng T21 và M11 54

Hình 3.5: Khả năng sử dụng các nguồn đường của chủng M11 và T21 sau 48h 57

Hình 3.6: Hoạt tính enzym dịch nội bào của chủng M11 và T21 60

FAO Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc

GC - MS Gas chromatography – Mass spectrometry

LAB Lactic acid bacteria

MRS de Man, Rogosa and Sharpe (Medium for LAB)

PCR Polymerase Chain Reaction

rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic acid

TCA cycle Tricarboxylic acid cycle

WHO Tổ chức Y tế Thế giới

LỜI MỞ ĐẦU

Pho mát là một thực phẩm giàu dinh dưỡng, có hàm lượng protein cao với đầy

đủ các axit amin không thay thế, chứa nhiều vitamin như: Vitamin A, riboflavin, vitamin B, vitamin D và các chất khoáng: kẽm, photpho, canxi Pho mát cũng mang lại nhiều lợi ích về sức khỏe như: Bảo vệ răng, chống loãng xương, ngăn ngừa ung thư

Theo thống kê của FAO, sản lượng pho mát trên toàn thế giới liên tục tăng qua các năm Năm 2013, sản lượng pho mát đạt khoảng 20 triệu tấn/năm Trong đó, sản xuất và tiêu thụ sản phẩm này chỉ tập trung ở các nước phát triển Ở Việt Nam, hầu hết pho mát được nhập khẩu và mức tiêu thụ còn khiêm tốn: kim ngạch nhập khẩu pho mát chỉ đạt 24,04 triệu USD (năm 2008), chiếm khoảng 7% tổng kim ngạch nhập khẩu sữa và các sản phẩm từ sữa Một trong những nguyên nhân là do sản phẩm chưa hợp với thị hiếu của người Việt Nam và giá thành cao Tuy nhiên, cùng với đà tăng trưởng kinh tế thì nhu cầu về các sản phẩm có giá trị dinh dưỡng, tốt cho sức khỏe như pho mát sẽ tăng cao Năm 2009, mức tiêu thụ sữa và các sản phẩm từ sữa bình quân đầu người đang ở mức rất thấp 11,2 kg/người/năm so với mức bình quân 62 kg/người/năm của Châu Á, 96 kg/người/năm của thế giới và 248 kg/người/năm ở các nước phát triển Như vậy có thể thấy nhu cầu về sữa và các sản phẩm từ sữa trong đó có pho mát ở Việt Nam còn rất lớn

Vi khuẩn lactic được coi là vi sinh vật an toàn và đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực sản xuất và bảo quản thực phẩm Trong ngành công nghiệp sản xuất pho mát, các vi khuẩn lactic với vai trò là giống khởi động được sử dụng nhằm tạo lập các đặc điểm đặc trưng về cảm quan, cấu trúc và dinh dưỡng cho sản phẩm Hơn nữa, hệ enzym của vi khuẩn lactic cũng góp phần tích cực chuyển hóa các sản phẩm thủy phân protein từ sữa thành các hợp chất có hoạt tính sinh học Các giống khởi động đã được thương mại hóa thường là sự kết hợp của một, hai hoặc một vài

chủng thuộc thuộc các chi Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc

Hiện nay, ở Việt Nam đã có nghiên cứu về công nghệ sản xuất chế phẩm giống khởi động cho lên men thực phẩm như nem chua, tôm chua, sữa chua Tuy nhiên, nghiên cứu về giống khởi động ứng dụng cho sản xuất pho mát vẫn chưa

được tiến hành nhiều Xuất phát từ những vấn đề trên, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên

cứu tuyển chọn chủng giống khởi động cho lên men pho mát”

Mục tiêu của đề tài: Tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic làm giống khởi

động phục vụ cho sản xuất pho mát

Nội dụng nghiên cứu

 Khảo sát các đặc điểm của vi khuẩn lactic làm giống khởi động trong sản xuất pho mát: khả năng đông tụ sữa, kiểu hình lên men lactic, sinh tổng hợp exopolysaccharide, chuyển hóa citrate, hoạt tính X – prolyl – dipeptidyl aminopeptidase, hoạt tính chống oxy hóa

 Tuyển chọn chủng giống, định tên và lập hồ sơ bộ chủng giống

 Kiểm tra đặc tính của sữa lên men và khả năng tạo hương của pho mát tươi làm từ sữa lên men bởi hỗn hợp chủng giống

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về pho mát

1.1.1 Pho mát

Pho mát (hay phô mai) là tên gọi chung của một nhóm các sản phẩm từ sữa, được sản xuất trên toàn thế giới với đủ các hương vị, màu sắc, độ mềm cứng khác nhau Hiện nay, có hơn 1000 loại pho mát, được làm từ nhiều nguồn khác nhau như sữa bò, cừu, dê , nhưng chủ yếu là từ sữa bò Pho mát là một thực phẩm có nguồn gốc lâu đời, được cho là bắt nguồn từ khu vực nằm giữa hai con sông Tigris và Euphrates, nay là Iraq, cách đây khoảng 8000 năm [26, 59]

Pho mát là một thực phẩm giàu dinh dưỡng, có hàm lượng protein, chất béo tương đối cao, ở dạng dễ hấp thu, có đầy đủ các axit amin không thay thế, các vitamin và chất khoáng [9, 58]

Theo định nghĩa của FAO/WHO, pho mát là sản phẩm rắn hoặc bán rắn, ở dạng tươi hoặc đã qua ủ chín, thu được bằng cách làm đông tụ sữa hoặc các nguyên liệu từ sữa: sữa gầy, sữa tách béo, cream, whey cream, nhờ hoạt động của enzym rennet hoặc các tác nhân đông tụ thích hợp khác và làm tách một phần nước khỏi quện sữa đông [62]

Pho mát có thể được phân loại theo nhiều cách khác nhau: tác nhân đông tụ casein, độ ẩm, loại vi sinh vật tham gia vào quá trình ủ chín hay dựa vào cấu trúc của pho mát Phân loại theo độ ẩm, pho mát được chia các loại như sau:

Bảng 1.1: Phân loại pho mát theo độ ẩm [66]

Pho mát mềm 55- 80

Pho mát tươi, không ủ chín: Cottage, Ricotta,

Quarg, Mozzarella Pho mát ủ chín bề mặt bằng nấm mốc: Brie,

Camembert Pho mát bán

Phân loại pho mát dựa vào cấu trúc và công nghệ sản xuất:

- Pho mát tươi đông tụ bởi axit, không bổ sung enzym rennet hoặc nếu có thì với tỷ lệ rất thấp Axit được tạo ra thường bằng vi khuẩn lactic Tuy nhiên có một

số loại pho mát tươi được axit hóa trực tiếp bởi gluconodelta – lactone Sản phẩm điển hình là Cottage, Quark, Cream và pho mát tươi Bắc Mỹ

- Pho mát tươi đông tụ bởi rennet, không bổ sung vi khuẩn lactic hoặc nếu có thì rất ít như: Quesco, Balnco, Quesco Fresco, Halloumi, pho mát tươi từ Ý

- Pho mát đông tụ bởi axit ở nhiệt độ cao Sản phẩm có độ ẩm cao nhưng chắc Sản phẩm điển hình như Ricotta (Ý), Channa và Paneer (Ấn Độ), pho mát trắng

Mỹ - Latin

- Pho mát mềm ủ chín: vi khuẩn lactic được cấy vào để lên men lactic trước khâu được đông tụ bởi enzym rennet Một số pho mát điển hình như: Fetta, Camembert, Brie, Blue

- Pho mát bán cứng có qua giai đoạn rửa hạt pho mát sau đông tụ như: Gouda, Edam, Colby

- Pho mát cứng nhiệt độ thấp, không qua giai đoạn rửa hạt pho mát sau đông

tụ như: Cheddar, Pasta Filata

- Pho mát cứng nhiệt độ cao, quá trình tách nước hỗ trợ bằng nhiệt độ cao như: Romano, Swiss, Parmersan

