công nghệ khử nghiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao bằng một số chủng vi khuẩn và vi nấm

việc nghiên cứu công nghệ khử nhiễm aflatoxin trên ngô lạc

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề.

Ngô, lạc là hai loại nông sản chính của ngành nông nghiệp nước ta Chúng không chỉ là nguồn lương thực quan trọng cho đời sống con ngưòi mà còn là nguồn thức ăn quan trọng trong chăn nuôi gia súc gia cầm Không những thế lạc còn đựơc xuất khẩu với số lượng lớn ra nước ngoài Vì vậy việc nghiên cứu để bảo quản, nâng cao chất lượng nông sản đã thu hút các tổ chức quốc tế cũng như các cơ quan khoa học về lương thực thực phẩm của thế giới

Điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm của nước ta rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển Các nông sản dạng hạt như ngô, lạc là nguồn cơ chất lý tưởng cho sự phát triển của nấm mốc Nấm mốc phát triển không những làm giảm giá trị dinh dưỡng của hạt mà còn sinh ra các độc tố khác nhau gọi chung

là mycotoxin Trong những độc tố nguy hiểm phải kể đến aflatoxin aflatoxin

là độc tố của nấm Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus nominus Ngô, lạc là hai sản phẩm thường nhiễm aflatoxin ở mức độ cao.

Trên thế giới hiện nay việc nghiên cứu để tìm ra biện pháp làm giảm lượng độc tố aflatoxin trong lương thực nói chung và trong ngô, lạc nói riêng đã và đang được các nhà khoa học rất quan tâm

Ở nước ta từ những năm 1970 Nguyễn Phùng Tiến và cộng sự [8]

đã nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc trên thóc ở kho bảo quản lương thực miền Bắc Việt Nam và một số lương thực như đậu, đỗ, lạc…Đặng Hồng Miên [2] cũng đã nghiên cứu sự nhiễm nấm mốc aflatoxin trên lạc

Nguyễn Thùy Châu và cộng sự - 1997 [11] đã nghiên cứu tình hình nhiễm độc tố nấm mốc: aflatoxin, fumonixin, ochratoxin Alternaria, deoxynivalenol và nivalenol… trên ngô, gạo, và các biện pháp phòng trừ

Một số công trình của Đậu Ngọc Hào về sự nhiễm nấm mốc và aflatoxin trên thức ăn gia súc và các biện pháp khử độc tố aflatoxin B1 bằng

NH4OH cũng đã được nghiên cứu và công bố [3]

Nguyễn Thùy Châu và cộng sự cũng đã nghiên cứu khử aflatoxin trên ngô bằng NH3 và Ca(OH)2, kết quả cho thấy NH3 và Ca(OH)2 có tác dụng khử rõ rệt aflatoxin trên ngô và cho hiệu quả khử là 90%

Tuy nhiên việc khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa chất như NH3 có giá thành cao và để lại mùi khó chịu cho nông sản bị xử lý Để khắc phục nhược điểm này các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu khử nhiễm aflatoxin bằng biện pháp sinh học

Góp phần vào việc nghiên cứu công nghệ khử nhiễm aflatoxin trên ngô lạc chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“ Nghiên cứu công nghệ khử nghiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao bằng một số chủng vi khuẩn và vi nấm”.

1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu.

1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu

- Tìm được công nghệ khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc bằng một

số chủng vi khuẩn và vi nấm

1.2.2 Nội dung nghiên cứu.

- Nghiên cứu khả năng khử nhiễm aflatoxin của một số chủng

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.Đại cương về độc tố nấm mốc

Độc tố nấm mốc (hay còn gọi là mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi chất thứ cấp của các nấm mốc và gây ngộ độc với động vật có vú, cá và gia cầm [15] Sự sinh trưởng và phát triển của nó phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện sinh thái (Moreau 1975) [6] Những điều kiện đó là vùng sinh thái, khí hậu (nhiệt độ,

độ ẩm), lượng nước có trong cơ chất…Sự sản sinh độc tố nấm mốc là kết quả của sự tác động qua lại giữa kiểu gen (genotype) và điều kiện phát triển của chúng Độc tố nấm là sản phẩm thứ cấp tiết ra trong quá trình chuyển hóa của một số loài nấm mốc Quá trình trao đổi chất của nấm gồm 2 giai đoạn: trao đổi chất sơ cấp và trao đổi chất thứ cấp

Trao đổi chất sơ cấp được hiểu là các phản ứng tạo thành các chất cần thiết đảm bảo sự sống và sự phát triển của tế bào Trao đổi chất thứ cấp là quá trình tạo thành các chất mà vai trò sinh lý của chúng chưa thật cần thiết cho sự tồn tại của chính tế bào đó Quá trình trao đổi chất sơ cấp của tế bào nhìn chung là giống nhau ở hệ thống sống, nhưng quá trình trao đổi chất thứ cấp thì phụ thuộc khá chặt chẽ vào đặc tính của mỗi loài mỗi chủng nấm mốc.Thông thường quá trình này xảy ra vào cuối giai đoạn phát triển của tế bào nấm mốc Bệnh độc tố nấm mốc được bắt đầu nghiên cứu sâu từ khi mà cả thế giới bị thức tỉnh bằng việc phát hiện bệnh X ở gà tây của nước Anh vào năm 1960 Bệnh X đã làm chết hàng vạn con gà tây do ăn lạc bị nhiễm loài nấm mốc rất

phổ biến là A flavus.

Hầu như tất cả các sản phẩm thực vật đều có thể là cơ chất cho sự phát triển của nấm mốc và sự tạo mycotoxin tiếp theo, do đó nó có Khả năng nhiễm trực tiếp vào thực phẩm của con người Khi gia súc ăn các thức ăn có

mycotoxin chúng không chỉ chịu tác dụng độc trực tiếp mà còn là nguồn mang mycotoxin vào sữa, thịt và như vậy tạo sự nhiễm mycotoxin vào con người Những độc tính của mycotoxin đối với động vật thực nghiệm đã được chứng minh là rất lớn

Các mycotoxin đã thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học ở nhiều lĩnh vực khác nhau.Nó đã được chứng tỏ bằng nhiều hội nghị quốc tế và hội thảo, tạp chí và các bài báo nghiên cứu dành cho vấn đề có tính cấp thiết này [22]

Cho đến nay có trên 300 loại độc tố nấm đã được phát hiện và nghiên cứu Nhưng chỉ có 20 loại mycotoxin có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và thường liên quan đến an toàn thực phẩm, chúng được tạo bởi 5 chi

nấm Claviceps, Penillium, Apergilus, Fusarium, Alternaria.

Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), sterimatocystin, acid cyclopianzoic

Các độc tố của Penillium: Patulin, ochratoxin A, citrinin, penitremA, và

acid cyclopianzoic toxin, diacetocyscirpenol, fumonsin, và moniliformin

Các độc tố của nấm Fusarium: Deoxynivalenol, nivalenol, zearelenon,

Trong số các mycotoxin thì aflatoxin là độc tố được phát hiện sớm nhất

và được nghiên cứu đầy đủ nhất về mọi phương diện

2.2.1.Tích chất hóa lý

Các aflatoxin gồm bốn hợp chất của nhóm bis-furanocoumarin, là sản

phẩm trao đổi chất tạo bởi nấm A flavus và A parasiticus được đặt tên là B1,

B2, G1, G2 .Các aflatoxin nhiễm trên các sản phẩm thực vật

Các công thức cấu tạo của một số aflatoxin và các chất trao đổi liên quan đến aflatoxin B1,G1 và aflatoxin B2, G2, là dẫn xuất hydro của các hợp chất mẹ Các aflatoxin M1,M2 là các chất trao đổi hydroxilat hóa của B1 và B2

theo thứ tự Chúng có công thức cấu tạo như sau:

O

xanh lá cây) Aflatoxin B1 và B2 trong sữa bò được chuyển hóa và gọi là aflatoxin M1 và aflatoxin M2 (M là chữ viết tắt của Milk) Trong bốn loại aflatoxin, aflatoxin M1 được tìm thấy ở nồng độ cao nhất, sau đó là G1 còn B2

và G 2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn

Các aflatoxin phát quang mạnh khi dưới ánh sáng cực tím sóng dài Điều này cho phép phát hiện các hợp chất này ở nồng độ cực thấp (0.5ng hay thấp hơn trên một vét sắc kí bản mỏng) Nó cung cấp điểm cơ bản về mặt thực hành cho tất cả phương pháp hóa lý cho việc phát hiện và định lượng Aflatoxin M1 ở nồng độ 0.02mg/l có thể phát hiện được trong sữa lỏng

Các aflatoxin được hòa tan trong các dung môi phân cực nhẹ như chloroform và metanol đăc biệt tan nhiều trong dimethysunfoxit (dung môi thường được sử dụng như phương tiện trong việc áp dụng các aflatoxin vào các động vật thực nghiệm) Tính tan của aflatoxin trong nước dao động từ 10-20mg/l

Vì là chất tinh khiết nên các aflatoxin rất bền ở nhiệt độ cao, khi được làm nóng trong không khí Tuy nhiên nó tương đối không bền khi được để trong không khí dưới tia cực tím ở phiến sắc kí bản mỏng và đặc biệt khi hòa tan ở các dung môi có độ phân cực cao Các aflatoxin ít hoặc không bị phá hủy dưới điều kiện nấu bình thường và làm nóng khi thanh trùng Tuy nhiên, lạc rang đã giảm đặc biệt lượng aflatoxin và nó có thể bị phá hủy hoàn toàn bằng amoniac hay hypochlorit

Sự có mặt của vòng lacton ở phân tử aflatoxin làm chúng nhạy cảm với việc thủy phân trong môi trường kiềm, đặc tính này là quan trọng trong bất kỳ quá trình chế biến thực phẩm, vì quá trình xử lý kiềm làm giảm sự nhiễm của aflatoxin trong sản phẩm, mặc dầu sự có mặt của pH, protein trong sản phẩm

và thời gian xử lý có thể thay đổi kết quả Tuy nhiên nếu xử lý kiềm là nhẹ thì việc axit hóa sẽ làm phản ứng ngược trở lại để tạo aflatoxin ban đầu

Moreau và cộng sự [6] khi nghiên cứu tích chất của aflatoxin đã đưa ra những kết quả sau:

Bảng 2.1.Tích chất hóa lý của một số Aflatoxin

AflatoxinCông thức phân tửTrọng lượng phân tửNhiệt độ nóng chảyHuỳnh quang

C17H14O6

314286-289305-309280-283Xanh lam

G1

C17H12O7

328244-246247-250246-247Xanh lục

G2

C17H14O7

330229-231237-240

Xanh lục

M1

C17H12O7

Xanh lam tím

M2

C17H14O7

320293

Tím

Ghi chú: *: kết quả của Townsend

* *: kết quả của Stubblefield

* * *: kết quả của Beljaas

phân lập được có khả năng tạo aflatoxin với tỷ lệ cao (từ 20-98%)

Bảng 2.2 Các chủng tạo aflatoxin của A flavus phân lập từ bốn loại hạt cốc

Số chủng phân lậpPhần trăm chủng phân lập tạo aflatoxin (%)

Sản lượng tạo aflatoxin (µ/kg)

Lạc100983300

Hạt bông59813200

Gạo127201100

Lúa63243300

(Số liệu Schroder và Boller 1976)

Sản lượng aflatoxin thường tỷ lệ với trọng lượng hệ sợi nấm tạo thành khi nuôi cấy: khi số lượng hệ sợi nấm đạt giá trị tối ưu thì sản lượng aflatoxin lớn nhất Độc tố này sẽ giảm sút nhanh chóng khi hệ sợi nấm phân giải Sự sản sinh aflatoxin trong điều kiện nuôi cấy thông thường bắt đầu từ lúc hình

thành các cơ quan mang bào tử đính của A flavus, nó tăng dần cho đến giai

đoạn sinh bào tử mạnh mẽ [6]

2.2.3 Điều kiện sinh độc tố

Các nhiệt độ cực tiểu, tối thích và cực đại cho sự tạo aflatoxin là 12oC,

27oC và 40-42oC theo thứ tự Northolt đã nhiên cứu tác dụng của hoạt tính

nước và nhiệt độ lên sự phát triển và sự tạo aflatoxin của A parasiticus và đi

đến kết luận rằng: aflatoxin được tạo ra ở hoạt độ nhỏ hơn 0.83 và nhiệt độ dưới 10oC là rất ít và không phát hiện được [22] Tóm lại, khả năng sinh độc

tố phụ thuộc vào nhiều yếu tố, đó là chủng nấm mốc, nhiệt độ và yếu tố môi trường

Lượng aflatoxin sản sinh ra cũng thay đổi phụ thuộc vào các yếu tố này Một số chủng sinh aflatoxin có thể bị mất khả năng này sau nhiều lần cấy truyền liên tiếp trên môi trường tổng hợp nhưng cũng có thể làm tăng tính độc của chúng nếu cấy truyền trên các môi trường thích hợp Khi hệ sợi nấm càng phát nhiều thì khả năng sinh độc tố càng mạnh và ngược lại Môi trường có bổ sung nấm men hoặc pepton hoặc các acid amin cùng với điều kiện pH, nhiệt

độ thích hợp (pH=5-5.4, nhiệt độ 26-28oC) là điều kiện tốt nhất cho sự tạo thành độc tố aflatoxin

Hàm ẩm của cơ chất cũng là yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm mốc và sự tạo mycotoxin cho thấy rằng hàm ẩm 18.3% trên cơ sở trọng

lượng ẩm là giới hạn dưới đối với sự phát triển của A flavus ở ngô bóc vỏ

Các nghiên cứu sâu hơn trong điều kiện khống chế chính xác cho thấy hàm ẩm

cân bằng với độ ẩm tương đối 85% là giới hạn dưới của sự phát triển A flavus

ở tinh bột

Ngoài ra các vitamin nhóm B cũng kích thích sự tạo thành các aflatoxin

Người ta đã xác định được rằng khi A flavus phát triển trên hạt lúa mì thì hàm

lượng aflatoxin tạo ra ở giai đoạn phôi mầm nhiều hơn hẳn giai đoạn phôi nhũ Việc thêm nước chiết từ lúa mì, lipit hay các acid béo sẽ kích thích tốt sự tạo thành aflatoxin Điều này khiến người ta nghĩ rằng các chất này có vai trò

quan trọng trong việc sinh tổng hợp aflatoxin vì sự phân hủy của chúng tạo thành các chất tiền sản phẩm tham gia vào vòng chuyển hóa sinh tổng hợp aflatoxin.

