BÁO CÁO THỰC TẬP XÉT NGHIỆM Y HỌC DỰ PHÒNG

nhằm đánh giá tình trạng vệ sinh môi trường nước, ngộ độc thực phẩm về mặt vi sinh như: tổng số vi khuẩn hiếu khí, Coliform, E.Coli, Staphylococci dương tính với Coagulase, Staphylococcu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

BÁO CÁO THỰC TẬP XÉT NGHIỆM Y HỌC DỰ PHÒNG

Đối tượng: Sinh viên YHDP K35 Thời gian thực hiện:

Giảng viên hướng dẫn:

Nhóm sinh viên thực hiện:

Dương Hưng (09530400

Võ Sen Hồng(09530400 Lâm Quốc Thi(09530400 Đinh Hoàng Nhớ(09530400 Nguyễn Đình Trung(0953040051)

CẦN THƠ - 2015

Chương I ĐĂT VẤN ĐỀ 1

Chương II KẾT QUẢ THỰC HIỆN 3

2.1 PHÒNG VI SINH NƯỚC - THỰC PHẨM 3

2.2 PHÒNG LÝ HÓA NƯỚC-THỰC PHẨM 8

2.3 PHÒNG KÍ SINH 11

2.4 PHÒNG HUYẾT THANH HỌC 15

2.5 PHÒNG VI SINH BỆNH 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Phụ lục 1

Chương I ĐĂT VẤN ĐỀ

Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, hiện nay công tác bảo vệ vàchăm sóc sức khỏe người dân không chỉ đơn thuần là khám chữa bệnh mà đangtập trung ưu tiên vào vấn đề phòng bệnh là chủ yếu Và trong hoạt động phòngbệnh thì xét nghiệm y học dự phòng là một lĩnh vực không thể thiếu và có thểứng dụng trong tất cả các lĩnh vực để đáp ứng với sự phát triển của xã hội

Vấn đề đầu tiên của xét nghiệm y học dự phòng chính là xét nghiệm chẩnđoán người bệnh, người lành mang trùng, ổ nhiễm trùng giúp cho vấn đề điều trịcho người bệnh nói riêng và mở rộng hơn là xác định ổ dịch tiến tới đưa ra nhữngquyết định quan trọng để dập dịch hạn chế bệnh truyền nhiễm lan rộng ra cộngđồng Các nhân tố vi sinh thường gặp nhất trong xét nghiệm y học dự phòngthường là tả, lỵ trực trùng, thương hàn, E Coli, Coliforms, HIV, Viêm gan siêu

vi B, kí sinh trùng sốt rét, Clostridium pefringans…

Bên cạnh đó, xét nghiệm các yếu tố môi trường học như các nhân tố lý hóatrong nước và thực phẩm cũng là một lĩnh vực rất quan trọng trong xét nghiệm yhọc dự phòng Để làm được điều này, ngoài hệ thống tiêu chuẩn, quy chuẩn, quytrình hết sức chặt chẽ, người xét nghiệm cần phải có kiến thức tốt, tinh thần tráchnhiệm cao và sự tỉ mỉ trong từng thao tác lấy mẫu, xét nghiệm và báo cáo Kếtquả của quá trình này chính là công bố các tiêu chuẩn môi trường, nước uống,nước sinh hoạt, thực phẩm…để phục vụ trong công tác chuyên môn cũng nhưgiải quyết một số vấn đề cấp thiết của dư luận

Tuy có những tiến bộ to lớn về điều trị và phòng ngừa bệnh truyền nhiễmtrong nhiều thập niên qua, nhưng hiện nay nó vẫn còn là nguyên nhân chính gâybệnh tật, tử vong, làm tồi tệ cho điều kiện sống của nhiều triệu người trên toàncầu, nhất là tại các nước đang phát triển

Riêng năm 2014, tình hình dịch bệnh trên thế giới diễn biến hết sức phứctạp, nhiều dịch bệnh mới nổi và nguy hiểm phát sinh, gia tăng đột biến tại nhiềunước trên thế giới, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe và kinh tế Có thểliệt kê như: bệnh Ebola bùng phát mạnh mẽ, cúm A(H7N9), cúm A(H5N6) đãbùng phát tại Trung Quốc với hàng trăm trường hợp mắc và tử vong, dịch bệnhMERS-CoV hoành hành ở Trung Đông Để đối phó với vấn đề đó, toàn ngành y

tế nói chung và ngành xét nghiệm y học dự phòng nói riêng cần thường xuyên,liên tục trang bị và cập nhật kiến thức, kĩ năng để có đủ năng lực để xét nghiệmsàng lọc, phát hiện các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm như trên

