Kiểm nghiệm lương thực thực phẩm chuyên đề: tiêu chuẩn hiện hành trong kiểm nghiệm coliform và e coli

c/ Định lượng Coliforms phân:• Cấy ria dịch dịch mẫu từ ống + trên môi trường EC sang môi trường EMB ủ 37oC trong 24h.. - Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1ml cấy vào canh Tryptone, ủ ở

CHUYÊN ĐỀ

I Tổng quan về coliforms và E.coli

III Các tiêu chuẩn hiện hành

1 Đối với nước

2 Đối với thực phẩm

3 Một số tiêu chuẩn quốc tế

- Không sinh bào tử

- Hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi

- Sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 370C trong vòng 24 giờ

- Không sinh bào tử

- Chứa β-galactosidase

I TỔNG QUAN

- Các giống có nguồn gốc từ phân (như Escherichia) :

+ Phát triển nhanh, khoảng 16 giờ, trong 8 môi trường dinh dưỡng ở 440C

- Các giống không có nguồn gốc từ phân (như Citrobacter, Klebsiella,

Enterobacte ):

+ Chúng có nguồn gốc thuỷ sinh hay từ đất,

không có nguồn gốc từ phân.

1 Coliform

Coliforms tổng số

Coliforms chịu nhiệt

Coliforms phân

Vi khuẩn đường ruột

Yersinia Salmonella

Shigella

Vị trí của coliform trong họ Enterobacteriaceae (Vi khuẩn đường ruột)

 Coliforms chịu nhiệt:

- Là những coliforms có khả năng lên

men lactose sinh hơi trong khoảng

trường EC.

 Coliforms phân (E.coli giả định):

- Là coliforms chịu nhiệt có khả

năng sinh indole khi được ủ khoảng

Trypton.

Fecal Coliform

- Là một phân nhóm của nhóm coliforms phân

- Cho kết quả thử nghiệm IMViC là

++ Hình Vi Khuẩn E.coli

Các dòng E.coli có khả năng gây bệnh :

- EAEC (Enteroaggregative E coli), E coli kết tập ở ruột

- EHEC (Enterohemorrhagic E coli), E coli gây xuất huyết ở ruột.

- EPEC (Enteropathogenic E coli), E coli gây bệnh đường ruột

- ETEC (Enterotoxigenic E coli), E coli sinh độc tố ruột

- EIEC (Enteroinvasive E coli), E coli xâm lấn niêm mạc ruột

II CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG

1 Định tính

Nguyên tắc:

- E coli lên men sinh hơi đường glucose, manitol, lactose,

galactose nhưng không sinh hơi đường maltose, arabinose E coli

không lên men dextrin, glycogen, inositol, salisin, ít khi lên men inulin, pectin

- Trong môi trường BGBL, khuẩn lạc dẹt, có ánh kim

hủy đạm, hoàn nguyên Nitrate thành Nitrite

Qui trình định tính

E.coli

Qui trình định tính

E.coli

Ghi nhận ống có sinh hơi (+).

- Cấy dịch mẫu từ các ống LSB dương tính (+) sang các ống chứa canh

BGBL

- Ủ 37oC ± 1oC trong 48h

2.1 PHƯƠNG PHÁP MNP

Quy trình định lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân

Và E.coli bằng pp MPN

Ghi nhận số ống (+) có sinh hơi với mỗi độ pha loãng.

b/ Định lượng Coliforms chịu nhiệt:

• Dùng que cấy vòng, chuyển một vòng dịch từ ống LSB (+) sang môi trường EC

• Ủ trong 44.5 ± 0,2oC trong 24h

 Đếm các ống có sinh hơi (+), ở mỗi độ pha loãng

c/ Định lượng Coliforms phân:

• Cấy ria dịch dịch mẫu từ ống (+) trên môi trường EC sang môi trường EMB ủ

37oC trong 24h

 khuẩn lạc tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim tím là khuẩn lạc của Colifoms phân

(E coli giả định).

- Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1ml cấy vào canh Tryptone, ủ ở 44,5 ± 0,2oC, trong 24h.Nhỏ thuốc thử Kovac’s vào các ống nghiệm: ống có xuất hiện màu đỏ trong môi trường trong vài phút là ống (+).