2.2.4 Sự nhiễm aflatoxin trên lương thực thực phẩm.

Các hạt lạc có thể bị nhiễm A flavus trước khi thu hoạch nhưng bị

nhiễm nhanh hơn sau khi cây lạc được nhổ lên và làm khô sơ bộ trước khi củ lạc được lấy ra khỏi cây.Thời gian sau thu hoạch này là thời gian nhiễm độc cao đối với sự tạo thành aflatoxin Các côn trùng gây thương tổn cho hạt cũng

là yếu tố đối với sự nhiễm A flavus

2.2.4.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Sự gây thương tổn do côn trùng do ngô ở ngoài đồng cũng có thể đi

kèm hoặc tiếp theo sự nhiễm A flavus và sự tạo aflatoxin trước thu hoạch

Theo ước tính của tổ chức Nông lương quốc tế (FAO) thì có khoảng 25% nông sản của thế giới chịu ảnh hưởng nghiêm trọng bởi mycotoxin, chủ yếu là aflatoxin Aflatoxin đã làm thiệt hại cho ngành trồng trọt và chăn nuôi rất lớn [22]

Mặc dù aflatoxin được tìm thấy trong nhiều loại lương thực, thực phẩm khác nhau nhưng hầu hết sự nhiễm tập trung ở lạc, các hạt có dầu khác như bông, ngô, và các sản phẩm được chế biến từ chúng Hạt dẻ Braxin là thường nhiễm nhất Bên cạnh đó, lúa mạch ở Ấn Độ cũng bị nhiễm aflatoxin

Những nghiên cứu của Ablas K và cộng sự (2004) cho thấy sự nhiễm

aflatoxin trên ngô do nấm A flavus gây nên là một vấn đề nghiêm trọng ở các

vùng trồng ngô của đồng bằng Missisipi của Mỹ Trong 3 năm nghiên cứu từ

2000 đến 2002, các tác giả đã nghiên cứu mức nhiễm A flavus trong đất và đã xác định rằng mức nhiễm A flavus trong đất trồng ngô bị ảnh hưởng bởi các

vụ canh tác trước Mật độ A flavus cao nhất là 794 CFU/g, trong đất trồng ngô

vụ 2001 so với 251 CFU/g trong đất trồng bông gối vụ năm 2000 và 457

CFU/g đất trồng lúa mì gối vụ năm 2002 Sự nhiễm A flavus trên ngô hạt năm

2000 dao động từ 0% đến 100% (trung bình là 15% hạt ngô bị nhiễm), hàm lượng aflatoxin trong ngô dao động từ 0 đến 1590 ppb (trung bình là 57ppb)

Ở Thái Lan 35% mẫu ngô nhiễm aflatoxin B1 với hàm lượng trung bình

400 microgam/kg Ở Uganda tỷ lệ này là 40% hàm lượng trung bình là 133 microgam/kg và đặc biệt ở đảo Sebu (Philippin) tỷ lệ nhiễm tới 79%, hàm lượng phát hiện được là 231 microgam/kg Hàm lượng các mẫu ngô ở các gia đình đã liên quan đến sự bùng nổ của bệnh gan, độc tố gây cấp tính của Tây bắc Ấn Độ [22]

Theo kết quả nghiên cứu của Goto và cộng sự [16] trong mùa mưa năm

1984, 1985 ở Thái Lan 85% số mẫu ngô thu thập được từ các kho bảo quản đã nhiễm aflatoxin B1 với hàm lượng 6.3-1310 ppb và 0.6-767 ppb theo thứ tự.2.2.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, Nguyễn Phùng Tiến và cộng sự [8] đã nghiên cứu mức độ nhiễm mốc trên ngô, kết quả là 38 mẫu bảo quản trong kho lương thực của

thành phố Thanh Hóa đã nhiễm nấm mốc thuộc các chi sau: Aspergillus, Cladosporium, Penillium, Sporotrichuro, Saccharomyces, Trichoderma, Geotrichum Tuy nhiên chưa có số liệu về mức nhiễm mycotoxin trong công

trình này

Đậu Ngọc Hào và các cộng sự [5] đã nghiên cứu mức nhiễm mốc và aflatoxin trên ngô của các tỉnh Sơn La và Thanh Hóa Kết quả phân tích của

24 mẫu ngô hạt và 24 mẫu ngô bột cho thấy các mẫu này đã nhiễm nhiễm

A.flavus với tỷ lệ từ 50-80% Các loài như A glaucus, A candidus cũng nhiễm với tỷ lệ khá cao Loài A ochraceus đã phát hiện thấy ở tỷ lệ thấp Các loài của chi Fusarium đã nhiễm với tỷ lệ 15% Kết quả nghiên cứu mức nhiễm

aflatoxin ở các mẫu ngô trên đã cho thấy là 33% mẫu ngô hạt đã nhiễm aflatoxin B1 từ 10- 40 ppb, 8.3% số mẫu nhiễm aflatoxin B2 từ 10 - 20 ppb, 72% số mẫu ngô bột đã nhiễm aflatoxin B1 từ 25 – 250 ppb, 9.5% số mẫu nhiễm aflatoxin B2 từ 10-20 ppb

Nguyễn Thùy Châu và cộng sự đã nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc

và aflatoxin trên nông sản của Việt Nam Mức độ nhiễm aflatoxin trên ngô và gạo ở một số địa phương cho thấy tần xuất nhiễm aflatoxin trên ngô ở miền Nam và miền Bắc Việt Nam là cao từ 73,3% - 95,8% trong đó hàm lượng aflatoxin trung bình cao nhất là 63,8ppb và hàm lượng aflatoxin trung bình thấp nhất là 16,25ppb đối với các tỉnh khác nhau

Nguyễn Thùy Châu và cộng sự đã nghiên cứu công nghệ khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc bằng một số hóa chất như NH3, foocmanđehit, Ca(OH)2

kết quả cho thấy rằng NH3 và Ca(OH)2 có tác dụng khử rõ rệt aflatoxin B1 trên ngô và cho hiệu quả đạt 90%