Đối với đối tượng bác sĩ y học dự phòng, mặc dù có thể không trực tiếpthực hiện, nhưng việc nắm bắt các nguyên tắc và tự trang bị cho mình những kiếnthức và kỹ năng cơ bản về xét nghiệm vi sinh y, ký sinh học, các kỹ thuật nuôi

cấy, soi phân tươi, phân lập để xác định các vi khuẩn gây bệnh, xét nghiệm cơbản để chẩn đoán bệnh ký sinh trùng, cách làm một số loại tiêu bản ký sinh trùng,cách thực hiện một số test chẩn đoán vi khuẩn, virus là hết sức cần thiết Việclàm trên vừa tích lũy kiến thức, kĩ năng chuyên môn vừa góp phần cùng với hệthống y tế công cộng, y học dự phòng cả nước chung tay bảo vệ sức khỏe toàndân.

Sau khi học xong học phần xét nghiệm y học dự phòng, sinh viên phải cócác khả năng:

1 Thực hiện các kỹ năng lấy và bảo quản bệnh phẩm cho các xét nghiệm Y học dự phòng.

2 Thực hiện và đánh giá kết quả của một số xét nghiệm xác định vi khuẩn, virus, ký sinh trùng của một số bệnh phổ biến hiện nay.

3 Thực hiện và đánh giá kết quả của một số xét nghiệm đáng giá tình trạng ô nhiễm của mẫu nước, thực phẩm.

Chương II KẾT QUẢ THỰC HIỆN

2.1 PHÒNG VI SINH NƯỚC - THỰC PHẨM

2.1.1 Cơ cấu tổ chức, hoạt động của phòng vi sinh nước – thực phẩm

a Cơ cấu tổ chức của phòng vi sinh nước – thực phẩm

b Hoạt động của phòng vi sinh nước – thực phẩm

Phân tích các chỉ tiêu vi sinh chỉ thị và vi sinh gây bệnh trong môi trườngnước, thực phẩm, nông sản thực phẩm… nhằm đánh giá tình trạng vệ sinh môi

trường nước, ngộ độc thực phẩm về mặt vi sinh như: tổng số vi khuẩn hiếu khí,

Coliform, E.Coli, Staphylococci dương tính với Coagulase, Staphylococcus aureus, Streptococcus fecalis, Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Clostridia, Bacillus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium perfringens, tổng số bào tử nấm men, nấm mốc…

2.1.2 Các hoạt động xét nghiệm của phòng vi sinh nước – thực phẩm

Trong thực phẩm

TCVN 6846 ; 2007TCVN 6505 – 1; 1999

2.1.3 Các thường qui kiểm nghiệm

a Định lượng Pseudomonas aerugino

Phạm vi áp dụng: Phương pháp này được áp dụng để phát hiện các ô

nhiễm do Pseudomonas aeruginosa trong các sản phẩm thực phẩm và thức ăn

chế biến sẵn

Nguyên tắc chung: Sử dụng phương pháp cấy đếm Pseudomonas

aeruginosa trên môi trường nuôi cấy chuyên biệt, sau khi ủ ở nhiệt độ 42oC trong

48h Chọn các khuẩn lạc nghi ngờ xác định Pseudomonas aeruginosa bằng

phương pháp thử nghiệm sinh vật hóa học theo thường quy

Lấy mẫu, chuẩn bị mẫu, bảo quản, chuyển mẫu: Tuân theo cách lấy mẫuQT.ĐBCL.LM.01/VS

Thiết bị, Dụng cụ: Dụng cụ và thiết bị chuyên dụng trong phòng kiểmnghiệm vi sinh vật

Môi trường, thuốc thử: Thạch Pseudomonas (Pseudomonas agar), Thạchdinh dưỡng (Nutrient agar), Canh thang BHI (Brain Heart Infusion), Dung dịchđệm peptone (Buffer peptone water – BPW), Simmon citrate, Canh thang ure,Canh thang Indol, Lysin decarboxylase (LDC), Môi trường TSI, Thuốc nhuộmGram, Thuốc thử Kovac’s, Thuốc thử oxidase

b Định lượng Staphylococci

Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng

Staphylococci có phản ứng dương tính với Coagulase trên đĩa thạch có mặt trong

các sản phẩm dùng cho con người hoặc thức ăn chăn nuôi, bằng cách đếm sốkhuẩn lạc thu được trên môi trường đặc (môi trường Baird-Parker) sau khi ủtrong điều kiện hiếu khí ở 35oC đến 37oC

Nguyên tắc chung:

- Cấy lên bề mặt của môi trường đặc chọn lọc, sử dụng 2 đĩa, dùng 1lượng mẫu qui định nếu sản phẩm ở dạng lỏng, hoặc với 1 lượng huyền phù banđầu nếu sản phẩm ở dạng khác

- Trong cùng 1 điều kiện, cấy các dung dịch pha loãng mẫu thập phân củamẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu, dùng 2 đĩa cho mỗi độ pha loãng

- Ủ 35oC hoặc 37oC, kiểm tra sau 24 h và 48 h

- Tính số lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với Coagulase

trong 1 ml hoặc 1g mẫu từ số lượng khuẩn lạc điển hình và/hoặc không điển hìnhtrên các đĩa ở các độ pha loãng đã chọn sao cho kết quả có ý nghĩa và đượckhẳng định bằng kết quả thử nghiệm Coagulase dương tính

Lấy mẫu, chuẩn bị mẫu, bảo quản, chuyển mẫu: Tuân theo cách lấy mẫuQT.ĐBCL.LM.01/VS

Thiết bị, Dụng cụ: Dụng cụ và thiết bị chuyên dụng trong phòng kiểmnghiệm vi sinh vật

Môi trường, thuốc thử: Thạch Baird-Parker, Thạch BHI, Huyết tương thỏ,Dung dịch đệm peptone (BPW)

c Định lượng Salmonella

Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện

Salmonella trên đĩa thạch, trong đó Salmonella typhy và Salmonella paratyphy

Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho:

- Các sản phẩm dùng cho con người và thức ăn chăn nuôi

- Các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và xử lý thực phẩm

Nguyên tắc chung:

Quy trình phát hiện Salmonella trong thực phẩm phải trải qua 4 giai đoạn:

Tăng sinh không chọn lọc, tăng sinh chọn lọc, dựa vào hình thái điển hình trêncác môi trường nuôi cấy chọn lọc, thử tính chất sinh hóa và kháng huyết thanhcủa vi khuẩn để xác định

Chú thích: Salmonella có thể có mặt với 1 lượng nhỏ và thường kèm theo 1 lượng khá lớn các vi sinh vật thuộc họ Enterobacteriacea hoặc các họ khác Do

đó cần tăng sinh sơ bộ để đảm bảo phát hiện 1 lượng nhỏ Salmonella hoặc

Salmonella bị suy giảm

Lấy mẫu, chuẩn bị mẫu, bảo quản, chuyển mẫu: Tuân theo cách lấy mẫuQT.ĐBCL.LM.01/VS

Thiết bị, Dụng cụ: Dụng cụ và thiết bị chuyên dụng trong phòng kiểmnghiệm vi sinh vật

Môi trường và thuốc thử: Dung dịch đệm peptone, Môi trường tăng sinh

chọn lọc thứ nhất: RVS, Môi trường chọn lọc thứ hai: MKTTn, Thạch XLD,Thạch dinh dưỡng, Thạch dinh dưỡng nữa đặc, Thạch TSI, Thạch Ure, Môitrường Lysin decacboxyl, Thuốc thử -Galactosidase, Thuốc thử VP, Môi trườngTryptophan broth, Thuốc thử Kovac’s, Thuốc thử KOH 40%, -Naphtol, Thuốcnhuộm Gram, Huyết thanh, Dung dịch nước muối sinh lý

d Định lượng Streptococcus faecalis

Phạm vi áp dụng: Phương pháp này được áp dụng để phát hiện các ô

nhiễm do Streptococcus faecalis trong các sản phẩm thực phẩm và thức ăn chế

biến sẵn

Nguyên tắc chung: Streptococcus faecalis (Liên cầu phân): Có thể phát

triển được trong môi trường có Natri Azid 0,04 % tạo thành các khuẩn lạc màu

đỏ và nâu đỏ Lựa chọn khuẩn lạc điển hình, xác định tính chất sinh vật hóa họctheo thường quy

Lấy mẫu, chuẩn bị mẫu, bảo quản, chuyển mẫu: Tuân theo cách lấy mẫuQT.ĐBCL.LM.01/VS

Thiết bị, Dụng cụ: Dụng cụ và thiết bị chuyên dụng trong phòng kiểmnghiệm vi sinh vật

Môi trường và thuốc thử

Canh thang Natri azit, Thạch TTC Natri azit (Thạch Slanetz và Barley),Canh thang Azit etyl màu tía (SF), Dung dịch đệm peptone (Buffer peptonewater – BPW), Thuốc nhuộm Gram

e Định lượng Bacillus cereus

Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng

Bacillus cereus giả định có khả năng mọc được trên đĩa thạch bằng kỹ thuật đếm

khuẩn lạc ở 30oC Phương pháp này có thể áp dụng cho:

- Các sản phẩm dùng cho con người, thức ăn chăn nuôi

- Các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và xử lý thực phẩm

Chú thích: Để cho phương pháp thử mang tính thực tiễn thì giai đoạnkhẳng định đã giới hạn về thử điển hình trên thạch MYP và thử hồng cầu Do

đó, thuật ngữ giả định đã được đưa vào để công nhận thực tế là giai đoạn khẳng

định không thể phân biệt được B.cereus với các loài Bacillus khác có liên quan mật thiết, nhưng thường ít gặp phải như: B.thuringiensis, B.weithenstephanensis,

B.mycoides Một phép thử di động bổ sung có thể giúp phân biệt Bacillus cereus với Bacillus anthracis khi nghi ngờ có mặt của Bacillus anthracis.

Nguyên tắc chung:

Cấy 1 lượng xác định của mẫu thử nếu mẫu thử nếu sản phẩm ở dạng lỏnghoặc huyền phù ban đầu nếu sản phẩm ở dạng khác, lên bề mặt môi trường cấyđặc chọn lọc đựng trong đĩa petri vô trùng

Chuẩn bị các cặp đĩa thạch khác trong cùng 1 điều kiện, dùng các dungdịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu

Ủ các đĩa này ở 30oC trong 18 h đến 48 h

Tính số lượng Bacillus cereus giả định có trong 1 mililit hoặc 1 gam mẫu

thử được tính từ số khuẩn lạc điển hình đã được khẳng định trên mỗi đĩa ở các độpha loãng đã chọn sao cho kết quả có ý nghĩa và được khẳng định theo quy địnhcủa phép thử này

Lấy mẫu, chuẩn bị mẫu, bảo quản, chuyển mẫu: Tuân theo cách lấy mẫuQT.ĐBCL.LM.01/VS

Thiết bị, Dụng cụ: Dụng cụ và thiết bị chuyên dụng trong phòng kiểmnghiệm vi sinh vật

Môi trường và thuốc thử

Môi trường thạch Manitol Egg York – Polimycin B sulfat (MYP), Thạchmáu cừu, Thuốc nhuộm Gram, Dung dịch đệm peptone (BPW)

f Định lượng E.coli

Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này qui định phương pháp định lượng

Escherichia coli dương tính ß glucuronidaza trong thực phẩm hoặc thức ăn chăn

nuôi Phương pháp này sử dụng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 44oC trên môi trường

đặc có chứa thành phần tạo sắc để phát hiện enzyme ß Glucuronidaza.

CẢNH BÁO – Một số chủng Escherichia coli không phát triển được ở 44oC

và cụ thể là các Escherichia coli âm tính β - Glucuronidaza như Escherichia coli

0157 sẽ không phát hiện được

Nguyên tắc chung: Cấy một lượng mẫu thử xác định hoặc với một lượngxác định huyền phù ban đầu lên các đĩa kép chứa môi trường Trypton – mật -glucuronid (TBX)

- Sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyềnphù ban đầu cấy vào hai đĩa cho mỗi dung dịch pha loãng, trong cùng một điềukiện

- Các đĩa này được ủ ở (44 ± 1)oC trong 18 h đến 24 h rồi kiểm tra để phát

hiện sự có mặt của các khuẩn lạc đặc trưng được coi là Escherichia coli dương

Thuốc thử, môi trường

Dịch pha loãng: Dung dịch đệm peptone ( BPW ), Môi trường nuôi cấy:Thạch trypton - mật – glucuronid ( TBX )

g Định lượng Coliform

Phạm vi áp dụng: Phương pháp này có thể áp dụng cho:

- Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, và

- Các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và chế biến thực phẩm.Bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc trên môi trường đặc sau khi ủ ở 30oC hoặc 37oC.

Chú thích: Nhiệt độ cần thỏa thuận giữa các bên liên quan Trong trườnghợp đối với sữa và các sản phẩm từ sữa, thì nhiệt độ ủ là 30oC

Kỹ thuật này được khuyến cáo sử dụng khi số lượng khuẩn lạc cần tìm dựkiến lớn hơn 100 trên mililit hoặc trên gam mẫu thử

Nguyên tắc chung:

Chuẩn bị 2 môi trường đặc chọn lọc, và lấy 1 lượng mẫu thử theo quyđịnh nếu là sản phẩm thử ban đầu là chất lỏng, hoặc lấy 1 lượng huyền phù banđầu theo quy định nếu sản phẩm ở dạng khác