- Thực hiện cho tất cả các ống (+) trên môi trường EC

Ghi nhận các ống (+) trên môi trường tryptone tương ứng với mỗi độ pha loãng

c/ Định lượng Coliforms phân:

d/ Định lượng E coli

• Thực hiện tương tự như trường hợp coliforms phân để tìm các khuẩn lạc E coli

giả định

• Chọn các khuẩn lạc có đường kính lớn hơn 1mm và cấy vào môi trường

MRVP, Simmon Citrate Agar để thực thử nghiệm IMViC

(-) (+)

•Khuẩn lạc E Coli giả định cho kết quả thử nghiệm IMViC tuần tự là (+ +

- -) chính là E coli.

Cách đọc kết quả:

Từ kết quả thu được ở các trường hợp trên, dùng bảng MPN thích hợp để tính

ra mật độ VSV trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/g hay MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng

-Thực hiện tương tự các ống (+) trong môi trường EC và tạo được được khuẩn lạc

E coli gỉa định trên môi trường EMB.

- Ghi nhận số ống nghiệm có E coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu.

Hệ thống MPN 15 ống

2.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc

- Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu

- Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu

- Cấy mẫu vào môi trường, ủ mẫu

- Đếm số khuẩn lạc hình thành

Định lượng Coliforms, Coliform phân bằng pp đếm khuẩn lạc:

Nguyên tắc:

Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường

thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose Đếm số khuẩn lạc lên men lactose &

sinh acid sau khi ủ ở 37±1oC trong 24-48h

Máy đếm khuẩn lạc

Chuẩn bị mẫu đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ pha loãng

Cấy vào ống canh BGBL, ủ ở

37 o C, 24-48h Cấy vào ống canh EC, ủ ở 44 o C, 24-48h

Đếm số ống canh(+) (sinh hơi)

Tính tỉ lệ khẳng định Coliforms

Chọn ống canh (+) (sinh hơi)

Mật độ Coliforms

Cấy vào ống canh Trypton, MR-VP, thạch SC Citrate Thử nghiệm Indol

Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỉ lệ khẳng định, tính mật độ của Coliforms và Coliform phân.

N

n1vf1+…+nivfi

A(CFU/g hay CFU/ml) = x R

N: tổng số khuẩn lạc đếm được

ni: số đĩa có số khuẩn lạc được tuyển chọn tại mỗi độ pha loãng

v: dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa

fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm

R: tỉ lệ khẳng định

Cách tính kết quả:

Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang

Các chất nhuộm phát huỳnh quang

- Acridin cam (AODC)

- 4’,6-dianidino-2-phenyl-indol (DAPI)

- Fluorescein isothiocyanate (FITC)

2.3 Phương pháp đếm khuẩn lạc trên màng lọc

Phễu lọc, giá đỡ màng lọc phải được vô trùng sau mỗi lần lọc

Mật độ VSV trong dịch lọc thích hợp: <150 khuẩn lạc/màng

Thể tích dịch lọc trong 1 lần: 50 -100ml

Nếu thể tích dịch lọc nhỏ hơn thì phải pha loãng bằng dd pha loãng hay nước cất vô trùng

Đĩa Petrifilm

E.coli/Coliform

• Nhanh chóng, chính xác Chỉ qua 3

bước đơn giản:

• 1- Cấy và trải đều 1 ml mẫu trên đĩa.

• 2- Ủ ở nhiệt độ thích hợp.

• 3- Đếm số khuẩn lạc sau 24h – 48h

E.coli = 49 (khuẩn lạc màu xanh có khí).

– Coliform tổng = 87 (khuẩn lạc xanh và đỏ có khí).

2.4 Phân tích nhanh bằng bộ Colilert

- Là bộ phân tích nhanh chỉ tiêu vi sinh mẫu nước của

hãng Idexx – Mỹ

- Định tính và định lượng cả hai chỉ tiêu Coliform và Ecoli

chỉ sau 24 giờ hoặc 18 giờ

Các bước đơn giản để phân tích định tích và định lượng Coliform và Ecoli bằng Colilert:

1- Pha thuốc thử vào 100mL mẫu

2- Đổ mẫu vào khay nhựa định lượng

3- Dán khay bằng máy dán và ủ mẫu ở thời gian

và nhiệt độ thích hợp

4- Định tính: Quan sát kết quả định tính dễ dàng bằng mắt thường: Giếng màu vàng dương tính với Coliform, soi đèn UV giếng phát huỳnh quang cho kết quả dương tính với Ecoli