2.2.5 Độc tính của Aflatoxin

Tác động lên tế bào: khả năng gây ung thư của các aflatoxin đã được Wogan nghiên cứu [24] và được IARC đánh giá lại [25] Ở mức độ tế bào việc cho uống aflatoxin với liều lượng khác nhau đã nhanh chóng ức chế enzym ADN polymeraza và ARN polymeraza ở gan, hiện tượng này được quan sát thấy ở cả tế bào người và tế bào động vật Quá trình sinh tổng hợp protein cũng bị hỏng, đặc biệt khi quá trình này chịu ảnh hưởng mạnh của quá trình sinh tổng hợp ARN thông tin Dường như sự ức chế polymeraza là hậu quả gián tiếp của hoạt tính mẫu bị hỏng của nhiễm sắc thể, do tương tác nhiễm sắc thể - toxin Sự tương tác giữa aflatoxin hay một số các dẫn xuất của nó với ARN với thành phần khác của nhiễm sắc thể là sự nhận xét như sự việc ban đầu ở hàng loạt các quan sát của các phản ứng

Bằng chứng khác do sự tác động của các aflatoxin lên lưới nội chất và

do đó làm thay đổi sự gắn polysome vào thành tế bào chất Krustev và các cộng sự đã nghiên cứu các biến đổi về mặt siêu cấu trúc và hình thái bệnh học của mô gan của chuột đực liên quan đến tác dụng của liều đơn độc aflatoxin

B1 [16]

Với liều nhiễm 6µ aflatoxin B1/100 g trọng lượng cơ thể chuôt đực, những biến đổi về mặt hình thái của tế bào gan được đặc trưng bởi sự phân ly của các thành phần hạt và sợi của nhân, sự vón nhiễm sắc thể ở ngoại biên của nhân, một vài sự biến dạng của màng nhân, làm giảm khoảng không xung quanh nhân và các giọt mỡ nhỉ ở một và nhân Lưới nội chất xung quanh nhân

ít được nhìn thấy và mất sự tạo hạt của các ribosome của chúng Từ các bộ phận khác, đặc biệt lý thú là các ribosome, rất nhiều không chỉ ở tế bào gan

mà còn ở các tế bào Kupfer Hoạt tính photphotaza acid cũng giảm rõ rệt [16]

Tác động ở người: nhiều nghiên cứu về các vùng dân cư khác nhau trên thế giới cho thấy rằng các nồng độ aflatoxin thực tế ở thức ăn có liên quan đến tai biến ung thư gan ở vùng đó

Bảng 2.3 Tỷ lệ dân số bị ung thư gan và hàm lượng aflatoxin trung bình

có trên thực phẩm (Số liệu của Alain Reilly, 1993).

Tên nước hoặc vùngHàm lượng aflatoxin trong thực phẩm(µ/kg)

Tỷ lệ người mắc ung thư gan trên 105người/năm

Vùng cao Kenya

0,11,2

Songkha (Thái Lan)

0,22,0

Thảo nguyên vùng cao (Thụy sỹ)

0,22,2Vùng cao trung bình Kenya

Thảo nguyên trung bình (Thụy Sỹ)

0,33,8

Vùng thấp Kenya

0,34,0

Ratbải (Thái Lan)

1,64,0

Thảo nguyên vùng thấp (Thụy Sỹ)

1,59,2

Môzămbic

7,813,0

Ba trẻ em ở Đài Loan và một trẻ em ở Uganđa đã bị hoại tử gan cấp tính liên quan đến việc ăn phải gạo và sắn nhiễm aflatoxin ở liều 200 microgam/kg

và 1700 microgam/kg là bằng chứng thuyết phục nhất về mối liên quan giữa aflatoxin với bệnh gan cấp tính Ở vùng Tây bắc Ấn Độ năm 1974, trong một dịch vụ vài trăm dân làng ăn ngô bị nhiễm aflatoxin ở mức 15μ/kg có dấu hiệu ngộ độc và trên 100 người đã bị chết

Các aflatoxin tác động lên gan theo trình tự như sau: đầu tiên là hoại tử

mô gan, tăng sinh biểu mô, sau đó là xâm nhiễm tế bào lympho để nhằm chống đỡ tạm thời rồi đến sơ gan, nếu thời gian kéo dài sẽ dẫn đến ung thư

gan Nhưng bản chất aflatoxin không gây ung thư mà do nó gắn vào một enzym dẫn đến ung thư, khả năng này phụ thuộc vào sự tồn tại của nhân dihydrofuran và phần 5 lacton chứa nó, do đó nó đổi phần tận cùng difuran quan trọng trong tính độc và tính gây độc.

2.2.6 Giới hạn Aflatoxin cho phép

Nhiều nước đã quy định giới hạn aflatoxin bị nhiễm trong lương thực, thực phẩm ở mức 5-20 microgam/kg Tổ chức tiêu chuẩn hóa thực phẩm thế giới (Codex) quy định là 10 microgam/kg Tại Việt Nam Bộ Nông Nghiệp và phát triển nông thôn cũng đã đưa ra quy định về hàm lượng tối đa aflatoxin B1

và hàm lượng tổng số các aflatoxin (B1 +B2 +G1+G2) được tính bằng mg trong

1 kg thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gia cầm gia súc (ppb) [22]

Bảng 2.4 Quy định về độc tố aflatoxin B 1 và aflatoxin tổng số của Việt Nam

Loại vật nuôiAflatoxin B1(ppb)Tổng số các aflatoxin (ppb)

Gà con từ 1-28 ngày tuổi

Heo con theo mẹ 1-20 ngày tu

Bảng 2.5 Những quy định mức cho phép aflatoxin trong thức ăn ở Mỹ

(FAO,1995)

Loại thực liệu Loại aflatoxin Mức cho phép (ppb)

Mọi thức ăn (người) trừ sữa

và phòng ngừa Tuy nhiên sự nhiễm aflatoxin đôi khi là không thể tránh được,

và nếu phòng ngừa thất bại thì phải xem tới các biện pháp khác Các kỹ thuật dùng để khử aflatoxin trong các mặt hàng khác nhau bao gồm phòng trừ bằng phương pháp vật lý, hóa học và sinh học

2.3.1 Vấn đề phòng ngừa

Vấn đề phòng ngừa sự nhiễm Aspergillus sản sinh aflatoxin có thể đưa

ra những biện pháp kiềm chế có lợi và hiệu quả nhất Nó có thể làm giảm phần lớn những tổn thất lương thực do nấm mốc gây hại Sau đây là một số biện pháp phòng chống nấm mốc cho lương thực trong quá trình bảo quản:

- Làm khô bằng nhiệt: Làm khô tự nhiên ( phơi dưới ánh nắng mặt trời) Sấy khô ( hàn, điện) làm cho các cơ chất đạt lượng nước cho phép Ví dụ ngô cần làm khô tới ≤ 13% trước khi bảo quản Phần lớn các loại nấm mốc phát triển tốt ở hàm lượng cơ chất 18-25%