Chuẩn bị các cặp đĩa môi trường chọn lọc khác trong cùng 1 điều kiện,dùng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù banđầu

Ủ các đĩa này ở 30oC hoặc 37oC (như thỏa thuận) trong 24 h

Đếm các khuẩn lạc đặc trưng và nếu cần, số khuẩn lạc được khẳng định bằnglên men Lactoza

Số Coliform có trong 1 mililit hoặc 1 gam mẫu thử được tính từ số khuẩn

lạc đặc trưng thu được trên các đĩa được chọn

Lấy mẫu, chuẩn bị mẫu, bảo quản, chuyển mẫu: Tuân theo cách lấy mẫuQT.ĐBCL.LM.01/VS

Thiết bị, Dụng cụ: Dụng cụ và thiết bị chuyên dụng trong phòng kiểmnghiệm vi sinh vật

Môi trường, thuốc thử

Dung dịch đệm peptone ( BPW), Thạch VRB Agar, Canh thang mậtlactoza lục sáng ( BGBL)

2.1.4 Kĩ thuật kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm

2.1.4.1 Các bước tiến hành

a Chuẩn bị môi trường và thuốc thử

Phụ lục pha chế môi trường và thuốc thử được đính kèm trang cuối củaquy trình kiểm nghiệm QT.KN.02/VS.TP (theo TCVN 6404 (ISO 7218), TCVN8128-1 (ISO/TS 11133-1), TCVN 8128-2 (ISO /TS 11133-2))

b Mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng tiếp theo

Theo TCVN 6507-1 (ISO 6887-1), đối với sản phẩm sữa theo TCVN 6263

(ISO 8261) Chuẩn bị một dãy các dung dịch pha loãng từ mẫu thử nếu sản phẩm

ở dạng lỏng hoặc từ huyền phù ban đầu nếu sản phẩm ở dạng khác

∑ a : Tổng số khuẩn lạc cho kết quả thử nghiệm khẳng định cho kết quảđúng với Coliforms;

V: Thể tích mẫu thử cấy trên đĩa đã chọn ;

n1: Số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ nhất ;

n2: Số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ hai ;

d: Độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng thứ nhất đã chọn.

2.1.4.3 Ghi chép và thông báo kết quả

- Nhân viên được phân công thử nghiệm ghi chép vào báo cáo kiểmnghiệm vi sinh thực phẩm BM 5.10.2/VS.TP.01

- Trả kết quả nội bộ (có xem xét và xác nhận của QLKT) cho bộ phậnnhận mẫu – kết quả và lưu kết quả tại labo

- Nếu kết quả có vấn đề nghi ngờ cần phải họp và thảo luận tại phòng thửnghiệm để có hướng giải quyết

2.1.5 Độ chính xác, độ đúng, độ không đảm bảo đo (các thông số đã định trị)

Tuân theo QT.ĐBCL.XĐPPT.01/VS

2.1.6 Biểu mẫu áp dụng

- BM 5.10.2/VS.TP.01: Báo cáo kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm

- BM.5.10.5: Phiếu kết quả kiểm nghiệm nội bộ

Sử dụng dãy chuẩn đã được xây dựng (theo 3.1) trên máy quang phổ kế

Từ Abs của mẫu đo được tính ra (mg/L) Fe Sử dụng đường chuẩn có R2≥ 0.99.Nếu mẫu được pha loãng, ta tính kết quả cuối cùng theo công thức sau:

Kết luận: Điểm của mẫu thử nằm trên đường chuẩn, do đó mẫu thử là mẫu

đạt tiêu chuẩn Qua xét nghiệm này chúng em đã biết được cách đo nồng độ sắttổng trên máy Quang phổ UV-Vis, thực hành các kĩ năng trong xét nghiệm lý hóatrong phòng xét nghiệm, từ khâu chuẩn bị dụng cụ, thuốc thử, cách lấy mẫu,

II XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG SULFATE (SO 4 2- ) TRONG NƯỚC

(THEO EPA-375.4-1997)

1 NGUYÊN TẮC CHUNG (PHỤ LỤC 1)

2 CÁCH TIẾN HÀNH (PHỤ LỤC 1)

3 CÁCH TÍNH TOÁN

Sử dụng dãy chuẩn đã được xây dựng (theo 3.1) trên máy quang phổ kế

Từ Abs của mẫu đo sẽ được tính ra mg/L SO42- dựa trên đường chuẩn Sử dụngđường chuẩn có R2 ≥ 0.99 Nếu mẫu được pha loãng, ta tính kết quả cuối cùngtheo công thức sau: mg SO42-/L= Cx ¿ f

Trong đó: - Cx: Nồngđộ mẫu đo được, f: Hệ số pha loãng mẫu

Kết luận: Điểm của mẫu thử nằm trên đường chuẩn, do đó mẫu thử là

mẫu đạt tiêu chuẩn

III XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PHOSPHATE (PO 4 3- ) TRONG NƯỚC

1 NGUYÊN TẮC CHUNG (PHỤ LỤC 1)

2 CÁCH TIẾN HÀNH (PHỤ LỤC 1)

3 CÁCH TÍNH TOÁN

Sử dụng dãy chuẩn đã được xây dựng (theo 6.1) trên máy quang phổ kế.

