Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của Bần trắng (Sonneratia alba) và Bần ổi (Sonneratia ovata), họ Bần (Sonneratiaceae), mọc ở rừng ngập mặn Cần Giờ, TP HCM - NCS. Nguyễn Thị Hoài Thu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  NGUYỄN THỊ HOÀI THU KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA BẦN TRẮNG SONNERATIA ALBA VÀ BẦN ỔI S

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



NGUYỄN THỊ HOÀI THU

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA BẦN TRẮNG (SONNERATIA ALBA)

VÀ BẦN ỔI (SONNERATIA OVATA),

Công trình được hoàn thành tại Đại học Khoa Học Tự Nhiên

Đại học Quốc Gia TP HCM

Người hướng dẫn khoa học:

GS TS Nguyễn Kim Phi Phụng (Việt Nam)

GS TS Poul Erik Hansen (Đan Mạch)

Phản biện độc lập 1: PGS.TS Phan Minh Giang

Phản biện độc lập 2: TS Trần Thị Phương Thảo

Luận án sẽ được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án cấp cơ sở đào tạo, họp tại Đại học Khoa Học Tự Nhiên

Vào hồi giờ ngày tháng năm 2015

Có thể tìm hiểu luận án tại Thư viện Tổng hợp và Thư viện Đại học Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia TP HCM

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1 Nguyen Thi Hoai Thu, Lam Phuc Khanh, Nguyen The Duy,

Nguyen Thi Kim Chanh, Nguyen Kim Phi Phung, Poul Erik

Hansen (2011), Chemical constituents from leaves of Sonneratia

alba J E Smith (Sonneratiaceae), Tạp chí Phát Triển Khoa học và

Công Nghệ, 14(6), 11–17

2 Nguyen Thi Hoai Thu, Lam Phuc Khanh, Poul Erik Hansen,

Nguyen Kim Phi Phung (2011), Some triterpenoid and phenolic

compounds from leaves of Sonneratia alba J.E Smith and their acetylcholinesterase inhibitions, Tạp chí Khoa học và Công Nghệ,

49(5B), 715–721

3 Nguyen Thi Hoai Thu, Poul Erik Hansen, Nguyen Kim Phi

Phung (2014), Thành phần hóa học của cao ethyl acetate của Bần ổi

Sonneratia ovata, mọc ở rừng ngập mặn Cần Giờ Tp HCM, Tạp chí

Y học TP HCM, 18(1), 217–221

4 Thi Hoai Thu Nguyen, Nguyen Kim Tuyen Pham, Khanitha

Pubhom, Poul Erik Hansen, Kim Phi Phung Nguyen (2014),

Structure elucidation of four new megastigmanes from Sonneratia

ovata Backer, Magnetic Resonance in Chemistry, 52, 795–802

5 Nguyen Thi Hoai Thu, Poul Erik Hansen, Nguyen Kim Phi

Phung (2015), Cô lập và xác định cấu trúc của luteolin và dẫn xuất

của nó từ lá Bần ổi Sonneratia ovata, Tạp chí Y học TP HCM, 19(1),

275–279

6 Thi Hoai Thu Nguyen, Huu Viet Thong Pham, Nguyen Kim

Tuyen Pham, Ngo Diem Phuong Quach, Khanitha Pubhom, Poul Erik Hansen, Kim Phi Phung Nguyen, Chemical

constituents from Sonneratia ovata Backer and their in vitro

cytotoxicity and acetylcholinesterase inhibitory activities,

Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, (Available online 11

April 2015) DOI information: 10.1016/j.bmcl.2015.04.017

1

MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới, nóng ẩm, gió mùa, nên có thảm thực vật rất phong phú đa dạng và là kho tàng dược liệu quý giá Rừng ngập mặn với các loài động, thực vật đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái ven biển Việt Nam Tuy nhiên, các hiểu biết về thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học của các loài cây ngập mặn còn rất hạn chế Vì vậy, luận án đặt vấn đề nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh

học của hai loài cây Sonneratia alba J.E Smith và cây Sonneratia ovata

Backer, mọc ở rừng ngập mặn Cần Giờ TP HCM, là những cây ít được nghiên cứu về mặt hóa học và hoạt tính sinh học, đặc biệt chưa được nghiên cứu ở Việt Nam

Nội dung chính được thực hiện trong luận án này là khảo sát thành phần

hóa học của lá hai loài cây Bần trắng Sonneratia alba J.E Smith và Bần ổi Sonneratia ovata Backer, thử nghiệm in vitro hoạt tính gây độc tế bào và

