Bài thuyết trình Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio

-Môi trường không có sự xuất hiện hay chuyển màu đen... Th nghi m sinh hóa: ử ệ Th nghi m Oxidase ử ệ Kết quả: + Xuất hiện màu xanh dương đậm do có sự hiện diện của cytochrom khử trong

Tiêu chu n hi n hành đ ki m nghi m ẩ ệ ể ể ệ Vibrio

• Phát tri n tốốt pH trên 9, dung d ch NaCl 3%ể ở ị

• Test Catalase (+), Oxidase (+), H2S (-), lên men Glucose khống sinh khí

• Là vi khu n gây b nh t , ch yêốu có trong các th c ph m t đ ng v t bi nẩ ệ ả ủ ở ự ẩ ừ ộ ậ ể

Gi ng ố Vibrio g m 4 loàithu c tác nhân gây b nh cho ng ồ ộ ệ ườ i

• Vibrio parahaemolyticus và Vibrio cholerae có kh nằng gây b nh đả ệ ường ru tộ

• Vibrio vulnificus có th vào c th thống qua vêốt thể ơ ể ương h ho c do b nh nhân ở ặ ệuốống nước bi n ch a vi khu n Tri u ch ng nhi m khu n thể ứ ẩ ệ ứ ễ ẩ ường x y ra là nốn, ảsốốt, tiêu ch y và h huyêốt áp.ả ạ

V cholerae V parahaemolyticus V vulnificus V alginolyticus

- Có th tằng tr ể ưở ng trong mối tr ườ ng ch a ứ

0-3% NaCl, khống phát tri n đ ể ượ c trong mối

- Phát tri n đ ể ượ c trong mối tr ườ ng

ch a đêốn 10% muốối ứ

2 Quy trình phân tích

2.1 Tăng sinh ch n l c ọ ọ

• Vibrio sinh trưởng bằằng cách tằng sinh trong mối trường pepton kiêằm ch a 1% ứmuốối NaCl cho trường h p ợ V cholera, V alginolyticus và V vulnificus; canh

Colistine cho trường h p ợ V parahaemolyticus.

• M u l ng: cho vào nẫ ỏ ước peptone kiêằm, 37ủ ở oC trong 18 – 24 gi ờ

• M u rằốn: cho vào túi PE vố trùng ch a nẫ ứ ước peptone kiêằm và đốằng nhâốt trong máy

d p m u rốằi 37ậ ẫ ủ ở oC trong 18 – 24 gi ờ

2.2 Phân l p ậ

• Ử trong mối trường TCBS 37ở 0C trong 18 – 22 gi ờ

• Câốy khu n l c đ c tr ng sang mối trẩ ạ ặ ư ường TSA hay th ch máu.ạ

• Ủ 370C đ lâốy sinh khốối cho b c tiêốp theo là th nghi m sinh hóa.ể ướ ử ệ

Khuẩn lạc V.Cholerae và V.Alginolyticus

Khuẩn lạc V.Parahaemolyticus và V.Vulnificus

2.3 Th nghi m sinh hóa ử ệ

K t lu n th nghi m sinh hóa c a ế ậ ử ệ ủ V cholera

-Th nghi m sinh hóa: ử ệ Quan sát tính di đ ng và hình thái c a vi khu n trên kính hi n vi ộ ủ ẩ ể

đ ườ ng th ng t đâằu đêốn cuốối vi tr ẳ ừ ườ ng.

o Lam kính 2: Nh 1 gi t huyêằn d ch phân lên lam kính, nh 1 gi t kháng huyêốt thanh t đa giá Nêốu là vi ỏ ọ ị ỏ ọ ả khu n t thì vi khu n s b bâốt ho t, khống di đ ng n a ẩ ả ẩ ẽ ị ạ ộ ữ

o Soi tiêu b n trên kính hi n vi nêằn đen, vi khu n t di đ ng nh sao đ i ngối ả ể ẩ ả ộ ư ổ

Th nghi m sinh hóa: ử ệ

Th nghi m kh năng lên men đ ử ệ ả ườ ng

• Môi tr ườ ng: Phenol red broth base pH 7.4

• Ch th pH ỉ ị : đ phenol ỏ , màu đ chuy n sang vàng khi pH dỏ ể ưới 6.8

• Ki m nghi m kh nằng lên men: ể ệ ả lactose, sucrose, mannose

• B sung đổ ường vào mối trường rốằi kh trùngử

• Sau đó câốy và 37ủ 0C trong 18 – 20 giờ

Th nghi m sinh hóa: ử ệ

Th nghi m kh năng lên men đ ử ệ ả ườ ng

•Đánh giá d a vào sinh acid (làm đ i màu ch th ) và sinh h i ự ổ ỉ ị ơ (CO2 t o thành đ c b y l i trong ốống Durham) ạ ượ ẫ ạ

•Kêốt qu : ả

• Ph n ng (+): mối tr ả ứ ườ ng chuy n vàng ể

• Ph n ng (-): mối tr ả ứ ườ ng có màu đ ỏ

Th nghi m sinh hóa: ử ệ

Th nghi m Decarboxylase ử ệ

• Enzyme carboxylase do VK t o ra lo i nhóm carboxyl c a acid amin t o amin hay ạ ạ ủ ạdiamin và CO2

• Môi tr ườ ng: Decarboxylase Basal Medium

• Ch th ỉ ị: Bromothymol purple pH 6.0, vùng chuy n màu pH 5.2 – 6.8 thay đ i t ể ổ ừvàng thành tím

• Ki m nghi m: ể ệ ADH, LDC.