Từ Abs của mẫu đo sẽ được tính ra mg/L PO43- dựa trên đường chuẩn Sử dụngđường chuẩn có R2≥0.99 Nếu mẫu được pha loãng, ta tính kết quả cuối cùngtheo công thức sau:mg PO43- /L = Cx ¿ f

Trong đó: - Cx: Nồngđộ mẫu đo được , f: Hệ số pha loãng mẫu

Đường chuẩn xây dựng có R2 đạt chuẩn của một đường chuẩn với R2 ≥0,99 (1>=R2>=0,99).

Kết luận: Điểm của mẫu thử nằm trên đường chuẩn, do đó mẫu thử là mẫu đạt

m – khối lượng mẫu thử, tính bằng g;

0,0014 – Số g nitơ tương ứng với 1ml dung dịch natri – hydroxyt 0,1 N;

Hàm lượng protein thô (X2) tính bằng phần trăm theo công thức:

 X 2 = X1 6,25=0,853%

Trong đó: X1 – Hàm lượng nitơ tổng số, tính bằng phần trăm

6,25 – Hệ số chuyển nitơ tổng số ra protein thô (100:16 = 6,25)

Kết luận: Hàm lượng nitơ tổng của mẫu nước mắm đạt chuẩn cho phép II.PHÁT HIỆN NHANH ACID BORIC/ NATRI BORATE TRONG THỊT

VÀ SẢN PHẨM THỊT THEO AOAC 959.09-2000

1 NGUYÊN TẮC CHUNG (PHỤ LỤC 1)

2 CÁCH TIẾN HÀNH (PHỤ LỤC 1)

3 BÁO CÁO KẾT QUẢ

Quan sát màu giấy nghệ của mẫu thử so sánh với màu giấy nghệ của mẫu trắng:

+ Màu của giấy nghệ của mẫu thử chuyển từ vàng sang đỏ có 2 mẫu dương

tính

+ Màu của giấy nghệ của mẫu thử giống màu của giấy nghệ của mẫu trắng

thì kết luận: mẫu thử không có acid boric (natri borat) có 1 mẫuâm tính.

III XÁC ĐỊNH TRỊ SỐ PEROXIDE TRONG DẦU MỠ (AOAC

Trong đó: S là số ml Na2S2O3 (đã được điều chỉnh với mẫu trắng: số ml Na2S2O3

dùng để chuẩn độ mẫu thử - số ml Na2S2O3 dùng để chuẩn độ mẫu trắng);

2.3.1 Cơ cấu tổ chức, hoạt động của phòng ký sinh

a Cơ cấu tổ chức của phòng ký sinh

trùng

- Trực tiếp xét nghiệm vàtrả lời kết quả

đường ruột

b Hoạt động của phòng ký sinh

- Tham gia công tác lấy mẫu khám sức khỏe tại trung tâm, Xí nghiệp và cácnhà hàng, khách sạn của quận, huyện TP Cần Thơ

- Tham gia phòng xét nghiệm tổng hợp.

- Tham gia công tác công đoàn

- Hỗ trợ các phòng khi có yêu cầu của khoa

3.2 Các hoạt động xét nghiệm của phòng ký sinh

- Thực hiện các xét nghiệm để tìm ký sinh trùng trong máu và phân

3.3 Kỹ thuật xét nghiệm ký sinh trùng sốt rét

1 Thời gian và vị trí lấy máu

- Để tìm được ký sinh trùng sốt rét nhiều nhất phải lấy máu vào lúc bắt đầulên cơn sốt hoặc đang lên cơn sốt Tốt nhất nên lấy máu khi bệnh nhân chưa đượcđiều trị Nếu đã điều trị thì số lượng ký sinh trùng sốt rét sẽ giảm hẳn, khó pháthiện

- Vị trí lấy máu: Thường lấy máu ở đầu ngón tay nhẫn trái hoặc ngón giữa

Có thể lấy máu ở dái tai Đối với trẻ nhỏ, để tránh cho trẻ sợ hãi nên lấy máu ởngón chân cái hoặc gót chân