ức chế acetylcholinesterase của các cao chiết và hợp chất cô lập được Kết quả đạt được của luận án góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học

của chi Sonneratia Bên cạnh đó, những thử nghiệm hoạt tính sinh học

cũng được thực hiện trên các hợp chất tinh khiết cô lập được, góp phần nâng cao giá trị ứng dụng của 2 loài cây này Chúng tôi chọn thử nghiệm hoạt tính ức chế acetylcholinesterase và hoạt tính gây độc trên ba dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư phổi (NCI–H460) và ung thư vú (MCF–7) Một số hợp chất có hoạt tính được tiến hành thử nghiệm xác định IC50 và khả năng gây độc trên tế bào lành (tế bào nguyên sợi của người)

ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Trong phần cô lập các hợp chất tinh khiết từ hai loài thuộc chi

Sonneratia, chúng tôi đã cô lập được 58 hợp chất, trong đó có 7 hợp chất

mới và một hỗn hợp của 2 hợp chất mới, 44 chất lần đầu tiên được biết đến

trong chi Sonneratia, 21 chất lần đầu tiên được báo cáo trong Sonneratia alba và 38 chất lần đầu tiên được báo cáo trong Sonneratia ovata

Kết quả thử hoạt tính ức chế acetylcholinesterase cho thấy các cao trích của hai loài này có hoạt tính yếu hoặc không có hoạt tính Trong số các hợp chất cô lập, có 3 hợp chất phenol có tiềm năng ức chế acetylcholinesterase Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư (Hela, NCI-H460, MCF-7) cho thấy một số hợp chất, gồm 6 hợp chất phenol, 2 lignan và 1 triterpen có

hoạt tính trên 1, 2 hoặc 3 dòng tế bào này Trong đó, hai hợp chất (67, 94)

gây độc dòng tế bào MCF-7 với IC50 lần lượt là 49.75 và 41.30 g/mL, nhưng không gây độc trên tế bào nguyên sợi của người (tế bào thường) ở nồng độ 100 µg/mL

BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN

Luận án gồm 255 trang, với phần nội dung chính 143 trang được phân

ra thành các phần như sau: Giới thiệu (1 trang), Chương 1: Tổng quan (9 trang), Chương 2: Thực nghiệm (13 trang), Chương 3: Kết quả và bàn luận (102 trang), Chương 4: Kết luận và kiến nghị (2 trang), Công trình công bố (1 trang), Tài liệu tham khảo (15 trang, với 133 tài liệu tham khảo) Riêng phần Phụ lục có 112 trang gồm 215 phổ IR, 1D và 2DNMR, phổ MS Toàn bộ luận án có 23 bảng, 10 hình ảnh và 2 sơ đồ Danh mục công trình với một quyển riêng, gồm 02 bài báo đã đăng hoặc nhận đăng trong tạp chí quốc tế (Magnetic Resonance in Chemistry, Bioorganic Medicinal Chemistry Letters), 04 bài báo đăng trong tạp chí chuyên ngành trong nước (Tạp chí Khoa Học và Công Nghệ, Tạp chí Phát Triển Khoa Học và Công Nghệ, Tạp chí Y Học TP HCM)

NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Tổng hợp các tài liệu nghiên cứu về trước của các tác giả trong và ngoài nước, trên các nội dung: mô tả thực vật, những nghiên cứu về dược học và những nghiên cứu về hóa học

3

Các tài liệu tham khảo cho thấy trên thế giới, chi Sonneratia có 20 loài,

ở Việt Nam có 5 loài, trong đó loài Sonneratia caseolaris (L.) Engl được

khảo sát nhiều nhất về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM

Chương 2 liệt kê các hóa chất, thiết bị thí nghiệm, nguyên tắc thử nghiệm hoạt tính sinh học, cùng với cơ quan đo phổ nghiệm cũng như thực hiện các thử nghiệm hoạt tính sinh học

2.1 Trích ly và cô lập các hợp chất

Hình 2.1 Sonneratia alba J.E Smith Hình 2.2 Sonneratia ovata Backer

2.1.1 Điều chế các loại cao

Lá cây Bần trắng Sonneratia alba J.E Smith và cây Bần ổi Sonneratia ovata Backer được thu hái ở rừng ngập mặn Cần Giờ TP HCM và được

định danh bởi TS Võ Văn Chi và cố Dược sỹ Phan Đức Bình Mẫu tiêu bản thực vật được lưu trữ tại Bộ môn Hoá hữu cơ, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, ký hiệu mẫu US-B005 (Bần trắng) và US-B006 (Bần ổi) Mẫu được cắt nhỏ, sấy khô, xay nhuyễn và trích bằng phương pháp ngâm dầm trong methanol ở nhiệt độ phòng, dung dịch được lọc qua giấy lọc và thu hồi dung môi ở áp suất thấp, thu được cao thô metanol Phần cao thô methanol tiếp tục được hòa tan vào nước sau đó được chiết lỏng–lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần, thu hồi dung môi dưới áp suất thấp có được các cao tương ứng