5 Định lượng: Đếm số giếng trên khay có kết quả dương tính, đối chiếu với bảng MPN để định

lượng Ecoli và Coliform

III CÁC TIÊU CHUẨN HIÊN HÀNH

Theo TCVN 5942 – 1995 qui định hai mức sau:

•- Loại A dùng làm nguồn cấp nước sinh hoạt nhưng phải qua quá trình xử

lý, giới hạn tối đa số Coliforms cho phép là 5000 MPN/100ml

•- Loại B dùng cho các mục đích khác, giới hạn tối đa số Coliforms cho phép là 10 000 MPN/100ml

•Đối với nước ngầm, tiêu chuẩn chất lượng về vi sinh vật theo TCVN 5944 –

1995 được quy định là Coliforms không quá 3 MPN/100ml, không cho phép

có Coliform phân.

1 Đối với nước

Nước uống

+Coliforms (MPN/100ml)

0

+Coliforms phân (MPN/100ml)

0

+E coli (CFU/100ml)

0

Tiêu chuẩn nước cấp cho sinh hoạt ở các nước tiên tiến qui định:

• Trị số E.Coli không nhỏ hơn 100 mL, nghĩa là cho phép chỉ có 1 vi khuẩn E.Coli trong 100 mL

nước (chỉ số E.Coli tương ứng là 10) TCVN qui định chỉ số E.Coli của nước sinh hoạt phải nhỏ hơn 20.

• Trị số E.Coli là đơn vị thể tích nước có chứa 1 vi

E.Coli có trong 1 lít nước

• Số lượng E.Coli nhiều hay ít tùy thuộc mức độ nhiễm bẩn của

nguồn nước

• Đặc tính của khuẩn E.Coli là khả năng tồn tại cao hơn các loại

vi khuẩn, vi trùng gây bệnh khác nên nếu sau khi xử lý nước,

nếu trong nước không còn phát hiện thấy E.Coli thì điều đó

chứng tỏ các loại vi trùng gây bệnh khác đã bị tiêu diệt hết.

Lượng

E.coli

Chất lượng nước

Chỉ tiêu trong nước khoáng thiên nhiên đóng chai, nước uống đóng chai và nước đá dùng liền

Chỉ tiêu Lượng mẫu

Coliform tổng số 1x250 Nếu số vi khuẩn (bào tử) ≥1 và ≤2 thì tiến hành

kiểm tra lần thứ 2 Nếu số vi khuẩn (bào tử) >2 thì loại bỏ

Phomat whey ( sản xuất từ whey đã qua xử lý

Thịt và sản phẩm chế biến từ thịt sử dụng trực

Thịt và sản phẩm chế biến từ thịt phải qua xử

cơ thịt và nội dịch

Bảng 2.1: QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA ĐỐI VỚI Ô NHIỄM VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM

QCVN 8-3:2012/BYT

Sản phẩm Chỉ tiêu Kế hoạch lấy mẫu Giới hạn cho phép

(CFU/ml hoặc CFU/g)

Phân loại chỉ tiêu

Nhuyễn thể hai mảnh, động vật chân

bụng, động vật da gai, hải tiêu (tunicates)

Bảng 2.1: QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA ĐỐI VỚI Ô NHIỄM VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM

QCVN 8-3:2012/BYT

Nhóm thực phẩm Giới hạn cho phép (CFU/g hay CFU/ml thực phẩm)

loại giáp xác, nhuyễn thể luộc hấp.

-Thủy sản khô sơ chế: cá khô.

Nhóm thực phẩm Giới hạn cho phép (CFU/g hay CFU/ml thực phẩm)

Nhóm sữa

-Sữa khô, sữa bột

-Sữa tươi tiệt trùng theo phương

-Nước giải khát không cồn

-Nước khoáng đóng chai.

Nhóm thực phẩm Giới hạn cho phép (CFU/g hay CFU/ml thực phẩm)

Nhóm thức ăn khô và chứa dinh

dưỡng cho trẻ em, thức ăn thay thế

đặc biệt

-Phải xử lí trước khi sử dụng.

-Dùng trực tiếp, không qua xử lí nhiệt.

