Nghiên cứu phân loại nấm men moniliella phân lập tại việt nam

Gần đây, Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã phát hiện một số đặc tính công nghệ ít hoặc chưa được biết tới của Moniliella như khả năng chuyển hóa thầu dầu t

Hình 1 Hình thái tế bào đặc trưng của Phaeococcus catenatus CBS 650 76

Hình 2 Hình ảnh tế bào Exophiala salmonis CBS 157.67

Hình 3 Hình ảnh tế bào Aureobasidium pullulans

Hình 4 Hình ảnh tế bào Moniliella suaveolens CBS 120.63 (trái) và Moniliella

acetoabuten CBS 169.66 (phải)

Hình 5 Cây phả hệ mô tả mối quan hệ giữa các loài thuộc chi Moniliella

Hình 6 Hình ảnh tế bào của Geotrichum candidum (trái) và

Trichosporon beigelii (phải)

Hình 7 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi đặc hiệu phát hiện

Candida albicans và Candida dubliniensis

Hình 8 Một số mẫu hoa phân lập được Moniliella

Hình 9 Vị trí các địa điểm thu thập mẫu phân lập Moniliella tại Việt Nam

Hình 10 Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào một số chủng nấm men Moniliella phân lập

được

Hình 11 Phổ fingerprinting của 126 chủng Moniliella phân lập được

Hình 12 Vị trí các chủng đại diện phân lập được thuộc chi Moniliella

Hình 13 Phổ PCR fingerprinting với mồi (GAC)5 của các chủng Moniliella carnis

và Moniliella dehoogii

Hình 14 Phổ PCR fingerprinting với mồi (GAC)5 của các chủng Moniliella byzovii

Hình 15 Tế bào sinh dưỡng của Moniliella carnis (KFP 246T) sinh trưởng trên môi

sau 7 ngày (phải)

Hình 20 Hình thái khuẩn lạc của M dehoogii KFP 211T và TBY 2041.5 trên môi trường Malt glucose 2°Bx sau 10 ngày nuôi cấy ở 28°C

Bảng 1 So sánh đặc điểm của chi Moniliella và một số chi khác

Bảng 2 Phương pháp trộn lẫn tế bào các chủng trong cùng 1 loài để phát hiện pha

sinh sản hữu tính

Bảng 3 Các chủng nấm men đen Moniliella phân lập được

Bảng 4 Ký hiệu các chủng trong PCR fingerprinting

Bảng 5 Kết quả phân nhóm các chủng bằng fingerprinting

Bảng 6 Danh sách chủng Moniliella trong mô tả loài mới

Bảng 7 Danh sách các chủng thuộc 2 nhóm M byzovii

Bảng 8 Sự khác nhau những đặc tính quan trọng giữa M carnis, M dehoogii, M

byzovii và những loài đã biết thuộc chi Moniliella

Bảng 9 Phân lập Moniliella tại Việt Nam và trên thế giới

PCR – Polymerase Chain Reaction (phản ứng trùng hợp chuỗi)

RFLP-Restriction Fragment Length Polymorphism (đánh giá đa hình DNA theo phương pháp cắt hạn chế)

T – Type strain (chủng chuẩn)

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN 2

1.1.NHÓM NấM MEN ĐEN 2

Một số chi nấm men đen 2

1.1.1 Chi Phaeococcomyces 2

1.1.2 Chi Exophiala 3

1.1.3 Chi Aureobasidium 3

1.1.4 Chi Moniliella 4

1.2.MộT Số PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOạI NấM MEN 10

1.2.1 Các phương pháp phân loại truyền thống 10

1.2.2 Các phương pháp hóa phân loại và sinh học phân tử 12

1.3.MộT Số PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIệN VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DạNG VI SINH VậT 14

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1.ĐốI TƯợNG 18

2.2.HÓA CHấT, DụNG Cụ, TRANG THIếT Bị MÁY MÓC 18

2.2.1 Hóa chất 18

2.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc 19

2.3.THÀNH PHầN MÔI TRƯờNG Sử DụNG TRONG NGHIÊN CứU 19

2.3.1 Môi trường làm giàu có nồng độ đường cao 19

2.3.2 Môi trường Malt-Glucose 2Bx có axit lactic 1‰ 19

2.3.3 Môi trường Malt-Glucose 2Bx không có axit lactic 20

2.3.4 Môi trường thử khả năng chuyển hóa các nguồn cacbon khác nhau 20

2.3.5 Môi trường thử khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau 20

2.3.6 Thử khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường và muối cao 21

2.3.7 Môi trường xác định khả năng sinh trưởng trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau 2.3.8 Môi trường thử khả năng hình thành tinh bột 22

2.3.9 Môi trường đánh giá hoạt tính phân giải urea 22

2.3.10 Môi trường đánh giá khả năng sinh trưởng khi có mặt Cycloheximide 23

2.3.11 Môi trường đánh giá khả năng chống chịu acid acetic 1 % 23

2.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CứU 24

2.4.1 Phương pháp phân lập 24

2.4.3 Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào 25

2.4.4 Phương pháp tách chiết DNA tế bào nấm men 25

2.4.5 Phương pháp tinh chế DNA 25

2.4.6 Phương pháp tiến hành phản ứng PCR fingerprinting 26

2.4.7 Phương pháp điện di 26

2.4.8 Nhuộn gel và đọc kết quả 27

2.4.11 Đánh giá khả năng đồng hóa các nguồn nito khác nhau 28

2.4.12 Đánh giá khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường và nồng độ muối cao 29

2.4.13 Đánh giá khả năng sinh trưởng trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau 29

2.4.14 Thử khả năng hình thành tinh bột 29

2.4.15 Thử khả năng phân giải urea 29

2.4.16 Thử khả năng chống chịu với cycloheximit 30

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32

3.1.KếT QUả PHÂN LậP 32

3.2.QUAN SÁT HÌNH THÁI KHUẩN LạC, Tế BÀO 36

3.3.PHÂN NHÓM BằNG Kỹ THUậT FINGERPRINTING 37

3.5.MÔ Tả CÁC NHÓM LOÀI MớI THUộC CHI M ONILIELLA 44

3.5.1 Phân tích đặc tính di truyền của 3 loài mới 46

3.5.2 Đặc tính kiểu hình, sinh lý, sinh hóa của 3 loài mới 48

3.6.Sự ĐA DạNG M ONILIELLA PHÂN LậP TạI VIệT NAM 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60

CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU

Chi Moniliella được thiết lập bởi bởi Stolk và Dakin năm 1966 để xác lập vị trí phân loại cho 2 loài mới tìm được khi đó là Moniliella acetoabutens và Moniliella

tomentosa Năm 2009, căn cứ vào sự tương đồng nhất định về di truyền cũng như

một số đặc tính sinh lý, sinh hóa quan trọng, Rosa và cộng sự đã xếp một chi khác

là Trichosporonoides vào Moniliella Như vậy, trước khi nghiên cứu của chúng tôi được thực hiện, chi Moniliella bao gồm 9 loài, đó là Moniliella acetoabutens, M

fonsecae, M megachiliensis, M mellis, M nigrescens, M oedocephalis, M pollinis,

M spathulata và M suaveolens Phân loại của Moniliella thực sự vẫn chưa rõ ràng

Trình tự gần nhất của Moniliella fonsecae trong Genbank là Phylloporia pectinata, một thành viên của Agaricomycotina Với những trình tự khác, Moniliella thuộc

Ustilagionomycotina Hơn nữa, sự khác biệt về mặt di truyền giữa các loài thuộc chi Moniliella lại rất lớn, có thể tới 15-16% trong đoạn D1/D2 Do vậy việc tìm kiếm

những loài trung gian giữa các loài đã biết sẽ góp phần làm sáng tỏ phân loại của

Moniliella

Moniliella được sử dụng trong công nghiệp sản xuất erythriltol, một loại đường

chức năng có giá trị thương mại cao Gần đây, Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã phát hiện một số đặc tính công nghệ ít hoặc chưa

được biết tới của Moniliella như khả năng chuyển hóa thầu dầu thành γ-declactone

(tinh dầu đào) với độ tinh khiết cao, khả năng sinh lipase, khả năng sinh một loại kháng sinh (zymocin) mới Các nội dung nghiên cứu trong bản luận văn này được

thực hiện nhằm đánh giá đa dạng nấm men Moniliella tại Việt Nam, góp phần củng

cố hệ thống phân loại của chi và tạo cơ sở cho nghiên cứu công nghệ có sử dụng

Moniliella, cụ thể những nội dung nghiên cứu bao gồm:

- Phân lập nấm men Moniliella từ các nguồn mẫu khác nhau tại các địa điểm

khác nhau ở Việt Nam

- Phân nhóm, phân loại Moniliella phân lập được bằng hình thái; PCR

fingerprinting; giải trình tự DNA; phân tích cây phả hệ

- Phân tích sự đa dạng nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam về số loài,

phân bố

Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1 Nhóm nấm men đen

Nấm men đen được phát hiện từ khoảng đầu thế kỷ 20 nhưng khi đó người ta mới chỉ biết đến một vài chi trong số chúng Nấm men đen sinh sản vô tính là chủ yếu, bằng nảy chổi, tạo sợi hay mô phân sinh Điều tạo nên sự khác biệt giữa chúng

và các nhóm nấm men khác là chúng có melanin trong thành tế bào làm cho khuẩn lạc có thể có màu vàng lục, màu ô liu đến nâu sẫm, đen Ngoài ra, nấm men đen còn chứa carotenoid và mycosporines Một trong các lý do khiến những hiểu biết về nấm men đen kém xa so với các vi sinh vật khác có lẽ là do sự sinh trưởng chậm, khả năng cạnh tranh thấp với loài khác nên dễ bị bỏ qua trong các nghiên cứu, thêm nữa cấu trúc bào tử đính của chúng lại ít đặc điểm phân biệt, trong khi hiện tượng

đa hình thái của cùng một chủng lại khá phổ biến và gây khó khăn trong quá trình phân loại [9]

Một số chi nấm men đen

1.1.1 Chi Phaeococcomyces

Đặc điểm hình thái: Khuẩn lạc sinh trưởng chậm, nhầy, bề mặt có nhiều nếp nhăn, màu đen Tế bào dạng hình cầu đến elip Bào tử đính chuyển từ không màu sang nâu đậm hoặc đen [5, 7]

Hình 1 Hình thái tế bào đặc trưng của Phaeococcus catenatus CBS 650 76

(nguồn www.mycobank.org)

1.1.2 Chi Exophiala

Được mô tả đầu tiên vào năm 1966 bởi Carmichael với loài mới Exophiala

salmonis [5] Đến nay chi này gồm 28 loài: E castellanii, E jeanselmei, E moniliae, E pisciphila, E salmonis, E spinifera E jeanselmei Exophiala phân

bố nhiều trong đất, nước, thực vật, gỗ mục, và là nguyên nhân gây nhiều bệnh ở người

Exophiala có đặc điểm hình thái và sinh lý rất đa dạng, hình thái cơ bản có thể

tóm tắt như sau: Chiếm ưu thế trong môi trường nuôi cấy là tế bào là dạng phân đốt, thon dần về phía ngọn, một vài đốt hợp với nhau ở bên trong, mỗi đốt là một tế bào, đôi khi gồm hai tế bào Khi còn trẻ, các tế bào có dạng hình cầu, sinh sản bằng nảy chồi giống như nấm men thông thường, xếp thành chuỗi dài Sau một thời gian nuôi cấy, bắt đầu hình thành các vách ngăn bên trong sợi nấm, tạo thành đốt Các đốt này

có hình trụ, mọc kiểu tia và đặc trưng bởi các eo thắt hẹp Sau đó, từ các đốt sinh ra

bào, tập trung ở đỉnh của đốt hay trên cuống bào tử đính [5, 7]

Hình 2 Hình ảnh tế bào của Exophiala salmonis CBS 157.67

(Nguồn www.cbs.knaw.nl)

1.1.3 Chi Aureobasidium

Các loài thuộc Aureobasidium có phổ phân bố tương đối rộng và được tìm thấy trong đất, xác thực vật, lá cây Aureobasidium gồm 14 loài trong đó A pullulans được biết đến nhiều nhất Về mặt hình thái, Aureobasidium tạo khuẩn lạc lúc đầu

màu trắng, sau chuyển sang màu sẫm hoặc đen Đường kính sợi nấm từ 2-10 μm

Không phát hiện thấy cuống bào tử đính Aureobasidium sinh sản vô tính với bào tử

thành từng đám Các bào tử này sau đó tiếp tục sinh sản bằng nảy chồi hoặc hình thành túi bào tử thứ cấp [7]

Hình 3 Hình ảnh tế bào chủng Aureobasidium pullulans

(Nguồn www.mycobank.org)

1.1.4 Chi Moniliella

Sau khi chi Moniliella được thiết lập bởi Stolk & Dakin (1966) cho hai loài mới

là M acetoabutens và M tomemtosa Tiếp theo hai loài Moniliella suaveolens và

Moniliella mellis, đã được miêu tả bởi von Arx (1972) và Rao & de Hoog (1975),

được coi là tương tự như chi Moniliella, khác biệt chủ yếu bởi kích thước khuẩn lạc

và tế bào nhỏ hơn [8] Trong các nghiên cứu sau đó, cho thấy hai chi này tương đồng với nhau [8] Năm 2009, Rosa và cộng sự đã xác định các giả thuyết này bằng

so sánh trình tự vùng D1/D2 của rDNA 26S và đi đến kết luận Moniliella và

Trichosporonoides được xếp vào cùng một chi, loài M pollinis có trình tự vùng

D1/D2 giống với Trichosporonoide madida, chỉ khác nhau bởi tỉ lệ G+C tương ứng

là 50.4 và 50.2, do đó hai loài này thống nhất tên là M pollinis M pollinis được mô

tả khác với M tomemtosa về hình thái và mức độ chuyển hóa tạo erythritol, nhưng

về trình tự D1/D2 cho thấy chúng tương đồng nhau Như vậy cho đến trước nghiên

cứu này chi Moniliella gồm 9 loài như sau [24]

Moniliella acetoabutens Stolk & Dakin (1966)

Moniliella fonsecae Rosa, Jindamorakot, Limtong, Nakase, Lachance,

Fidalgo-Jiménez, Daniel, Pagnocca, Inácio & Morais (2008)

Moniliella megachiliensis (Inglis & Sigler) Rosa & Lachance (2008)

Moniliella mellis (Fabian & Quinet) V Rao & de Hoog (1975)

Moniliella nigrescens (Hocking & Pitt) Rosa & Lachance (2008)

Moniliella oedocephalis (Haskins & Spencer) Rosa & Lachance (2008)

Moniliella pollinis (Hennebert & Verachtert) de Hoog & Guého (1984)

Moniliella spathulata (de Hoog) Rosa & Lachance (2008)

Moniliella suaveolens (Lindner) von Arx (1972)

Phần lớn các loài thuộc chi Moniliella phân lập được thường phân bố ở những

nơi có nhiều dầu mỡ hoặc nơi có nồng độ đường cao như phấn hoa, mật ong…Ví

dụ, M acetoabutens cho tới nay chỉ gặp trên các mẫu thực phẩm lên men có độ chua cao như xốt hoa quả, dưa muối, M mellis từ mật ong, M nigrescens từ jam, marmalade hỏng, M spathulata từ sữa trâu, M suaveolens từ sữa, bơ, phomat … M

fonsecae phân lập từ hoa Angelonia pilosella, M megachiliensis phân lập từ côn

trùng, M oedocephalis từ mật ong, M pollinis từ phấn hoa

Về mặt hình thái học, những loài thuộc chi Moniliella có khuẩn lạc màu hơi

xám đến đen oliu, sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi và hình thành sợi nấm và bào

tử đốt Ngoại trừ M fonsecae, những loài thuộc chi Moniliella mang những đặc tính đặc biệt trong số những nấm đảm (Basidiomycetous) với khả năng chịu áp suất thẩm thấu và lên men Moniliella có những đặc trưng về cấu trúc như thành tế bào gồm

nhiều lớp và thiếu xylose, fucose Vách tế bào có các cấu trúc lỗ, vách ngăn

(dolispores) với các kênh hẹp [20] Moniliella phản ứng dương tính với Diazonium

blue Tất cả các loài có khả năng đồng hóa nitrat và sản sinh urease Ubiquinone

isoprenologue chính được xác định trong Moniliella là Co-Q9

Sự phân nhánh các loài của chi Moniliella được nghiên cứu bởi phân tích trình

tự vùng D1/D2 của gen LSU rRNA, mức độ sai khác về mặt di truyền giữa các loài

là cao Trong đoạn D1/D2 của gen LSU rRNA, các loài có thể sai khác nhau đến

15% thậm chí là hơn [22] Di truyền không đồng nhất trong chi cũng được thể hiện qua hơn 16% sai khác về tỷ lệ G+C trong DNA [4] Mặc dù các loài thuộc chi

