Nghiên cứu phát hiện lectin thực vật có khả năng ngưng kết đặc hiệu với một số vi khuẩn gây nhiễm độc thực phẩm phổ biế

DANH MỤC CÁC BẢNG 1.2 Các phân tử trên bề mặt tế bào có khả năng tương tác với lectin 48 1.3 Một số đặc điểm quan trọng của lectin trong việc ứng dụng thành các sản phẩm chẩn đoán vi sin

1.1Tình hình ngộ độc thực phẩm trên thế giới và ở Việt Nam 12

1.3 Một số vi khuẩn gây bệnh qua đường thực phẩm thường gặp 15

1.3.5.4 Bệnh đường ruột- dạ dày do Bacillus cereus 35

1.5.2 Các ứng dụng của lectin trong chẩn đoán vi khuẩn 46 1.5.2.1 Ứng dụng của lectin trong chẩn đoán các vi khuẩn Gram dương 47 1.4.2.1 Ứng dụng lectin trong chẩn đoán vi khuẩn Gram âm 49 1.5.2.3 Mối liên quan giữa tính đặc hiệu đường của lectin và khả năng gây ngưng kết vi

1.5.3 Ý nghĩa của việc sử dụng lectin làm công cụ chẩn đoán vi khuẩn 52

2.2.1 Hoá chât – sinh phẩm, thiết bị dùng trong nghiên cứu vi sinh vật 56 2.2.2 Hoá chât – sinh phẩm, thiết bị dùng trong tách chiết và nghiên cứu về lectin 57

2.3.1.1 Kỹ thuật phát hiện Salmonella, Shigella trong thực phẩm 57

2.3.1.2 Phương pháp phát hiện E coli trong thực phẩm theo kĩ thuật IMViC 60

2.3.2.2 Xác định hoạt độ lectin bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu 65 2.3.2.3 Phản ứng ngưng kết giữa các tế bào vi khuẩn và lectin 66

2.3.2.4 Phương pháp tiến hành phản ứng đặc hiệu đường 67 2.3.2.5 Xác định ảnh hưởng của pH lên hoạt độ của lectin 67 2.3.2.6 Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ của lectin 68

2.3.2.8 Phương pháp sắc ký trao đổi ion trên cột CM- Sephadex 69

2.3.2.9 Phương pháp điện di biến tính trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE) 71

3.1 Nghiên cứu khả năng gây ngưng kết của lectin lên một số nhóm vi khuẩn gây ngộ độc

3.3 Nghiên cứu mối tương tác giữa lectin với một số vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm phân lập

3.2.2 Kết quả gây ngưng kết của lectin thực vật với vi khuẩn phân lập 88

3.2.2.1 Tác dụng gây ngưng kết của lectin với các chủng thuộc chi Salmonella 88

3.3.2.2 Tác dụng gây ngưng kết của lectin với Shigella 91

3.3.2.3 Tác dụng của lectin lên các loài vi khuẩn thuộc chi E.coli 93

3.3.2.4 Tác dụng của lectin lên các loài vi khuẩn thuộc chi Staphylococcus 96

3.3.2.5 Nghiên cứu tính chất gây ngƣng kết đặc hiệu của lectin để ứng dụng lectin vào

3.4 TINH CHẾ VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH HÓA SINH MIỄN DỊCH CỦA 2 LECTIN

3.4.1 Tinh chế và nghiên cứu đặc tính lectin hạt Đậu ma 107 3.4.1.1 Lựa chọn đệm chiết thích hợp cho quá trình tinh chế 107 3.4.1.2 Tinh chế lectin hạt Đậu ma bằng kết tủa phân đoạn nhờ điều chỉnh pH 108 3.4.1.3 Tinh chế ĐM-CP2 trên cột sắc ký trao đổi ion CM- Sephadex 109 3.3.1.4 Nghiên cứu một số tính chất hóa sinh của lectin hạt Đậu ma 112 3.4.2 Tinh chế và nghiên cứu đặc tính lectin từ cây Tú cầu đỏ 117 3.4.2.1 Sắc kí qua cột trao đổi ion DE-52 Cellulose 117 3.3.2.2 Kiểm tra độ tinh sạch của chế phẩm bằng điện di biến tính 119 3.3.2.3 Nghiên cứu một số đặc tính của lectin Tú cầu đỏ 120

PAGE Điện di trên gel polyacrylamid

(Polyacrylamide gel Electrophoresis ) PBS Phosphate buffered saline

PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) WGA Wheat germ agglutinin (lectin mầm lúa mỳ)

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.2 Các phân tử trên bề mặt tế bào có khả năng tương tác với lectin 48 1.3 Một số đặc điểm quan trọng của lectin trong việc ứng dụng thành các sản

phẩm chẩn đoán vi sinh vật

56

2.1 Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập được trên thực phẩm 64

3.1 Sự tương tác giữa lectin thực vật với các vi khuẩn nghiên cứu 72 3.2 Tác dụng ức chế của đường lên các dịch lectin thô 75 3.3 Kết quả phân lập Salmonella trên các mẫu thức ăn 78 3.4 Kết quả phân lập Shigella trên các nhóm thực phẩm 80 3.5 Kết quả phản ứng sinh hóa của các chủng E coli phân lập 82 3.6 Kết quả ngưng kết với kháng huyết thanh của các chủng nghiên cứu 83 3.7 Sự có mặt của Staphylococcus aureus trên các mẫu thức ăn 85 3.8 Kết quả thí nghiệm xác định enzym coagulase của các chủng phân lập 87 3.9 Tác dụng gây ngưng kết của lectin với Salmonella 89 3.10 Tác dụng gây ngưng kết của lectin với Shigella flexneri 92 3.11 Tác dụng gây ngưng kết của lectin với vi khuẩn E.coli 94 3.12 Sự tương tác giữa lectin với các loài vi khuẩn Staphylococcus 97 3.13 Sự tương tác giữa lectin với các vi khuẩn nghiên cứu 102 3.14 Kết quả loại bỏ protein tạp DCT lectin hạt Đậu ma bằng pH 3.5 108 3.15 Kết quả loại bỏ protein tạp DCT lectin hạt Đậu ma bằng pH 9.5 109 3.16 Kết quả về tính đặc hiệu đường của lectin Đậu ma 116 3.17 Khả năng ngưng kết vi khuẩn của dịch thô và chế phẩm hạt Đậu ma 117 3.18 Kết quả tinh chế lectin Tú cầu đỏ qua cột DE – 52 120 3.19 Kết quả về tính đặc hiệu đường của lectin Tú cầu đỏ 122 3.20 Tác dụng gây ngưng kết của lectin Tú cầu với các vi khuẩn nghiên cứu 123

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1 Hình thái vi khẩn Salmonella dưới kính hiển vi điện tử 17 1.2 Thành phần kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella 17 1.3 Cấu trúc kháng nguyên O của Salmonella O6,7 19

1.4 Cấu trúc kháng nguyên O của Salmonella O62 ssp.arizonae 19 1.5 Cấu trúc kháng nguyên O của Shigella flexneri serotype Y 23

1.7 Sự xâm nhập của Shigella trong tế bào biểu mô ruột 25 1.8 Cấu trúc của oligosaccharide (1) và O-polysaccharide (2) của E coli

O150

27

1.9 Cấu trúc lớp glycan của Staphylococcus aureus 31 1.10 Vị trí liên kết đặc hiệu đường Gal/GaNAc của 4 loại lectin họ Đậu 44 1.11 Lectin ConA ngưng kết với E coli gián tiếp qua đường mannose 50 2.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ

protein chuẩn theo phương pháp Lowry

68

3.1 Kết quả phản ứng sinh hoá của chủng Salmonella phân lập 79

3.3 Kết quả các phản ứng sinh hoá của chủng Shigella 80

3.6 Hình ảnh khuẩn lạc S aureus trên môi trường Chapman 84 3.7 Hình ảnh tế bào của chủng S aureus phân lập 85 3.8 Hình ảnh khuẩn lạc của S aureus trên môi trường Baird-Parker chứa

lỏng đỏ trứng gà

86

3.9 Kết quả ngưng kết của lectin thực vật với chủng Salmonella 90

3.10 Hình ảnh ngưng kết của các nhóm lectin thực vật với chủng E coli 95 3.11 Sơ đồ khoá định loại các chủng vi khuẩn E coli 96 3.12 Sơ đồ khoá định loại các chủng thuộc chi Staphylococcus 101 3.13 Sơ đồ khoá định loại tổng quát các loài vi khuẩn nghiên cứu 104

3.16 Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ lectin hạt Đậu ma 113

3.19 Sắc kí đồ cột DE - 52 Cellulose của dịch chiết thô Tú cầu đỏ 118

3.19 Ảnh hưởng của pH lên chế phẩm lectin Tú cầu đỏ 120 3.20 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên chế phẩm lectin Tú cầu đỏ 121

Nguyên nhân gây ra ngộ độc thực phẩm thường gặp là do hóa chất, do độc tố,

do vi sinh vật …Tuy nhiên nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm là do nhiễm vi

khuẩn và chủ yếu tập trung vào các vi khuẩn như: Salmonella, Shigella, Escherichia

coli, Staphylococus aureus, Vibrio cholerae, Clostridium perfringens…[40] Số lượng

các ca ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn vẫn ngày càng tăng, không chỉ ở những nước đang phát triển mà cả các nước có nền kinh tế vững mạnh Để làm giảm nguy cơ ngộ độc thức ăn cần có nhiều biện pháp đồng bộ từ việc trang bị kiến thức cho những người liên quan trực tiếp đến thực phẩm, chủ động làm sạch môi trường, thực hiện quy trình

vệ sinh đề phòng sự ô nhiễm và đặc biệt là cần thường xuyên kiểm tra phát hiện mức