TIÊU CHUẨN TÊN MẶT HÀNG TVKHK COL ECO

TIÊU CHUẨN TÊN MẶT HÀNG TVKHK COL ECO

TCVN5649/92 Hàng khô (không ăn liền) 1.000.000 0

TCN 118:1998 Thịt nghêu luộc: n:5

m: 50.000 M: 500.000 c: 2

Bảng 2.3: TCVN và TCN (Bộ thủy sản) về vi sinh trên thủy sản

TCVN6175/9 Mực, cá khô tẩm gia vị 50.000 10 0

THỊ TRƯỜNG TÊN MẶT HÀNG TVKHK COL ECO

Châu Âu

Giáp xác và nhuyễn thể luộc

Hàng dạng nguyên liệu (raw material)

Hàng ăn liền (raedy to eat) Ruốc tôm bò (nguyên con) 10 4

Thuỷ sản thanh trùng Pasteur, bảo quản sơ 10 5 0

Thuỷ sản ngâm dầu, muối 10 5 0

Cá fillet ướp lạnh 10 5

Bảng 2.4: Một số tiêu chuẩn vi sinh trên thủy hải sản ở thị trường Châu Âu

3.Một số tiêu chuẩn Quốc tế

THỊ TRƯỜNG TÊN MẶT HÀNG TVKHK COL ECO

Châu Âu

Cá fillet đông lạnh 1-5 x 10 4

Cá xông khói 5 x 10 5 0 1 Nhuyễn thể 2 mảnh sống

Giáp xác luộc nguyên con ướp lạnh 10 5

Giáp xác / tôm luộc nguyên con ướp lạnh 10 3 0

Tôm luộc nguyên con ướp lạnh 10 5

Điệp, sò 10 6

Bảng 2.4: Một số tiêu chuẩn vi sinh trên thủy hải sản ở thị

trường Châu Âu

THỊ TRƯỜNG TÊN MẶT HÀNG TVKHK COL ECO

Bảng 2.4: Một số tiêu chuẩn vi sinh trên thủy hải sản ở thị

trường Châu Âu

THỊ TRƯỜNG TÊN MẶT HÀNG TVKHK COL ECO

Bảng 2.4: Một số tiêu chuẩn vi sinh trên thủy hải sản ở thị

trường Châu Âu

THỊ TRƯỜNG TÊN MẶT HÀNG TVKHK COL ECO

THỊ TRƯỜNG TÊN MẶT HÀNG TVKHK COL ECO

Châu Á

Cá khô tẩm gia vị, mực 5 x 10 4 0 0

Giáp xác luộc 10 4 9 Giáp xác đông lạnh 10 6 11 Tôm vỏ đông lạnh 10 6 200 0 Tôm thịt đông lạnh 10 6 200 0 Tôm thịt IQF 10 6 200 0 Mực đông lạnh 10 6 200 0 Hàng khô ( không ăn liền) 10 6 0

Bảng 2.6: Một số tiêu chuẩn vi sinh trên thủy hải sản ở thị

trường Châu Á

Mực nang fillet ăn liền

Sashimi 5 x 104 10 0Nhuyễn thể 2 mảnh 10 6 200 0

Nước và thực phẩm nuôi sống con người nhưng cũng có thể gây ngộ độc hoặc nhiễm bệnh cho con người do có thể chứa các độc tố vi sinh vật hoặc các vi sinh vật gây bệnh.

Mặc dù có thể gây ngộ độc, số lượng tế bào vi sinh hiện diện hoặc độc tố của chúng tiết ra trong thực phẩm khi được sử dụng phải đủ lớn

Tuy mật độ vi sinh vật ban đầu trong nước , trong nguyên liệu, trong thực phẩm có thể rất thấp nhưng ở những điều kiện nhất định thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo độc tố của vi sinh vật trong quá trình chế biến hoặc bảo quản thực phẩm, mật độ vi sinh vật được nhân lên nhanh đến mức đủ để gây bệnh hay sản xuất đủ lượng độc tố gây hại

Do vậy mật độ cho phép của vi sinh vật gây bệnh trong nước, thực phẩm là rất thấp, trong đa

số các trường hợp là bằng không

Trần Linh Thước (2012), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm, NXB

http://qcvn.gov.vn/news/vi/133/182/a/trung-tam-chung-nhan-phu-hop-quacert-trien-khai-chuong-hanh.aspx