Moniliella biểu hiện một số hóa phân loại và siêu cấu trúc giống những loài thuộc

ngành Ustilaginomycotina, thế nhưng việc sắp xếp vào bậc phân loại cao hơn là

không đảm bảo bởi phân tích D1/D2 LSU rRNA hoặc các đoạn gen rRNA khác [22] Một sự hiểu biết rõ ràng hơn về sự tiến hóa của chi sẽ được xác định dựa trên việc phát hiện ra nhiều loài mới để lấp vào các khoảng trống giữa các đơn vị phân

loại đã được thiết lập Thêm nữa, nghiên cứu về chi Moniliella ngày càng được thúc

đẩy do những đặc tính trong sinh trưởng của chúng như ưa lipit, chịu áp suất thẩm thấu, điều này hứa hẹn triển vọng cho các quá trình công nghệ sinh học Thực tế,

những loài thuộc chi Moniliella đang được dùng trong sản xuất erythritol thương

mại [23]

Hình 4 Hình ảnh tế bào Moniliella suaveolens CBS 120.63 (trái) và Moniliella

acetoabuten CBS 169.66 (phải) (Nguồn www.mycobank.org)

Hình 5 Cây phả hệ mô tả mối quan hệ giữa các loài thuộc chi Moniliella Phylloporia

pectinata được sử dụng như nhóm ngoài Mã số GenBank của trình tự rDNA được đưa ra

sau tên loài Thanh chèn tương ứng 5% khác biệt trình tự

Bảng 1 So sánh đặc điểm hình thái của chi Moniliella với một số chi thường gặp có thể bị

Phân bố ở những nơi có nhiều dầu mỡ hoặc những nơi có áp suất thẩm thấu cao như mật ong, phấn hoa

Geotrichum

Khuẩn lạc màu trắng, bột hoặc lông xù giống

Moniliella nhưng khuẩn lạc không chuyển

sang màu xám đen Chỉ sinh sản bằng phân đốt, không nảy chồi Tế bào to và dài, khoảng xấp xỉ 10µm

Phân bố trong đất hoặc nơi nhiều dầu mỡ

Candida Tế bào hình tròn hay elip Sinh sản vô tính

theo kiểu nảy chồi

Phân bố nhiều trong tự nhiên, thường ở những nơi có nồng độ đường cao như mật mía, một số chi xuất hiện ở những

nơi nhiều dầu mỡ như C

Hình 6 Hình ảnh tế bào của Geotrichum candidum.(trái) và

Trichosporon beigelii (phải)

Từ khía cạnh công nghệ, nấm men Moniliella có nhiều ưu điểm như khả năng

sinh sản nhanh trong điều kiện hiếu khí, vi hiếu khí, phát triển dạng đơn bào trong môi trường lỏng, phù hợp với công nghệ lên men chìm phổ biến hiện nay

Moniliella còn có khả năng phát triển trong điều kiện áp suất thẩm thấu cao tương

đương với nồng độ glucose 60% Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong sản xuất thương mại khi cần nâng cao nồng độ cơ chất và sản phẩm Tính ưa áp suất thẩm thấu cũng góp phần giảm tạp nhiễm trong quá trình lên men So với các nấm

men khác cũng như vi khuẩn, tế bào nấm men Moniliella có kích thước khá lớn

thuận lợi cho công nghệ thu hồi sản phẩm (lọc, ly tâm) Ngoài ra, trên môi trường

cơ chất rắn, Moniliella có thể phát triển ở dạng sợi và thích hợp với công nghệ sản

xuất lên men bề mặt [8]

Moniliella được quan tâm nhiều tới khả năng chuyển hóa glucose thành

erythritol Erythritol là loại đường chứa 4 nguyên tử cacbon và có một số đặc tính quan trọng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm như hàm lượng calo thấp

(1/10 so với sucrose), mát lạnh khi tan, độ ngọt dịu tương đương 70-80% sucrose, không gây sâu răng, và có ưu điểm hơn so với các loại đường chức năng khác như xylitol, maltitol vì không gây khó chịu cho đường tiêu hóa (Munro và cộng sự, 1998) Trên quy mô công nghiệp, erythritol được sản xuất bởi hai phương pháp khác nhau là: phương pháp Misubishi/Nikken (phương pháp M/N) và phương pháp Cerestar (phương pháp C) Đây thực chất là quá trình lên men nhờ vi sinh vật, trong

đó, phương pháp M/N sử dụng chủng nấm men Moniliella megachiliensis còn phương pháp C lại sử dụng chủng Moniliella pollilis Moniliella suaveolens còn

được biết đến với khả năng chuyển hóa sinh γ-decalactone khi sử dụng bánh ép dầu (oil press cakes) như một cơ chất tạo ra tới 180 mg γ-decalactone trên 1 kg chất khô khi chưa tối ưu [13]

Tại Việt Nam, gần đây trong hoạt động bảo tồn gen Vi sinh vật công nghiệp, trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã phát hiện

Moniliella có khả năng sinh zymocin, một loại kháng sinh kháng nấm men

Zymocin có thể được ứng dụng hiệu quả trong công nghiệp để bảo vệ các quá trình lên men khỏi sự xâm nhiễm và phá hoại của các loài nấm men hoang dại, trong bảo quản nước hoa quả Zymocin đồng thời cũng hứa hẹn nhiều khả năng được ứng dụng như một chất kháng sinh chống nấm trong y học Ngoài ra, nhiều chủng

Moniliella còn có khả năng sinh lipase, một enzyme được ứng dụng phổ biến trong

công nghiệp tẩy rửa và công nghiệp thực phẩm…

Hiện nay, Viện Công nghiệp Thực phẩm đang tiến hành thực hiện đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu công nghệ sản xuất đường chức năng erythritol từ tinh bột” thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp

chế biến đến năm 2020, sử dụng nấm men Moniliella Một trong những mục tiêu được đặt ra trong luận văn là đánh giá đa dạng nấm men Moniliella tại Việt Nam và

cung cấp một số lượng lớn chủng giống phong phú về mặt di truyền, đáp ứng các yêu cầu của nội dung sàng lọc trong đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước

1.2 Một số phương pháp phân loại nấm men

Hệ thống phân loại của nấm men hiện nay gồm có 14 lớp, 5 phân lớp, 15 họ, 95 chi và khoảng 1500 loài [18] Hệ thống phân loại nấm men được xây dựng dựa trên các sự tương đồng và khác biệt giữa các taxa theo các đánh giá phân loại truyền thống với cơ sở là đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại hiện đại với cơ

sở là thông tin di truyền

1.2.1 Các phương pháp phân loại truyền thống

Phương pháp phân loại truyền thống dựa vào các đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hóa để phân loại nấm men [1, 18]

Dựa vào đặc điểm hình thái tế bào nấm men: nấm men là cơ thể đơn bào nhưng

rất đa dạng về hình thái tế bào Thông thường tế bào nấm men có hình elip, hình cầu, một số có hình kéo dài dạng que, đôi khi có hình quả chanh Vì vậy, dựa vào

sự khác nhau về hình thái ta có thể sơ bộ phân loại các giống nấm men khác nhau

Dựa vào đặc điểm nuôi cấy: Quan sát sự thay đổi của môi trường lỏng trong

quá trình nuôi cấy để phân loại như: độ đục, độ tạo váng, bọt khí Nếu nuôi trên môi trường thạch thì đánh giá bằng hình thái, kích thước, màu sắc (trắng, kem, đục, ) và bề mặt khuẩn lạc (nhẵn, xù xì, lồi, lõm, )

Dựa vào đặc điểm sinh sản:

mẹ, chồi có tách ra khỏi tế bào mẹ hay không nhằm phân biệt các chủng khác nhau

bào tử, hình dạng, số lượng bào tử trong nang, hình dạng nang, khả năng phá vỡ nang