độ ô nhiễm vi khuẩn gây bệnh đối với thực phẩm

Có rất nhiều phương pháp khác nhau để kiểm tra, phát hiện sự có mặt của vi khuẩn trên thực phẩm như phương pháp nuôi cấy truyền thống, phương pháp sử dụng sinh học phân tử hay phương pháp miễn dịch Phương pháp sử dụng sinh học phân tử cho kết quả nhanh, chính xác nhưng lại tốn kém, đòi hỏi trang thiết bị và nguyên vật liệu đồng bộ với chi phí cao trong khi phương pháp truyền thống đòi hỏi thời gian và công sức lớn của kỹ thuật viên và vẫn là phương pháp được dùng phổ biến tại các phòng thí nghiệm ở Việt Nam [72] Tuy vậy, phương pháp vẫn gặp phải một số khó khăn khi triển khai tại các phòng thí nghiệm nhỏ Hướng nghiên cứu sử dụng lectin trong phát hiện, phân loại vi khuẩn đang được quan tâm trong thời gian gần đây Ưu

điểm của phương pháp này là cho kết quả nhanh, không đắt tiền, độ lặp lại cao, các nguyên liệu trong thí nghiệm bền và dễ bảo quản [45], đặc biệt là có thể triển khai tại các phòng thí nghiệm phân tích nhỏ

Lectin là một protein không có chức năng xúc tác, không có tính chất miễn dịch nhưng có khả năng liên kết thuận nghịch, phi hóa trị các carbohydrate mà không làm thay đổi cấu trúc của carbohydrate được liên kết [55] Bề mặt của tế bào vi khuẩn có nhiều gốc đường có khả năng tương tác với lectin, mang tính đặc hiệu cao Do vậy, dựa vào mối tương tác lectin – vi khuẩn có thể nhận biết được nhóm vi khuẩn nào có liên kết đặc hiệu với lectin, từ đó sử dụng lectin để nhận biết được nhóm này Đã có nhiều công bố về việc sử dụng lectin để phát hiện một số vi khuẩn, điển hình như lectin từ

đậu tương (SBA) và ốc sên (HPA) để nhận biết Bacillus anthracis – vi khuẩn gây bệnh than – một vi khuẩn rất khó phân biệt với các chủng Bacillus khác, lectin mầm lúa mỳ (WGA) giúp phát hiện vi khuẩn Neisseria…[41] Lectin đã trở thành một chất thử tiêu

chuẩn dùng trong phân loại vi sinh vật học [110] Thêm vào đó vì lectin có hoạt độ cao nên tác dụng ở những nồng độ rất loãng, có tính đặc hiệu và có thể sử dụng ở dạng dẫn xuất gắn enzym, vàng, các đồng vị phóng xạ hoặc các chất chuẩn Nguồn lectin được

sử dụng nghiên cứu trong phân loại vi khuẩn thường có nguồn gốc từ thực vật do có nhiều ưu điểm như nồng độ lectin cao, đặc hiệu với nhiều loại đường, dễ tách chiết…[56]

Việt Nam là một nước nhiệt đới với nguồn thực vật phong phú Đây chính là nguồn cung cấp lectin dồi dào mà chưa được khám phá Trong nước, các lectin thực vật mới được tập trung nghiên cứu về các đặc tính, quá trình tinh sạch và ứng dụng trong y học Hướng nghiên cứu ứng dụng lectin trong phát hiện vi sinh vật chỉ được bắt đầu một vài năm trở lại đây Kết quả bước đầu cho thấy việc xác định các vi khuẩn gây bệnh bằng lectin có độ đặc hiệu cao, ổn định, cho kết quả nhanh, dễ thực hiện và ít tốn kém [20, 21, 22] Tuy vậy các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc thăm dò khả năng

ngưng kết của lectin đối với một số loài vi khuẩn Tại Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào thống kê đầy đủ về mối tương tác đặc hiệu của lectin với các loài vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt là vi khuẩn gây bệnh qua thực phẩm Do tiềm năng ứng dụng lớn của lectin, luận án được tiến hành với những mục tiêu:

1 Phát hiện, nghiên cứu, tuyển chọn được các nhóm lectin tương tác đặc hiệu với các nhóm vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm phân lập tại Việt Nam

2 Tinh chế, xác định được một số tính chất các lectin có biểu hiện tương tác đặc hiệu với vi khuẩn, bước đầu xây dựng quy trình phát hiện vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm bằng phản ứng ngưng kết với lectin

Những đóng góp mới của luận án:

1 Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu một cách toàn diện về các nhóm lectin thực vật gây ngưng kết đặc hiệu với một số vi khuẩn gây bệnh qua đường thực phẩm

2 Bước đầu xây dựng được quy trình phát hiện và phân biệt 4 vi khuẩn

Eschesrichia coli gây bệnh (EPEC), Shigella flexneri, Staphylococcus aureus và Salmonella bằng lectin

3 Đã đưa ra được quy trình tinh chế tách chiết một số lectin có ngưng kết

đặc hiệu với vi khuẩn Eschesrichia coli gây bệnh (EPEC) và vi khuẩn Salmonella

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

1.1.1 Trên Thế giới

Theo ước tính của WHO (2008), hàng năm trên Thế giới có khoảng 130 triệu người mắc bệnh tiêu chảy, trong đó xấp xỉ 70% là do truyền qua đường ăn uống như ăn phải thực phẩm bị nhiễm bẩn, hóa chất hay vi sinh vât gây bệnh [108] Cũng theo WHO, hơn 49 nước đang phát triển trung bình có tỷ lệ chết do tiêu chảy ở trẻ em dưới

5 tuổi là 6,6%, chiếm 36% ca tử vong do mọi nguyên nhân của trẻ em dưới 5 tuổi Ở

Mỹ, theo thống kê của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa dịch bệnh (CDC) thì mỗi

năm có khoảng 5% dân số bị ngộ độc trong năm, với khoảng 5000 người chết [40] Tại

Pháp, hàng năm có khoảng 75 vạn ca ngộ độc thực phẩm (1210 ca/10 vạn dân) trong

đó 7 vạn ca cấp cứu trong tình trạng nguy kịch, 113 nghìn ca phải nhập viện [80] Tại Thái Lan, Ân Độ, Philipin có khoảng 100 người vào viện hằng ngày do nguyên nhân

sử dụng thực phẩm không an toàn Theo thống kê ở Philipin thì tiêu chảy là một trong

10 nguyên nhân gây bệnh chính với tổng số 19.498 ca (1997) và 19.598 ca (1998) [80]

Đặc biệt năm 2011, một biến chủng E coli cực độc đã gây tình trạng nhiễm khuẩn thực

phẩm bùng phát tại Đức và một số nước châu Âu khác với 16 người chết và hơn 1.000 người mắc bệnh, trong đó gần 400 người có nguy cơ tử vong Theo Trung tâm Kiểm soát và Ngăn ngừa dịch bệnh châu Âu (ECDC), đã có 9 trường hợp được thông báo ở Thụy Điển, 4 người trong số đó có đi du lịch tới phía bắc nước Đức Vụ dịch này đã gây thiệt hại lớn cho ngành nông nghiệp châu Âu khi ECDC thông báo vi khuẩn bị lây nhiễm qua các thực phẩm như dưa chuột, cà chua, giá đỗ…

1.1.2 Tại Việt Nam

Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có khoảng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 3000 - 5000 nạn nhân nhập viện và 30 - 100 ca tử vong [4] Nhà nước cũng phải dành một kinh phí rất lớn cho việc điều trị, xét nghiệm và điều tra tìm nguyên nhân ngộ độc Theo cục ATVSTP, năm 2012 số vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra trong toàn quốc có giảm nhẹ so với cuối năm 2010 nhưng số người chết và nhập viện có chiều hướng tăng cao so với năm 2011 (Bảng 1.1) Số người mắc tăng so với năm trước là 54,8%, số người nhập viện tăng 43,5%, số người tử vong tăng 53,6% Số ca mắc ngộ độc thực phẩm tập trung cao nhất ở miền Đông Nam Bộ chiếm 51,91% Số tử vong do ngộ độc thực phẩm tập trung nhiều ở các vùng núi phía Bắc chiếm 51,81% [4,107]

Bảng 1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam

Nguyên nhân hàng đầu trong các vụ ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật Trong

số đó, vi khuẩn chiếm tỉ lệ cao và là nguyên nhân chính gây ra các vụ tiêu chảy hàng

loạt (chiếm 33-49%) [2] Các vi khuẩn gây bệnh thường gặp là Salmonella, Shigella,

Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio cholerae… Bệnh thường xảy ra do

thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong quá trình chế biến, bảo quản như thức

ăn nấu chưa kĩ, để lâu ở nhiệt độ thường, thực hiện khâu vệ sinh kém…[23]

Salmonella là nguyên nhân của 70% vụ ngộ độc do vi khuẩn, có trong nhiều loại thực

phẩm (đồ nguội, thịt nguội, nghêu sò, gà chưa nấu chín, sản phẩm từ sữa sống…) nhất

là các món ăn chế biến từ trứng tươi hoặc còn hơi tươi sống [40] Độc tố từ vi sinh vật cũng là một trong các nguyên nhân chiếm 20-30% các vụ ngộ độc thực phẩm tập thể

Trong số này, vi khuẩn Staphylococcus aureus hiện diện nhiều trong các món ăn làm bằng tay (bánh ngọt), vi khuẩn Clostridium perfringens hay phát sinh trong các món

được nấu, nướng và hâm nóng

Ngoài ra, ngộ độc thực phẩm còn có nguyên nhân là do thực phẩm bị ô nhiễm

hóa chất (chiếm11-27%) như cyanua, asen, các kim loại nặng, benladol, hóa chất bảo

quản thực phẩm, hóa chất bảo vệ thực vật 27% số vụ ngộ độc là do ăn phải thực phẩm

còn tồn đọng hóa chất hay bị đầu độc qua nước, thức ăn, không khí…

1.2 NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO VI KHUẨN

Ngộ độc thực phẩm có nguyên nhân từ vi khuẩn được chia thành 3 nhóm chính:

 Nhiễm trùng phát sinh từ thực phẩm (Foodborne infections)

