Bộ môn : Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Đề tài : Lai Phân Tử Nhóm : 12, Tiết 910, thứ 5

Bộ môn : Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Đề tài : Lai Phân Tử Nhóm : 12, Tiết 910, thứ 5 Bộ môn : Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Đề tài : Lai Phân Tử Nhóm : 12, Tiết 910, thứ 5 Bộ môn : Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Đề tài : Lai Phân Tử Nhóm : 12, Tiết 910, thứ 5 Bộ môn : Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Đề tài : Lai Phân Tử Nhóm : 12, Tiết 910, thứ 5 Bộ môn : Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Đề tài : Lai Phân Tử Nhóm : 12, Tiết 910, thứ 5 Bộ môn : Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Đề tài : Lai Phân Tử Nhóm : 12, Tiết 910, thứ 5 Bộ môn : Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Đề tài : Lai Phân Tử Nhóm : 12, Tiết 910, thứ 5 Bộ môn : Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Đề tài : Lai Phân Tử Nhóm : 12, Tiết 910, thứ 5 Bộ môn : Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Đề tài : Lai Phân Tử Nhóm : 12, Tiết 910, thứ 5 Bộ môn : Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Đề tài : Lai Phân Tử Nhóm : 12, Tiết 910, thứ 5 Bộ môn : Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Đề tài : Lai Phân Tử Nhóm : 12, Tiết 910, thứ 5 Bộ môn : Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Đề tài : Lai Phân Tử Nhóm : 12, Tiết 910, thứ 5

Trường Đại Học Công Nghiệp Thực

Phẩm TPHCM Khoa Công Nghệ Thực Phẩm

• Bộ môn : Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

• GVHD : Nguyễn Thị Mỹ Lệ

• Đề tài : Lai Phân Tử

• Nhóm : 12, Tiết 9-10, thứ 5

• 5 Nguyễn Mai Huyền Trân

• 6 Nguyễn Mai Ngọc Hân

• 7 Trần Khánh Thanh Trúc

Nội dung chính

• I Lịch sử lai phân tử

• II Khái niệm về lai phân tử

• III Các phương pháp lai phân tử

• IV Ứng dụng của lai phân tử

• V Ví dụ của lai phân tử

I Lịch sử lai phân tử

• 1960 Julius Marmur và những đồng nghiệp của ông quản lý, ngành học tại đại học Harvard đã

khám phá ra quá trình ủ lại (reannealing) Quá

trình này bao gồm sự kết hợp lại của những mạch đơn thành các phân tử 2 mạch đôi bền vững Từ

sự khám phá ra quá trình reannealing, phương

pháp lai các sour nucleic được phát triển

• Sử dụng kỹ thuật những mạch bổ sung từ các

nguồn khác nhau của acid nucleic có thể trộn lẫn thành dạng phân tử 2 mạch đôi được đặt tên là thể lai (hybrid).

II Khái niệm về lai phân tử

• Sau khi hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau dưới tác động của Tm, sự bắt cặp sẽ không xảy ra nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột

• Lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi trường

ở dạng mạch đơn dưới một cấu hình không gian

vô trật tự Ngược lại, nếu sau khi hai mạch tách rời, nhiệt độ được giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch sẽ bắt cặp trở lại Hiện tượng này được gọi là sự lai phân tử

(molecular hybridization)

II Khái niệm về lai phân tử

• Đặc điểm :

Đặc hiệu tuyệt đối : sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung

Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay

RNA, dẫn đến sự hình thành các phân tử DNA, RNA-RNA hay các phân tử lai DNA-

DNA-RNA

II Khái niệm về lai phân tử

Hình – sự lai giữa DNA và RNA

II Khái niệm về lai phân tử

Các yếu

tố ảnh hưởng

Các yếu

tố ảnh hưởng

Nhiệt độ

Độ dài các trình tự

Độ dài các trình tự

1 Nồng độ DNA và thời gian phản ứng

- Nồng độ DNA nghĩa là số

lượng các trình tự bổ sung càng

cao thì xác suất chúng tiếp xúc

với nhau càng tăng, kết quả là

tốc độ phản ứng lai phân tử tăng

lên.