- Chiếu xạ: Chiếu xạ tia cực tím, tia λ với mục đích tiêu diệt các loại vi khuẩn, nấm mốc để làm giảm thiệt hại do chúng gây ra, các tia này làm biến đổi cấu trúc chủ yếu của các axit amin, axit nucleic, protein làm tác động chuyển hóa tế bào, tác dụng diệt nấm, diệt vi khuẩn Phần lớn các loài nấm mốc bị diệt ở liều 4.5 kgy (1kgy = 100 Krad = 1kJ/kg)

- Sử dụng các loại khí: Metylbromid ở liều 129 mg/l/Penillium hoặc 40mg/l/Penillium có thể diệt được nhiều loại nấm mốc Khí ozon ở liều 10mg/m3 không khí được xác định liên tục trong nhiều ngày có thể ngăn cản

sự phát triển của nấm mốc Khí CO2 được ứng dụng trong bảo quản lương thực trong túi PE kín có thể chống được nấm mốc

- Hoá học : Được ứng dụng và nghiên cứu do tích chất an toàn của một

số hoá chất, đặc biệt là các axit hữu cơ: axit sorbic, axit propionic, axit acetic, axit benzoic các muối Na và Ca của chúng như canxipropionat hay natripionat

ở liều 1-3% các axit hoặc muối của axit trên có thể ức chế sự phát triển của nấm mốc trong thời gian dài Một số hợp chất hữu cơ khác thiosulfit, Na 2SO3, KHSO2, NaHSO3, Na2S2O5 thiabendazon diphing, tinh dầu thực vật( tinh dầu cam ở liều 0.2%) có thể ức chế được nhiều loại nấm mốc, mentho liều 1.1%

một số tinh dầu khác: tinh dầu hôi tinh dầu được chiết từ cây tỏi có tác dụng

ức chế nấm mốc

- Sinh học: Dùng các loại cây có sẵn trong thiên nhiên để chống nấm mốc thực phẩm Ví dụ dùng lá cây xoan hoặc lá hoa cúc vàng để xông vì cả hai loại lá cây này đều có tinh dầu, axit focmic Đó là những chất sát khuẩn, kháng khuẩn Khi xông bằng hai loại lá này thì ngô có độ ẩm 10-13% có thể kéo dài thời gian bảo quản 30 ngày

- Vô hoạt hay mất hoạt tính bằng phương pháp vật lý: ít có hiệu quả vì aflatoxin có thể chịu nhiệt được nhiệt độ >100-105oC Nếu chiếu xạ 10kgy thì

sẽ gây ảnh hưởng tới nguyên liệu Dùng hấp ướt (autoclve) 1.5at trong 60 phút nhưng lại ít có giá trị ứng dụng trong thực tế

- Phương pháp hấp thụ: Các chất hấp thụ như silicagel, axit nhân silic, than hoạt tính… có tác dụng rất tốt để hấp thụ aflatoxin trong quá trình tiêu hóa, các aflatoxin được hấp thụ sẽ được thải ra ngòai qua phân

- Làm mất hoạt tính bằng các hợp chất oxi hóa khử Na2SO4, NaHSO3, 1% hoặc 2% có tác dụng vô hoạt aflatoxin Hiện nay người ta sử dụng NH3 ở dạng khí nén được bơm tuần hoàn vào các thùng chứa ngô bằng thép (Metal silo) hoặc trong các túi PE có thể chứa đến 2030 tấn ngô Ngô có hàm lượng aflatoxin 750ppb sau 13 ngày xử lý, với 1.5 % NH3 ở nhiệt độ 32oC đã làm giảm xuống còn 7 ppb

2 3.2 Các phương pháp khử độc tố bằng hóa chất

Nhiều hóa chất có thể phá hủy aflatoxin tinh khiết hayaaflatoxin trong các nguyên liệu nhiễm tự nhiên Những hóa chất này bao gồm: chlorine, ozon, acid hydrochloric, peroxit benzoic, amoniac, natri hydrochlorit và etanolamin Các hóa chất dùng cho việc khử độc tố aflatoxin phải thỏa mãn các tiêu chuẩn sau: - Phải phá hủy hay khử aflatoxin

- Không được tạo hay giải phóng ra bất kỳ các dư lượng độc hay gây ung thư ở sản phẩm cuối cùng.

Phải phá hủy các bào tử và sợi nấm mà dưới điều kiện thuận lợi, chúng

có thể tái nhiễm lại ở sản phẩm

Phải giữ được giá trị dinh dưỡng và tính ăn được của nguyên liệu ban đầu

Nhiều hóa chất khảo sát đã không thỏa mãn tất cả các tiêu chuẩn trên Mặc dù chúng phá hủy các aflatoxin nhưng lại làm giảm đáng kể giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu xử lý tạo nên các sản phẩm độc hay các sản phẩm có tác dụng phụ không mong muốn

Một số quá trình xử lý bằng hóa chất có hiệu quả trong việc phá hủy các afatoxin thỏa mãn những tiêu chuẩn trên Trong số này hydrogen peroxit, natri hydroxit và natri hydroclorit dường như có khả năng trong việc khử afltaoxin

từ các sản phẩm giàu protein hay các sản phẩm dùng cho người ăn, trong khi

đó dimetylamin hay amoniac có thể áp dụng cho việc khử độc tố các hạt có dầu

2.3.3 Giảm hàm lượng aflatoxin bằng biện pháp sinh học

Nhiều loại hóa chất có thể phá hủy aflatoxin tinh khiết hoặc các aflatoxin trong các nguyên liệu tự nhiễm tự nhiên khác như: chlorin, ozon, acid hydrôchloric…Các hóa chất này mặc dầu phá hủy aflatoxin nhưng lại làm giảm đáng kể giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu xử lý và tạo nên các sản phẩm độc hay các sản phẩm phụ có tác dụng không mong muốn Do vậy việc

sử dụng các biện pháp sinh học không có hại cho con người và thực phẩm mà lại có khả năng làm giảm sự tạo độc tố hoặc ức chế hoàn toàn việc tạo độc tố

là biện pháp lý tưởng

Một số chủng nấm mốc và vi khuẩn có khả năng giảm sự tạo độc tố thì ngoài việc đảm bảo tính an toàn không độc hại đối với con người và thực

phẩm được xử lý, đôi khi cần phải thỏa mãn một số yêu cầu khác, chẳng hạn

Streptorocus lactic đòi hỏi nuôi trên môi trường dinh dưỡng đặc biệt nên

không thể thích hợp đối với việc xử lý trên ngũ cốc và thực phẩm

Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được khuyến cáo áp dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao quá giới hạn cho phép sử dụng là không thể tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hoá chất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lương thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản Khử độc tố bằng biện pháp sinh học có thể được định nghĩa như sự phân giải bằng enzym hay chuyển hoá sinh học của các độc tố nấm