Nhiễm trùng phát sinh từ thực phẩm xảy ra do ăn phải thức ăn nước uống bị nhiễm các vi vi sinh vật và virut gây bệnh đường tiêu hóa Các tế bào sống của các tác nhân gây bệnh đường ruột xâm nhập qua đường thực phẩm, sinh sản và sinh độc tố

(nhiễm trùng) Đại diện của nhóm này là các vi khuẩn như Salmonella, E coli,

Shigella, Camplyobacter, Listeria, …

 Bệnh nhiễm và gây độc phát sinh từ thực phẩm (foodborne toxicoinfections)

Các tác nhân gây bệnh trong nhóm này bao gồm một số trực khuẩn Gram dương sinh bào tử và một số trực khuẩn Gram âm Các vi khuẩn sinh trưởng, hình thành và giải phóng ra độc tố sau khi xâm nhập vào hệ đường ruột – dạ dày Thông thường chúng cần phải có mặt ở những nồng độ cao mới đủ để gây bệnh Các vi khuẩn gây

bệnh thường gặp là Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Vibrio cholera, E coli

gây bệnh đường ruột…

 Bệnh ngộ độc phát sinh từ thực phẩm (foodborne intoxications)

Các vi sinh vật gây bệnh là các chủng tạo ra độc tố khi chúng sinh trưởng trên thực phẩm và các thành phần của thực phẩm Độc tố có thể là các protein hoặc các phân từ hữu cơ không bền hoặc bền với nhiệt Một độc tố có thể gây ra các triệu chứng đường ruột, triệu chứng thần kinh, thậm chí có thể gây ung thư Bệnh ngộ độc thực phẩm có nguồn gốc vi sinh vật xảy ra do ăn phải một loại thực phẩm chứa độc tố đã được hình thành từ trước đó Nhóm vi khuẩn có sinh độc tố hay gặp trong thực phẩm là

Staphylococcus aureus, Clostridium botulium

Vi khuẩn là một trong những nguyên nhân chính gây ra ngộ độc thực phẩm, chịu trách nhiệm cho khoảng 40% các vụ ngộ độc do vi sinh vật Các báo cáo về số lượng các ca ngộ độc thực phẩm trên thế giới trong 3 năm gần đây (2010 – 2013) cho thấy con số này không những giảm đi mà còn có nguy cơ tăng cao, đặc biệt ở một số

nhóm vi khuẩn quan trọng như Salmonella, Listeria…[105] Để giảm thiểu tỷ lệ ngộ

độc thực phẩm cần rất nhiều các biện pháp phối hợp đồng bộ trong đó việc phát hiện mức độ ô nhiễm vi khuẩn gây bệnh trên thực phẩm là điều cốt lõi Quá trình xác định đúng nguyên nhân gây bệnh sẽ đóng vai trò chính trong công tác đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, làm giảm các vụ ngộ độc thực phẩm và bệnh tật do vi khuẩn gây ra Ngoài ra, việc xác định này còn giúp cho việc chủ động kiểm tra đánh giá các số liệu dịch tễ học như xác định loại thực phẩm, nguyên nhân truyền bệnh, phát sinh ngộ độc hoặc khu vực và điểm vụ dịch nào đã là nguồn lây lan…từ đó sẽ có những chính sách hợp lý trong công tác đảm bảo ATVSTP

1.3 MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH QUA THỰC PHẨM THƯỜNG GẶP

Theo báo cáo của WHO và CDC (2013) về nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm

trên thế giới trong 2 năm 2009 - 2010, Samonella đứng thứ nhất trong số các vi khuẩn

gây ngộ độc thực phẩm, đứng thứ hai trong số các nguyên nhân sinh học gây ngộ độc

thực phẩm (chỉ sau Norovirus) [44, 105] Shigella và E coli cũng đứng trong nhóm

năm vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm phổ biến nhất Còn về ngộ độc thực phẩm do độc

tố sinh học, Staphylococcus aureus đóng vai trò chính cùng với vi khuẩn Clostridium

perfringens Tại Việt Nam, các nghiên cứu gần đây cũng cho thấy 4 nhóm vi khuẩn

này là nguyên nhân của nhiều vụ ngộ độc lớn [5,12,13]

1.3.1 Vi khuẩn Salmonella và các bệnh do Salmonella

1.3.1.1 Vi khuẩn Salmonella

Salmonella là một trong những tác nhân gây bệnh cho người và súc vật truyền

từ thực phẩm, chủ yếu từ thịt (heo, bò, gia cầm) và các sản phẩm của thịt, trứng và các sản phẩm từ trứng bị nhiễm khuẩn Theo thống kê, hàng năm trên Thế giới có khoảng

16-33 triệu người mắc bệnh thương hàn và có khoảng 155 ca tử vong [58]

Hàng năm Việt Nam có khoảng 10.000-20.000 trường hợp mắc thương hàn, và

có khoảng hàng chục người tử vong mỗi năm [4,13] Bệnh tản phát ở nhiều tỉnh hay tạo ra các vụ dịch nhỏ ở đồng bằng sông Cửu Long, ven biển miền Trung, một số tỉnh đồng bằng Bắc bộ và ở miền núi phía Bắc

Salmonella thuộc họ Enterobacteriacea, là vi khuẩn gặp nhiều trong tự nhiên

như ở ruột gia súc, động vật có vú hoang dại, bò sát, chim và côn trùng Vi khuẩn

Salmonella được đặt tên theo nhà khoa học đã phát hiện ra chúng - Daniel Salmon

Phần lớn các thành phần của vi khuẩn đã được xác định và cho thấy rằng các serovar

của Salmonella có mức tương đồng về trình tự ADN cao (95 -99%) Do vậy hệ thống định danh hiện nay cho rằng Salmonella chỉ có hai loài đó là S enterica (tên liên quan đến nguyên nhân gây bệnh đường ruột của vi khuẩn) và S bongori Salmonella

enterica có 6 dưới loài (subspecies) gồm Salmonella enterica subsp enterica, Salmonella enterica subsp salamae, Salmonella enterica subsp arizonae, Salmonella enterica subsp diarizonae, Salmonella enterica subsp hautenae và Salmonella enterica subsp indica hoặc subspecies I, II, IIIa, IIIb, IV và VI) [38] Trước đây S

bongori là một thành viên của S enterica subspecies V nhưng sau đó được tách ra

thành 1 loài riêng biệt

Salmonella là trực khuẩn Gram âm, có thể đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi,

có khả năng di động, không sinh nội bào tử (Hình 1.1) Salmonella là vi khuẩn yếm khí

tùy tiện, có sức đề kháng cao Chúng phát triển ở nhiệt độ 60

C – 420C (thích hợp nhất

là 350C - 370C) và pH 6-9 (thích hợp nhất ở pH 7,2), tại nhiệt độ 180C - 420C chúng có thể sống được 15 ngày, khi đun nóng 600C chúng sống được 10 phút và chỉ 2 phút ở

1000C đã tiêu diệt được loài vi khuẩn này [18]

Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Salmonella

dưới kính hiển vi điện tử

(Nguồn: www.dmacasia.com)

Hình 1.2 Thành phần kháng nguyên của vi

khuẩn Salmonella

(Nguồn: www.bact.wisc.edu)

Salmonella mang 3 loại kháng nguyên chính: kháng nguyên roi (kháng nguyên

H), kháng nguyên thân (kháng nguyên O) và kháng nguyên bề mặt (kháng nguyên Vi) (Hình 1.2)

Kháng nguyên roi (kháng nguyên H)

Kháng nguyên H đóng vai trò quan trọng trong cơ chế gây bệnh của Salmonella

Kháng nguyên H không tham gia gây bệnh nhưng chúng kích thích cơ thể tạo thành kháng thể kháng H gây nên hiện tượng ngưng kết Phản ứng ngưng kết này có ý nghĩa thực tiễn để chẩn đoán bệnh thương hàn [52]

Theo Kauffmann, các Salmonella đều có kháng nguyên H dưới 2 pha: pha 1

được ghi bằng chữ viết thường a, b, c, d hoặc pha 2 được ghi bằng các chữ số Ả Rập

1,2,…Hai pha này được mã hóa bởi gen fliC hoặc fliB [52]

Kháng nguyên thân (kháng nguyên O)

Kháng nguyên O có ở tất cả các loài Salmonella Kháng nguyên O được thể

hiện ở trên bề mặt của lớp màng ngoài và được quyết định bởi chuỗi đường đặc hiệu ở

trên bề mặt tế bào Đây là thành phần quan trọng trong việc tạo ra độc tố của

Salmonella Kháng nguyên O cũng là vị trí quan trọng trong quá trình nhận biết tế bào

cũng như liên kết vi khuẩn với các thành phần khác, trong đó có lectin

Bản chất của kháng nguyên O là lypopolysaccharide (LPS) trong đó chuỗi O vươn ra ngoài tế bào được cấu tạo bởi các phân tử đường gồm D- galactose, L – rhamnose, D – mannose [47] Cấu trúc oligosaccharide của lõi giúp cho các tế bào biểu

mô nhận ra và tiếp nhận vi khuẩn, kháng nguyên O cần thiết cho sự tạo thành kháng

huyết thanh Dựa vào thành phần kháng nguyên O, Salmonella chia thành 2 nhóm: một

nhóm có N-acetylglucosamine (GlcNAc) hoặc N-acetylgalactosamine (GalNAc) trong cấu trúc và nhóm kia có galactose (Gal) là đường đầu tiên trong đơn vị O lặp lại [38]

Thành phần carbohydrate trong cấu trúc kháng nguyên O ở Salmonella rất đa dạng

Một số cấu trúc oligosaccharide của kháng nguyên O được chỉ ra trong hình 1.3, 1.4

Hình 1.3 Cấu trúc một phần kháng nguyên O của Salmonella O6,7 [38]

Chú thích p: các monosaccharide ở dạng pyranose

Hình 1.4 Cấu trúc một phần kháng nguyên O của Salmonella O62 ssp.arizonae [38]