Dựa vào các đặc điểm sinh lý, sinh hóa: sử dụng các kiểm tra về sinh lý sinh

hóa như: khả năng lên men đường, khả năng đồng hóa đường và các hợp chất nitơ, khả năng tạo màng, khả năng tạo sắc tố, khả năng tiết một số enzym ngoại bào quan trọng (amylase, protease, lipase, kitinase, xenlulolase, cazeinase), khả năng tiết axit

amin, vitamin ra môi trường nuôi cấy [1, 18] Xác định các đặc tính sinh lý, sinh hóa là một bước rất quan trọng để phân loại nấm men, là cơ sở sàng lọc các đặc tính công nghệ, theo đó người ta phải tiến hành nghiên cứu các đặc điểm cụ thể sau đây:

raffinose, inulin, starch, melibiose, cellobiose, D-xylose

maltose, cellobiose, trelalose, lactose, melibiose, raffinose, melezitose, inulin, tinh bột tan, D-xylose, L-arabinose, D- arabinose, D-ribose, L-rhamnose, D-glucosamin, N-acetyl-D-glucosamin, methanol, ethanol, glycerol, erythritol, ribitol, galactitol, D-mannitol, D-glucitol, a- metyl-D-glucosid, salicin, glucono-d-lacton, D-gluconat, 2-ketogluconat, 5-ketogluconat, DL-lactat, succinat, citrat, inositol, saccharat, xylitol, L-arabinitol, propan 1,2 diol, butan 2,3 diol, D-glucuronic acid, D-galacturonic acid

cadaverine dihydrochloride, creatine

pantothenate, biotin, thiamine hydrochloride, pyridoxin hydrochloride, niacin, folic acid, p-aminobenzoic acid

 Khả năng sản sinh sắc tố

Ngoài ra để xác định loài mới còn cần phân tích thành phần acid béo của tế bào, thành phần đường trong tế bào, phân tích hệ coenzyme Q, tỷ lệ G+C, đặc tính huyết thanh miễn dịch

1.2.2 Các phương pháp hóa phân loại và sinh học phân tử

Ngoài phương pháp phân loại truyền thống các nhà phân loại còn có thêm một công cụ nữa là phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử Nhờ sự phát triển của

kỹ thuật di truyền và máy móc hiện đại giúp các nhà phân loại học có thêm cơ sở vững chắc để phân loại, thậm chí định tên đến loài một cách chính xác mà không cần nghiên cứu đến nhiều khía cạnh cùng một lúc

Phân tích thành phần thành tế bào: Dựa trên cơ sở thành phần trong chuỗi

polysaccarit cấu tạo nên thành tế bào giữa các loài nấm men khác nhau thì khác nhau Việc phân tích thành phần thành tế bào cung cấp một đặc điểm quan trọng để phân loại nấm men Các thành phần của thành được sử dụng để phân tích bao gồm glucan, mannan, kitin, xylose [18]

Thành phần G/C: Tỉ lệ (G+C)/(A+T+G+C) có xu hướng không đổi đối với các

loài nhất định, và khác nhau giữa các loài Do vậy thành phần (G+C) phản ánh mối quan hệ phát sinh loài Các chủng có thành phần (G+C) khác nhau 2- 2,5% thì thuộc hai loài khác nhau Tuy nhiên thành phần (G+C) chỉ giúp phân biệt được hai loài khác nhau mà không xác định được hai chủng có cùng loài hay không vì nếu tỷ lệ (G+C) giống nhau nhưng trình tự khác nhau thì chúng thuộc hai loài khác nhau [18,

19]

Loại CoQ: CoQ là chất mang quan trọng trong quá trình vận chuyển điện tử

trong chuỗi hô hấp Các loài nấm men khác nhau có số lượng và loại CoQ khác nhau là cơ sở để phân loại nấm men đến mức độ chi Các CoQ phát hiện ở nấm

Kỹ thuật PCR fingerprinting: phương pháp fingerprinting là phương pháp dùng

để phân nhóm dưới loài dựa trên sự tương đồng các đoạn DNA vệ tinh DNA vệ tinh là các đoạn DNA có trình tự lặp lại lớn phân bố ngẫu nhiên trong hệ gen của tế bào, thường không mã hóa cho gen và ít bị đột biến, thay đổi Do đó chúng thường được dùng làm công cụ đắc lực trong phân loại Sử dụng các mồi được thiết kế theo trình tự của các DNA vệ tinh trong phản ứng PCR Sau đó các đoạn DNA vệ tinh đã khuếch đại sẽ được điện di để so sánh kích thước Sự tương đồng của các phổ băng thể hiện sự gần gũi của các chủng nấm men

Trình tự rDNA: Do ribosome có ở tất cả các tế bào sinh vật và ít biến đổi nên nó

là cơ sở nghiên cứu tổ tiên chung cho mọi sinh vật Các rDNA có nhiều bản sao, dễ phân lập, kích thước nhỏ nên dễ dàng phân tích các đặc điểm liên quan bằng các kĩ thuật hiện đại như: RFLP, AFLP, hoặc đọc trình tự nucleotit, từ đó phân loại các vi sinh vật một cách chính xác hơn Các đoạn rDNA thường được chọn là: rDNA 5S, rDNA 5.8S, rDNA 18S, rDNA 26S, và ITS

Đoạn gen mã hóa rDNA 5S: trước đây được sử dụng nhiều trong phân loại do

nó có kích thước nhỏ (120 Nu) dễ xác định trình tự và có tính bảo thủ cao, là cơ sở

để xác định mối quan hệ phát sinh loài trên phổ rộng Hiện nay vai trò rDNA 5S được thay thế bởi rDNA 18S, rDNA 26S do chúng cung cấp nhiều thông tin hơn Đoạn gen mã hóa rDNA 18S: Đoạn gen này có kích thước lớn, có chứa các vùng bảo thủ ở các phần khác nhau Do vậy phân tích trình tự rDNA 18S cho phép xác định mối quan hệ sinh vật từ ngành cho đến loài, hiệu quả hơn khi kết hợp với đặc điểm (G+C), CoQ, thành tế bào để phân loại Tuy nhiên việc phân tích trình tự rDNA 18S có nhiều hạn chế do kích thước của chúng quá lớn gây tốn kém trong

đọc trình tự, làm cản trở việc áp dụng kỹ thuật này một cách rộng rãi trong phân loại

Đoạn gen mã hóa rDNA 26S: Một trong những thành tựu quan trọng đã đạt được trong nghiên cứu đa dạng nấm men gần đây là thiết lập được cơ sở dữ liệu về trình tự D1/D2 của rDNA 26S cho tất cả các nấm men đã biết Điều đó cho phép so sánh loài mới phân lập với các loài đã biết, nhờ đó xác định được tên và vị rí của nó trong hệ thống phân loại một cách nhanh chóng và dễ dàng Đoạn D1/D2 của rDNA 26S được chọn để nghiên cứu vì kích thước nhỏ (600 bp), và khác nhau giữa các loài (tính đặc hiệu loài cao), các chủng khác nhau dưới 1% nucleotit thì cùng một loài và trên 1% có thể thuộc các loài khác nhau Tuy nhiên cần phải sử dụng nhiều gen để phân tích thì hiệu quả phân loại sẽ cao và chính xác hơn

Vùng ITS: Vùng này nằm giữa rDNA 18S và rDNA 26S, có kích thước khoảng

500 bp Do có tính bảo thủ cao, kích thước nhỏ nên vùng ITS được sử dụng trong phân loại khá phổ biến như đoạn D1/D2 của rDNA 26S So với mức độ tương đồng của đoạn D1/D2 thì vùng ITS cũng tương tự, các chủng khác nhau dưới 1% nucleotit thì được coi là cùng loài và trên 1% thì có thể chúng thuộc các loài khác nhau [14, 16]

1.3 Một số phương pháp phát hiện và đánh giá đa dạng Vi sinh vật

Phương pháp Peptide axit nucleic (PNA): cung cấp một công cụ để phát hiện và

định lượng của các loài trong các mẫu bệnh phẩm và các sản phẩm thực phẩm, thông qua lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) PNA đầu dò có một peptide như một khung xương sống để nối các chuỗi nucleotide bổ sung đặc trưng cho một loài cụ thể, và một nhãn huỳnh quang được gắn thêm vào, phản ứng lai sau đó được phát hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang (Stender và cộng sự 2001) Nếu đầu dò bổ sung với rRNA, toàn bộ tế bào của các loài mục tiêu sẽ "phát sáng" khi quan sát, mặt khác kỹ thuật này cũng cho phép định lượng số lượng tế bào Một lợi thế là một mẫu có thể được pha loãng và trực tiếp dùng đầu dò Nhưng bất lợi là đầu dò phải được phát triển cho mỗi loài quan tâm, một vấn đề phổ biến nhất cho công nghệ

dùng đầu dò Kỹ thuật PNA đã có hiệu quả để phát hiện Dekkera (Brettanomyces)

bruxellensisin trong rượu vang hỏng (Stender và cộng sự 2001) và để phát hiện Candida albicansin trong mẫu máu (Rigby và cộng sự 2002) [18]