1.1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ pho mát trên thế giới và Việt Nam

Theo thống kê của FAO, sản lượng pho mát trên thế giới năm 2010 đạt khoảng 20,2 triệu tấn, trong đó tập trung chủ yếu ở khu vực châu Âu, bắc – trung Mỹ với sản lượng tương ứng là 10,3 và 6,8 triệu tấn Trong giai đoạn từ 2000 – 2010, sản lượng pho mát trên toàn thế giới tăng 3,6 triệu tấn, trung bình mỗi năm sản lượng pho mát tăng khoảng 2% [80] Tình hình tiêu thụ pho mát cũng khác nhau rõ rệt giữa các nước và theo khu vực Pho mát chủ yếu được tiêu thụ ở các nước phát triển, tập trung nhiều ở khu vực châu Âu và bắc Mỹ Tuy nhiên, các số liệu thống kê cũng cho thấy lượng pho mát tiêu thụ được cho đã tăng ở hầu hết các nước

Hình 1.1: Sản lượng pho mát trên thế giới giai đoạn 2000 – 2010 [28]

Ở Việt Nam, tính đến năm 2009, mức tiêu thụ sữa và các sản phẩm từ sữa bình quân đầu người là 11,2 kg/người/năm thấp hơn nhiều so với mức bình quân của Châu Á (62 kg/người/năm) và của thế giới (96 kg/người/năm) [4] Tuy nhiên, cùng với việc thu nhập bình quân đầu người đang tăng lên hàng năm và thói quen tiêu thụ sữa được hình thành thì thị trường sữa Việt Nam có tiềm năng tăng trưởng khá tốt trong tương lai Theo thống kê của Tổng cục hải quan, kim ngạch nhập khẩu sữa và các sản phẩm từ sữa của 11 tháng đầu năm 2009 chỉ đạt 287,14 triệu USD, giảm 28,92% so với cùng kì năm 2007 nhưng tới năm 2013, con số này đã tăng lên 839,4 triệu USD, tăng 25% so với cùng kỳ năm 2012 (673,8 triệu USD) [78]

Hiện nay, các sản phẩm pho mát: Chedda, Gouda, Emmental, Pasmesan, Mozzarella, Edam đã được nhập khẩu vào Việt Nam nhưng mức tiêu thụ chưa cao Tuy nhiên, nhu cầu sử dụng các sản phẩm sạch và có giá trị dinh dưỡng cao ngày

Triệu tấn

càng tăng nên các sản phẩm như pho mát sẽ có nhiều triển vọng Năm 2008, kim ngạch nhập khẩu pho mát đạt 24,04 triệu USD, tăng 7,33 triệu USD so với năm

2007 Năm 2009, kim ngạch nhập khẩu pho mát 11 tháng đầu năm chiếm 7,23% tổng kim ngạch nhập khẩu sữa và các sản phẩm từ sữa [6] Đến nay, pho mát đã trở thành loại thực phẩm khá quen thuộc ở các thành phố lớn Đánh giá được nhu cầu

về pho mát sẽ tăng trưởng ở Việt Nam, đặc biệt là loại pho mát chế biến hợp với khẩu vị và sở thích của người Việt Nam, các công ty chế biến sữa quy mô vừa và nhỏ như công ty Cổ phần Sữa Ba Vì đang chuẩn bị tham gia vào lĩnh vực sản xuất này

Hình 1.2: Tỉ trọng kim ngạch nhập khẩu sữa và các sản phẩm từ sữa

của Việt Nam, năm 2009 [6]

1.1.3 Công nghệ sản xuất pho mát

Sản xuất pho mát thực chất là quá trình loại nước khỏi sữa, trong đó casein và chất béo của sữa được cô đặc từ 6 – 12 lần tùy từng loại pho mát, bắt đầu bằng một hoặc kết hợp của hai quá trình: lên men nhờ vi sinh vật và đông tụ protein sữa nhờ enzym rennet Quy trình sản xuất pho mát gồm các khâu chính: đông tụ sữa, loại nước khỏi quện sữa (cắt quện sữa, nấu, khuấy, ép), tạo hình (nghiền, đổ khuôn, ép)

và muối Tuy nhiên, ở mỗi khâu cách thức thực hiện khác nhau đã tạo ra các sản phẩm đặc trưng riêng Quy trình sản xuất có thể tóm tắt như sau [9, 10, 59]:

- Tiêu chuẩn hóa: Pho mát có thể làm từ sữa, sữa đã tách béo hoặc tách một phần chất béo Trước khi đưa vào sản xuất sữa được tiêu chuẩn hóa nhằm đảm bảo nguồn nguyên liệu ổn định để tạo ra sản phẩm pho mát có chất lượng đồng nhất

- Thanh trùng: Thanh trùng nhằm tiêu diệt hệ vi sinh vật có mặt trong sữa Tuy nhiên, thanh trùng cũng làm giảm hàm lượng canxi trong sữa do đó làm giảm khả năng đông tụ sữa bằng enzym Để khắc phục nhược điểm này, nhà sản xuất thường

bổ sung thêm muối calcium chloride Chế độ thanh trùng phổ biến 72 – 76oC, trong

15 – 20 giây Một số loại pho mát như Parmigiano – Reggiano làm từ sữa tươi chưa qua thanh trùng

- Đông tụ sữa: Quá trình đông tụ casin có thể thực hiện bằng tác nhân đông tụ là enzym hoặc giống khởi động Một số loại pho mát, quá trình này diễn ra nhờ sự kết hợp cả hai tác nhân trên Giống khởi động cho mỗi loại pho mát thường khác nhau: Giống khởi động trong sản xuất pho mát Cheddar là các vi khuẩn lactic ưa ấm, có thể

là một hoặc kết hợp cả hai loài Lactococcus lactis subsp cremoris, Lc lactis subsp

lactis; ở pho mát Emmental là các vi khuẩn ưa nhiệt và có thể có các vi khuẩn

propionic; các pho mát sử dụng sữa chưa thanh trùng thì hệ vi sinh vật sẵn có trong sữa được xem như là giống khởi động

- Tách nước khỏi quện sữa: Giai đoạn này gồm các bước cắt quện sữa, gia nhiệt nhằm làm đẩy nhanh quá trình tách nước Ở mỗi loại pho mát, thời gian và nhiệt độ gia nhiệt quện sữa là khác nhau: Ở pho mát Cheddar quện sữa được gia nhiệt tới 37 –

39oC, pho mát Parmigiano – Reggiano, Emmental nhiệt độ gia nhiệt lên tới 53 – 55oC

- Tạo hình và muối: Sau khi tách nước, quện sữa có thể được xay nhỏ, bổ sung thêm muối và ép, tạo khuôn hoặc được ép thành khuôn trước, sau đó bổ sung muối bằng cách ngâm trong bể muối từ 1 -2 ngày Kết thúc quá trình này, thu được pho mát tươi và sử dụng được

- Ủ chín: Pho mát tươi có thời hạn sử dụng ngắn (1 – 2 tuần) Để kéo dài thời gian

sử dụng cũng như tạo cảm quan về hương vị, các loại pho mát thường được ủ chín Nhiệt

độ ủ chín thường 4 – 12oC, tùy từng pho mát mà thời gian ủ chín có thể từ 1 – 2 tháng (Emmental), 2 – 3 tháng (Gouda) hoặc tới 2 năm (Parmigiano – Reggiano)

Hình 1.3: Sơ đồ sản xuất pho mát Cheddar (a) và Emmental (b) [59]

1.1.4 Các quá trình chuyển hóa của vi khuẩn lactic trong sản xuất pho mát Quá trình sản xuất pho mát đòi hỏi phải có vi khuẩn lactic (LAB) Chúng có thể được chủ động bổ sung vào sữa hoặc sử dụng ngay những vi khuẩn có mặt trong sữa tươi