Chú thích p: các monosaccharide ở dạng pyranose

Trong sơ đồ Kauffmann – White, các kháng nguyên O được phân chia thành các nhóm riêng biệt và được đặt tên bắt đầu từ nhóm A bao gồm các kháng nguyên O:1, O:2, O:12 đến nhóm Z, nhóm chỉ có một kháng nguyên duy nhất là O:50 [52]

Kháng nguyên bề mặt (Kháng nguyên K – Kháng nguyên Vi)

Là kháng nguyên bề mặt bao bên ngoài thành tế bào vi khuẩn, dưới dạng một màng mỏng nên không nhìn thấy được dưới kính hiển vi thường

Kháng nguyên Vi giúp vi khuẩn chống lại sự tiêu diệt trực tiếp của các bổ thể

và đại thực bào, sống sót và nhân lên trong các đại thực bào Ngoài ra nó còn làm giảm khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn vào cơ thể vật chủ Vì vậy để có thể có hiệu quả xâm nhiễm cao cũng như tránh được khỏi sự tấn công của hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ, vi khuẩn cần có cơ chế điều khiển chặt chẽ sự hoạt động của kháng nguyên

Vi

Kháng nguyên Vi bao bọc kháng nguyên O giúp kháng nguyên O không bị tấn công bởi bổ thể và kháng thể trong tế bào vật chủ nhưng tính chất này làm ngăn cản khả năng ngưng kết của kháng nguyên O Vì vậy, trong nhiều trường hợp kháng nguyên O chỉ được bộc lộ ra khi phá huỷ kháng nguyên Vi bằng cách đun nóng canh khuẩn trong 1 giờ ở 1000C kháng nguyên Vi dễ bị phân huỷ bởi axit, phenol và nhiệt

độ

1.3.1.2 Ngộ độc thực phẩm do Salmonella

Salmonella không chỉ là tác nhân gây ra các bệnh thương hàn và phó thương

hàn mà còn gây ra chứng ngộ độc thực phẩm Các bệnh này nếu không được chữa trị kịp thời đều gây ra những biến chứng nguy hiểm làm ảnh hưởng tới sức khoẻ con người và có thể dẫn đến tử vong Thực phẩm có nguồn gốc từ động vật như thịt bò, thịt

gà, thịt lợn, trứng, sữa…có liên quan nhiều đến các vụ dịch ngộ độc do Salmonella Ngoài ra Salmonella cũng có thể xâm nhập qua các thực phẩm có nguồn gốc từ thực

vật (do sử dụng nước bẩn để rửa), hải sản, cá có vây…

Mặc dù Salmonella có hơn 2500 typ huyết thanh khác nhau nhưng chỉ có một số

nhóm liên quan thường xuyên đến các bệnh phát sinh từ thực phẩm do sự khác nhau về địa lí cũng như khả năng gây bệnh của một serovar hay một chủng Các nhóm

Salmonella thường gặp là S Typhimureum, S Enteritidis [14]

Cơ chế gây bệnh của Salmonella

Hầu hết các vi khuẩn Salmonella không gây bệnh thương hàn đều xâm nhập vào

cơ thể người qua thức ăn, cũng có khi lây từ người sang người Sau khi vào hệ tiêu hóa,

vi khuẩn sẽ xâm chiếm ruột hồi và ruột kết, xâm nhập vào biểu mô ruột, nhân lên ở trong đó và các hạch lympho

Tiếp đến, chúng nhân lên mạnh mẽ trong nội bào và lây lan sang các hạch lympho ruột và đi khắp cơ thể nhờ hệ tuần hoàn Chúng bị bắt giữ bởi các tế bào của lưới nội mô Hệ thống tế bào này sẽ làm hạn chế và điều khiển tốc độ lây lan của vi khuẩn Tuy nhiên, tùy thuộc vào typ huyết thanh và hệ thống bảo vệ của cơ thể mà vi khuẩn có thể lan tới các cơ quan như gan, lách, xương

Sau khi xâm nhập vào ruột, hầu hết Salmonella đều tạo ra các cytotoxin có khả

năng kìm hãm sự tổng hợp protein gây ra các phản ứng viêm rất mạnh hoặc tạo ra các khối u Tuy nhiên, sự xâm nhiễm vào các tế bào biểu mô trước đó có thể gây ra sự tổng

hợp và giải phóng các cytokine trước viêm gồm: IL-1, IL-6,IL-8,TNF-2,IFN-U,MCP-1

và GM-CSF Chúng kích thích các phản ứng viêm xảy ra dữ dội và có thể gây tổn thương ruột Ruột bị tổn thương sẽ làm xuất hiện các triệu chứng như sốt, ớn lạnh, đau bụng, tăng bạch cầu và tiêu chảy

1.3.2 Shigella và bệnh lỵ trực khuẩn

Lỵ là bệnh thường gặp trên toàn cầu, nhất là ở những nước đang phát triển, điều

kiện vệ sinh thiếu thốn Đây là nguyên nhân gây ra khoảng 14.000 trường hợp tử vong trong tổng số 125 triệu ca mắc bệnh mỗi năm tại châu Á [112] Việt Nam nằm trong danh sách 1 trong 6 nước châu Á có tỷ lệ mắc bệnh cao (2,1 ca/1000 dân/năm ở mọi độ tuổi và 3,2 ca/1000 dân/năm ở trẻ em dưới 5 tuổi), cao hơn rất nhiều so với các nước phát triển (3,7ca /100 000 dân/ năm của Mỹ năm 1999 hoặc 3,2 ca /100 000 dân /năm ở

Hà Lan từ năm1996 đến năm 2000) [39]

Chi Shigella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, nhóm

Escherichiae và có tên là trực khuẩn lỵ Tên vi khuẩn được đặt theo tên của nhà khoa

học Nhật Bản Kiyoshi Shiga - người đã phát hiện ra Shigella dysenteriae typ I vào năm

1896 Tiếp đó các loài được phát hiện là S flexneri, S boydii và S sonnei (tên loài

được đặt theo tên người phát hiện) Bốn loài trên được phân loại dựa trên sự khác biệt

về sinh hóa trong đó Shigella dysenteriae nằm ở nhóm A gồm 12 serotyp, S flexneri thuộc nhóm B gồm 6 serotyp, S boydii thuộc nhóm C với 23 serotyp và S sonnei có 1

serotyp (nhóm D) [39] Việc phân loại các serotyp dựa trên các thành phần kháng

nguyên O của lipopolysaccharide (LPS) ở màng ngoài Cơ chế gây bệnh của Shigella

rất phức tạp nhưng chủ yếu là phá hủy thành ruột do độc tố Shiga gây hoại tử biểu mô,

gây loét, viêm và chảy máu

1.3.2.1 Đặc điểm sinh học của Shigella

Shigella là trực khuẩn Gram âm, không có khả năng di động, kị khí không bắt

buộc Shigella không có vỏ, không có tiên mao, tiêm mao, không sinh bào tử

Shigella có hai loại kháng nguyên: kháng nguyên O và kháng nguyên K

Kháng nguyên O là có ở tất cả các chủng Shigella, có tính đặc hiệu cao, là thành

phần kháng nguyên của thành tế bào Kháng nguyên O là một phức hợp protein, poliozid và lipid Trong đó protein có tính kháng nguyên, poliozid quyết định tính đặc hiệu của kháng nguyên, còn lipid quyết định tính độc Hầu hết các kháng nguyên O là heteropolysaccharides được cấu thành từ 3 -5 đơn vị O theo đường thẳng hoặc phân

nhánh Khác với Salmonella, vị trí của các đơn vị đường trong cấu trúc kháng nguyên

O của Shigella mang đặc điểm điển hình của các vi khuẩn đường ruột Mỗi kháng

nguyên O bao gồm glucosamine (D-GlcNAc) và (hoặc) galactosamine (D-GalNAc) Một số loại đường khác thường gặp trong cấu trúc này là L-rhamnose (L-Rha), D-glucose (D-Glc), D-galactose (D-Gal), D-glucuronic acid (D-GlcA), D-galac-turonic acid (D-GalA) và D-mannose (D-Man) Thêm vào đó D-ribose (D-Rib) cũng bắt gặp ở một số cấu trúc kháng nguyên O và một vài đường khác nữa như L-fucose (L-Fuc), N-acetyl-D-mannosamine (D-ManNAc), N-acetyl-L-quinovosamine (L-QuiNAc), N-acetyl-L-fucosamine (L-FucNAc), 4-amino-4-deoxy-D-quinovose (D-Qui4N), L-iduronic acid (L-IdoA) và N-acetyl-D-galactosaminuronic

N-acetyl-D-acid (D-GalNAcA) [39] Mọi kháng nguyên O của Shigella trừ D1, B18 và F1–F5 có

tính axit do sự có mặt của axit đường (hexuronic hoặc pseudaminic acid) hoặc các hợp chất không phải là carbohydrate có tính axit như lactic acid bị ether hóa (glycolactilic acids), pyruvic acid acetals hoặc alanine [67]

Hình 1.5 Cấu trúc kháng nguyên O của Shigella flexneri 036 [112]

Chú thích p: các monosaccharide ở dạng pyranose

Kháng nguyên K là KN vỏ bề mặt chỉ có ở Shigella nhóm A và nhóm C Kháng

nguyên K nằm ở bên ngoài kháng nguyên thân, nó có thể nằm dưới dạng một lớp vỏ dày hoặc dưới dạng một lớp rất mỏng Bản chất polysaccharide của nó mang tính đặc hiệu cho từng typ huyết thanh Trong ngưng kết, kháng nguyên O thường bị ức chế bởi kháng nguyên K bọc kín bên ngoài Vì thế để tránh hiện tượng này cần phá huỷ kháng nguyên K bằng cách đun canh khuẩn ở 1000C trong 1 giờ