Hình 7 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi đặc hiệu phát hiện Candida

albicans và Candida dubliniensis Phản ứng PCR gồm mồi cho đoạn D1/ D2 và mồi đặc

hiệu dành riêng cho Candida albicans (Mannarelli và Kurtzman 1998)

Kỹ thuật Realtime PCR: kỹ thuật này cũng đã được nghiên cứu và ứng dụng

rộng rãi trong nấm học y học, đặc biệt là những mục tiêu nhằm phát hiện và định

lượng C albicans Trong các thử nghiệm, kỹ thuật này có thể phát hiện được 5

cfu/ml Một lợi thế của phương pháp này là phát hiện sớm các tác nhân gây bệnh tiềm ẩn, góp phần khởi đầu điều trị Các mồi phổ biến nhất được sử dụng là dựa về trình tự của rDNA lặp lại, chẳng hạn như vùng ITS1, ITS2, hoặc gen rRNA 18s Kỹ thuật này cũng đang trở nên sử dụng rộng rãi trong phân tích thực phẩm và nước giải khát, và đã được sử dụng để phát hiện và định lượng của nấm men hư hỏng trong nước cam (Casey và Dobson 2004) cũng như trong quá trình lên men rượu vang (Cocolin và cộng sự 2001) [18]

Kỹ thuật DGGE: Điện di gradient biến tính (DGGE) là một kỹ thuật đầy hứa

hẹn đã được sử dụng để nhận dạng các loài và định lượng các quần thể nấm men trong thực phẩm và đồ uống DGGE là một công cụ được phát minh nhằm ứng dụng cho việc phân tích DNA Kỹ thuật này được sử dụng để phát hiện sự thay đổi mã di truyền trong DNA và có thể xác định sự sai khác 1 bp giữa các sợi DNA Nguyên lý

của kỹ thuật này là sự phân tách sợi DNA dựa trên thành phần bazơ hoặc tỷ lệ G+C/A+T cấu trúc nên sợi DNA Sự tách nhau của các sợi A xảy ra do sự tiếp xúc của chúng với một gradient của tác nhân biến tính ở nhiệt độ cao trong gel acrylamit Khi mẫu DNA chạy qua gel từ nồng độ biến tính thấp đến nồng độ biến tính cao hơn, nó bắt đầu nóng chảy tại nhiều vị trí khác nhau Đối với các mẫu DNA

có hàm lượng G+C càng cao thì càng khó biến tính Do vậy DNA có khả năng chạy

xa hơn trên gel, ngược lại mẫu DNA có hàm lượng G+C thấp thì nhanh chóng bị nóng chảy ở cùng nồng độ của tác nhân biến tính, do vậy chúng chạy chậm hơn

trong gel và cách xa so với mẫu DNA chạy nhanh hơn [18]

Trong tự nhiên tồn tại hệ vi sinh vật hết sức đa dạng Bằng phương pháp phân lập sẽ thu được các chủng vi sinh vật thuần khiết từ các mẫu nghiên cứu, tuy nhiên nếu môi trường phân lập không phù hợp hoặc vì lý do khác mà có thể bỏ sót loài vi sinh vật nào đó Như vậy, việc đánh giá đa dạng vi sinh vật trong mẫu không được toàn diện Để khắc phục nhược điểm này, các nhà vi sinh vật học đã sử dụng phương pháp PCR và điện di gradent biến tính để đánh giá vi sinh vật trong các mẫu thu được mà không cần qua phân lập Thành phần vi sinh vật được thể hiện qua các băng DNA của các vi sinh vật có trong mẫu được khuếch đại trên gel điện di nằm ở các dải nồng độ khác nhau Để xác định vị trí phân loại của các vi sinh vật có trong mẫu bánh men cần tiến hành giải trình tự đoạn DNA được khuếch đại Điểm ưu việt của DGGE so với điện di thường là nó có thể phân tách các đoạn DNA có cùng kích thước nhưng khác nhau về trình tự nucleotit và thành phần G+C thành các băng điện di khác nhau Do mỗi đoạn DNA thuộc các vi sinh vật khác nhau sẽ có trật tự sắp xếp và thành phần nucleotit khác nhau nên mức độ biến tính

sẽ khác nhau ở cùng nồng độ tác nhân biến tính Dựa vào các băng điện di thu được

có thể đánh giá sơ bộ sự đa dạng vi sinh vật trong các mẫu quan tâm Để đánh giá chính xác hơn về thành phần các vi sinh vật có trong mẫu, người ta tiến hành cắt băng điện di, thôi gel và khuếch đại đoạn DNA đó bằng các cặp mồi đã dùng ở trên nhưng không chứa đoạn G+C nhờ PCR Sau đó tiến hành giải trình tự đoạn DNA được khuếch đại, dùng các phần mềm hỗ trợ để xác định chi vi sinh vật trong mẫu

Phương pháp này hiện nay được sử dụng khá phổ biến trong vi sinh vật học môi trường, hoặc trong trường hợp không thể phân lập được vi sinh vật phục vụ nghiên cứu

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

Trong nghiên cứu này, 1653 mẫu khác nhau, bao gồm 615 mẫu hoa và côn trùng, 329 mẫu tương, 709 mẫu bàn thái thịt và sản phẩm dầu mỡ từ các tỉnh Hà Nội, Vình Phúc, Hưng Yên, Hải Dương, Hòa Bình, Nam Định, Quảng Ninh, Thái Nguyên, Phú Thọ, Lâm Đồng, Bình Thuận, Phú Yên được khảo sát Từ 1653 mẫu

này, có 126 chủng nấm men Moniliella được phân lập và sử dụng làm đối tượng nghiên cứu Ngoài ra còn có 78 chủng Moniliella phân lập được trước đây trong nội

dung khóa luận tốt nghiệp đại học của học viên cũng được sử dụng phục vụ nghiên cứu

2.2 Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị máy móc

2.2.1 Hóa chất

Hóa chất dùng trong nuôi cấy:

Agar (Việt Nam), Malt (Đan Mạch), Glucose (Trung Quốc), Acid lactic (Trung Quốc), Yeast extract (Ấn Độ), Malt extract (Ấn Độ), Peptone (Ấn Độ)

Hóa chất dùng cho test sinh hóa:

Yeast Nitrogen Base (Difco, Mỹ), nguồn cacbon (Sigma, Mỹ), Yeast Carbon Base (Difco, Mỹ), Purified agar (Oxoid, Anh), nguồn nito (Sigma, Mỹ)

Hóa chất dùng cho PCR

Ethidium Bromide để nhuộm gen Pharmacia-Biotech (Mỹ)

2.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc

Máy móc, thiết bị: bộ điện di ngang (Pharmacia Biotech, Gibco), box cấy (BioblockScientific, Pháp), cân điện tử (Precisa, Thụy Điển), kính hiển vi quang học (Eclipse E600-Nikon, Nhật), lò vi sóng (LG, Hàn Quốc), hệ thống soi và chụp ảnh gel điện di (Syngene), máy đo pH (Toledo - Anh), máy lắc ổn nhiệt (Eppendorf, Đức), máy ly tâm cao tốc (Heraeus – Sepatech), máy PCR (PE-Gene Amp PCR System 9700), nồi hấp thanh trùng (Himayatoko, Nhật), tủ lạnh giữ giống (Electrolux, Thụy Điển), tủ nuôi cấy (Sanyo,Nhật), máy phá tế bào (Mini Beadbeater, Biospec Products), máy đông khô (VirTis Freeze Dryers 2.0, SP Scientific, Tây Ban Nha)

Dụng cụ: Đĩa Petri, pipette tự động các loại, ống Falcon, ống nghiệm, ống Eppendorf, ống đong, đèn cồn, bình tam giác (loại từ 20 - 1000), bình Schott, que cấy,

2.3 Thành phần môi trường sử dụng trong nghiên cứu

2.3.1 Môi trường làm giàu có nồng độ đường cao

Thành phần môi trường Glucose 50°Bx (1000 ml): Glucose (49.5 %), Yeast

extract (0.5 %), nước cất

Chuẩn bị: cân các thành phần, mỗi hóa chất cho vào 1 bình Schott riêng sau đó

khử trùng ở 115°C, 15 phút Sau khi khử trùng trộn dung dịch hóa chất lại với nhau cho vào mỗi ống Falcon đã khử trùng 30 ml Bảo quản trong tủ mát

Tác dụng: làm giàu nấm men đen trong mẫu thu thập được.