Vi khuẩn lactic đã được sử dụng trên toàn thế giới, đóng vai trò quan trọng trong lên men thực phẩm ở quy mô công nghiệp Thuật ngữ vi khuẩn lactic dùng để chỉ đặc điểm của quá trình trao đổi chất cơ bản của nhóm vi khuẩn này: Chuyển hóa đường hexose chủ yếu thành axit lactic Do liên quan tới sản xuất axit lactic nên

định nghĩa mang tính chất hóa sinh nhiều hơn phân loại học Trong sản xuất pho mát, các vi khuẩn lactic tham gia vào nhiều quá trình sinh hóa:

1.1.4.1 Quá trình chuyển hóa lactose

Lên men lactose thành L – axit lactic là chức năng cơ bản của chủng giống khởi động trong sản xuất pho mát Sự axit hóa này không chỉ tới ảnh hưởng đến cấu trúc ban đầu của quện sữa mà còn ảnh hưởng tới chất lượng pho mát do pH quyết định khả năng hòa tan của casein [61] Ngoài ra, pH còn gián tiếp tác động tới việc tổng hợp chất thơm: tạo ra hệ đệm quy định sự sinh trưởng của vi sinh vật và khả năng hoạt động của các enzym trong quá trình ủ chín

Tùy theo giống khởi động mà lactose có thể được chuyển hóa theo con đường

Embden-Meyerhof (EM) hoặc con đường phosphoketolase (hình 1.4) Theo con đường

EM, từ một phân tử glucose tạo ra hai phân tử axit lactic Theo con đường phosphoketolase thì một phân tử glucose tạo ra một phân tử axit lactic, ethanol và CO2

Hình 1.4: Các con đường lên men hexose (glucose) chính ở vi khuẩn lactic [42]

Streptococcus thermophilus không sử dụng được galactose, khi lên men sữa sẽ

gây ra sự tích tụ galactose trong quện sữa Do đó, loài này thường được kết hợp với các loài có khả năng sử dụng galactose Trong sản xuất pho mát, việc lên men triệt

để nguồn lactose là quan trọng để tránh sự phát triển quá mức của hệ vi sinh vật không mong muốn khác [61]

1.1.4.2 Quá trình chuyển hóa axit lactic

Lactate cũng là một chất thơm của pho mát Ở một số pho mát Thụy Sĩ,

lactate là nguồn cơ chất chính cho vi khuẩn propionic Propionibacterium sp sinh

trưởng Chúng chuyển hóa lactate thành axit propionic (cũng là hợp chất thơm) và

CO2 – tạo ra cấu trúc mắt của pho mát [60] Ngoài ra, lactate có thể bị oxy hóa theo các con đường khác nhau, tổng hợp nên các hợp chất thơm khác như acetate, ethanol, formate ở giai đoạn ủ chín Tuy nhiên, mức độ oxy hóa này phụ thuộc vào

hệ vi sinh vật và sự sẵn có oxy trong pho mát Một số chủng lactobacili và pediococci phân lập từ pho mát Cheddar có khả năng oxy hóa lactate thành acetate

và CO2 trong điều kiện hiếu khí ở phòng thí nghiệm và hệ thống oxy hóa này được cho là cũng xảy ra dưới những điều kiện ủ chín của pho mát Cheddar Khi có mặt của oxy, một vài chủng pediococci có thể oxy hóa lactate thành formate và acetate

Sự có sẵn oxy không chỉ phụ thuộc vào kích thước khối pho mát mà còn do tính thấm oxy của vật liệu bao gói quy định Ở các loại pho mát có màng bọc, quá trình oxy hóa lactate xảy ra rất hạn chế do lượng oxy sẵn có thấp [61]

Hình 1.5: Các con đường chuyển hóa lactate trong giai đoạn ủ chín pho mát [59,61]

1) Sự raxemic hóa; 2) Chuyển hóa bởi Propionibacterium freudenreichii ở pho mát Thụy Sĩ; 3) Quá trình oxi hóa lactate; 4) Chuyển hóa thành formate, ethanol và acetate; 5)

Chuyển hóa kị khí lactate thành butyrate và H 2

Ở một số loại pho mát rắn, quá trình đường phân có thể tạo ra một số sản

phẩm không mong muốn trong giai đoạn ủ chín Dưới điều kiện kị khí, Clostridium

tyrobutyricum chuyển hóa lactate thành butyrate và khí H2 Quá trình này không chỉ tạo ra khí H2 gây hiện tượng vỡ pho mát mà còn liên quan đến sự phát triển của các hợp chất không có hương vị [61] Để tránh hiện tượng này, một số kỹ thuật làm giảm số lượng bào tử trong sữa được sử dụng như: vệ sinh sạch sẽ, ngăn cản sự nảy mầm của bào tử bằng việc bổ sung lysozyme hay bổ sung thêm nitrate (NO3

-) hoặc loại bỏ cơ học các bào từ bằng vi lọc [59]

1.1.4.3 Quá trình chuyển hóa citrate

Hàm lượng citrate trong sữa tươi khoảng 8 mmol/ lít sữa, nhưng 94% trong số này bị mất trong quá trình sản xuất pho mát do hòa tan vào huyết tương sữa [60] Tuy nhiên, một lượng ít citrate còn lại trong quện sữa (10mmol/kg quện sữa) lại đóng vai trò quan trọng trong quá trình thành các hợp chất thơm bay hơi Một số loài có khả năng chuyển hóa citrate (Cit+) như Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacetylactis (trước đây gọi là Streptococcus diacetylactis) và Leuconostoc spp (như Leuconostoc mesenteriodes subsp cremoris và Ln lactis) [42, 48, 60]

Các loài này có gen mã hóa cho protein vận chuyển citrate ngoại bào vào tế bào chất nằm trên plasmid

Hình 1.6: Các con đường chuyển hóa citrate của các chủng Cit+ thuộc Lactococcus

và Leuconostoc sp [59, 61]

Các chủng Cit+ không sử dụng citrate như là nguồn năng lượng nhưng chúng nhanh chóng chuyển hóa citrate khi có mặt của lactose và một số loại đường khác theo các con đường như hình 1.6 Sản phẩm của quá trình chuyển hóa là CO2, diacetyl, acetate, acetoin và có thể có 2,3 – butanediol CO2 đóng vai trò chính trong việc tạo nên cấu trúc “mắt” của một số pho mát Hà Lan Diacetyl là một hợp chất thơm quan trọng của pho mát, nhưng các phản ứng dẫn đến sự tổng hợp diacetyl thì chưa được nghiên cứu sâu Diacetyl có thể được tổng hợp trực tiếp từ acetaldehyde

– thiamine pyrophosphate (Acetaldehyde TPP) và acetyl – CoA nhưng enzym diacetyl synthase chưa được nhận dạng một cách rõ ràng ở LAB hoặc có thể được tổng hợp từ quá trình oxy hóa α – acetolactate [56] Diacetyl thường được tổng hợp với một lượng rất nhỏ (<0,11 mmol) trong khi đó lượng acetoin sinh ra cao hơn 10 – 50 lần [59]

Một số loài Lactobacillus có khả năng sử dụng citrate để tổng hợp succinate

(hình 1.7) Succinate là một axit hữu cơ, có vị cay mặn, là một trong 15 hợp chất cần thiết tạo nên hương vị của pho mát Ở pho mát Emmental, hàm lượng succinate được

công bố là 0,8 – 1,4 g/kg [25] Ở pho mát Cheddar, một số loài Lactobacillus tổng

hợp succinate thông qua chu trình tricacboxilic acid dạng rút gọn (chu trình TCA) [42] Ở pho mát Thụy Sĩ, succinate được các vi khuẩn propionic tổng hợp từ quá trình

dị hóa axit aspartic Các chủng này không phải đóng vai trò là chủng khởi động

Hình 1.7: Con đường tiềm năng tổng hợp succinate của các chủng Lactobacillus [25] Các enzym tham gia: 1 – lactate dehydrogenase; 2 – pyruvate casrboxylase; 3 – malate dehydrogenase; 4 – fumarase; 5 – fumarate reductase; 6 – citrate lyase; 7 – aspartate aminotransferase; 8 – aspartase; 9 – aconitase; 10 – isocitrate lyase