- Thời gian phản ứng càng dài thì

xác suất trên càng lớn hơn và số

lượng phân tử lai tăng dần cho

đến khi toàn bộ các trình tự bổ

sung đều tái bắt cặp (lai).

3 Độ dài của các trình tự

• Tốc độ lai tăng tỷ lệ thuận với căn bậc 2 của

độ dài các trình tự bổ sung

vượt quá 1,2M lại

hoàn toàn không còn

tác dụng

III Các phương pháp lai phân tử

Gồm 3 phương pháp

Gồm 3 phương pháp

1 Lai trên pha lỏng

• Nguyên tắc : Các trình tự bổ sung (các mạch đơn) nằm trong môi trường lỏng là một dung dịch đệm Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi

nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài

độ

1 Lai trên pha lỏng

• Phân tích định lượng các phân tử lai: 3 phương pháp

S1

Sử dụng Nuclease

S1

Sắc kí trên hydroxylapatiteSắc kí trên hydroxylapatite

- Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn, hiện tượng này có tên gọi

là hiệu ứng siêu sắc (hyperchromic effect)

Hiệu ứng siêu sắc :

Nhuộm tím phân tử DNA , nếu đem chúng đun nóng lên và làm lạnh

từ từ thì kết quả là các phân tử DNA sẽ trở nên tím đậm hơn lúc đầu một chút Nếu hạ nhiệt độ một cách đột ngột thì chúng sẽ trở nên rất đậm

Đó là do hiện tượng các mạch đơn DNA hấp thu tia UV mạnh hơn DNA mạch đôi.

Phương pháp sử dụng nuclease S1

- Nuclease S1 là enzyme thủy giải các nucleic acid mạch đơn bất kể là DNA hay RNA trong một số điều kiện thực nghiệm

- Dung dịch phản ứng lai được trích ra một phần, đem xử lí với nuclease S1

- Các mạch đơn sẽ bị thủy giải, các nucleic acid còn lại tương ứng với các phân tử lai được thu nhận qua phương pháp tủa rồi đem định lượng

Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite

- Hydroxylapatite là những tinh thể phosphat calci

- Kỹ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu (đoạn nucleotide hoặc kháng thể ) để lai với ADN,ARN hoặc với các protein ở trong các tế bào mà không cần tách chiết.

- Sau khi các hỗn hợp bị đốt nóng, chúng được làm lạnh để những mạch đơn va chạm ngẫu nhiên Các hỗn hợp được ủ khoảng 120h ở 60 0 C trong một dung dịch đệm Natri phosphat

1 Lai trên pha lỏng

2 Lai trên pha rắn

• Nguyên tắc : Lai trên pha rắn có cùng nguyên tắc với lai trên pha lỏng Điểm khác biệt ở đây là 1 trong 2

trình tự bổ sung (thường là trình tự đích, trình tự cần tìm) được cố định trên 1 giá thể rắn.

2 Lai trên pha rắn

Hình – các bước lai trên pha rắn

2 Lai trên pha rắn

Các yếu tố kỹ thuật quan trọng trong phương pháp lai trên pha rắn :Giá thể rắn dùng để cố định nucleic acid là các màng lai, có 2 loại màng lai : (1) màng lai bằng nitrocellulose và (2) màng lai bằng nylon.

2 Lai trên pha rắn

không tiếp xúc được với các trình tự bổ sung

2 Lai trên pha rắn

WESTERN BLOT

DOT (SLOT)

BLOT DOT (SLOT)

BLOT

SOUTHERN BLOT

Mục đích :

- Phương pháp này dùng để định vị những trình tự đặc biệt trên DNA bộ gen, hay những DNA kích thước nhỏ như DNA plasmid, phage,…

- Cơ sở của phương pháp là kỹ thuật chuyển (transfer) DNA tử gel lên màng lai do Southern mô tả năm 1975

mẫu dò không bắt cặp chuyên biệt với DNA cố định trên màng.