2.3.2 Môi trường Malt-Glucose 2Bx có axit lactic 1‰

Thành phần (1000 ml): Malt (1 %), glucose (1 %), agar (2 %), acid lactic 90 %

(1ml acid lactic cho 1000 ml môi trường), nước cất

Chuẩn bị: Cân các thành phần với tỷ lệ như trên Cho hỗn hợp vào bình Schott

sau đó đem khử trùng ở 121°C trong 15 phút để môi trường nguội xuống 70-80°C,

bổ sung acid lactic 90 % với tỷ lệ 1 ml acid/ 1000 ml môi trường, trộn đều và đổ ra đĩa Petri trong điều kiện vô trùng

Tác dụng: dùng làm môi trường phân lập với mẫu đã làm giàu bằng môi trường

có nồng độ đường cao

2.3.3 Môi trường Malt-Glucose 2Bx không có axit lactic

Thành phần (1000 ml): Malt (1%), glucose (1%), agar (1,5%), nước cất

Chuẩn bị: cân các thành phần, cho hỗn hợp vào bình Schott rồi hấp khử trùng ở

121°C trong 15 phút sau đó để nguội môi trường xuống 70- 80C đổ ra đĩa Petri trong điều kiện vô trùng, môi trường này dùng cho tinh sạch chủng giống

Cân các thành phần, hoà tan agar sau đó dùng pipet hút 4 ml cho vào ống nghiệm nút xoáy, rồi hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút, sấy nhẹ môi trường cho khô và bảo quản trong tủ mát, môi trường này dùng cho bảo quản giống

2.3.4 Môi trường thử khả năng chuyển hóa các nguồn cacbon khác nhau [18]

Môi trường kiểm tra (100 ml): Yeast Nitrogen Base (0,67 g), nguồn cacbon (42

loại 0.5 g/ 100 ml, riêng Raffinose là 1 g/ 100 ml), nước cất

Môi trường đối chứng dương (100 ml): Yeast Nitrogen Base (0,67 g), glucose

Tác dụng: thử khả năng chuyển hóa các nguồn cacbon khác nhau

2.3.5 Môi trường thử khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau [18]

Thành phần (100ml): Yeast Carbon Base (1,17 g), agar tinh khiết (1 g), nước

cất

Chuẩn bị: cân các thành phần, cho vào bình Schott, hấp khử trùng ở 0,9atm

trong 10 phút Để nguội khoảng 40°C rồi đổ ra đĩa Petri sạch trong điều kiện vô trùng

Tác dụng: thử khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau

2.3.6 Thử khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường và muối cao

Môi trường có nồng độ đường cao [18]

Môi trường 50% glucose (1000 ml): Glucose (50%), yeast extract (1%), agar (2%), nước cất

Môi trường 60% glucose (1000 ml): Glucose (60%), yeast extract (1%), agar (2%), nước cất

Môi trường đối chứng (1000 ml): Glucose (5 %), yeast extract (1%), agar (2%), nước cất

Chuẩn bị: Cân các thành phần, cho vào bình schott Hấp khử trùngở 0,9 atm, 110°C trong 10 phút Để nguội khoảng 70°C đổ ra đĩa petri vô trùng trong điều kiện

vô trùng Đĩa petri được bảo quản mát

Tác dụng: Thử khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường cao

Môi trường có nồng độ muối cao (10% Nacl) [18]

Thành phần (100 ml): Yeast Nitrogen Base (0,67 g), glucose (5 g), NaCl (10 g), nước cất

Chuẩn bị: Cân các thành phần, hòa tan trong nước, cho vào mỗi ống nghiệm có nút cao su 2 ml môi trường, hấp khử trùng ở 120°C, 15 phút Môi trường sau khi khử trùng được bảo quản mát

Tác dụng: thử khả năng sinh trưởng của nấm men trong môi trường có nồng độ muối cao

2.3.7 Môi trường xác định khả năng sinh trưởng trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau [18]

Thành phần (1000 ml): Glucose (4 %), peptone (0,5 %), agar (2 %), nước cất Chuẩn bị: Cân các thành phần, cho vào bình Schott Hấp khử trùngở 121°C, 15

phút Để nguội khoảng 70°C đổ ra đĩa Petri vô trùng trong điều kiện vô trùng Đĩa Petri được bảo quản mát

Tác dụng: Đánh giá khả năng sinh trưởng của nấm men ở nhiệt độ khác nhau

2.3.8 Môi trường thử khả năng hình thành tinh bột [18]

Thành phần (1000 ml): (NH4)2SO4 (2 g), KH2PO4 (2 g), MgSO4.7H2O (1 g), glucose (20 g), agar (20 g), nước cất; pH 4,5

Chuẩn bị: Cân các thành phần, cho và bình Schott hấp khử trùngở 121°C , 15

phút, Để nguội khoảng 70°C đổ ra đĩa Petri vô trùng đã cho sẵn 1 giọt hỗn hợp vitamin trong điều kiện vô trùng Đĩa Petri được bảo quản mát

Dung dich lugol để kiểm tra có thành phần (100 ml): I2 (5 g), KI (10 g), nước cất Pha loãng dung dịch 5 lần trước khi sử dụng

Tác dụng: Kiểm tra sự hình thành tinh bột trên môi trường nuôi cấy nấm men

2.3.9 Môi trường đánh giá hoạt tính phân giải urea [18]

Thành phần môi trường Christensen (1000 ml): Pepton (1 g), NaCl (5 g),

KH2PO4 (2 g), glucose (5 g), agar (20 g), nước cất

Chuẩn bị: cân các thành phần, đun tan môi trường, thêm 6 ml dung dịch đỏ

phenol có nồng độ 0,2 % trong cồn, hấp khử trùng ở 121°C, 15 phút Để nguội môi trường tới 50°C thêm 500 µl dung dịch urea (dung dịch 20 % khử trùng riêng qua màng lọc) trộn đều Sau đó đổ ra đĩa Petri vô trùng trong điều kiện vô trùng Đĩa Petri được bảo quản mát

Tác dụng: đánh giá khả năng phân giải urea của nấm men

2.3.10 Môi trường đánh giá khả năng sinh trưởng khi có mặt Cycloheximide

Chuẩn bị: cân các thành phần, hòa tan trong nước, cho vào ống nghiệm 2 ml/

ống, hấp khử trùng ở 121°C, 15 phút Ống nghiệm sau khử trùng được bảo quản mát

Tác dụng: đánh giá khả năng sử dụng D-glucose khi bổ sung cycloheximit với

nồng độ 0,1 % và 0,01 %

2.3.11 Môi trường đánh giá khả năng chống chịu acid acetic 1 % [18]

Thành phần (100 ml): D-glucose (10 g), Tryptone (1 g), yeast extract (1 g),

Agar (2 g), nước cất

Chuẩn bị: cân các thành phần, hòa tan trong nước, cho hỗn hợp vào bình Schott,

hấp khử trùng ở 121°C, 15 phút Đến khi môi trường nguội khoảng 45°C -50°C, bổ sung nhanh 1 ml glacial acetic acid vào môi trường, lắc đều và đổ ra đĩa Petri

Tác dụng: đánh giá khả năng chống chịu của nấm men khi sinh trưởng trên môi

trường có nồng độ acid acetic 1 %

2.3.12 Môi trường phát hiện pha sinh sản hữu tính ở nấm men [18]

YM agar (1000 ml): Glucose (10 g), Yeast extract (3 g), Malt extract (3 g),

Peptone (5 g), agar (20 g), nước cất

Malt-Glucose 2°Bx agar (1000 ml): Malt (1 %), Glucose (1 %), agar (2 %), nưar

(2 (1 Yeast carbon base agar (1000 ml): Yeast Carbon Base (11,7 g), agar (20 g),

nước cất

Chuẩn bị: Chuẩn bị: cân các thành phần, hòa tan trong nước, cho hỗn hợp vào

bình schott, hấp khử trùng ở 121°C, 15 phút Đến khi môi trường nguội khoảng 70°C thì đổ ra đĩa petri