Khả năng sinh độc tố

Các nhóm Shigella đều có nội độc tố (endotoxin) Riêng S shiga và S smitzii

còn có thêm ngoại độc tố (exotoxin) Cư trú tại một vị trí nhất định trong cơ thể vật chủ, trực khuẩn chỉ sinh sản ít, không tìm thấy trong máu và các cơ quan bên trong,

nhưng Shigella tạo ra độc tố và độc tố sẽ lan tràn ra khắp cơ thể để gây bệnh và có thể

gây chết cho vật chủ

Nội độc tố của Shigella thường thấy biểu hiện thông qua các phản ứng trong

ruột Nội độc tố có cấu tạo như kháng nguyên thân, bản chất là lipopolysaccharide

(LPS) Ngoại độc tố của S shiga và S smitzii (Shigella nhóm A) có độc tính rất mạnh

với hệ thần kinh trung ương Dưới tác dụng của formol và ở nhiệt độ 400C trong một tháng ngoại độc tố mất tính độc nhưng vẫn còn tính kháng nguyên và có khả năng kích thích cơ thể hình thành kháng thể

Độc tố lỵ có cấu tạo gồm 2 thành phần: tiểu phần A và tiểu phần B Trong đó tiểu phần A có tác dụng như một enzym, còn tiểu phần B chịu trách nhiệm bám vào tế bào cảm thụ Một phân tử độc tố gồm 1 tiểu phần A và 5 tiểu phần B Tiểu phần A gồm

2 chuỗi polypeptide (A1 và A2) Tiểu phần A và B được nối thông qua cầu nối disunfua (S-S ) (hình 1.6) Trọng lượng phân tử của tiểu phần A là 38Da, mỗi tiểu phần

B có trọng lượng phân tử là 7,7 kDa [64]

Hình 1.6 Mô hình cấu tạo độc tố vi khuẩn Shigella

(Nguồn: http://textbookofbacteriology.net/Shigella.html) Khi tấn công, vi khuẩn bám vào tế bào vật chủ, sự bám dính này tác động lên actin Khi vi khuẩn đã bám dính vào tế bào, các sợi actin trở nên dày hơn thành F-actin

ở ngay dưới vi trí bám của vi khuẩn Khi actin đã được sắp xếp lại, chúng tạo nên các giả túc kéo vi khuẩn vào trong hốc thực bào của tế bào Vi khuẩn tiết ra chất cytochalasins B và D ngăn cản quá trình trùng hợp actin để ngăn cản quá trình thực bào Lúc đó tiểu phần B bám vào glycolipid ở bề mặt tế bào chủ Sau khi gắn vào bề mặt của tế bào vật chủ, tiểu phần A chui vào trong tế bào gây rối loạn chức năng tế bào

và làm ngừng quá trình tổng hợp protein của tế bào chủ, làm bất hoạt tiểu đơn vị 60S của ribosom bằng cách tách cầu nối N-glycosidic của adenosin ra khỏi rARN 28S là một thành phần của ribosom 60S [91]

1.3.2.2 Ngộ độc thực phẩm do Shigella

Shigella xâm nhập vào thực phẩm qua con đường nhiễm phân từ người mang vi

khuẩn một cách trực tiếp hoặc gián tiếp Shigella chỉ gây bệnh cho người và khỉ Chỉ

với số lượng chỉ từ 102–103 tế bào vi khuẩn đã có thể gây bệnh [39]

Vi khuẩn dễ dàng đi qua hàng rào bảo vệ axít dạ dày của cơ thể, xâm nhập vào

tế bào biểu mô của niêm mạc ruột già Tại đây vi khuẩn sẽ nhân lên, gây tổn thương tế bào vật chủ và tạo ra hình ảnh loét đặc trưng ở đại tràng (Hình 1.7)

Hình 1.7 Sự xâm nhập của Shigella flexneri

(Nguồn http://cmr.asm.org/content/21/1/134/F1.expansion.html)

Chú thích: S flexneri vượt qua hàng rào bảo vệ của tế bào biểu mô ruột thông qua tế bào M và cư trú ở đại thực bào Sau đó vi khuẩn lan tỏa ra khắp các tế bào biểu mô ruột từ phía màng nội bào xâm nhập vào trong tế bào chất Từ đây vi khuẩn tiếp tục lan sang các tế

bào biểu mô khác và gây ra các phản ứng viêm

Tổn thương ban đầu của các tế bào biểu mô đại tràng là sự phá hủy các vi nhung mao Vi khuẩn xâm nhập vào trong tế bào nhờ các thụ thể đặc hiệu ở bề mặt của vi khuẩn (được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid xâm nhập) Màng tế bào biểu mô lõm vào, đưa vi khuẩn xâm nhập vào bên trong tế bào Từ các túi không bào, vi khuẩn tiếp tục xâm nhập vào trong các bào tương, nhân lên và lan truyền sang các tế bào bên cạnh và đi vào tổ chức bạch huyết đại tràng Quá trình này gây ra phản ứng viêm cấp, xuất tiết, chảy máu, tiêu hủy tế bào niêm mạc Vi khuẩn chết hàng loạt giải phóng ra

nội độc tố và cả ngoại độc tố (đối với S shiga và S smitzii) Tại chỗ nội độc tố giải

phóng sẽ gây xung huyết, tạo thành những ổ loét và mảng hoại tử Ngoài ra nó còn tác động lên thần kinh hệ vận động, hệ cảm giác và hệ thực vật gây co thắt làm tăng nhu động ruột Người bệnh xuất hiện các triệu chứng đau quặn bụng, mót rặn, tiêu chảy, rối loạn các chức năng của ruột, mất cân bằng nước và điện giải [17,18]

Thành ruột non

Tế bào biểu mô ruột

Dịch mô Đại thực bào bị vỡ giải phóng vi khuẩn

1.3.3 Escherichia coli gây bệnh

Với phát hiện của Theodor Escherich vào năm 1885, E coli được biết đến là

một vi khuẩn kị khí không bắt buộc, hình que, không sinh bào tử, vô hại, là một vi khuẩn bình thường trong hệ đường ruột của người Nhưng từ giữa những năm 1940, đã

có nhiều bằng chứng cho thấy một số chủng E coli nhiễm trùng qua đường thực phẩm gây ra tiêu chảy và được gọi là E coli gây bệnh đường ruột ví dụ như chủng O157:H7, O104.H21 E coli O157:H7 có thể gây ra tiêu chảy nghiêm trọng, ra máu hoặc đau

bụng, tiếp đến là thiệt hại nghiêm trọng trong hệ thống các cơ quan cơ thể như suy thận [57]

1.3.3.1 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn E coli

E coli thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, phân bố nhiều

trong tự nhiên, trong đường ruột của người và gia súc Trong đường ruột chúng hiện diện nhiều ở đại tràng nên còn có tên gọi là vi khuẩn đại tràng Những chủng vô hại là thành viên của khu hệ vi sinh vật bình thường trong đường ruột, có ích cho cơ thể vật chủ do có khả năng tiết vitamin K2 và cạnh tranh không cho các vi khuẩn có hại phát triển vượt trội

E coli là trực khuẩn Gram âm, thường đứng riêng lẻ, từng đôi hay từng chuỗi

ngắn, kích thước dài từ 1-4 m và rộng từ 0,4-0,7 m Vi khuẩn có nhiều tiêm mao xung quanh thân và một lông roi (tiên mao), và không có bào tử Vỏ capsul chỉ xuất hiện ở nhóm có độc lực

E coli bao gồm 3 loại kháng nguyên chính [61]: Kháng nguyên lông (KN H),

kháng nguyên thân (KN O), kháng nguyên bề mặt (KN K) Các chủng E coli được đặt tên, phân loại dựa vào các dạng serotype O:K:H (ví dụ E coli O86:K62:B7) [83]

Kháng nguyên O: E coli có khoảng 150 yếu tố huyết thanh khác nhau Kháng

nguyên này có khả năng chịu nhiệt Đây là thành phần quan trọng của vi khuẩn Kháng

nguyên O có thành phần là polysaccharide Những loại đường thường gặp trong thành

phần kháng nguyên O của E coli là D-Glcp, D-GlcpNAc,D-Galp,

D-GalpNAc,D-Manp, and L-Rhap [65] Bằng cách sử dụng phương pháp sắc kí lỏng cao áp, Wen Yi

đã công bố thành phần đường trong cấu trúc O của E coli O86 bao gồm -Galp, Fucp, -GalpNAc, và -Galp(E) Kết quả phân tích sự metyl hóa các thành phần chuỗi

-O đã cho thấy sự có mặt của 4,6-di--O-methyl-galactose, 3,4,6-tri--O-methyl-galactose, 2,3,4-tri-O-methyl-fucose, 2-deoxy-2-N-methylacetamido-4,6-di-O-methyl-galactose, 2-deoxy-2-N-ethylacetamido-3,4,6-tri-O-methyl-galactose theo tỷ lệ 1.0:1.0:1.0:1.4:0.4 [106]

Hình 1.8 Cấu trúc oligosaccharide (1) và O-polysaccharide (2) của E coli O150[83]

Chú thích p: các monosaccharide ở dạng pyranose

 Kháng nguyên H: có khoảng 40 dạng khác nhau và là kháng nguyên không

chịu nhiệt

 Kháng nguyên K: gồm có kháng nguyên L và B không chịu nhiệt và kháng

nguyên A, M chịu nhiệt tới 1200

C

1.3.3.2 Các nhóm E coli gây bệnh

Mặc dù E coli có nhiều serotype khác nhau nhưng phần lớn chúng đều là những

vi khuẩn vô hại Khi cơ thể bị nhiễm vi khuẩn với số lượng nhiều kèm theo khả năng sinh độc tố thì lúc đó ngộ độc mới xảy ra

E coli có 2 loại độc tố là:

- Ngoại độc tố: Phá huỷ thành niêm mạc, hấp thu qua đường bạch huyết gây hoại tử và gây nhiễm độc thần kinh

- Nội độc tố: phá huỷ thành mạch máu, làm tăng huyết áp, gây ngộ độc thần kinh và biểu hiện nhiều triệu chứng khác

Dựa vào các đặc điểm sinh học, khả năng và cách thức gây bệnh, E coli được

chia thành 5 nhóm:

Enteropathogenic E coli (EPEC)