2.3.3.1 Khử nhiễm aflatoxin bằng chủng Flavobacteroum aurantiacum

Flavobacterium aurantiacum là vi khuẩn Gram âm, hiếu khí tế bào hình

que, dạng thuôn dài, kích thước chiều dài 2-5 µm, rộng 0.3-0.5 µm, jhông có khả năng di động Khuẩn lạc trên thạch có màu từ vàng kem đến màu vàng cam

Nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả như Claude Morro (1970),

Cotty Pitter (1992) đã cho thấy vi khuẩn Flavobacterium aurantiacum có khả

năng phân huỷ aflatoxin Nó có khả năng phân hủy aflatoxin một cách không trở lại cả từ môi trường rắn và môi trường lỏng Khả năng loại trừ aflatoxin B1

của vi khuẩn này từ các thực phẩm đã được chứng minh ở các loại dầu thực vật lạc, ngô, bơ lạc và sữa lạc Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng yếu tố

có vai trò quan trọng trong việc phân giải aflatoxin B1 bằng chất chiết của

Flavobacterium aurantiacum có thể là protein với các tính chất enzym Khả năng sử dụng chất chiết protein thô từ Flavobacterium aurantiacum được tinh

chế trong công nghiệp thực phẩm đã được Cộng đồng Châu Âu và cơ quan

Quản lý thực phẩm và thuốc của Mỹ đề nghị như các biện pháp loại trừ aflatoxin từ các thực phẩm bị nhiễm.

2.3.3.2 Khử nhiễm aflatoxin bằng chủng Rhizopus delemar

Theo Larone Rhizopus delemar là lòai phổ biến trong thiên nhiên như

trong đất, không khí, hoa quả thối, trong xác động thực vật và trong bánh mì

để lâu ngày

Rhizopus delemar thường phát triển khuẩn ty bao phủ phần bên ngoài cở chất Khuẩn ty của Rhizopus delemar không có vách ngăn Khi còn non sợi

khuẩn ty có dạng sợi bông vải màu trắng Khi trưởng thành sợi khuẩn ty có

màu xám, khi già chuyển thành màu xám hơi vàng Khuẩn lạc Rhizopus delemar phát triển rất nhanh trên môi trừơng PDA Mặt trắng của khuẩn lạc có

màu trắng nhợt

Cuống sinh bào tử hình tròn hoặc hình trứng, đường kính 4-11µm, bề mặt trơn Nhiệt độ là 25oC và pH tối ưu của Rhizopus delemar là 5.5-5.8.

Zhu C.R và cộng sự (1989) đã nghiên cứu tác dụng khử nhiễm aflatoxin

của Rhizopus delemar bằng thực nghiệm trên chuột nhắt có nhiễm aflatoxin

aflatoxin B1 đã được đưa vào nước uống cho chuột nhắt cái ở liều 126 µg trong một tuần và toàn thể liều thử là 3,40 mg trong thời gian 27 tuần Chất

chiết của Rhizopus delemar đã được đưa đồng thời vào nhóm chuột này bằng

việc trộn dung dịch aflatoxin B1 Chuột được giết riêng biệt vào các tuần tuổi

18 30, 38, và 52 Các ổ bệnh thay đổi tế bào gan và các mô ung thư đã được định lượng bằng kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử và bằng các phản ứng enzym Ở nhóm chuột ăn thức ăn nhiễm aflatoxin B1, tai biến ung

thư gan là 71% Ở nhóm chuột ăn thức ăn có Rhizopus delemar cùng với

aflatoxin B1, các ổ bệnh phát triển quá mức và các ổ bệnh có triệu chứng bệnh học enzym đã giảm ở tất cả các thời gian lấy mẫu chuột để thử và không có

con chuột nào xuất hiện triệu chứng ung thư gan Kết quả thực nghiệm này

cho thấy rằng Rhizopus delemar có khả năng ức chế mạnh tác dụng độc và tính

gây ung thư gan của aflatoxin B1 Nấm Rhizopus delemar có thể được sử dụng

như biện pháp tiện lợi và hiệu quả để kiểm soát sự nhiễm độc do aflatoxin

2.3.6 Biện pháp phân tách vật lý

a Các qui trình phân loại

Vì biện pháp phòng ngừa rất khó thực hiện trong thực tế, cho nên người

ta tìm các biện pháp khác để kiềm chế Các phương pháp sử dụng rộng rãi nhất bao gồm loại trừ chọn lọc các phần đã nhiễm của sản phẩm Nói rộng ra, vấn đề này là khả năng áp dụng phụ thuộc chủ yếu vào tích chất vật lý của sản phẩm Các qui trình phân loại dựa trên các đặc tính như màu và kích thước của hạt… đã được sử dụng thành công đối với lạc ăn Những phương pháp này dựa trên sự định vị aflatoxin ở phần tương đối nhỏ của hạt, với sự thiếu hụt rất

dễ nhận ra ở kích thước và hình dạng của hạt

b Các quy trình chiết xuất bằng dung môi

Việc chiết xuất bằng dung môi có một số thuận lợi:

- Aflatoxin có thể bị loại trừ hoàn toàn một cách cơ bản trong điều kiện thuận lợi

- Ít có khả năng tạo từ aflatoxin những sản phẩm khác có hoạt tính sinh lý

đa dạng

- Việc chiết xuất có thể tiến hành với việc thu hồi dung môi mà không bị mất chất dinh dưỡng trong nhiều trường hợp

Những điều bất lợi:

- Cần phải có chiết xuất dung môi đặc biệt

- Sẽ chiết xuất luôn một số thành phần hòa tan cùng aflatoxin

- Giá thành của việc chiết xuất cao

- Có thể bị mất mùi của sản phẩm xử lý

Để tìm được dung môi có thể thích hợp cho tất cả các sản phẩm là một nhiệm vụ khó Các yếu tố khác như giá của dung môi và biện pháp thu hồi chúng cũng là vấn đề Thêm nữa là độc tính của dung môi và dư lượng của chúng, cuối cùng là tính an toàn của quá trình xử lý vì tính dễ cháy, dễ nổ và điểm sôi của dung môi

Các aflatoxin có thể được chiết xuất bằng các dung môi như cloroform/nước, axeton/nước Những hệ dung môi này chỉ loại trừ aflatoxin đơn độc mà không loại trừ dầu.Còn các nhóm dung môi như hidrocacbon dầu hỏa/nước loại trừ chủ yếu dầu nhưng cũng có khả năng loại trừ aflatoxin

Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng việc dùng hệ thống chiết xuất bao gồm hỗn hợp hexan – metanol, hexan – etanol, hexan – etanol - nước, và hexan –axeton - nước.Hệ thống bao gồm 54% axeton, 44% hexan và 2% nước ( tính theo trọng lượng ) đã tìm thấy một trong những hệ thống thành công nhất có thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12-15% dầu và dư lượng lipit gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40 microgam/kg

PHẦN 3:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.Đối tượng nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu

Các chủng Flavobacterium aurantiacum và Rhizopus delemar do phòng vi

sinh Viện cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch cung cấp

3.1.2 Các hóa chất dùng cho phân tích độc tố aflatoxin B 1

* Na2SO4 khan ( Trung Quốc )

* NaCl nhà máy hóa chất Việt Trì

* Các dung môi cloroform, hexan, aceton, chì axetat (Trung Quốc)

* Các chuẩn độc tố aflatoxin B1 (Sigma, Mỹ)

* Silicagel 60 F245, Merck, Cộng hòa liên bang Đức, cho sắc ký lớp mỏng

3.1.3 Dụng cụ thí nghiệm

* Buồng sắc lý lớp mỏng (chromatography tank ), Thụy Sỹ

* Máy nghiền đồng thể polytron, Cộng hòa liên bang Đức

* Giấy lọc Whatman No1, Chemapoli, Tiệp Khắc

* Kính hiển vi Olympus có gắn máy chụp ảnh Nhật

* Phễu chiết

* Ống hút tự động 0,2ml và 0,1ml Trung Quốc

* Bơm tiêm vi lượng Hamilton

* Máy cô chân không.