Tác dụng: phát hiện pha sinh sản hữu tính của Moniliella

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp phân lập

Các loại mẫu được thu thập từ các địa điểm khác nhau Nấm men đen có trong các mẫu được làm giàu trong các môi trường có nồng độ đường cao Sau đó được

Quy trình tiến hành phân lập như sau:

đường cao Cho mẫu vào mỗi ống falcon 50ml môi trường đã chuẩn bị, vặn

chặt nắp

 Khi mẫu có hiện tượng lên men, dùng pipet hút 75 l dịch vào đĩa thạch

thạch thứ nhất, sau đó giữ nguyên que chang chang đều tiếp lên đĩa thạch thứ

hai và ba Như vậy ta được các đĩa thạch với nồng độ tế bào giảm dần

nghi ngờ là nấm men đen được làm tiêu bản và soi dưới kính hiển vi quang

học Chọn lấy các khuẩn lạc đại diện tiến hành làm sạch và giữ giống

2.4.2 Làm sạch và giữ giống

Lấy một ít nấm men cần làm sạch và cấy ria lên đĩa Petri chứa môi trường

Khi thấy nấm men đã mọc mà không thấy xuất hiện khuẩn lạc khác lạ thì chọn lấy

một khuẩn lạc riêng rẽ và cấy giữ giống vào trong ống nghiệm nút cao su chứa môi

1-2 ngày, sau đó cất giữ trong tủ mát Trường hợp nấm men chưa sạch (có khuẩn lạc lạ) thì phải làm sạch lại như cách trên

2.4.3 Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào

sau 5 ngày lấy ra quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc Làm tiêu bản

2.4.4 Phương pháp tách chiết DNA tế bào nấm men

Tế bào được nuôi cấy trên môi trường Malt-Glucose 2Bx sau 3 ngày Lấy 2

Hút bỏ phần dịch và tiến hành rửa tế bào 2 lần bằng nước cất vô trùng Qua mỗi lần

trùng, 100l hạt thủy tinh, 150l dung dịch phenol/chlorofom (tỷ lệ 1:1), đặt vào máy phá tế bào trong 1 phút Đem ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút Lấy

2.4.5 Phương pháp tinh chế DNA

Do DNA của nấm men đen còn chứa nhiều chất ức chế PCR nên trước khi dùng DNA làm khuôn cho phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành tinh chế DNA bằng Silica

vô trùng Bổ sung 150l dung dịch Binding buffer có chứa Silica Đem ly tâm ở

13000 vòng/phút trong 2 phút Hút bỏ dịch do DNA đã bám trên bề mặt các hạt

cất vô trùng dùng cho PCR Ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 1 phút, DNA ở phần dịch nổi là DNA đã được tinh chế DNA sau khi tinh chế có thể dùng làm khuôn

2.4.6 Phương pháp tiến hành phản ứng PCR fingerprinting

Phản ứng PCR finger printing được tiến hành với thành phần phản ứng như sau:

Tiến hành nhân đoạn DNA bằng kĩ thuật PCR sử dụng mồi MST2 trên máy Gene Amp, System 9700 (PE), chương trình MST2 Chu trình gia nhiệt như sau:

tiếp với các bước: biến tính ở 94C trong vòng 40 giây, gắn mồi ở 52C trong 1

2.4.7 Phương pháp điện di

Các sản phẩm sau khi chạy PCR được điện di trên gel agarose 1 % với dung dịch

(kích thước tùy theo số lượng mẫu cần điện di) được đặt thăng bằng trên mặt phẳng nằm ngang đã đặt sẵn lược Để gel đông lại ở nhiệt độ phòng, gỡ bỏ lược, đặt bản gel vào buồng điện di ngang sao cho bản gel chìm hẳn trong dung dịch đệm TAE Dùng micropipette nhỏ các sản phẩm sau PCR vào các giếng của bản gel Với các gel sử

dụng răng lược nhỏ, dùng 3-5 l mẫu cho mỗi giếng Điện di với hiệu điện thế 100V

50-2.4.8 Nhuộn gel và đọc kết quả

pha trong nước cất (trong 30 phút), sau đó vớt bản gel ra và rửa qua bằng nước cất

để loại bỏ Ethidium Bromit bám không đặc hiệu Sau khi rửa, các băng DNA được quan sát bằng máy soi gel InGenius của hãng Syngene

2.4.9 Phương pháp phân loại nấm men dựa vào đọc trình tự rDNA

DNA sau khi được tách và tinh chế như trên, tiến hành phản ứng PCR nhằm khuếch đại vùng ITS và đoạn D1/D2 của đoạn rDNA 26S với thành phần và tỷ lệ như sau:

Tiến hành nhân đoạn DNA bằng kĩ thuật PCR trên máy Gene Amp, System

Sản phẩm PCR sau đó cũng được kiểm tra bằng điện di và nhuộm bằng ethidium bromit như trên, và soi bằng máy soi gel Sau đó sản phẩm PCR được đọc trình tự với

4 mồi ITS1, ITS4, NL1, NL4 Kết quả đọc trình tự được xử lý với các phần mềm

Bioedit, Vector NTI Sau đó sử dụng chương trình MEGA 5.3 để xây dựng cây phân loại nhằm xác định vị trí của chủng quan tâm

2.4.10 Đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon khác nhau

Môi trường được chuẩn bị như mục 2.3, 42 nguồn cacbon bao gồm: D-Glucose, D-Galactose, L-Sorbose, D-Glucosamine, D-Ribose, D-Xylose, L-Arabinose, D-Arabinose, L-Rhamnose, Sucrose, Maltose, α,α-Trehalose, Me a-D-Glucoside, Cellobiose, Salicin, Arbutin, Melibiose, Lactose, Raffinose, Melezitose, Inulin, Starch, Glycerol, Erythritol, Ribitol, Xylitol, D-Glucitol, D-Mannitol, Galactitol, myo-Inositol, D-Glucono-1,5-lactone, 2-Keto-D-Gluconate, 5-Keto-D-Gluconate, D-Gluconate, D-Galacturonate, DL-Lactate, Succinate, Citrate, Methanol, Ethanol, Propane 1,2 diol, Butane 2,3 diol

Các chủng đem kiểm tra được nuôi cấy trẻ hóa trên môi trường Malt-Glucose

ml dung dịch yeast nitrogen base vô trùng đã chuẩn bị trước, lắc đều cho tế bào hòa đều vào trong dịch Dùng pipet Paster vô trùng hoặc sử dụng pipetman với đầu côn

vô trùng có màng lọc hút 30 µl dịch tế bào cho vào mỗi ống nghiệm chứa các nguồn cacbon khác nhau và 1 ống đối chứng dương, 1 ống đối chứng âm Ống nghiệm để trong tủ nuôi cấy ở 28°C trong vòng 3 tuần Sau mỗi tuần đem quan sát và đọc kết quả

2.4.11 Đánh giá khả năng đồng hóa các nguồn nito khác nhau

Môi trường được chuẩn bị như mục 2.3 Năm nguồn nito được sử dụng bao gồm:

Petri, lấy một lượng nhỏ tế bào (khoảng 1/8 vòng que cấy) hòa vào 600 µl nước cất

vô trùng Hút dịch tế bào mỗi chủng vào 6 đĩa Petri vô trùng (1 đĩa đối chứng âm không có nguồn nito, 5 đĩa tương ứng với 5 nguồn nito khác nhau) đã chuẩn bị sẵn, mỗi đĩa 100 µl Khi môi trường nguội đến khoảng 40°C, đổ ra đĩa Petri, trộn đều dịch

tế bào và môi trường, để đĩa khô trong box cấy, không tia UV Khi bề mặt đĩa đã hoàn toàn khô, cho vào mỗi đĩa vài tinh thể của 5 nguồn nitơ khác nhau và mỗi đĩa

Nuôi cấy ở 28°C trong 5 ngày, sau đó quan sát đọc kết quả Sự sinh trưởng xung quanh tinh thể nitơ được coi là phản ứng dương

2.4.12 Đánh giá khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường và nồng độ muối cao

Các chủng đem kiểm tra được nuôi cấy trẻ hóa trên môi trường Malt-Glucose

2 ml dung dịch yeast nitrogen base vô trùng đã chuẩn bị trước, lắc đều cho tế bào hòa đều vào trong dịch Dùng pipet Paster vô trùng hoặc sử dụng pipetman với đầu côn

vô trùng có màng lọc hút 30 µl dịch tế bào cho vào mỗi ống nghiệm môi trường có nồng độ đường khác nhau, nồng độ muối cao và 1 ống đối chứng Ống nghiệm để trong tủ nuôi cấy ở 28°C trong vòng 3 tuần Sau mỗi tuần đem quan sát và đọc kết quả