Từ nhiều năm nay EPEC được xác định dựa vào nhóm huyết thanh O1 và type

huyết thanh O: H Loại E coli này không sản xuất độc tố ruột mặc dù vẫn gây tiêu

chảy Khả năng gây bệnh của EPEC liên quan tới đặc tính “bám dính và loại bỏ “ của vi khuẩn Quá trình phát triển của bệnh diễn ra theo 3 giai đoạn như sau: Bám dính tại chỗ, truyền tín hiệu, và bám dính chặt [26] Ba giai đoạn này liên quan tới vai trò của các yếu tố sau: plasmid EAF (EPEC adherence factor) có trọng lượng khoảng 60 kDa Khi bám vào tế bào biểu mô nó sẽ tạo nên một đường truyền tín hiệu khác trong tế bào Gen chịu trách nhiệm cho hoạt động truyền tín hiệu được mã hoá tại LEE, LEE tại tiếp tục mã hoá cho hệ thống tiết typ III, các protein tiết và intimin [101] Các protein tiết

gồm có: esp A, esp B, esp D và các gen mã hoá cho hệ thống tiết typ III là sep và esc

[68] Sự bám dính chặt của EPEC vào tế bào biểu mô vật chủ thông qua intimin - protein ở màng ngoài tế bào vi khuẩn có trọng lượng khoảng 94 - 97 kDa được mã hoá

bởi gen eae Gen này có mặt ở EPEC và EHEC nhưng không có ở ETEC, E coli bình

thường ở ruột và các vi khuẩn khác [26]

Enterotoxigenic E coli (ETEC)

ETEC là nguyên nhân gây tiêu chảy hàng đầu ở trẻ em trong các nước đang phát triển cũng như là nguyên nhân phổ biến nhất của tiêu chảy du lịch ETEC xâm nhập vào bề mặt ruột non và gây tiêu chảy bằng các độc tố ruột và yếu tố bám dính Chúng

có thể tiết ra một trong 2 loại độc tố là LT (Heat -labile toxin ) và ST (Heat – stabile toxin) hoặc cả 2 loại độc tố

LT là phân tử oligomer đựơc mã hoá bởi gen elt và etx LT có cấu trúc gồm 2

tiểu phần A và B Trong đó 5 tiểu phần B bao quanh tiểu phần A thông qua các cầu nối disunfua (S-S)

ST là phân tử monomer chứa nhiều vị trí cystein của cầu nối disulfua (S-S) Độc

tố ST gồm 2 loại: Sta và STb Thụ thể bám của Sta là enzym ở màng tế bào: guanylate cyclase C (GC-C) GC-C nằm ở đỉnh của tế bào biểu mô ruột, kích thích hoạt hoá sản sinh ra nhiều loại enzym trong tế bào, chuyển hoá AMP thành AMP vòng Lượng AMP vòng tăng đột ngột dẫn đến tăng tiết Cl- trong tế bào và giảm hấp thụ NaCl của nhung

mao ruột, nước từ tế bào chảy vào lòng ruột dẫn đến tiêu chảy cấp tính [17]

Enterohemorrhagic E coli (EHEC)

EHEC gây bệnh thông qua 2 cơ chế:

- Gây tổn thương mô học: Sự bám của EHEC vào niêm mạc ruột làm thoái hoá nặng các vi nhung mao Các yếu tố độc lực trong cơ chế này là một plasmid có trọng lượng phân tử 60 MDa, intimin - một protein màng ngoài có trọng lượng phân tử 97

kDa, và một cụm gen độc lập eae, EspA, EspB, EspD, Sep, esc nằm trên nhiễm sắc thể

Cơ chế sinh độc tố tuột: EHEC tiết ra độc tố gọi là verotoxin kí hiệu là Stx một loại protein mang tính KN mạnh với gen mã hoá nằm trên nhiễm sắc thể Stx gồm

-Stx1 và Stx2 Chúng tạo nên độc tố đồng dạng với độc tố của vi khuẩn lị Shigella [82]

Stx 1 và Stx2 đều có 2 tiểu phần A và B Tiểu phần A mang tính chất của một enzym, tiểu phần B có chức năng gắn với một thụ thể đặc hiệu glycolipid kí hiệu là Gb3 Các Gb3 thường thấy ở các tế bào biểu mô thuộc lớp tế bào biểu mô thận, tế bào biểu mô ruột Stx với hoạt tính enzym xâm nhập vào tế bào chất, ức chế quá trình tổng hợp protein tại bào tương và gây chết tế bào này Stx chỉ phá huỷ chọn lọc trên các tế bào nang mang chức năng hấp thụ và bảo tồn các tế bào vùng kẽ Quá trình này kết hợp với

quá trình tổn thương mô học làm tăng tiết nước vào lòng ruột dẫn đến tiêu chảy phân nước.

Enteroinvasive E coli (EIEC)

EIEC xâm nhập vào tế bào biểu mô của đại tràng, tiết ra một hoặc nhiều độc tố ruột và gây tiêu chảy Các gen cần thiết cho sự xâm nhập nằm tại plasmid kí hiệu là

pInv có trọng lượng phân tử là 140 kDa, gen chủ yếu là gen mã hoá cho hệ thống tiết

typ III Bộ máy này cần thiết cho sự tiết các protein đóng vai trò trong khả năng gây

bệnh của E coli Đó là các gen tổng hợp các protein tiết IpaA, IpaD, các protein xâm nhập IpaC, Ipa B, Ipa D, Ipa H [102] Gen sản xuất độc tố là sen nằm ở plasmid Nó

mã hoá cho một protein độc tố có trọng lượng là 63 kDa

Enteroaggregative E coli (EAEC)

Đặc tính của EAEC là tiết chất nhầy vào niêm mạc ruột, vi khuẩn bao quanh chất nhầy tạo thành một lớp màng mỏng, nhầy, tại đây chúng phá huỷ tế bào nhờ độc tố

ở niêm mạc ruột [27,61] Các nghiên cứu hiện nay chưa có bằng chứng rõ ràng về vấn

đề này

1.3.4 Staphylococcus aureus

Tụ cầu khuẩn Staphylococcus là vi khuẩn có khả năng gây bệnh rất cao, gây

nhiều bệnh nặng cho người cũng như đề kháng kháng sinh rất mạnh Ngộ độc thực

phẩm do S aureus gây ra thường gặp trên toàn cầu, nhất là ở những nước đang phát

triển Đây là nguyên nhân gây ra khoảng 185000 trường hợp mắc mỗi năm [78] Việt Nam nằm trong danh sách các nước thuộc khu vực Đông Nam Á thường hay xuất hiện ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng cao nhất trên thế giới Hơn nữa, nước ta lại là một nước có nền kinh tế đang phát triển, điều kiện sinh hoạt còn yếu kém, vấn đề vệ sinh thực phẩm, vệ sinh nguồn nước sinh hoạt và việc xử lý rác thải chưa thực sự được chú

trọng Đây chính là điều kiện giúp cho S aureus lây lan và phát triển thành các vụ dịch,

kéo theo những tổn thất nặng nề về mặt kinh tế cũng như con người

1.3.4.1 Đặc điểm sinh học

Tụ cầu khuẩn Staphylococcus là vi khuẩn Gram dương, hình cầu, đường kính khoảng 0.8 – 1.5 µm, tế bào thường tụ lại thành đám hình chùm nho S aureus không

di động, kị khí tùy tiện, không sinh bào tử, một số chủng có màng giáp Cấu trúc thành

tế bào của một số vi sinh vật trong đó có Staphylococcus có vai trò quan trọng trrong

quá trình xâm nhập của tế bào, tính chất gây bệnh…[92] Thành tế bào của

Staphylococcus được cấu thành từ murein, teichoic acids và các protein liên kết với

thành Murein bao gồm các đơn vị glycan được liên kết với nhau qua cầu nối peptide

Cấu trúc glycan - murein của Staphylococcus bao gồm N-acetylglucosamine

(GlcpNAc), phần đuôi N-acetylmuramic acid (MurpNAc) - thành phần cung cấp liên kết -(1,4) của các đơn vị disaccharide lặp lại – và MurpNAc là đại diện cho phần cuối của chuỗi (hình 1.9) [44]

Hình 1.9 Cấu trúc lớp glycan của Staphylococcus aureus [44]

(a : cấu trúc bậc 3 của đơn vị disaccharide-peptide lặp lại, b: sơ đồ sắp xếp các đơn vị này)

Dựa trên phương diện gây bệnh, tụ cầu khuẩn được chia thành hai nhóm chính:

Tụ cầu khuẩn sinh enzym coagulase

Nhờ enzym coagulase, trên môi trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn tạo nên các khuẩn lạc màu vàng Do vậy vi khuẩn này còn gọi là tụ cầu vàng Các vi khuẩn quan

trọng của nhóm này là: Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius

Tụ cầu khuẩn không sinh enzym coagulase

Do không có enzym coagulase nên trên môi trường nuôi cấy có máu, khuẩn lạc

có màu trắng ngà Trên lâm sàng thường gọi các vi khuẩn này là tụ cầu trắng Các vi

khuẩn nhóm này bao gồm : S.epidermidis, S saprophyticus, S haemolyticus, S capitis,

… [28].Ngoài ra còn có 16 chủng tụ cầu khuẩn khác không hiện diện ở người

Phần lớn các tụ cầu khuẩn gây bệnh chứa enzym dezoxyribonuclease có thể phân hủy axit dezoxyribonucleic

1.3.4.2 Khả năng sinh độc tố [43]

Tụ cầu vàng có khả năng sinh ngoại độc tố và nội độc tố Ngoài sự sản sinh enzym coagulase và yếu tố kết cụm, tụ cầu khuẩn còn sản xuất một số enzym và độc tố quan trọng góp phần tạo nên độc lực mạnh mẽ của chủng vi khuẩn này:

- Hyaluronidase: enzym này có khả năng phá hủy chất cơ bản của các cơ quan, giúp vi khuẩn có thể phát tán trong đó

- Hemolysine và leukocidine: phá hủy hồng cầu (tan máu) và gây chết các tế bào hạt cũng như đại thực bào