* Đèn cực tím 254 nm – 366nm Camag (Thụy Sỹ )

* Máy đánh sóng siêu âm

* Các dụng cụ dùng cho nuôi cấy vi sinh vật

* Máy cất quay chân không ( Đức)

* Tủ cấy vô trùng ( Đức)

* Nồi hấp tự động ( Đài Loan).

* Máy lắc

3.2 Phương pháp chiết xuất aflatoxin.

Chúng tôi tiến hành phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc kí bản mỏng do Doronina và Maksimenko [17] mô tả Dựa trên cơ sở của phương pháp CB (AOAC) [13] có cải tiến gồm những giai đoạn sau:

25 gam mẫu được nuôi A flavus, chiết xuất aflatoxin bằng hỗn hợp

aceton (100ml) và dung dịch NaCl 10% (25ml) Mẫu được nghiền trên máy nghiền đồng thể Polytron Lọc qua giấy lọc Whatman No1 Lấy 50ml dịch lọc

và kết tủa bằng Pb(CH3COO)2 10% (50ml) để loại bỏ protein, tiếp tục lọc qua giấy lọc để thu 80ml dịch lọc 80 ml dịch lọc đó chuyển vào phễu chiết và được bổ sung 2 lần hexan (40ml ) để chiết xuất bằng hai pha lỏng-lỏng Bỏ phần dịch nổi phía trên Phần dịch trong ở phía dưới lại tiếp tục đưa trở lại phễu chiết và được bổ sung cloroform 40ml (3lần) Lớp nước aceton nhẹ hơn

sẽ nổi lên trên, loại bỏ lớp aceton Lớp clorofrom có aflatoxin được giữ lại Làm bay hơi toàn bộ lượng clorofrom có aflatoxin ở máy cất quay cô chân không Phần cặn được hòa tan vào 100 µl clorofrom, giữ ở 40C cho đến khi tiến hành định lượng và định tính aflatoxin

Quy trình chiết tách Aflatoxin

Nghiền 5 phút trên máynghiền đồng thể

Nghiền 5 phút trên máynghiền đồng thể

Bọc giấy bạcbảo quản lạnh 4oC

40 ml n-hexan (nhắc lại 2 lần)

40 ml n-hexan (nhắc lại 2 lần)

- Định tính aflatoxin:

Dùng bơm tiêm vi lượng (mycrosyring) nhỏ trên sắc lý lớp mỏng 2µl, 4µl, 6µl và 2lần 10µl mẫu phân tích Một lượng nhỏ của dung dịch được chấm vào phiến mỏng cách đường thẳng mép dưới 2cm và 1,5-2 cm từ mỗi cạnh bên.Việc chấm phải thực hiện ở những phần nhỏ sao cho đường kính của các vết nhỏ không quá 5mm trên đường bắt đầu Nhỏ 2, 4, 6 µl chuẩn aflatoxin B1

với nồng độ 0,71 ng/µl trên cùng một phiến bản mỏng Nhỏ 5 µl chuẩn aflatoxin B1 vào cùng một vết của mẫu phân tích (10µl) như chuẩn trong Hệ dung môi cho sắc ký bản mỏng một chiều là: clorofrom : aceton = 1: 9

Giới hạn độ phát hiện của phương pháp là 1µg aflatoxin/kg sản phẩm, hệ

số dao động là 0,3-5,0 Phát hiện aflatoxin bằng cách phát hiện sự phát quang của phiến lớp mỏng ở buồng tối dưới đèn cực tím sóng dài (có bước sóng 365 nm) Phát hiện bằng mắt thường trên sắc ký đồ của mẫu chiết, cường độ phát quang của các vết có giá trị Rf bằng với chuẩn Chọn phần tương ứng thích hợp của mẫu phân tích cho việc định lượng aflatoxin

Thử xác minh aflatoxin: * Thử với acid vô cơ: phun lên bản mỏng dung dịch acid H2SO4 trong nước tỉ lệ 2: 1 Nếu như màu phát quang các vết của mẫu chiết không chuyển sang màu vàng như ở mẫu chuẩn, tức là không có

aflatoxin trong mẫu thử Nhưng nếu màu phát quang của các vết của mẫu thử aflatoxin ứng với nồng độ di động sắc ký cũng chuyển thành màu vàng, điều

đó có thể xem như có aflatoxin trong mẫu thử

* Thử với acid trifluoroaxetic: Chỉ áp dụng aflatoxin B1, G1, M1 : sau khi nhỏ các vết của các mẫu thử và chuẩn aflatoxin, nhỏ lên các vết chấm của chuẩn

và mẫu thử 30 µl acid trifluoroaxetic Để phản ứng xảy ra trong 10 phút

Tránh ánh sáng Sau đó chạy sắc ký trên hệ dung môi thích hợp Aflatoxin sau khi kết họp với axit trifluoroaxetic tạo thành một hợp chất phân cực hơn nên

có Rf thấp hơn so với aflatoxin không có axit chỉ thị Mẫu có aflatoxin sẽ tụt ngang với Rf của chuẩn so với chuẩn không chấm axit trifluoroaxetic Đây là phản ứng chính thức được dùng để làm phản ứng thử xác minh aflatoxin của các phòng thí nghiệm trên thế giới

_Định lượng aflatoxin:

Nếu aflatoxin được phát hiện trong mẫu thử, có thể định lượng chúng như sau:

Nhỏ 10µl chất chiết với đường kính của vết không quá 5mm, ở góc dưới bên phải của bản mỏng và cách mép 1,5cm.