2.1.2 Trích ly, cô lập các hợp chất từ hai loài thuộc chi Sonneratia

Việc trích ly và cô lập được thực hiện bằng sắc ký cột cổ điển với silica gel pha thường hoặc pha đảo RP-18 kết hợp với sắc ký bản mỏng

2.2 Thử nghiệm hoạt tính sinh học

2.2.1 Thử nghiệm hoạt tính ức chế acetylcholinesterase in vitro

Hoạt tính ức chế acetylcholinesterase của các cao chiết cũng như các hợp chất cô lập được thực hiện theo phương pháp Ellman, 1961 và chất chứng dương là galanthamine Mẫu được gửi thử nghiệm tại Khoa Dược, Đại học Y Dược TP HCM, hoặc tại Khoa Sinh, Đại học Khoa Học Tự

Nhiên – TP HCM

2.2.2 Thử nghiệm hoạt tính ức chế in vitro trên ba dòng tế bào ung thư

người và tế bào nguyên sợi của người của các hợp chất cô lập được

Hoạt tính gây độc tế bào kháng lại 3 dòng tế bào ung thư (Hela, H460 và MCF-7) của các hợp chất cô lập được thực hiện ở nồng độ 100

NCI-g/mL, sử dụng chất nhuộm Sulforhodamine B (SRB) và chất chứng dương là camptothecin Các mẫu có hoạt tính được tiến hành thử nghiệm xác định liều IC50 và khả năng gây độc trên tế bào nguyên sợi của người Mẫu được gửi thử nghiệm tại Khoa Sinh, Trường Đại học Khoa Học Tự

Nhiên – TP HCM

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả khảo sát cấu trúc hóa học

Từ lá của hai loài cây Bần trắng và Bần ổi, chúng tôi đã cô lập được 58 hợp chất, trong đó có 7 hợp chất mới, một hỗn hợp của 2 hợp chất mới Cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được xác định bằng cách phân tích các

dữ liệu phổ nghiệm MS, 1D và 2D–NMR, đo năng lực triền quang và nhiệt

độ nóng chảy, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo, đã được trình bày chi tiết trong quyển luận án

Các hợp chất được phân loại theo 7 nhóm, như sau:

Hợp chất 74a và 74b được cô lập từ phân đoạn A2 của loài S ovata

 Khối phổ: HR-ESI-MS (ghi nhận ion dương): m/z 261.1479 [M+Na]+

(tính toán lý thuyết cho C14H22O3+Na, 261.1467)

 Phổ 1H, 13C–NMR: Trình bày trong Bảng 3.1

Phổ 1H và 13C–NMR của 74 cho thấy các cặp tín hiệu hiện diện với tỉ lệ

khoảng 1.2:1.0; vì vậy nó được đề nghị là một hỗn hợp của hai xuyên lập

thể phân 74a và 74b Phổ proton của 74 cho thấy một tín hiệu mũi đôi tại

δH 1.30 (3H, d, 6.5 Hz, H–10) của một nhóm methyl gắn kề với một nhóm methine Điều này cũng phù hợp với tương quan COSY của proton H–10 với tín hiệu proton tại δH 3.80 (1H, quint–like, H–9) Hơn thế nữa, phổ COSY cũng cho thấy các tín hiệu tương quan của proton H–9 với proton olefin tại δH 5.72 (1H, dd, 15.6, 5.1 Hz, H–8), của proton H-8 với một proton olefin khác tại δH 5.73 (1H, d, 15.6 Hz, H–7) Vì vậy, 74 được đề

nghị có mảnh >C–CH=CH–CH(OR)CH3 trong công thức Hằng số ghép

lớn 15.6 Hz đề nghị cấu hình E của nối đôi tại C–7

Phổ proton cũng cho thấy một tín hiệu mũi đơn proton olefin tại δH 5.89 (H–4), và tín hiệu này có tương quan COSY với tín hiệu proton methyl bị giảm chắn tại δH 1.90 (3H, s, H–13) Điều này cho thấy nhóm methyl này

gắn trực tiếp vào nối đôi Bên cạnh đó, phổ HMBC cho thấy tương quan của H–13 với các tín hiệu carbon tại δC 127.0 (=CH–, C–4), 162.8 (>C=,