1.1.4.4 Quá trình phân giải lipit và chuyển hóa axit béo

Chất béo sữa có vai trò quan trọng để tạo nên những hợp chất hương thuần túy của pho mát Những nghiên cứu ở pho mát Cheddar cho thấy pho mát được sản xuất

từ sữa đã thay chất béo bằng nguồn lipit khác đã không tạo ra hương thơm chính xác Trên thực tế, việc phát triển hương vị hài hòa là khó khăn chính khi sản xuất loại pho mát ít hoặc tách chất béo [29, 60]

Quá trình phân giải lipit diễn ra chủ yếu trong giai đoạn ủ chín pho mát Lipase tồn tại trong pho mát do nhiều nguồn khác nhau Bản thân sữa tươi cũng chứa enzym lipoprotein lipase, tuy nhiên hoạt tính của enzym bị mất ở sữa đã thanh trùng Một số pho mát Ý như Provolone, Pecorino trong quá trình sản xuất người ta

bổ sung hỗn hợp lipase, esterase cùng với enzym rennet Hệ enzym lipase/esterase của chủng khởi động ít được quan tâm hơn hệ enzym phân giải protein Các loài

Lactococcus có hoạt tính phân giải lipit yếu nhưng có thể đã giải phóng một lượng

lớn axit béo tự do khi mật độ tế bào ở mức cao sau giai đoạn đông tụ sữa Các

lipase/esterase của Lactococcus thường là enzym nội bào Các loài Lactobacillus lên men lactic đồng hình bắt buộc như: Lactobacillus helveticus, Lb delbrueckii subsp bulgaricus và Lb delbrueckii subsp lactis cũng tổng hợp esterase [60] Các loài Lactobacillus lên men lactic dị hình tùy nghi như Lb casei, Lb paracasei và Lb

plantarum chiếm ưu thế trong hệ vi sinh vật không đóng vai trò là chủng khởi động

(Nonstarter lactic acid bacteria – NSLAB) cũng có hoạt tính phân giải lipit yếu

Hình 1.8: Các con đường chuyển hóa axit béo tự do [59]

Quá trình phân giải triglyceride tạo ra các axit béo, glycerol, mono – hoặc diglyceride Chất béo trong sữa của các động vật nhai lại chứa lượng lớn các chuỗi axit béo ngắn và trung bình, khi bị thủy phân chúng đóng góp đáng kể vào việc tạo hương của nhiều loại pho mát Các axit béo tự do có thể phản ứng với ethanol hoặc các nhóm chứa gốc lưu huỳnh tạo ra các ester hoặc thioester (hình 1.8) Có tới 14 loại ester khác nhau được tìm thấy trong pho mát Emmental, và ester cũng được cho

là góp phần vào hương thơm ở pho mát Parmigiano – Reggiano Các ester phổ biến nhất trong số 38 ester được tìm thấy trong pho mát Parmigiano – Reggiano bao gồm: ethyl butanoate, ethyl hexanoate, ethyl acetate, ethyl octanoate, ethyl decanoate và methyl hexanoate [42, 60]

1.1.4.5 Quá trình phân giải protein

Phân giải protein là quá trình phức tạp nhất và có thể là quan trọng nhất trong số các sự kiện sinh hóa diễn ra ở giai đoạn ủ chín pho mát Quá trình này ảnh hưởng đến

sự hình thành hương vị của pho mát theo nhiều hướng khác nhau Một vài chuỗi peptit ngắn, axit amin tạo hương vị và có thể là cả vị không mong muốn (như vị đắng) cho pho mát (bảng 1.2) Sự phân giải casein làm thay đổi cấu trúc pho mát (làm mềm) tạo điều kiện để giải phóng các hợp chất có vị trong khi nhai Ngoài ra, quá trình này còn là nguồn cung cấp cơ chất (axit amin) cho một loạt các quá trình dị hóa diễn ra sau đó như: sự khử amin, khử cacboxyl, chuyển amin, khử lưu huỳnh [59] Bảng 1.2: Mô tả vị và ngưỡng giá trị của vị của một số axit amin của pho mát

Nồng độ trong Cheddar (µg/g) Cảm nhận Vị

Ở hầu hết các loại pho mát, quá trình thủy phân casein ban đầu diễn ra chủ yếu nhờ hoạt động của enzym đông tụ và một mức độ ít hơn của các plasmin, tạo ra các peptit chuỗi dài và trung bình Các oligopeptit này được hấp thụ vào tế bào nhờ kênh vận chuyển oligopeptit, di -/tri – peptit [41] Trong tế bào chất, các peptit bị phân giải nhờ một loạt các enzym nội bào Các peptidase của LAB được chia thành các endopeptidase, aminopeptidase, di -/tri – peptidase [16, 34] Sản phẩm cuối cùng của quá trình phân giải protein là các axit amin tự do (FAA) Nồng độ FAA phụ thuộc vào từng loại pho mát và được dùng như là một chỉ số của sự chín [29] Nồng độ của FAA trong pho mát ở bất kì giai đoạn của quá trình chín là kết quả của

sự giải phóng các axit amin từ casein và sự chuyển hóa các axit amin thành các sản phẩm khác qua quá trình dị hóa Các axit amin chính ở pho mát Cheddar là glutamate, leucine, arginine, lysine, phenylalanine và serine [70] Nồng độ của các axit amin thường là tăng lên trong quá trình chín, ngoại trừ arginine [63]

Mặc dù một số peptit, axit amin có hương vị đặc trưng như vị đắng, ngọt, malt nhưng nhìn chung chúng chỉ tạo nên hương vị cơ bản của pho mát Việc tác động nhằm làm tăng quá mức hoạt tính của một vài enzym phân giải protein, cũng như việc thêm các axit amin vào pho mát hầu như không ảnh hưởng tích cực đến hương

vị của sản phẩm Sự phân giải protein một cách không cân đối có thể dẫn tới sự dư thừa các peptit có vị đắng và do đó, làm giảm hương vị vốn có của pho mát [74]

Hình 1.9: Khái quát các con đường chuyển hóa protein tạo hương ở các sản phẩm

sữa lên men [70]

Trong tế bào, hầu hết axit amin bị chuyển hóa thành α – keto axit nhờ enzym aminotransferase Axit α – Keto là chất trung gian, có thể bị chuyển hóa thành axit hydoroxy, aldehyde hay CoA – ester Các phản ứng này hầu hết diễn ra nhờ enzym, nhưng cũng có thể xảy ra sự chuyển đổi hóa học như sự hình thành benzaldehyde từ axit phenypyruvic [65] Các aldehyde có thể bị khử hydro hoặc hydro hóa để tạo thành các chất tương ứng là alcohol và axit hữu cơ Các hợp chất này là cơ chất cho các enzym esterase và acyltransferase hoạt động, tạo ra các (thio) – ester Một trong những vai trò sinh học của sự phân giải axit amin là tổng hợp nên các tiền chất, chẳng hạn như cần thiết cho sự tổng hợp sterol và các chuỗi axit béo có nhánh Con đường chuyển hóa axit amin quan trọng khác, được bắt đầu bởi enzym lyase như: cystathionine β – lyase có khả năng xúc tác chuyển hóa methionine thành

Ngoại bào Nội bào Axit amin

Axit amin

methanethiol [23]; threonine aldolase, thuộc lớp enzym lyase khác, có thể chuyển hóa trực tiếp threonine thành acetaldehyde [45]

Các hợp chất có hương tiềm năng nhất trong sơ đồ trên là các aldehyde, alcohol, axit cacboxylic và ester Trong đó, quan trọng hơn cả là các các aldehyde, alcohol, axit cacboxylic và ester được chuyển hóa từ các axit amin: methionine, phenylalanine, threonine [42]