Ở góc dưới bên trái cách mép 1, 2, 3 cm và 1,5 cm từ mép dưới của bản mỏng nhỏ 2, 4, 6 µl theo thứ tự dung dịch chuẩn aflatoxin

Thực hiện sắc kí bản mỏng ở hệ dung môi cloroform : aceton =9 : 1 So sánh cường độ phát quang của các chuẩn aflatoxin khác nhau trên phiến mỏng với vết của mẫu thử

Bằng mắt thường định lượng aflatoxin ở vết của mẫu thử (nanogram) theo công thức sau:

V2 là thể tích hỗn hợp nước – aceton lấy cho phân tích (ml)

V3 là thể tích hỗn hợp nước – aceton và chì acetate (ml)

V4 là thể tích dịch lọc sau khi làm sạch bằng chì acetate (ml)

V5 là thể tích dịch chiết đã bay hơi làm sạch ở cloroform trước khi làm sắc kí bản mỏng (µl)

V6 là thể tích dung dịch chiết chấm vào bản mỏng (µl)

m là lượng aflatoxin ở vết chuẩn trên phiến mỏng (ng)

M là trọng lượng sản phẩm lấy để phân tích (g)

3.2.7 Phương pháp xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao bằng chủng Rhizopus delemar

Bổ sung 1 lượng Rhizopus delemar với mật độ bào tử là 106 / g xử

lý vào 250 g ngô hạt hoặc lạc hạt có bổ sung các chất khoáng và 1 lượng

aflatoxin là 200 ppb Tiến hành nuôi các chủng Rhizopus delemar trên ngô hạt

hoặc lạc hạt ở các nhiệt độ là 200C, 250C, 280C, 300C, 350C và độ ẩm là 15%, 17%, 20%, 25%, 30% Sau các khoảng thời gian là từ 1 đến 9 ngày xác định

hiệu quả khử nhiễm aflatoxin bằng chủng Rhizopus delemar trên thông qua

việc xác định hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô xử lý Chúng tôi tiến hành theo phương pháp của Nguyễn Thuỳ Châu

3.2.8 Phương pháp xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao bằng chủng Flavobacterium aurantiacum.

Bổ sung 1 lượng hỗn dịch tế bào Flavobacterium aurantiacum sao

cho có nồng độ là 106 tế bào/ml môi trường bột ngô lỏng hoặc bột lạc lỏng có

bổ sung một số chất khoáng và một lượng aflatoxin là 200ppb Tiến hành nuôi

cấy Flavobacterium aurantiacum trên môi trường bột ngô lỏng hoạc bột lạc

lỏng ở các nhiệt độ 220C, 240C, 260C,280C, 300C Sau các khoảng thời gian từ

1 đến 9 ngày xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin bằng Flavobacterium

aurantiacum thông qua việc xác định hàm lượng aflatoxin trong mẫu xử lý

Chúng tôi tiến hành theo phương pháp của Nguyễn Thuỳ Châu

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Xác định khả năng khử aflatoxin nhiễm trên ngô của chủng

Rhizopus delemar

Trong số 22 chủng Rhizopus delemar do phòng vi sinh viện cơ điện

nông nghiệp phân lập chúng tôi đã tiến hành khảo sát 6 chủng để đánh giá hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô

Bảng 1: Hiệu quả khử aflatoxin trên ngô bằng một số chủng Rhizopus

delemar sau 7 ngày xử lý.

STT chủngTên chủngHàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô trước khi xử lý (ppb)

Hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô sau khi xử lý (ppb)

Hiệu quả khư aflatoxin của chủng R.delemar(%)

1

R.delemarVS1

2007065

2

R.delemarVS2

2004087

3

R.delemarVS3

2007065

4

R.delemarVS4

2006070

5

R.delemarVS5

200

6

R.delemarVS6

2007065

Kết quả ở bảng 1 cho thấy việc sử dụng các chủng Rhizopus delemar đã

khử được aflatoxin trên ngô một cách đáng kể, hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô trước khi xử lý là 200ppb xuống còn từ là 70ppb đến 40 ppb sau xử lý

Trong số các chủng khảo sát có chủng R.delemarVS2 có hoạt tính khử

aflatoxin cao nhất nhất, hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô trước xử lý là 200ppb và sau xử lý là 40ppb, hiệu quả khử aflatoxin của chủng này là 87% Các chủng còn có hoạt tính khử aflatoxin thấp hơn lại cho hiệu quả khử aflatoxin đạt từ 65 đến 73%

Đây là kết quả quan trọng trong việc ứng dụng chủng Rhizopus

delemarVS2 để khử nhiễm aflatoxin ở mức độ cao trên ngô ở quy mô lớn.

4.1.1 Nghiên cứu một số của yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả khử

aflatoxin nhiễm trên ngô ở mức độ cao của chủng R.delemaVS2.

Để nghiên cứu công nghệ khử nhiễm trên ngô ở mức độ cao, chúng tôi

đã khảo sát một số yếu tố công nghệ như thời gian xử lý, nhiệt độ xử lý, độ ẩm của ngô trong quá trình xử lý

4.1.1.1 Ảnh hưởng của thời gian xử lý

Bảng 2: Ảnh hưởng của thời gian xử lý đến hiệu quả khử aflatoxin nhiễm

trên ngô của chủng Rhizopus delemarVS2.

STTThời gian xử lý(ngày)Hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô trước khi xử lý(ppp)

bằng chủng R.delemarVS2

Hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô sau khi xử lý bằng chủng

R.delemarVS2(ppb) Hiệu quả khử aflatoxin trên ngô bằng chủng R.delemarVS2 (%)

1Ngày thứ nhất2002000

2Ngày thứ hai2001905

3Ngày thứ ba200170

15

4Ngày thứ tư200145 28,5

5Ngày thứ năm20011045

6Ngày thứ sáu2007065

7Ngày thứ bảy2005075

8Ngày thứ tám20035

9Ngày thứ chín2002090

Kết quả bảng 2 cho thấy trong 5 ngày đầu của quá trình xử lý, hiệu quả

giảm aflatoxin trên ngô của chủng R.delemarVS2 là không đáng kể, chỉ đạt từ

0 đến 45% Từ ngày thứ 8 đến ngày thứ 9, hiệu quả giảm aflatoxin trên ngô

của chủng R.delemarVS2 là cao nhất, hàm lượng aflatoxin trên ngô trước xử

lý là 200ppb giảm xuống còn 35ppb ở ngày thứ 8 và 20ppb ở ngày thứ 9 sau

xử lý, hiệu quả giảm aflatoxin lần lượt là 88,5% đến 90% Như vậy khoảng

thời gian thích hợp nhất để xử lý aflatoxin trên ngô của chủng R.delemarVS2

là 8 đến 9 ngày

Dưới đây là đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian xử lý đến hiệu quả

khử aflatoxin trên ngô của chủng R.delemarVS2:

Động thái khử aflatoxin nhiễm trên ngô bằng chủng R delemarVS2

4.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý đến hiệu quả khử aflatoxin trên ngô của chủng R delemar VS2

Sau khi xác định được thời gian xử lý thích hợp bằng chủng R

delemar VS2, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến hiệu quả khử aflatoxin của chủng R delemarVS2.

Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến khả năng khử aflatoxin nhiễm trên

ngô của các chủng R delemarVS2 được thể hiện ở bảng 3