C–5), và 79.2 (>C(OH)–, C–6), vì vậy 74 có mảnh –

CH=C(CH3)–C(OH)< trong công thức

Ở vùng từ trường cao, phổ proton của 74 còn cho thấy cặp tín hiệu

proton mũi đơn của hai nhóm gem–methyl tại δH 1.07 (H–11) và 0.99 (H–12) của nhóm >C(CH3)2, cặp tín hiệu proton mũi đôi với hằng số ghép lớn 16.8 Hz tại δH 2.41 và 2.26 mà cùng có tương quan HSQC với carbon tại δC49.9 (C–2) Hơn nữa, phổ HMBC cho thấy tương quan của H–11 và H–12 với các carbon C–1 (δC 41.3, >C<), C–2, và C–6, của cả hai proton methylene H–2a và H–2b với các carbon C–1, C–3 (δC 198.0), C–4, C–6,

C–11, và C–12 Vì vậy, 74a và 74b được đề nghị với khung

6,9-dihydroxymegastigmane-4,7-diene-3-one

Bên cạnh đó, mỗi hợp chất còn có một nhóm methoxy Tín hiệu của hai nhóm methoxy này cộng hưởng tại δH 3.24 (3H, s, –OCH3) và δC 56.3 (–OCH3), và tại δH 3.26 (3H, s, –OCH3) và δC 56.3 (–OCH3) Nhóm methoxy gắn vào khung megastigmane tại C–9 được xác định dựa trên tương quan HMBC của proton methoxy với carbon C–9

Theo tác giả Yamano và Ito, hai đồng phân (6S,9R) và (6S,9S) của

vomifoliol hữu triền có giá trị lần lượt là +214.1 và +197.8, và hai đồng

phân (6R,9S) và (6R,9R) tả triền có giá trị lần lượt là –195.8 và –205.2

Hợp chất 74 chỉ khác vomifoliol ở chỗ có thêm một có nhóm methoxy tại

C–9 và có năng lực triền quang là [α] +158.3 (c 1.2, MeOH) Vì vậy, 74

được đề nghị là hỗn hợp của hai xuyên lập thể phân (6S,9R) và (6S,9S) với

tỉ lệ khoảng 1.2:1.0 (74a và 74b)

Khối phổ phân giải cao HR–ESI–MS cho mũi ion phân tử giả tại m/z

261.1479 [M+Na]+, tương ứng với công thức phân tử C14H22O3 (tính toán lý thuyết của C14H22O3+Na là 261.1467) Tất cả những dữ kiện trên đề nghị

cấu trúc của 74 là hỗn hợp với tỉ lệ (1.2:1.0) của sonnerstigmane A

Ghi chú: c: Chloroform–d m: Methanol–d4

*: Bộ tín hiệu phổ của 74a và 74b có thể trao đổi cho nhau

3.1.2 Khảo sát cấu trúc hóa học của sonnerstigmane D (79)

Hợp chất 79 thu được từ phân đoạn A8 của sơ đồ 2 của loài S ovata

 Dạng dầu không màu

 [α] +2.3 (c 0.48, MeOH)

 Khối phổ phân giải cao: HR-ESI-MS (ghi nhận ion dương): m/z

409.1858 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết của C19H30O8+Na, 409.1838)

 Phổ 1H, 13C-NMR: Trình bày trong Bảng 3.1

Khối phổ phân giải cao HR–ESI–MS cho mũi ion phân tử giả tại m/z

409.1858 [M+Na]+, tương ứng với công thức phân tử C19H30O8 (tính toán

lý thuyết của C19H30O8+Na là 409.1838) Phổ 1H và 13C–NMR của 79 cho thấy những tín hiệu của khung megastigmane giống như 74a và 74b Tuy nhiên, hợp chất 79 khác với 74a và 74b ở vị trí của nối đôi tại C–6 và sự

hiện diện thêm một proton methine gắn oxygen tại δH 4.75 (1H, dd, 10.0, 5.0 Hz, H–8) và bớt một tín hiệu proton olefin Điều này cũng phù hợp với phổ 13C-NMR của 79 cho thấy sự hiện diện thêm một carbon methine gắn