• Hâốp kh trùng mối trử ường rốằi câốy

• B sung dâằu khoáng hay parafin rốằi 37ổ ủ 0C trong 1 đêốn 4 ngày

Th nghi m sinh hóa: ử ệ

Th nghi m Decarboxylase ử ệ

 Kêốt qu : ả

• Mối trường đ c, màu tím (COụ 2 sinh ra làm thay đ i pH, đ i màu ch ổ ổ ỉ

th ).ị

• Mối trường trong, màu vàng

MT tr ướ c khi c y ấ P dứ ương tính P âm tínhứ

Th nghi m sinh hóa: ử ệ

Th nghi m kh năng sinh Indol ử ệ ả

 Mối trường: Trypton

 Thuốốc th : Kovac’sử

 Cho thêm eter đ chiêốt Indolể

 Ủ 44.50C trong 24 giờ

 Kêốt qu :ả(+) Bêằ m t mối trặ ường màu đỏ

(-) Bêằ m t mối trặ ường có màu vàng c a thuốốc th (đối khi có màu cam do Skatol là tiêằn ủ ửchâốt Methyl hóa c a Indol t o ra).ủ ạ

Chủng VSV MT canh trypton

Thu c th Kovac’s ố ử

Pứ dương tính Pứ âm tính

37oC / 24h

Th nghi m sinh hóa: ử ệ

Th nghi m kh năng sinh H ử ệ ả 2S

Th nghi m sinh hóa: ử ệ

Th nghi m kh năng sinh H ử ệ ả 2S

• Enzym desulfohydrase do VK t ng h p s xúc tác s chuy n hóa acid amin ch a l u ổ ợ ẽ ự ể ứ ưhuỳnh (cystein, cystin, methionin) và phóng thích H2S

• Môi tr ườ ng:

Th ch nghiêng: KIA, TSIạ

Th ch đ ng: SIM, PIAạ ứ

Đĩa petri: BSA

• Câốy vào mối trường rốằi 37ủ 0C trong 24 – 48 gi ho c đêốn 7 ngày nêốu câằn.ờ ặ

Th nghi m sinh hóa: ử ệ

Th nghi m kh năng sinh H ử ệ ả 2S

Kết quả:

(+) Môi trường xuất hiện màu

đen do H2S tạo tủa đen với sulfide

trong môi trường

(-)Môi trường không có sự xuất

hiện hay chuyển màu đen

(+) ĐC

Th nghi m sinh hóa: ử ệ

Th nghi m ử ệ Oxidase

• Xác đ nh s hi n di n c a enzym oxidase VSV Enzym quan tr ng nhâốt c a h enzym này là ị ự ệ ệ ủ ở ọ ủ ệ cytochrome oxydase trong chu i truyêằn đi n t c a hố hâốp hiêốu khí ỗ ệ ử ủ

• Thuôếc thử: p – phenylenediamine.

• Câốy lên ốống th ch nghiêng rốằi 24 – 48 gi ạ ủ ờ

• Tiêốp t c tiêốn hành theo 1 trong 2 cách: ụ

Nhúng giâốy l c vào tetramethyl – p – phenylenediamine dihydrochloride 1%, dùng que câốy dàn ọ đêằu sinh khốối lên tâốm giâốy l c đó ọ

Nh lên sinh khốối vài gi t p – aminophenylenediamine oxalate 1% và α – napthol 1% trong ỏ ọ ethanol.

Th nghi m sinh hóa: ử ệ

Th nghi m Oxidase ử ệ

Kết quả:

(+) Xuất hiện màu xanh dương đậm do có sự

hiện diện của cytochrom khử trong tế bào làm thuốc thử oxy hóa thành indolphenol.

(-) Không xuất hiện màu xanh dương.

Th nghi m sinh hóa: ử ệ

Th nghi m sinh hóa: ử ệ

Th nghi m ONPG ử ệ

Kết quả:

(+) Xuất hiện màu vàng trong dịch cấy do quá trình thủy phân phóng thích o – nitrophenol có màu vàng.

(-) Không xuất hiện màu vàng.

Lactose agar

qua đêm ủ

37oC

Màu vàng

Th nghi m sinh hóa: ử ệ

Th nghi m kh năng oxi hóa – lên men (th nghi m Hugh – Leifson) ử ệ ả ử ệ

• Nhằằm xác đ nh VSV biêốn d ị ưỡ ng carbohydrate theo ph ươ ng th c oxi hóa hay lên men, quá ứ trình lên men t o mối tr ạ ườ ng có tính acid cao h n quá trình oxi hóa => làm đ i màu ch ơ ổ ỉ

Th nghi m sinh hóa: ử ệ

Th nghi m kh năng oxi hóa – lên men (th nghi m Hugh – Leifson) ử ệ ả ử ệ

Biến dưỡng theo phương thức lên

men Biến dưỡng theo phương thức oxi hóa

2 ống đều bị acid hóa đều trên mặt và

phần sâu của môi trường.