- Exfoliatine: có khả năng phá hủy lớp thượng bì và gây tổn thương da tạo các bọng nước Ví dụ điển hình là hội chứng Lyell do tụ cầu

- Năm độc tố ruột (enterotoxine A, B, C, D, E) bền nhiệt Các độc tố ruột này đóng vai trò quan trọng trong ngộ độc thực phẩm

- Độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc : là nguyên nhân gây nên hội chứng sốc

nhiễm độc, một hội chứng sốc trầm trọng

Hầu hết các chủng tụ cầu khuẩn đều sản xuất được enzym penicillinase lactamase) Enzym này phá hủy vòng beta-lactam, cấu trúc cơ bản của các chất kháng sinh họ penicilin như penicillin G, ampicillin và ureidopenicillin, làm cho các chất kháng sinh này mất tác dụng [46] Đặc biệt các chủng các chủng tụ cầu vàng đề kháng

(beta-methicilin (MRSA – Methicilin resistant Staphylococcus aureus) đang trở nên phổ biến

và là mối nguy hại trong cộng đồng vì nó có khả năng kháng được nhiều loại chất kháng sinh thế hệ mới nhất [78]

1.3.4.3 Nhiễm độc do S aureus

Ngộ độc thức ăn do S aureus có thời gian ủ bệnh ngắn hơn so với các nhóm vi

khuẩn đường ruột gây ngộ độc thức ăn khác, chỉ 1-6 giờ (trung bình 2-3 giờ) sau khi ăn phải thức ăn có chứa độc tố Độc tố này bền với nhiệt nên khi nấu thì tụ cầu khuẩn bị tiêu diệt nhưng độc tố vẫn tồn tại Biểu hiện của nhiễm độc gồm : hội chứng sốc do độc

tố, hội chứng tróc da hay ngộ độc thức ăn Các quá trình nhiễm độc do tụ cầu khuẩn trải qua 4 bước: sự xâm nhập chủng vi khuẩn sinh độc tố, sản xuất độc tố, hấp thu độc

tố và gây độc cơ thể [92].Triệu chứng của bệnh: nôn ói, đau quặn bụng và tiêu chảy,

tiêu chảy không kèm theo máu và ít mất nước hơn so với vi khuẩn tả và E coli, không

xuất hiện sốt hay phát ban (đây là đặc điểm để phân biệt giữa ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng với các nhóm vi khuẩn khác) thần kinh người bệnh bình thường Phần lớn trường hợp bệnh đều tự khỏi và hồi phục trong 8-24 giờ sau khởi phát Những trường hợp nặng có thể bị giảm thể tích và tụt huyết áp [48]

1.3.5 Các nhóm vi khuẩn khác

1.3.5.1 Bệnh do Listeria

Bệnh do Listeria (Listeriosis) gây ra ở người đã được thừa nhận từ lâu Bệnh

xảy ra không nhiều thường chủ yếu ở trẻ sơ sinh, người cao tuổi và người có hệ thống

miễn dịch không hoàn thiện Bệnh do Listeria gây ra ở người được coi như một bệnh

cơ hội Tuy nhiên, sự có mặt của L monocytogenes trong nhiều loại thực phẩm có

nguồn gốc từ động vật và thực vật và các bệnh có nguồn gốc từ thực phẩm bị lây nhiễm

chỉ mới được công nhận gần đây L monocytogenes do Joseph Lister phát hiện là trực

khuẩn nhỏ Gram dương, dinh dưỡng lạnh, nội bào tùy tiện, kị khí không bắt buộc,

không sinh bào tử, di động Yếu tố gây độc của L monocytogenes là một loại

hemolysin đặc biệt, listeriolysin O Nó được tạo ra trong pha sinh trưởng của tế bào Các tác nhân gây bệnh xâm nhập vào các mô của cơ thể và sinh sản bên trong tế bào của cơ thể, từ đó giải phóng ra độc tố [82, 87]

1.3.5.2 Các bệnh do Campylobacter (Campylobacteriosis)

Campylobacter gây ra các bệnh viêm đường ruột-dạ dày ở người Ở nhiều

nước, số ca Campylobacteriosis có thể vượt xa tổng số các bệnh do Salmonella và

Shigella Thực phẩm có liên quan rất nhiều đến Campylobacteriosis là sữa tươi và

thịt gà nấu chưa chín Campylobacter lây truyền qua đường phân – miệng, qua quan

hệ tình dục [50] Mặc dù có một số Campylobacter spp có liên quan đến bệnh Campylobacteriosis song chỉ có C jejuni được phân lập trong hầu hết các trường hợp mắc C jejuni là vi khuẩn hình que, Gram âm, di động, không sinh bào tử Tế bào nhỏ, dễ gãy và có hình xoắn C jejuni chứa một độc tố đường ruột không bền nhiệt,

chịu trách nhiệm với các triệu chứng bệnh đường ruột Độc tố phản ứng chéo với độc

tố tả và đặc điểm tạo thành độc tố được liên kết với plasmid Ngoài ra, các chủng tạo

ra một yếu tố xâm nhập cho phép các tế bào xâm nhập và thiết lập trong các tế bào biểu mô ở cả ruột non và ruột già của người [17]

1.3.5.3 Bệnh viêm đường ruột- dạ dày do Clostridium perfringens

Viêm đường ruột gây ra bởi C perfringens bùng phát đều có số lượng người

mắc bệnh lớn Ở Mỹ, vào những năm 1960 và 1970, nó có liên quan tới trên 7% tổng

số các vụ bùng phát phát sinh từ thực phẩm và trên 10% tổng số người mắc bệnh

Vào những năm 1980, tỷ lệ bùng phát phát sinh từ thực phẩm giảm xuống khoảng

3% tổng số các vụ dịch, khoảng 5% tổng số người mắc bệnh [91]

Trong số 5 typ C perfringens, các chủng thuộc typ A thường tham gia vào các

bệnh nhiễm trùng - gây độc phát sinh từ thực phẩm Độc tố ruột có liên quan đến bệnh phát sinh từ thực phẩm là một protein không bền nhiệt Đó là một protein nội bào được tạo ra bởi tế bào trong quá trình hình thành bảo tử trong ruột và được giải phóng ra Khác với các độc tố của các vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm, độc tố ruột được sản sinh trong đường tiêu hóa Các thông số môi trường đối với sự sản sinh độc

tố ruột có liên quan đến môi trường hình thành bảo tử Một số báo cáo cho rằng, ngoài ruột, sự hình thành bào tử và tạo thành độc tố ruột ở những nồng độ nhất định cũng xảy ra trong một số loại thực phẩm [17]

1.3.5.4 Bệnh đường ruột- dạ dày do Bacillus cereus

Bacillus cereus là những trực khuẩn Gram dương, di động, tạo thành nội bào

tử ở chính giữa của tế bào Bacillus cereus sản sinh ít nhất hai kiểu độc tố ruột (độc

tố gây nôn và độc tố ruột), mỗi loại có liên quan tới từng kiểu triệu chứng đặc thù [18] Độc tố được tạo ra trong quá trình sinh trưởng của tế bào ở phạm vi nhiệt độ sinh trưởng và được giữ lại trong tế bào Chỉ khi các tế bào bị dung giải độc tố mới được giải phóng ra Chúng tồn tại trong đường ruột nhưng cũng có thể tồn tại trong thực phẩm Do vậy các trường hợp bệnh cũng có thể được coi như ngộ độc thực

phẩm giống như ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus

1.3.5.5 Vibrio cholerae

V.cholerae thuộc họ Vibrionaceae, là căn nguyên gây nên bệnh tả Theo thông

báo của WHO mỗi năm có tới 8 triệu lượt người ở mọi lứa tuổi phải nhập viện vì tiêu chảy do vi khuẩn tả, và hơn một phần ba số ca tử vong là ở trẻ em dưới 5 tuổi

V.cholerae được chia thành 3 type huyết thanh khác nhau: Inaba, Ogawa,

Hikojima Kháng nguyên của V.cholerae gồm 3 yếu tố A, B, C tạo nên Sự khác nhau

giữa các type huyết thanh là rất lớn Type Ogawa sản xuất KN A và B, lưọng nhỏ C Type Inaba chỉ sản xuất KN A và C Type Hikojima sản xuất cả 3 yếu tố do vậy có thể xảy ra phản ứng chéo với kháng huyết thanh type Inaba và Ogawa [17]

Vi khuẩn tả xâm nhập vào cơ thể thông qua thức ăn, nguồn nước bị nhiễm khuẩn Sau khi xâm nhập, vi khuẩn bám vào niêm mạc ruột và phát triển nhờ có pH thích hợp (pH xấp xỉ 8) và tiết độc tố (choleragen – cholera toxin – CT)

1.3.5.6 Clostridium botulinum và bệnh do Clostridium botulinum (Botulism)

Các bệnh botulism xảy ra sau khi ăn phải thực phẩm chứa độc tố butulin có độc

lực cao từ Clostridium botulinum Butulin là một độc tố thần kinh và tạo ra các triệu

chứng thần kinh cùng với một số triệu chứng ở dạ dày.Trừ khi sử dụng các biện pháp

điều trị nhanh chóng, nếu không bệnh rất dễ gây tử vong Bệnh do C botulinum xảy ra

ở trẻ em khi trẻ ăn phải bào tử Clostridium, các bào tử này sẽ nảy mầm, sinh trưởng và

sinh độc tố trong hệ đường ruột- dạ dày và gây ra các triệu chứng đặc thù

1.4 CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH KIỂM TRA VI KHUẨN TRONG THỰC PHẨM

Trong phần lớn các trường hợp ngộ độc thực thẩm do vi khuẩn, triệu chứng ngộ độc thường đa dạng, nhiều lúc không biểu hiện rõ và diễn biến khá phức tạp Do vậy công tác tìm đúng thủ phạm gây ngộ độc là vô cùng quan trọng, giúp cho việc điều trị

và theo dõi diễn biến dịch chuẩn xác, kịp thời

Kỹ thuật phân tích kiểm tra vi khuẩn trong thực phẩm dựa trên một số công đoạn [18]:

- Chọn và thu thập mẫu, chuyển đến phòng phân tích

nhiều bước kỹ thuật phức tạp và thời gian kéo dài Bước đầu là thu thập các mẫu thực phẩm sau đó tiến hành phân lập trên các môi trường đặc hiệu để kiểm tra sự có mặt của

vi khuẩn Các vi khuẩn phân lập lại tiếp tục được kiểm tra bằng các phản ứng hóa học đặc trưng cho từng loại và so sánh với bảng kết quả sinh hóa định danh vi khuẩn (bảng sinh hóa bao gồm các đặc điểm sinh hóa đặc trưng nhất để phân biệt các loài vi sinh vật gây bệnh) [9] Quy trình này thường tốn rất nhiều thời gian, công sức và phụ thuộc vào kinh nghiệm của các kỹ thuật viên mới cho kết quả chính xác [72] Tuy vậy đây vẫn là một phương pháp sáng giá, một công cụ hữu ích trong việc xác định sự có mặt của một

số vi khuẩn trong thực phẩm mà phần lớn các phòng kiểm nghiệm thực phẩm trong nước sử dụng Việc phát hiện các vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi theo tiêu chuẩn Việt Nam vẫn đang được thực hiện theo phương pháp này [25]

Hiện nay, các thử nghiệm sinh hóa truyền thống để định danh vi sinh vật đã có thể được thực hiện đơn giản hơn ở dạng đĩa giấy, que giấy Ngoài ra còn có các bộ kit cho phép thực hiện hàng loạt thử nghiệm hóa sinh theo một quy trình hai lựa chọn để định danh vi sinh vật Bộ kit này đang dần được phổ biến với ưu điểm xác định định hướng phân biệt các chủng vi sinh vật, kiểm tra chuyên sâu về phân loại vi sinh vật đồng thời các bước tiến hành thường đơn giản, tiết kiệm thời gian, công sức hơn so với phương pháp nuôi cấy thông thường Các bộ test thường sử dụng là API, Rosco, …Tuy vậy mỗi bộ kit chỉ cho phép định danh được một số vi sinh vật, chi phí thử nghiệm đắt tiền [23]

Kỹ thuật màng phim khô (petrifilm)

Đây là kỹ thuật mới với sự góp sức của các môi trường sẵn dưới dạng petrifilm nhằm hỗ trợ cho phương pháp nuôi cấy truyền thống Mẫu thực phẩm được cấy truyền trên màng phim đã tái tạo độ ẩm thích hợp và tạo thành gel Sau đó màng phim được đưa vào tủ cấy để quần thể vi sinh vật phát triển, tiếp theo tiến hành kỹ thuật nhuộm

màu để xác định chủng vi sinh Kỹ thuật màng phim khô có thuận lợi không mất công chuẩn bị môi trường, thao tác thuận tiện tiết kiệm dung tích nuôi cấy

1.4.2 Các phương pháp hiện đại

phẩm và độc tố của chúng gồm Salmonella, L monocytogenes, C jejuni Minnich đã

sử dụng IgG kháng lại kháng nguyên roi của Salmonella Typhimurium để phát hiện

Salmonella hay việc sử dụng enzym đánh dấu bằng avidin – biotin đã phát hiện được Salmonella trong các mẫu thực phẩm với giới hạn 25CFU/g Tuy nhiên phương pháp

ELISA thông thường chỉ phát hiện được vi khuẩn trong mẫu thực phẩm với nồng độ

104 – 106 CFU/ml (g) do vậy vẫn cần phải có bước tăng sinh trước khi phân tích

Kỹ thuật khuếch đại phản ứng polymerase (PCR)

PCR là phản ứng có sự tham gia của các enzym nhằm khuếch đại một đoạn axit nucleic mong muốn Đây là một kỹ thuật in vivo cho phép nhân nhanh một đoạn gen mong muốn lên hàng triệu lần trong một khoảng thời gian ngắn Phản ứng PCR hoàn toàn dựa theo quá trình sao chép ADN trong tế bào, trong đó ADN được nhân lên theo

cơ chế bán bảo tồn PCR đã được chứng minh là một trong những công cụ hữu hiệu trong chẩn đoán nhanh các bệnh truyền nhiễm [68,102] Kỹ thuật này hiện nay đang được áp dùng trong nhiều lĩnh vực như khoa học hình sự, mô bệnh học, các chẩn đoán trước sinh và chẩn đoán về các mầm bệnh [24]

PCR đã được sử dụng để chuẩn đoán, xác định nhanh Shigella, Salmonella và

E coli Hai đoạn gen invA1 và invA2 đã được sử dụng làm trình tự thiết kế một cặp

mồi để phát hiện Salmonella trong các mẫu thực phẩm bằng phương pháp PCR [86]

Gen mã hóa cho độc tố của Shigella và E coli (VirF) có độ dài khoảng 443 bp và 331

bp hay gen ipaH, ial cũng được sử dụng để phát hiện ra Shigella ở nồng độ 101 tế bào trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp này [64,97] Phương pháp PCR có độ nhạy gấp

102 tới 105 lần so với xét nghiệm hóa sinh tiêu chuẩn và xét nghiệm lai tách dòng Bằng việc sử dụng các fluorophores và fluorophore kết hợp như một chất đánh dấu đặc hiệu loài, Qiuying Huang đã dùng phương pháp real-time PCR để phát hiện được 8 nhóm vi khuẩn gây bệnh qua đường thực phẩm trong cùng một phản ứng [85] Vũ Đình Thiêm

đã sử dụng phương pháp real-time TaqMan PCR (real-time PCR), một phiên bản sửa

đổi của ipaH-specific PCR để phát hiện Shigella khi theo dõi những bệnh nhân đi

khám do tiêu chảy tại Nha Trang, Khánh Hòa, Việt Nam [104] Đích của cặp mồi là

trình tự gen kháng nguyên xâm nhập H (ipaH) có ở cả bốn loài vi khuẩn Shigella và

Ecoli xâm nhập ruột IpaH đã được phát hiện trong 55/ 60 (93%) mẫu cấy dương tính Shigella, trong khi chỉ được phát hiện ở 87/ 245 (36%) bệnh nhân cấy âm tính Shigella

không bị bệnh lỵ (P <0,001) Độ nhạy của phương pháp được tăng lên đối với trẻ em

và những bệnh nhân bị bệnh lỵ và đạt 100% đối với trẻ em bị bệnh lỵ

Kỹ thuật trở kháng và tính dẫn điện

Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên đặc tính của vi sinh vật là khi phát triển trong môi trường nuôi cấy đã làm thay đổi đặc tính dẫn điện của môi trường Bản thân các chất dinh dưỡng trong môi trường như đường, polysaccharide, protein và lipid không hoặc chỉ tích điện rất ít nhưng khi bị chuyển hóa thành các sản phẩm cuối cùng

sẽ lại tích điện Thí dụ glucose không tích điện nhưng khi chuyển thành 2 phân tử axit lactic sẽ tích điện và khi vi sinh vật phát triển trong môi trường nuôi cấy sẽ làm tăng độ dẫn điện và dung lượng điện (conductance capacitance) đồng thời làm giảm sự trở kháng điện và sự thay đổi tính dẫn điện Trở kháng trên sẽ được đo và ghi lại bằng cặp điện cực qua đó đánh giá được cường độ dòng điện thay đổi trong môi trường

Hiện nay đã có rất nhiều kỹ thuật phân tích kiểm tra vi sinh vật trong thực phẩm với thời gian ngắn và độ tin cậy cao, có khá nhiều ưu điểm hơn phương pháp qui ước thường quy đã được sử dụng trong phòng thí nghiệm Nhưng trên thực tế, nhiều kĩ thuật chưa được phổ biến tại các phòng thí nghiệm kiểm tra và cả các viện nghiên cứu

do điều kiện trang thiết bị và thiếu cán bộ kĩ thuật chuyên sâu [15] Đặc biệt đối với các phòng phân tích nhỏ, việc áp dụng những phương pháp kĩ thuật mới hiện đại là một điều khó khả thi do thiếu kinh phí hoạt động và cán bộ chuyên trách Các phòng phân tích nhỏ như trạm y tế gần như không có đầy đủ các dụng cụ lấy mẫu và không tự làm được các xét nghiệm nhanh để tham gia vào công tác điều tra ngộ độc thực phẩm [15]

Vì vậy hướng nghiên cứu để có thể đưa ra các phương pháp phân tích đủ độ tin cậy nhưng đơn giản, rẻ tiền và dễ thực hiện đang được ưu tiên

1.4.3 Phương pháp sử dụng lectin

Trong những năm đầu thế kỉ 20, một phương pháp xác định vi khuẩn mới được phát triển là phương pháp ngưng kết nhờ lectin Lectin là một oligomer bao gồm hai đến bốn chuỗi polypeptide với một chuỗi có một vị trí nhận diện carbohydrate Tính chất điển hình của lectin là khả năng tương tác đặc hiệu với đường Các đường tạo phức với chúng tốt nhất là các monosaccharide và oligosaccharide [56] Trên bề mặt vi khuẩn có nhiều vị trí để liên kết với lectin như capsule, glycolipid, glycoprotein, polysaccharide đặc hiệu nhóm, peptidoglycan…Do vậy, lectin có thể gây ngưng kết vi khuẩn do liên kết với các vị trí này Lectin đã được sử dụng để phân biệt vi khuẩn Gram âm với Gram dương, làm mẫu dò trong chẩn đoán Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về khả năng tương tác đặc hiệu giữa lectin với một số vi khuẩn gây bệnh

như Staphylococcus, Neisseria, Helicobacteria, Campylobacter… Concanavali A (Con A) – lectin từ cây đậu rựa gây ngưng kết các chủng Staphylococcus không có enzym

coagulase và cho thấy có thể phát hiện ra các chủng này nhờ lectin liên kết đặc hiệu với thành phần N – acetylglucosamin, - D-gal-(1,3)-D-Gal-NAc trên thành tế bào vi