Bảng 1.3: Các hợp chất hương hình thành từ quá trình chuyển hóa axit amin qua

axit α – keto theo con đường chuyển hóa transaminase [60]

Axit

Alcohol

1.2 Giống khởi động cho sản xuất pho mát

1.2.1 Các nhóm vi khuẩn lactic khởi động trong công nghiệp sản xuất pho mát Giống khởi động cho sản xuất sản phẩm từ sữa là vi sinh vật được chủ động

bổ sung vào nguyên liệu để tạo ra sản phẩm cuối cùng với các đặc điểm mong muốn, thông qua sự phát triển và quá trình lên men của chúng [64]

Bảng 1.4: Các giống khởi động của một số loại pho mát [17]

1 Parmesan, Romano Hỗn hợp Lactobacillus bulgaricus và Streptococcus

thermophilus

2 Cheddar Lactococcus lactis ssp lactis; Lc lactis ssp cremoris;

Lc lactis ssp lactis var diacetylactis

3 Swiss, Emmental

Hỗn hợp Lactobacillus bulgaricus (hoặc Lactobacillus

lactis hoặc Lactobacillus helveticus) và Streptococcus thermophilus và Propiani bacterium shermanii

4 Provolone Hỗn hợp các chủng Lactobacillus chịu nhiệt và

Streptococcus thermophilus

STT Loại pho mát Giống khởi động

5 Blue, Gogonzola,

Roquefort, Stilton Lc lactis ssp lactis và Penicillium roqueforti

6 Camembert Lactococcus spp và Penicillium camembert

7 Brick, Limburger

Hỗn hợp Streptococcus thermophilus và Lc lactis ssp

cremoris; Streptococcus thermophilus và Lactobacillus bulgaricus; Lc lactis ssp lactis và Streptococcus thermophilus

8 Muenster Hỗn hợp Streptococcus thermophilus và các chủng

Lc lactis ssp lactis hoặc Lc lactis ssp cremoris;

Hỗn hợp Lc lactis ssp lactis hoặc Lc lactis ssp lactis

và Lc lactis ssp lactis var diacetylactis (hay các chủng Leuconostoc)

Trong công nghệ lên men các sản phẩm từ sữa, nhiệm vụ chính của giống khởi động vi sinh vật là : (1)- bảo quản sản phẩm về mặt sinh học, kéo dài thời hạn sử dụng so với nguyên liệu không lên men; (2)- tạo các đặc điểm cảm quan đặc trưng như vị, hương; (3)- tạo cấu trúc đặc trưng cho sản phẩm về độ nhớt, độ cứng, độ thoáng cũng như màu sắc; (4)- tạo lập các đặc điểm về dinh dưỡng đặc trưng Giống khởi động trong sản xuất pho mát có thể được chia thành các nhóm sau:

1.2.1.1 Các chủng vi khuẩn lactic ưa ấm

Nhóm LAB ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu ở 30°C, bao gồm các loài

thuộc hai chi, Lactococcus và Leuconostoc Lactococcus lactis ssp lactis,

Lactococcus lactis ssp cremoris đóng vai trò chính là sinh axit, các loài

Lactococcus lactis ssp lactis biovar diacetylactis, Leuconostoc lactis, Leuconostoc cremoris tạo hương thơm cho pho mát [17]

Các giống khởi động ưa ấm có thể được phân loại thành 4 nhóm sau, dựa trên khả tổng hợp các chất tạo hương cho sản phẩm:

- Loại O: Gồm những chủng khởi động không tạo hương: Lactococcus lactis ssp lactis và Lactococcus lactis ssp cremoris

- Loại D: Gồm các chủng có khả năng lên men citrate – đóng vai trò tạo

hương: Lactococcus lactis ssp lactis biovar diacetylactis

- Loại B (hoặc L): Chỉ gồm các chủng Leuconostoc có khả năng lên men

citrate để tạo hương

- Loại BD (hoặc LD): Gồm cả các chủng có khả năng tạo chất thơm như Lc

lactis ssp lactis biovar diacetylactis và các chủng thuộc chi Leuconostoc

Trong sản xuất pho mát, có thể sử dụng chủng đơn lẻ hoặc kết hợp các chủng với nhau tạo giống khởi động Trong hỗn hợp giống khởi động thì các chủng sinh axit chiếm ưu thế 90 – 99%, còn các chủng tổng hợp chất hương chỉ chiếm 1 – 10% [15] Các chủng lactic ưa ấm đã được sử dụng trong sản xuất nhiều loại pho mát khác nhau Người ta ước tính rằng hai phần ba quá trình lên men sữa là sử dụng các chủng ưa ấm Trong ngành công nghiệp sữa liên quan tới quá trình lên men, thì các chủng nào càng lên men nhanh thì càng tốt Đây dường như là một đặc tính ưu thế

của các loài Lactococcus Các loài khác cũng làm giảm độ pH của sữa nhưng với

tốc độ chậm hơn nhiều [18]

1.2.1.2 Các chủng vi khuẩn lactic ưa nhiệt

Các chủng lactic ưa nhiệt được sử dụng trong sản xuất các loại pho mát cần nhiệt độ nấu cao (Emmental, Gruyere, Grana, Comte) Các LAB ưa nhiệt thuộc hai

chi là Lactobacillus và Streptococcus Mặc dù Lactobacillus là một nhóm lớn gồm

64 loài nhưng chỉ một vài trong số chúng có khả năng lên men sữa Các loài

Lactobacillus đã được thương mại hóa chủ yếu là: Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii ssp lactis và Lactobacillus helveticus Ở chi

Streptococcus, trong số 27 loài thì chỉ có duy nhất Streptococcus thermophilus được

sử dụng làm giống khởi động trong sản xuất thực phẩm và các sản phầm từ sữa

Trong nhóm này, bên cạnh các chủng khởi động cố hữu còn có các chủng

thuộc chi Enterococcus thường có mặt với số lượng lớn Chúng có một số ưu điểm:

sản xuất ra axit nhanh, chịu được nhiệt độ đun sôi, có khả năng thích ứng nhanh với muối Nhược điểm chính là loài này có nguồn gốc từ phân và một số chủng được coi là tác nhân gây bệnh Theo Lopez-Diaz et al.(2000), enterococci đại diện cho các hệ vi sinh vật chiếm ưu thế ở pho mát truyền thống làm từ sữa chưa qua thanh

trùng và nên được sử dụng như chủng khởi động [49] Enterococcus feacalis đã được sử dụng để thúc đẩy quá trình chín của pho mát [17] Ngoài ra, Enterococcus

còn ảnh hưởng có lợi đến sự sinh trưởng của loài LAB khác vì các hoạt động phân giải protein mạnh của chúng [49]

Pediococci không được sử dụng như là chủng khởi động trong bất kỳ sản phẩm sữa nào mặc dù chúng có thể được tìm thấy trong các mẫu pho mát đã ủ chín

Chỉ có hai loài Pediococcus pentosaceus và Pediococcus acidilactici được tìm thấy

trong các sản phẩm từ sữa Gần đây, chủng pediococci có khả năng sử dụng lactose

đã được sử dụng thay thế Streptococcus thermophilus vì các chủng thuộc loài này

dễ bị phage xâm nhiễm [33]

1.2.2 Chức năng cần thiết của giống khởi động công nghiệp

Trong công nghiệp sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa nói chung và pho mát nói riêng, điều quan trọng là tạo ra sản phẩm có chất lượng cao và ổn định Điều này phụ thuộc chủ yếu vào giống khởi động sử dụng Nhiều nghiên cứu về vai trò và những thuộc tính cần thiết của giống khởi động cho sản xuất pho mát đã được thực hiện [19, 22, 39] Về cơ bản, giống khởi động trong sản xuất pho mát cần có những đặc điểm: sinh axit, ảnh hưởng tích cực đến sự hình hương thơm, tổng hợp exopolysaccharide, sinh tổng hợp các enzym chuyển hóa protein [17, 27]