Ống kị khí bị acid hóa đều khắp

thạch sâu.

Ống hiếu khí không bị acid hóa trên mặt, chỉ bị acid hóa ở đáy ống.

Th nghi m sinh hóa: ử ệ

Th nghi m kh năng oxi hóa – lên men (th nghi m Hugh – Leifson) ử ệ ả ử ệ

A : đ i ch ng ố ứ

B : ph n ng Ôxi hóa ả ứ

C : ph n ng lên men ả ứ

Th nghi m kháng huy t thanh ử ệ ế

Nh 1 gi t kháng huyêốt thanh lên lam kính s ch và m t gi t nỏ ọ ạ ộ ọ ước muốối sinh lý lên

m t v trí khác c a lam Dùng que câốy vố trùng khác nhau chuy n vi khu n t TSA ộ ị ủ ể ẩ ừlên hai gi t dung d ch trên rốằi phân tán đêằu vi khu n Kêốt lu n dọ ị ẩ ậ ương tính khi có

hi n tệ ượng ng ng kêốt gi t có kháng huyêốt thanh và khống có hi n tư ở ọ ệ ượng ng ng ưkêốt gi t nở ọ ước muốối S d ng ch ng ch ng dử ụ ủ ứ ương và ch ng ch ng âm trong quá ủ ứtrình th c hi n.ự ệ

M t s ph ộ ố ươ ng pháp nhanh:

• Test kit: Thường được dùng đ sàng l c m t ph m vi l n, m t sốố s n ph m cũng ể ọ ở ộ ạ ớ ộ ả ẩ

đã được thương m i.ạ

• Phương pháp mi n d ch: nh EIA, ELISA cũng đễ ị ư ược phát tri n, tuy nhiên các b kit ể ộ

được thương m i hoá thì khống ph biêốn khiêốn phạ ổ ương pháp này khống được

th nh hành.ị

• Phương pháp sinh h c phân t : Ngày nay m t sốố phọ ử ộ ương pháp phân t đã đử ược phát tri n,đáng chú ý là k thu t PCR Hi n nay đã có b sinh ph m dùng xác đ nh ể ỹ ậ ệ ộ ẩ ị

c 3 loài: ả V cholerae, V parahaemolyticus và V vulnificus ch trong vòng 24h bằằng ỉ

k thu t real time PCR (Labelled DNA probes ) t m u th c ph m, h n n a còn có ỹ ậ ừ ẫ ự ẩ ơ ữ

th xác đ nh đ c tốố c a ể ị ộ ủ V.cholerae mà bằằng phương pháp phân tích t các ch ng ừ ủ

V.cholerae râốt khó khằn.

Quy trình phát hi n và đ nh danh ệ ị V cholera và V parahaemolyticus

S đôồ đ nh l ơ ị ượ ng V parahaemolyticus

Tên chỉ tiêu Mức

1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí, tính bằng số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm, không lớn hơn 1.000.000

2 Tổng số Coliforms, tính bằng số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm, không lớn hơn 200

3 Staphylococcus aureus, tính bằng số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm, không lớn hơn 100

4 E coli, tính bằng số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm Không cho phép

5 Salmonella, tính bằng số khuẩn lạc trong 25g sản phẩm Không cho phép

B ng 1 Ch tiêu vi sinh s n ph m thu s n đông l nh - cá basa philê ả ỉ ả ẩ ỷ ả ạ

B ng 2 Ch tiêu vi sinh s n ph m thu s n đông l nh – th t nghêu lu c ả ỉ ả ẩ ỷ ả ạ ị ộ

Hoặc E coli (trên môi trường đặc), tính bằng số khuẩn lạc trong1g sản phẩm m = 10, M = 100, n = 5, c = 1

3 Vi sinh vật gây bệnh, tính bằng số khuẩn lạc trong 25 g sản phẩm :

- Salmonell

Khôngcho phép, n = 5, c = 0

Tên chỉ tiêu Mức và yêu cầu

1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí, tính bằng số khuẩn lạc trong 1 g sản phẩm, không lớn hơn 100.000

2 Tổng số coliform, tính bằng số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm, không lớn hơn 100

3 Staphylococcus aureus, tính bằng số khuẩn lạc trong 1 g sản phẩm, không lớn hơn 100

4 Escherichia coli, tính bằng số khuẩn lạc trong 1 g sản phẩm Không cho phép

6 Vibrio cholera, tính bằng số khuẩn lạc trong 25 g sản phẩm Không cho phép

B ng 3 Ch tiêu vi sinh v t c a Surimi ả ỉ ậ ủ

Tài li u tham kh o: ệ ả

[1] Trâằn Linh Thướ Phc ươ ng pháp phân tích vi sinh v t trong n ậ ướ c, th c ự

ph m, m ph m ẩ ỹ ẩ NXB Giáo d c 2007.ụ