2.4.13 Đánh giá khả năng sinh trưởng trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau

Môi trường đã chuẩn bị như mục 2.3 Mỗi chủng cấy lên hai đĩa môi trường, mỗi đĩa cấy chấm 3 khuẩn lạc, sau đó được nuôi cấy trong 2 điều kiện nhiệt độ 30°C và 37°C trong 1 tuần Theo dõi sự sinh trưởng và ghi kết quả

2.4.14 Thử khả năng hình thành tinh bột

Các chủng được cấy chấm 3 khuẩn lạc trên mỗi đĩa môi trường đã chuẩn bị ở mục 2.3 Nuôi cấy nấm men trong vòng 1 tuần ở 28°C, sau đó nhỏ dung dịch lugol đã chuẩn bị vào môi trường xung quanh khuẩn lạc, nếu môi trường chuyển sang màu tím thì chứng tỏ có sự hình thành tinh bột

2.4.15 Thử khả năng phân giải urea

Tiến hành cấy chấm 3 khuẩn lạc lên đĩa môi trường đã chuẩn bị sẵn như mục 2.3 Nuôi cấy nấm men trong vòng 1 tuần ở 28°C Nếu môi trường xung quanh khuẩn lạc chuyển sang màu hồng đến đỏ thì chứng tỏ chủng đó có khả năng phân giải urea

2.4.16 Thử khả năng chống chịu với cycloheximit

Lấy 1/4 vòng que cấy tế bào cho vào mỗi ống nghiệm chứa 2 ml dung dịch yeast nitrogen base vô trùng đã chuẩn bị trước, lắc đều cho tế bào hòa đều vào trong dịch Dùng pipet Paster vô trùng hoặc sử dụng pipetman với đầu côn vô trùng có màng lọc hút 30 µl dịch tế bào cho vào mỗi ống nghiệm môi trường có nồng độ cycloheximide khác nhau và 1 ống đối chứng (chỉ có Yeast Nitrogen Base và D-Glucose) Ống nghiệm để trong tủ nuôi cấy ở 28°C trong vòng 3 tuần Sau mỗi tuần đem quan sát và đọc kết quả Chủng nào có khả năng chống chịu với cycloheximide sẽ phát triển

2.4.17 Thử khả năng chống chịu với 1% acetic acid

Cấy chấm khuẩn lạc đã được trẻ hóa trên môi trường Malt Glucose 2°Bx vào các đĩa môi trường đã chuẩn bị như mục 2.3 Các đĩa nuôi cấy được đặt trong tủ nuôi cấy

ở 28°C trong vòng 1 tuần, quan sát sự sinh trưởng của khuẩn lạc, nếu các chủng mọc lên thành khuẩn lạc thì chứng tỏ các chủng đó có khả năng chống chịu acetic acid 1

%

2.4.18 Phát hiện khả năng sinh sản hữu tính

Việc phát hiện ra khả năng sinh sản hữu tính của nấm men có ý nghĩa rất quan trọng nhất là trong tiến hóa và phân loại vi sinh vật, cho đến nay trên thế giới chưa

phát hiện được hiện tượng sinh sản hữu tính ở Moniliella Để nghiên cứu phát hiện

pha sinh sản hữu tính chúng tôi tiến hành thí nghiệm như sau, các chủng trong cùng 1 loài sau khi được xác định qua fingerpringting và trình tự rDNA sẽ được trẻ hóa trên môi trường Malt-Glucose 2°Bx, sau đó tế bào các chủng được trộn lẫn lần lượt với nhau trong nước cất, nhỏ các dịch vào các môi trường đĩa YM agar, Malt-Glucose 2°Bx agar, Yeast carbon base agar (môi trường không có nguồn nito), Water agar, nuôi cấy các chủng ở 15°C và 5°C trong vòng 1 tuần, quan sát sự phát triển nấm men hàng ngày, soi dưới kính hiển vi nhằm phát hiện pha sinh sản hữu tính của chúng

Bảng 2 Phương pháp trộn lẫn tế bào các chủng trong cùng 1 loài để phát hiện pha sinh sản

hữu tính

All Chủng 1 Chủng 2 Chủng 3 Chủng 4 Chủng 5 Chủng 1 x

Chương 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết quả phân lập

Như những nghiên cứu trước đây cho thấy Moniliella thường phân lập được từ

các sản phẩm do con người tạo ra, những nơi có nhiều dầu, mỡ hoặc những nơi có

nồng độ đường cao Với mục đích nghiên cứu sự đa dạng của chi Moniliella tại Việt

Nam, chúng tôi đã tiến hành thu thập nhiều loại mẫu khác nhau như bàn thái thịt, lọ

mỡ, nem chua, hoa, mật ong,… ở các địa điểm như Hà Nội, Lào Cai, Vĩnh Phúc, Hưng Yên, Hải Dương, Hòa Bình, Nam Định, Quảng Ninh, Thái Nguyên, Phú Thọ, Lâm Đồng, Bình Thuận, Phú Yên Môi trường dùng cho phân lập có thành phần như đã nêu, như vậy, ngoài các thành phần cơ bản là nguồn dinh dưỡng còn có axit lactic Axit lactic với nồng độ 1‰ tạo pH khoảng 4,5 trong môi trường sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn

Quá trình phân lập được tiến hành như mô tả trong phần phương pháp Sau khi nuôi cấy, các khuẩn lạc có màu sắc là các gam màu tối (xanh đen, đen ) hoặc từ màu vàng chuyển sang vàng xanh, vàng đen hay các khuẩn lạc có màu trắng, nhưng

bề mặt xốp, dễ gạt bằng que cấy được làm tiêu bản quan sát hình thái tế bào Những chủng có tế bào có cả dạng hình cầu và hình que kèm theo đứt gãy nhiều được giữ lại để làm sạch và bảo quản trong các ống nghiệm thạch nghiêng nút cao su để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo Sở dĩ vẫn giữ các khuẩn lạc có màu trắng là do các chủng nấm men đen khác nhau có thời gian chuyển màu khác nhau Kết quả từ

1653 mẫu, Moniliella được phát hiện ở 55 mẫu (khoảng 3% chứa Moniliella), 126 chủng nấm men đen Moniliella đã được phân lập Trên đĩa phân lập có thể chỉ có 1 khuẩn lạc Moniliella hoặc đại đa số các khuẩn lạc là Moniliella Kết quả được thể hiện trong bảng 3

Các chủng nấm men sau khi phân lập sẽ được phân nhóm bằng hình thái tế bào, phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting

Bảng 3 Danh sách 126 chủng nấm men đen Moniliella phân lập được

1

Thớt, bàn thái

thịt, lọ mỡ

Chợ Lớn – Xuân Hòa – Vình Phúc TBY 1521.1, TBY 1521.2, TBY 1488.2

Văn Thai- Cẩm Giàng – Hải Dương

TBY 509.3, TBY 505.2, TBY518.3, TBY 511.3, TBY 511.2 TBY 503.3, TBY 507.2, TBY 503.2

Lương Tài – Bắc Ninh TBY 635.2, TBY 636.1, TBY 621.2 TBY 629.1, TBY 628, TBY 621.1, TBY 1468, Phùng Khoang – Hà

Nội TBY 1235.1, TBY 1235.2

Hà Trung – Hạ Long – Quảng Ninh TBY 1599.1, TBY 1605.2

Mê Linh – Hà Nội TBY 1378.5, TBY 1378.1, TBY 1418.1, TBY 1418.4, TBY 1418.6, Nghĩa Lạc – Nghĩa

TBY 2044.4, TBY 2044.6, TBY 2056.2, TBY 2056.1 TBY 2091.2, TBY 2118.4, TBY 2085.7, TBY 2041.2 TBY 2041.5, TBY 2118.3, TBY 2041.4, TBY 2118.1 TBY 2041.1, TBY 2041.8, TBY 2041.7, TBY 2108.7 TBY 2042.1, TBY 2041.6, TBY 2045.5, TBY 2041.3 TBY 2108.10, TBY 2092.1, TBY 2060.1, TBY 2029.4 TBY 2092.3, TBY 2054.1

Tam Đảo – Vĩnh Phúc TBY 1885 Đông Anh - Hà Nội TBY 2127.3, TBY 2127.4, TBY 2125.1