4 Cuối cùng, người ta dùng kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography) để định vị các phân tử lai Người ta sẽ đặt một phim nhạy cảm với tia xạ áp sát vào màng lai, các mẫu dò được đánh dấu phóng xạ sẽ tác động lên phim và kết quả được thể hiện qua các chấm đen trên phim.

2 Chuyển RNA lên màng lai.

3 Đem lai RNA trên màng với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ.

4 Các phân tử lai được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi.

PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT

Mục đích : dùng để phát hiện protein

• - Protein sau khi được chiết tách và điện di trên

polyacrylamide gel sẽ được chuyển lân màng nitrocellulose.

• - Protein cố định trên màng tạo ra những vệt (blot) có thể thăm

dò (probe) được nhờ sử dụng kháng thể.

• - Trước khi thăm dò, các vị trí còn trống trên màng được trám bằng protein để ngăn cản hiện tượng gắn không đặc hiệu của kháng thể lên màng.

• - Sau đó 1 loại kháng thể (primary antibody) có kháng nguyên chính là protein được xác định được thêm vào và kháng thể

này sẽ gắn lên các vệt protein trên màng.

• - Một kháng thể khác (secondary antibody) có mang một lọai enzyme sẽ bắt cặp với khácg thể ban đầu, enzyme trên phản ứng với cơ chế đặc hiệu tạo ra sản phẩm kết tủa có màu tại vị trí của phức hợp kháng nguyên_kháng thể

DOT VÀ SLOT BLOT

Mục đích : định lượng tương đối cho 1 RNA đặc trưng trong

1 hỗn hợp RNA mà không cần phải phân tách chúng ra

Phương phá này có thể sử dụng cho RNA.

• Trong phương pháp này người ta không chuyển acid

nulceic từ gel lên màng mà đặt trực tiếp 1 lượng mẫu nhỏ lên màng lai ( thành 1 điểm_Dot hay 1 khe_Slot) Quá trình lai và phân tách phâan tử lai giống như đề cập ở phần trên Bản phóng xạ tự ghi sau đó đươ 5c phân tích bằng kỹ thuật mật độ kế cho phép ước lượng số lượng các phân tử lai có trong mẫu Trong thục nghiệm, người ta sử dụng một dụng

cụ ( tên là manifold) cho phép đặt một lúc nhiều mẫu DNA hay RNA lên màng lai.

Southern Blot Northern

Blot Western Blot

3 Chạy trên gel

(thường dùng là

agargose)

Làm biến tính

DNA với alkali

3 Chạy trên gel (thường dùng

là agargose)

3 Chạy trên gel (thường dùng là polyacrylamide, gọi là SDS PAGE

nitrocellulose (thường bằng hoạt động mao dẫn).

4 Chuyển lên màng

nitrocellulose (thường do chạy điện di).

5 Tắc nghẽn với

DNA dư 5 Tắc nghẽn với RNA dư 5 Tắc nghẽn với protein dư

6 Lai với mẫu

dò DNA được

đánh dấu

6 Lai với mẫu dò DNA được đánh dấu

6 Lai với mẫu dò kháng thể được đánh dấu

nghiêm ngặt).

7 Rửa sạch khỏi mẫu dò chưa được liên kết.

8 Phóng xạ tự

ghi

8 Phóng xạ tự ghi

8 Phóng xạ tự ghi hay thể hiện

rõ với chất nền

có màu

Northern Blot Western Blot

Hình – Chuyển DNA từ gel lên

màng lai

Hình – Lai với mẫu dò DNA được đánh dấu

Southern Northern Western

Ứng

dụng

-Bản đồ giới hạn của gene X trong chromosome.

- Phát hiện các fragment

polymorphysm của cùng 1 gen ở các

cá thể khác nhau

-Phát hiện đột biến mất đoạn, điểm

hay tái tổ hợp trên

1 gen.

- Bao nhiêu mRNA của gene X hiện diện?