với oxygen tại δC 72.3 (C–8) thay vì một tín hiệu carbon tứ cấp gắn oxygen

tại 80 ppm của C–6 trong hợp chất 74a và 74b Quan sát này cũng được

xác định dựa vào tương quan COSY của proton olefin H–7 tại δH 6.09 (1H,

d, 10.0 Hz) với proton carbinol H–8 tại δH 4.75 (1H, dd, 10.0, 5.0 Hz), của H–8 với proton carbinol H–9 tại δH 3.83 (1H, m), và của H–9 với proton methyl tại δH 1.30 (3H, d, 6.5 Hz, H–10) (Hình 3.1) Hơn nữa, phổ HMBC cho thấy tín hiệu tương quan của proton H–10 với hai carbon gắn oxygen tại δC 72.3 (C–8) và 82.1 (C–9), của H–13 tại δH 2.15 (3H, s) với các carbon olefin tại δC 127.3 (C–4), 158.9 (C–5), và 145.2 (C–6) (Hình 3.1) Phổ 1H–NMR của 79 cũng cho thấy một tín hiệu proton anomer tại δH4.46 (1H, d, 7.5 Hz, H–1’) và những tín hiệu proton carbinol cộng hưởng từ 3.26–3.86 ppm của một đơn vị đường β–D–glucose Điều này phù hợp với

sự hiện diện của một tín hiệu carbon anomer tại δC 105.7 và năm tín hiệu carbon carbinol cộng hưởng từ 62.7 đến 78.0 ppm Nhóm glucose gắn vào phần aglycone tại C–9 được xác định bởi tương quan HMBC của proton anomer H–1’ với carbon C–9 Phổ NOESY (Hình 3.1) cho thấy tương quan của proton olefin H–7 và proton methyl H–13, vì vậy, nối đôi tại C–6 có

cấu hình E

Đơn vị đường glucose được xác định là đường β- dựa trên hằng số ghép cặp lớn 7.5 Hz của tín hiệu proton anomer tại δH 4.46 Phổ HMBC cho thấy tín hiệu tương quan với cường độ mạnh của proton H–1´ và C–9,

9

Hình 3.1 Một số tương quan COSY, HMBC và NOESY của 79 và 80

Hình 3.2 Cấu trạng của hai hợp chất 79 và 80 (Cấu trúc của 80 là thay

nhóm O-glucopyranosyl bằng nhóm hydroxyl và cấu trạng của 80 tương

ứng lần lượt là A’, B’, C’, D’, E’, F’, G’, H’, I’, J’ và K’)

của proton H–9 và C–1´, và phổ NOESY cũng cho thấy tín hiệu tương quan mạnh của proton H–9 và proton H–1´ (Hình 3.1) Điều này đề nghị hai proton H–9 và proton H–1´ gần nhau trong không gian Hơn nữa, tín hiệu tương quan NOESY mạnh của H–8 với cả proton methyl H–11 và H–12 cho thấy proton H–8 hướng về phía gần những proton methyl này Từ

những thông tin trên, 12 cấu trạng của hợp chất 79 được đề nghị như trong

Hình 3.2

Cấu hình tuyệt đối của hai carbon gắn oxygen C–8 và C–9 được xác định dựa trên sự ghép cặp H-H, cường độ của tín hiệu tương quan NOESY, giá trị tính toán lý thuyết mức độ che chắn hạt nhân 13C và năng lượng của

các cấu trạng của hợp chất 79 Việc tính toán theo thuyết hàm mật độ

(density functional theory: DFT) dựa trên phần mềm Gaussian 09, các cấu trạng được tối ưu hóa hoàn toàn sử dụng các biến B3LYP của thuyết hàm

mật độ Trong tất cả các cấu trạng của 79, mức độ che chắn hạt nhân của

các carbon C–7, C–8, C–9, C–10, C–1´, CH3–11 và CH3–12 được tính toán

vì những carbon này bị ảnh hưởng nhiều nhất bởi cấu trạng và cấu hình khác nhau Kết quả được trình bày trong Hình 3.2

Phổ NOESY cho thấy tương quan với cường độ mạnh của proton H–8

và proton H–10, nên bốn cấu trạng A, D, I và L là không phù hợp Tương quan NOESY rất yếu của H–8 and H–9 cho thấy hai proton này xa nhau không gian, vì vậy các cấu trạng B, E, H, và K cũng không phù hợp Từ những thông tin này, chỉ còn bốn cấu trạng C, F, G, và J là phù hợp với các tương quan NOESY Tiếp theo, G và J bị loại bởi vì hai cấu trạng này có hệ

số tương quan (R2) giữa mức độ che chắn hạt nhân theo tính toán và độ dịch chuyển hóa học của các carbon tương ứng thấp hơn hai cấu trạng còn lại F và C (Hình 3.2) Việc phân biệt hai cấu trạng này dựa trên các giá trị năng lượng theo tính toán lý thuyết Cấu trạng E đã bị loại, mà năng lượng tính toán của cấu trạng F lại cao hơn E là 23 KJ, vì vậy cấu trạng F kém ưu đãi hơn E, vì thế F bị loại Ngược lại, cấu trạng C thì ưu đãi hơn cấu trạng