1.2.2.1 Sản xuất axit

Sản xuất axit là đặc điểm phổ biến nhất của các chủng lactic khởi động Chúng chuyển hóa lactose thành axit lactic, kết quả là làm giảm pH của sữa Sự axit hóa này không chỉ gây ra hiện tượng đông tụ sữa mà còn tăng cường sự tách nước ra khỏi quện sữa trong sản xuất pho mát Môi trường pH thấp cũng ức chế đáng kể sự phát triển của các vi sinh vật gây hỏng sữa Ngoài ra, sinh axit còn ảnh hưởng tích cực đến sự hình thành kết cấu, mùi thơm và vị của pho mát [68] Các vi khuẩn lactic lên men lactose theo 2 con đường là lên men đồng hình (sản phẩm chính là axit lactic) và lên men dị hình (ngoài axit lactic còn có các sản phẩm khác như ethanol, axit acetic, CO2)

1.2.2.2 Tổng hợp enzym phân giải protein

Khả năng phân giải protein là hoạt tính cần thiết để cho sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic Theo Thomas & Mills (1981) [72], hàm lượng peptide và FAA trong sữa chỉ đủ đáp ứng cho 25% sinh khối tế bào khi nuôi cấy ở điều kiện bình thường

Do đó, đây là đặc tính mà chủng giống khởi động cần có để đảm bảo cho quá trình lên men diễn ra ổn định Sự phân giải protein còn tạo ra các axit amin – là tiền chất cho một loạt các phản ứng tổng hợp nên các hợp chất thơm xảy ra trong quá trình ủ chín pho mát Ngoài ra, hệ enzym của vi khuẩn lactic cũng tham gia vào chuyển hóa các sản phẩm thủy phân protein từ sữa thành các hợp chất có hoạt tính sinh học: tạo các peptit có hoạt tính chống oxy hóa, kích thích hệ miễn dịch, ức chế hoạt động của enzym chuyển angiotensin

Phức hệ tham gia phân giải protein của LAB gồm 3 hợp phần chính: Các protease gắn vào thành tế bào, làm nhiệm vụ thủy phân casein thành các oligopeptit; các peptidase nội bào, phân giải các peptit chuỗi dài thành các chuỗi peptit ngắn và axit amin; các kênh vận chuyển, cho phép chuyển chuỗi peptit ngắn và axit amin vào tế bào chất

Khả năng sinh tổng hợp X – prolyl – dipeptidyl aminopeptidase (PepX) cũng

là một đặc tính cần thiết của chủng khởi động PepX là enzym có tác dụng thủy phân chuỗi peptit tại vị trí ngay sau axit amin proline, khi axit amin này nằm ở đầu

N của oligopeptit Casein của sữa chứa một lượng lớn proline, trong α S1 -, α S2 -, β -

và k – casein, axit amin này chiếm tỷ lệ tương ứng là 17%, 10%, 35% và 20% [66]

Proline ảnh hưởng tới cấu trúc không gian của chuỗi peptit chứa proline, làm ngăn cản hoạt động phân giải của các endo – và exo – peptidase đối với các peptit này

Do đó, hoạt tính thủy phân chuỗi peptit chứa proline là một phần thiết yếu trong hệ enzym phân giải protein của chủng khởi động Trong sản xuất pho mát, PepX có tác dụng làm giảm vị đắng của pho mát, nhờ hoạt tính thủy phân các peptit kị nước PepX tác dụng đặc hiệu lên casomorphin (là sản phẩm thủy phân không hoàn toàn

từ casein) Casomorphin là peptit thuộc dạng exorphin, có tác dụng lên hệ thần kinh não, gây ra hội chứng tự kỷ, bệnh tim mạch, tiểu đường typ 1 [41] Enzyme này đã

được phát hiện ở một số LAB có trong pho mát như Lactobacillus dellbrueckii subsp bulgaricus, Lactobacillus acidophilus [14], Lactobacillus casei subsp casei [36], Lactobacilluscasei [11], Propionibacterium shermanii [30], Lactobacillus

helveticus [21] và Lactobacillus curvatus [50]

1.2.2.3 Tổng hợp exopolysaccharide

Nhiều chủng LAB có khả năng tổng hợp các exopolysaccharide (EPS) EPS là polysaccharide ngoại bào, có thể gắn chặt vào thành tế bào tạo thành lớp vỏ bao quanh tế bào vi khuẩn (CPS) hoặc tồn tại dưới dạng một chất nhờn lỏng (ropy polysaccharide) giải phóng vào môi trường EPS có thể cấu tạo từ một loại monomer (homopolysaccharide) hoặc từ nhiều loại monomer khác nhau (heteropolysaccharide)

Một số loài LAB như Lc lactis ssp lactis, Lb delbrueckii ssp bulgaricus và

Streptococcus thermophilus tổng hợp nên các heteropolysaccharides [17] Trong môi

trường tự nhiên, EPS có chức năng bảo vệ tế bào vi khuẩn khỏi các tác động của sự mất nước, áp lực thẩm thấu, sự tấn công của phage, chất kháng sinh, các chất độc hại và tăng khả năng bám dính vào bề mặt chất rắn [13]

Hình 1.10: Vị trí của polysaccharide được tổng hợp bởi các vi khuẩn Gram (+) và

Gram (-) trên tế bào [23]

CPS = Capsular polysaccharides, EPS = exopolysaccharides

Nhờ đặc tính tăng cường độ nhớt, nhiều chủng khởi động sinh EPS đã được sử dụng trong sản xuất công nghiệp Các chủng này đóng góp vào việc tạo nên cấu trúc mịn, chắc và ổn định của quện sữa

1.2.2.4 Khả năng tạo hương

Khả năng tổng hợp cấu tử hương của chủng khởi động sẽ ảnh hưởng tới chất lượng của sản phẩm Trong pho mát, các hợp chất tạo hương được chia thành hai nhóm: Các hợp chất hình thành trong giai đoạn lên men sữa và trong giai đoạn ủ chín Nhóm đầu tiên bao gồm các axit hữu cơ: axit lactic và axit axetic được tổng

hợp bởi Lc lactis ssp lactis và Lc lactis ssp cremoris và acetaldehyde, diacetyl, acetoin được Lc lactis ssp lactis biovar diacetylactis và các loài Leuconostoc

chuyển hóa từ nguồn citrate có trong sữa Một số nghiên cứu cho rằng những hợp chất này được tạo ra để tránh sự tích tụ pyruvate trong tế bào Nhóm thứ hai gồm các hợp chất hình thành từ quá trình phân giải protein và axit amin Khả năng chuyển hóa axit amin thành các hợp chất thơm của LAB đã được nghiên cứu Các

loài Lc lactis subsp lactis, Lc lactis supsp cremoris, Lactobacillius lactis, Lb

helveticus, Lb bulgaricus, Lb casei đều có khả năng chuyển hóa methionine thành

methonethiol, dimethyledisulphide và dimethyltrisulphide [77]

1.2.3 Tình hình nghiên cứu tạo giống khởi động cho sản xuất pho mát ở Việt Nam

Hiện nay, nhiều nghiên cứu liên quan đến phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic cho lên men thực phẩm, axit lactic, probiotics đã được công bố: Lê Thanh Bình và Phạm Thị Ngọc Lan (1997); Lê Thanh Bình và cs (2008), Lê Ngọc Trân và cs (2008); Nguyễn La Anh và cộng sự (2013)

Các nghiên cứu về công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh đang được quan tâm: Nguyễn La Anh và cộng sự (2010) đã nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm lactic dùng cho tôm chua

Nghiên cứu về giống khởi động cho lên men sữa chưa có nhiều công bố: Trần Thị Ngọc Mai (2010) đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cộng sinh

giữa chủng vi khuẩn lactic Lactobacillus spp và nấm men Saccharomyces

cerevisiae nhằm tạo ra hạt Kefir ổn định về chất lượng ứng dụng cho cho sản xuất

sữa chua Hiện nay, hướng nghiên cứu tạo giống khởi động phục vụ cho sản xuất pho mát chưa có tài liệu nào được công bố

Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Các hóa chất dùng để phân tích đường tổng, hàm lượng protein: H2SO4,

Na2SO4, NaOH, CuSO4 (Trung Quốc), folin ciocalteu (Merk), kali natri tactarat, bovine serum albumin (Mỹ), Phenol (Merk)

Cơ chất dùng cho phân tích hoạt tính X – prolyl – dipeptidyl aminopeptidase: Glycyl – prolyl – 4 – nitroanilide, p – nitroaniline (Pancreac – Tây Ban Nha), Tris HCl (Merk)

Bộ kit kiểm tra khả năng sử dụng nguồn cacbon, hoạt tính enzym: API 50 CHL (Biomérieux - Pháp), API ZYM (Biomérieux - Pháp)

2.1.2 Thiết bị

- Box cấy

- Cân phân tích PA 214 (Mỹ)

- Máy đo quang phổ UV – 1650 PC (Nhật)

- Máy ly tâm Sorvall RC6 (Đức)

- Máy phá tế bào French press FA – 078A (Mỹ)

- Tủ sấy MOV – 2125, DNE 610 (Nhật)

- Nồi hấp tiệt trùng SA – 300VF (Đài Loan)

- Máy đo pH Orion 410A (Mỹ)

- Kính hiển vi Leica BM500 (Đức)

2.2 Nguồn sữa và chủng vi sinh vật

Chủng vi sinh vật: 38 chủng vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ sữa trong bộ sưu

tập giống tại Viện Công nghiệp Thực phẩm được lựa chọn để khảo sát các đặc điểm của chủng giống khởi động cho sản xuất pho mát

Nguồn sữa: Sữa được dùng để lên men là loại sữa tươi thanh trùng Mộc Châu

không đường có hàm lượng (tính trên 100ml): Chất béo 3,5g ± 0,3; Protein 3,1g ± 0,1; Canxi 115mg ± 11

K2HPO4.3H2O 0,26 Tween 80 0,1 Triamonium citrate 0,215

pH : 6,5-6,8

- Môi trường MRS – agar có bổ sung thêm agar 2% và 0,3% CaCO3.

- Môi trường được hấp vô trùng 1210C trong 15 phút

2.2.2 Môi trường thử citrate

- Dung dịch A: Potasium ferry cyanide 10%

- Dung dịch B: 1g ferric citrate + 1g sodium citrate trong 40ml nước

Hấp tiệt trùng môi trường M, dung dịch A, B ở 115oC/ 15 phút Sau khi hấp vô trùng, thêm 10 ml mỗi dung dịch A, B vào 1 lít môi trường M

2.2.3 Môi trường thử hoạt tính protease ngoại bào

Thành phần môi trường casein - agar:

2.2.4 Môi trường thử khả năng đông tụ sữa

Thành phần môi trường litmus – lactose

Thành phần Hàm lượng/ lít

pH: 6,8 Cân 100g sữa gầy, pha trong 500 ml nước ấm 37 – 40oC Bổ sung thêm 70ml litmus Định mức tới 1 lít Môi trường được phân phối vào các ống nghiệm 10ml/ống Hấp vô trùng 110oC/ 20 phút

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp kiểm tra khả năng đông tụ sữa

Phương pháp này dựa vào khả năng lên men lactose tạo axit lactic của chủng

vi khuẩn, giảm pH môi trường xuống 4,2 – 4,5 (là điểm đẳng điện của casein), làm đông tụ sữa và chuyển môi trường từ tím sang màu hồng Thực hiện theo mô tả của Washington C Winn và cộng sự (2006) [75]

Lấy 1 vòng que cấy khuẩn lạc của mỗi chủng từ đĩa MRS – agar đã nuôi 48 giờ, hoạt hóa vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường litmus – lactose và nuôi ở

30oC Theo dõi màu sắc và hiện tượng đông tụ sữa sau mỗi 24 giờ Các ống nghiệm đông tụ có màu trắng và hồng nhạt là kết quả của quá trình lên men lactose, phân

giải casein, litmus Sau 7 ngày, ống nghiệm vẫn ở dạng lỏng, có màu tím của litmus thì chủng lactic không làm đông tụ sữa

2.4.2 Phương pháp xác định kiểu len men

Nguyên lý của phương pháp là khả năng sinh khí CO2 của các chủng lên men lactic dị hình làm xuất hiện bọt khí trong ống Durham

Các chủng latic được cấy chuyển sang ống nghiệm chứa 10 ml môi trường MRS lỏng và ống Durham úp ngược, nuôi ở các nhiệt độ thích hợp trong 24h và quan sát Nếu thấy nổi bọt trong ống Durham, chứng tỏ chủng có sinh CO2 (chủng lên men lactic dị hình) Không thấy bọt khí trong ống Durham – chủng lên men lactic đồng hình

2.4.3 Phương pháp kiểm tra phổ nhiệt độ sinh trưởng

Chủng lactic được cấy ria trên đĩa MRS – agar, nuôi ở dải nhiệt độ: 15, 20, 30,

37, 40,42, 45 (oC) Nếu trên đường cấy ria, thấy khuẩn lạc mọc dày thì chứng tỏ chủng sinh trưởng tốt, kí hiệu (+); xuất hiện khuẩn lạc nhưng khuẩn lạc nhỏ, lớp sinh khối mỏng là chủng có khả năng sinh trưởng yếu, kí hiệu (-/+) Không thấy khuẩn lạc tức là chủng không phát triển được, kí hiệu (-)

2.4.4 Phương pháp kiểm tra khả năng sử dụng citrate

Phương pháp này dựa trên phản ứng giữa ion Fe3+, giải phóng từ hợp chất ferric citrate ở những chủng sử dụng được citrate, và potasium ferrycyanide tạo ra phức chất có màu xanh prussian Thực hiện theo mô tả của Kempler và cộng sự (1980) [43]

Chủng vi khuẩn lactic được cấy ria trên đĩa MRS – agar, nuôi ở nhiệt độ thích hợp trong 48 giờ Khuẩn lạc của mỗi chủng được cấy ria sang đĩa chứa môi trường citrate Sau 48 giờ, kiểm tra trên đĩa thạch: chủng nào có xuất hiện màu xanh prussian chứng tỏ có khả năng sử dụng citrate, chủng nào không làm xuất hiện màu xanh prussian, không chuyển hóa được citrate

2.4.5 Phương pháp định lượng exopolysaccharide

Phương pháp này dựa trên khả năng không tan trong ethanol và tan trong nước nóng của exopolysaccharide Lượng EPS thu được sẽ được định lượng theo phương

pháp phân tích đường tổng phenol - axit sunfuric, sử dụng glucose là chất chuẩn Tiến hành theo mô tả của Pablo Sebastián RIMADA và cộng sự (2003) [56]:

Chủng vi khuẩn, được hoạt hóa hai lần trong ống nghiệm chứa 5 ml môi trường MRS, nuôi ở 30oC (chủng ưa ấm) và 37oC (chủng ưa nhiệt)/ 18 giờ Sau đó, 5ml dịch nuôi cấy được ly tâm 8000 vòng/ phút trong 10 phút ở 30oC Sinh khối thu được, dùng để lên men 50 ml sữa thanh trùng Mộc Châu đã được hấp tiệt trùng

110oC/ 20 phút Mẫu đối chứng không bổ sung vi sinh vật Sau đông tụ, dịch sữa lên men và mẫu đối chứng đã chỉnh pH xuống 4,3 bằng HCl 10%, được phá đông tụ và đun cách thủy 15 phút Ly tâm lần 1: 10000 vòng/ phút trong 15 phút, thu dịch trong Hút 10 ml dịch trên sang ống fancol, bổ sung 20 ml cồn lạnh và để ở -20oC/