- Độ dài mRNA của gene X?

- Bao nhiêu protein X hiện diện ?

- Độ lớn của protein X?

Ứng dụng Dot blot

• - Cho phép định lượng tương đối một DNA hay RNA đặc trưng trong một hỗn hợp mà không cần phải tách chúng ra.

- Kỹ thuật Dot (dot là khe) đơn giản hơn nhiều so với các phương pháp khác vì:

 Không cần giai đoạn cắt bởi những enzyme cắt giới hạn

 Không cần chạy điện di

• Kỹ thuật dot được dùng trong nghiên cứu những

đoạn DNA ngắn

3 Lai tại chỗ

- Định nghĩa : Lai tại chỗ là 1 kiểu lai phân tử trong đó trình tự nuclic acid cần tìm (trình tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mô.

- Nguyên tắc : Nghiên cứu acid nucleic mà không cần qua giai đọan tách chiết chúng tế khỏi mô hay tế bào

- Ứng dụng đa dạng :

• Định vị gen trên NST.

• Nghiên cứu 1 mRNA riêng biệt trong tế bào và mô

3 Lai tại chỗ

• Các phương pháp :

L a i

t r ê n

k h u ẩ n

l ạ c

L a i

t r ê n

k h u ẩ n

l ạ c

Lai trên tế bào và môLai trên NST

3.2 Lai trên khuẩn lạc

3.3 Lai trên tế bào và mô

• Trong tế bào và mô, các RNA, đặc biệt là các

mRNA có sự phân bố không gian xác định Sự phân bố không gian này liên quan đến chức

năng, sự điều hòa biểu hiện cũng như tương tác giữa mRNA với các thành phần khác của tế bào

và mô Nghiên cứu trên mRNA đã tách chiết và tinh sạch không cho phép thu nhận các thông tin vừa kể Trong trường hợp đó, người ta thường

sử dụng phương pháp lai trên tế bào và mô

IV.Ứng dụng của lai phân tử

Ứng dụng

Ứng dụng

Y họcSinh học

IV Ứng dụng của lai phân tử

• Trong sinh học : tRNA

(transfer RNA–RNA vận

chuyển) được tạo ra trong

nhân sau đó được tống xuất

ra khỏi nhân chỉ một lần

duy nhất Nhưng sự trưởng

thành và quá trình chuyển

vận của nó từ nhân ra tế

bào chất thật sự không đơn

giản như trước nay người

ta vẫn nghĩ, thực tế nó

phức tạp hơn rất nhiều

IV Ứng dụng của lai phân tử

• Trong y học : Đối với

các tác nhân gây bệnh

khó nuôi cấy hay không

thể nuôi cấy thì kỹ thuật

sinh học phân tử là giải

IV Ứng dụng của lai phân tử

• Trong nông nghiệp :

Chẩn đoán các virus gây

bệnh thực vật có ý nghĩa

quan trọng trong bảo vệ

cây trồng

IV Ứng dụng của lai phân tử

• Trong chăn nuôi : trong

ngành thủy sản, dùng

phương pháp lai tại chỗ

(in situ hybridization)

để chẩn đoán bệnh

virus đốm trắng của

tôm.

IV Ứng dụng của lai phân tử

V Ví dụ

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ

TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH CÁC LỆCH BỘI NHIỄM

SẮC THỂ THƯỜNG GẶP

Lai huỳnh quang tại chỗ (FISH)

là kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bào và sinh học phân

tử, trong đó đầu dò đặc hiệu được lai với nhiễm sắc thể

(NST) ở kỳ giữa, và/hoặc nhân

tế bào ở gian kỳ, nhằm phát

hiện một cách chính xác các bất

thường NST

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH:

Fluorescence insitu hybridization )

Kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bào

và sinh học phân tử, trong đó đầu dò đặc

hiệu được lai với nhiễm sắc thể (NST) ở

kỳ giữa, và/hoặc nhân tế bào ở gian kỳ,

nhằm phát hiện một cách chính xác các

bất thường NST (6) Một trong những

ứng dụng của kỹ thuật FISH trong chẩn

đoán trước sinh là nhằm phát hiện các

lệch bội NST thường gặp như 13,18,21,

X,Y (10)

1 Đối tượng nghiên cứu:

Tiến hành kỹ thuật FISH và nuôi cấy NST theo

phương pháp mới cho 28 thai phụ mang thai

17-25 tuần có nguy cơ cao bị dị tật

Các thai phụ có kết quả siêu âm bất thường hoặc xét nghiệm bộ ba (Triple test) thuộc nhóm

nguy cơ cao được bác sỹ Sản khoa và bác sỹ

chuyên khoa Di truyền tư vấn về phương pháp chọc hút nước ối, kỹ thuật FISH và nuôi cấy tế bào ối,

những nguy cơ, giới hạn của các kỹ thuật này

3.Quy trình chọc hút nước ối

vị trí chọc kim thuận lợi (khoang ối rộng, xa các phần thai, đặc biệt đầu thai nhi)

- Kim chọc ối: dùng kim chọc tủy sống số 22G

- Dùng bơm tiêm 5 ml hút loại bỏ 2 ml dịch ối đầu tiên để tránh lẫn tế bào của mẹ.

- Thay bơm tiêm 20ml, hút 15-18ml dịch ối Dịch ối có màu vàng sáng, không lẫn máu của mẹ

- Mẫu dịch ối được lấy vào ống Falcon 15ml vô trùng Bảo quản

Bệnh viện Nhi TW làm FISH với tế bào ối trực tiếp, song song với nuôi cấy NST từ tế bào ối Mục đích nuôi cấy NST là để

kiểm chứng độ nhạy và đặc hiệu của kỹ thuật FISH, phát hiện các bất thường NST khác không nằm trong nhóm NST mà kỹ thuật FISH sàng lọc.

Kỹ thuật FISH

-Xử lý bệnh phẩm: Mẫu được xử lý theo quy trình thống nhất bằng Trypsin-EDTA 1X (Gibco), dung dịch KCl 0.075M, dung dịch cố định Methanol

- Tạo tiêu bản: Nhỏ cặn tế bào lên lam kính sạch Đánh giá mật

độ tế bào dưới kính hiển vi soi ngược.

- Nhỏ đầu dò : 10µl đầu dò đặc hiệu cho NST 13,18,21,X,Y (Vysis) trên vùng tế bào đã đánh dấu Vùng lai với đầu dò được phủ bằng DAPI (Sigma), cuối cùng được phủ bằng lamme 22x22mm (BDH).

- Phân tích dưới hệ thống kính hiển vi huỳnh quang với phần mềm ISIS (Metasystem) Đếm tối thiểu trên 50 nhân tế bào đối với từng loại đầu dò Kết luận kết quả lai bình thường nếu trên 80% nhân tế bào có 2 tín hiệu đối với từng loại đầu dò Kết luận kết quả lai bất thường khi có trên 30% nhân tế bào có số tín hiệu bất thường đối với từng loại đầu dò.

Kỹ thuật nuôi cấy nhiễm sắc

thể từ tế bào ối

Nuôi cấy NST từ tế bào ối theo phương pháp mới trên lammen 22x22mm Thực hiện chụp ảnh ít nhất 05 cụm NST bằng hệ thống Karyotyping (Karl Zeiss) và phân

tích bằng phần mềm IKaros

(Metasystem) Đếm 20 cụm dưới

kính hiển vi thường

Kết quả

Kết quả FISH sau 24 - 48 h thấy có 1 trường hợp lệch bội với NST 13 và 1 trường hợp lệch bội với NST 21 01 trường hợp có bất thường nhánh dài NST 16, không nằm trong nhóm NST mà

kỹ thuật FISH sàng lọc 100% kết quả FISH phù hợp với kết quả phân tích NST

từ tế bào ối sau 10 ngày

THANK

YOUR FOR LISTENING!