20 – 24 giờ, làm kết tủa EPS Ly tâm lần 2, 8000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC, thu kết tủa Hòa tan phần kết tủa thu được trong 10 ml nước nóng (> 95oC) và để nguội Bổ sung 20 ml cồn lạnh, để -20oC/ 20 – 24 giờ Ly tâm lần 3, 8000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC, thu kết tủa Kết tủa được hòa tan với 10 ml nước nóng Tiến hành ly tâm lần 4, 8000 vòng/ phút trong 10 phút ở 30oC, thu dịch trong Dịch này dùng để xác định hàm lượng EPS trong dịch sữa lên men, được bảo quản ở -20oC cho tới khi phân tích

2.4.6 Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng số phenol - axit sunfuric

Axit H2SO4 đặc có tác dụng phân cắt đường có phân tử lớn thành đường glucose Phân tử glucose tạo phức với phenol 5% lập thành màu So màu trên bước sóng λ = 490nm ta xác định được đường tổng trong mẫu phân tích Thực hiện theo

mô tả của Dubois M và cộng sự (1956) [24]

Dựa vào giá trị OD thu được ta lập đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa glucose

và mật độ quang tại bước sóng λ = 490nm Ta dựng được đường cong chuẩn glucose là một đường thẳng có phương trình dạng:

y = ax + b Trong đó: X: giá trị mật độ quang (OD)

Y: hàm lượng đường tổng có trong mẫu (mg/l)

Dựa vào đường cong chuẩn glucose để xác định hàm lượng đường tổng (hay EPS)

có trong mẫu phân tích

2.4.7 Phương pháp kiểm tra hoạt tính enzym protease ngoại bào

Enym phân giải protein có mặt trong dịch ngoại bào thu được sau khi ly tâm,

sẽ phân giải casein trên đĩa thạch chứa 2 thành phần casein – agar tạo ra vòng trong suốt sau khi đổ axit tricloroacetic 10% lên bề mặt đĩa thạch Thực hiện theo mô tả của Nippunpreet Kaur (2013) [55], có cải biến

 Tiến hành

Để kiểm tra hoạt tính protease ngoại bào, chủng vi khuẩn lactic được nuôi trên môi trường MRS Sau 24h, dịch nuôi cấy được ly tâm 8000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC Thu dịch trong phía trên Phân phối 20 µl dịch ngoại bào vào các giếng (có đường kính 6mm) trên đĩa casein – agar, để 30oC/ 24 giờ Đối chứng (-) thay bằng 20 µl nước cất vô trùng, đối chứng (+) thay bằng 20 µl dịch enzym neutrase Sau 24 giờ, đổ axit tricloroacetic 10% vào các đĩa trên Quan sát và đo đường kính vòng phân giải casein (là vòng không tạo màu trắng đục)

2.4.8 Xác định hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp DPPH

Phương pháp được thực hiện theo mô tả của Gayathri Balakrishnam và Ren Agrawal (2014) [32], có cải biến

Hoạt tính chống oxy hóa được xác định dựa trên khả năng đánh bắt các gốc tự

do 2,2 – diphenyl – 1 – picrylhydrazyl (DPPH) có màu đỏ, hấp thụ cực đại ở bước sóng 517 nm, khi phản ứng với các chất chống oxy hóa có trong dịch sữa lên men,

sẽ chuyển thành diphenylpicrylhydrazine có màu vàng Dựa vào mức độ loại bỏ gốc DPPH, có thể xác định được hoạt tính chống oxy của mẫu nghiên cứu

 Chuẩn bị dịch chiết sữa lên men

Mẫu sữa đông tụ bởi chủng vi khuẩn lactic và mẫu đối chứng (không bổ sung

vi sinh vật, đã chỉnh pH xuống 4,3 bằng HCl 10%) được ly tâm 10000 vòng/ phút trong 20 phút ở 4oC và thu dịch trong Hút 2 ml dịch trên vào ống fancol, bổ sung thêm 8 ml methanol, lắc đều Ly tâm 8000 vòng/ phút trong 5 phút, 4oC để loại bỏ kết tủa Dịch trong phía trên được dùng để phân tích hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp DPPH

 Tiến hành

- Pha dung dịch DPPH nồng độ 0,1 mM trong methanol

Để xác định hiệu suất loại bỏ gốc tự do, dịch mẫu, dung dịch DPPH và mẫu đối chứng (hỗn hợp nước cất : methanol tỷ lệ 1: 4) được bố trí như sau:

Hiệu suất loại bỏ gốc DPPH được tính theo công thức sau:

H (%) = [(OD3- (OD1 – OD2))/OD3]*100 Trong đó: OD1, OD2, OD3 là giá trị mật độ quang đo được tương ứng với các hỗn hợp 1, 2 và 3

2.4.9 Phương pháp xác định hoạt tính X – prolyl – dipeptidyl aminopeptidase Phương pháp này thực hiện theo MAGBOUL và cộng sự (2000) [50], có cải biến Phương pháp dựa trên hoạt động của enzym PepX, giải phóng ra p – nitroaniline (pNA) từ cơ chất Glycyl – prolyl – 4 – nitroanilide (Gly – Pro – pNA) Lượng pNA giải phóng ra quy định hoạt tính của enzym PepX Các bước tiến hành như sau:

 Chuẩn bị dịch chiết enzym nội bào

Chủng vi khuẩn được nuôi trong 200 ml môi trường MRS ở 30oC với các chủng ưa ấm và 37oC với các chủng ưa nhiệt trong thời gian 20 giờ Tiến hành ly

tâm thu sinh khối 8000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC Sinh khối được rửa 2 lần bằng 50 ml nước muối 0,85%, pH 7 Sinh khối thu được bằng cách ly 8000 vòng/ phút trong 15 phút, ở 4oC Sau rửa, sinh khối được tái huyền phù trong 20 ml đệm Tris HCl 0,05 M, pH 7,4 vô trùng (thể tích đệm Tris HCl bằng 1/10 thể tích dịch nuôi cấy) Tiến hành phá tế bào bằng máy French press, áp lực 2100 psi Điều chỉnh van đóng/mở sao cho dịch chảy ra không quá 15 giọt/phút Sau khi phá tế bào, dịch được ly tâm 8000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC Thu dịch trong, phân phối vào các ống eppendoff vô trùng, và bảo quản ở tủ đá (- 20oC) cho đến khi phân tích

 Kiểm tra sơ bộ hoạt tính PepX

Phân phối 50 µl cơ chất Glycyl – prolyl – p – nitroanilide (Gly – Pro – pNA) 2,0 mM vào các giếng trên đĩa Elisa Bổ sung 50 µl dịch chiết nội bào của mỗi chủng vào mỗi giếng đã có cơ chất Đối chứng (-): Thay dịch chiết nội bào bằng 50

ul đệm Tris HCl vô trùng Đối chứng (+): 50 ul dịch chiết nội bào của chủng PK2 (chủng đã biết có hoạt tính PepX) Hỗn hợp để ở tủ 37oC và quan sát màu sau 5, 15,

30, 60, 90, 120 phút Nếu có xuất hiện màu vàng sẽ được ghi nhận là có hoạt tính enzyme (+) Sau 120 phút nếu không xuất hiện màu vàng sẽ ghi nhận là không có hoạt tính (-)

OD2: 50 µl dịch cơ chất + 50 µl đệm Tris HCl

OD3: 50 µl dịch nội bào + 50 µl đệm Tris HCl

Hỗn hợp được để ở 37oC Khi nào xuất hiện màu vàng (căn cứ theo thời gian ở bước kiểm tra sơ bộ), thì tiến hành đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 405 nm Mật độ quang của pNA giải phóng ra được tính theo công thức sau:

OD (pNA) = OD1 – OD2 – OD3

Lượng pNA được tính căn cứ vào đường chuẩn và giá trị OD (pNA) Một đơn

vị hoạt độ PepX (U) được xác định bằng lượng enzym cần thiết để giải phóng 1