2 Phương pháp làm tiêu bản

- Làm tiêu bản máu đặc (giọt dày): Giọt đặc có ưu điểm là lấy nhiều máunên tập trung nhiều ký sinh trùng

- Làm tiêu bản máu đàn (giọt mỏng): Tiêu bản máu đàn do hồng cầu không

bị phá vỡ nên hình thể ký sinh trùng đẹp và điển hình Các thành phần hữu hìnhcủa máu đều đẹp và rõ ràng Việc xác định thể loại ký sinh trùng trên giọt máuđàn là tốt nhất Vì vậy trong chẩn đoán tìm ký sinh trùng sốt rét nên làm cả giọtđặc và giọt đàn

- Làm tiêu bản kết hợp (giọt máu đặc và giọt máu đàn trên 1lam): Để tiện sosánh và bảo quản, thường làm 2 giọt máu đặc và máu đàn trên 1lam bằng cáchdùng 1 lam kính sạch lấy 1 giọt máu có đường kính ≥ 1mm vào chính giữa lamkính để làm tiêu bản giọt đàn Lấy 1 giọt máu khác có đường kính 1-2mm vàochính giữa phần lam còn lại để làm tiêu bản giọt đặc

2.1 Chuẩn bị phương tiện

1.1 Dụng cụ

- Lam kính khô và sạch, lam kính có cạnh nhẵn để kéo máu giọt đàn

- Kim chích máu vô khuẩn

- Bông thấm nước vô khuẩn

- Bút chì kính, phiếu xét nghiệm

- Khay men

- Ống đong các loại 10ml, 20ml

- Pipet nhỏ giọt

- Đũa thuỷ tinh

- Giá nhuộm, giá cắm, các dụng cụ nhuộm

- Đồng hồ

1.2 Hoá chất

- Cồn 70[sup]0[/sup]

- Cồn tuyệt đối

- Thuốc nhuộm giemsa mẹ

- Dung dịch đệm hoặc nước cất

- Giấy thử pH hoặc máy đo pH

- Các dung dịch điều chỉnh pH : NaHPO4 2%, KH2PO4 2%

- Cồn tuyệt đối

Cách pha dung dịch đệm (phosphat buffer solution):

- KH2PO4: 0,7g

- NaHPO4: 1,0g

Cân 2 loại muối trên, mỗi loại vào 1 cốc chứa 150ml nước cất, dùng đũathuỷ tinh khuấy đều cho tan hết Đổ 2 loại vào ống đong rồi cho thêm nước cấtcho đủ 1000ml Khuấy đều, kiểm tra và điều chỉnh pH 7,2

Cách pha dung dịch giemsa nhuộm:

Nhuộm thường quy: dung dịch giemsa 3- 4%: Pha 9,7 ml dung dịch đệmvới 0,3ml giemsa mẹ, khi nhuộm để 30- 45 phút

Nhuộm nhanh: Dung dịch giemsa 10%: Pha 9ml dung dịch đệm với 1mlgiemsa mẹ Khi nhuộm để 15- 20 phút

2 Quy trình kỹ thuật:

a Lấy máu

- Sát khuẩn ngón tay chích máu bằng cồn 70[sup]0[/sup], chờ khô

- Dùng kim vô khuẩn chích vào vị trí sát khuẩn, sâu vừa phải khoảng 1mm

- Bỏ giọt máu đầu bằng cách dùng bông khô lau sạch

- Vuốt ngón tay nhẹ nhàng từ trên xuống

- Dùng 1 lam kính sạch cầm vào 2 cạnh mép lam áp nhẹ lên giọt máu đểđược 1 giọt có đường kính 3mm ở chính giữa lam hoặc 2 giọt ở 2 đầu lam

- Dùng góc của 1 lam kính sạch khác đặt vào trung tâm của giọt máu đánh theođường xoắn ốc từ trong ra ngoài khoảng 5- 6 vòng để được giọt máu có đườngkính 0,9- 1,0cm

- Lấy tiếp 1 lam kính sạch áp nhẹ lên giọt máu để được 1 giọt máu cóđường kính khoảng 1mm ở vị trí 2/3 lam kính

- Đặt cạnh của lam kéo lên phía trước sát với giọt máu tạo thành góc 45[sup]0[/sup], lùi lam kéo về phía sau một chút để máu lan đều trên cạnh củalam kéo, đẩy nhanh lam kéo về phía trước, để khô tự nhiên

30 Sát khuẩn tay bệnh nhân

- Đánh dấu tiêu bản máu, để khô

b Nhuộm tiêu bản:

- Cố định tiêu bản giọt đàn bằng cách tay trái cầm tiêu bản nghiêng30[sup]0[/sup], tay phải cầm pipet nhỏ 3- 4giọt cồn tuyệt đối lên phần đầu củatiêu bản máu Dùng pipet gạt ngang cho cồn tràn phủ khắp diện tích máu, vừa gạtvừa nghiêng tiêu bản cho cồn chảy hết về đuôi của tiêu bản máu Cắm tiêu bảnlên giá cho khô

- Đối với tiêu bản giọt đặc quá dày hoặc bị bẩn, mốc thì phải dung giải bằngcách nhỏ nước cất hoặc dung dịch giemsa 1% kín giọt máu, để 1- 2 phút, đổ nước

đi rồi cắm lên giá cho khô

- Xếp tiêu bản lên giá, nhỏ giọt dung dịch thuốc nhuộm phủ kín diện tíchmáu, để thời gian đúng với quy định

- Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ, không đổ thuốc nhuộm trước,không để nước xối trực tiếp vào giọt máu, để tiêu bản khô tự nhiên

c Đọc tiêu bản

- Soi kính hiển vi vật kính 100x, trả lời kết quả về ký sinh trùng sốt rét vànhận xét tiêu bản nhuộm

- Ghi kết quả XN

3.2 Kỹ thuật xét nghiệm ký sinh trùng đường ruột

Phạm vi áp dụng: phân tươi tìm ký sinh trùng đường ruột

Nguyên tắc: Thường dùng nước muối sinh lý và dung dịch lugol nhằm pháthiện trứng giun sán và đơn bào đường ruột có trong mẫu phân

- Dung dịch nước muối 0.9% để phát hiện trứng giun sán và thể hoạt độngcủa bào nang

- Dung dịch glugol để phát hiện bào nang của đơn bào ( DD glugol làmphân của đơn bào đậm hơn, dễ phát hiện hơn)

Chuẩn bị phương tiện

- Nước muối sinh lý

- Dung dịch lugol: + Iod: 1g

+ Kali Iodid: 2g + Nước cất vừa đủ : 100mL Dung dịch lugol đựng trong lọ màu, thời gian sử dụng 1 tháng

Bệnh phẩm: Đánh số thứ tự phù hợp với phiếu xét nghiệm

bên trái và một giọt lugol ở bên

phải lam

Hoà phân tìm trứng

4 Dùng que lấy một lượng phân

tương đương với đầu que diêm

trộn vào giọt nước muối sinh lý

Hoà đều phân trong

lugol

6 Đậy lamen lên mỗi giọt bằng

cách đặt nghiêng một cạnh lamen

xuống trước, từ từ hạ lamen

xuống

Đảm bảo vệ sinh,soi vật kính 40x

Dung dịch không tràn,không có bọt

Phát hiện được ký sinhtrùng có trong bệnhphẩm

thông tin

Chính xác

9 Xử lý tiêu bản, bệnh phẩm sau

khi xét nghiệm

Tiêu chuẩn một tiêu bản tốt

Tiêu bản không dày quá hoặc mỏng quá (có thể kiểm tra bằng cách đặt tiêubản lên tờ báo có chữ in mà vẫn đọc được chữ mờ) Phân hoà đều, không có bọt,dịch phân không tràn ra xung quanh và không tràn sang nhau giữa 2 giọt Mỗimẫu phân làm 2 tiêu bản

2.4 PHÒNG HUYẾT THANH HỌC

2.4.1 Cơ cấu, hoạt động của phòng:

2.4.1.1 Cơ cấu phòng huyết thanh học:

2.4.1.2 Hoạt động của phòng:

-Thực hiện lấy mẫu máu, xét nghiệm HIV và VGB theo yêu cầu, trả kết quả, bảoquản và lưu trữ mẫu bệnh phẩm,

- Đơn vị có khả năng khẳng định các mẫu HIV(+) theo qui định của Bộ Y Tế

2.4.2 Chiến lược xét nghiệm HIV [x]:

Các sinh phẩm xét nghiệm SP1,SP2,SP3 khác nhau về nguyên lý hoặc cáchchuẩn bị kháng nguyên

(*) Việc xét nghiệm lại bằng SP1,SP2 để kiểm tra loại trừ sai sót khi xét

nghiệm bằng sinh phẩm SP1 hoặc SP2

(**) Kết quả dương tính được dùng để kết luận các trường hợp nhiễm HIV vớiđiều kiện thực hiện xét nghiệm tại phòng xét nghiệm được Bộ Y tế

cho phép khẳng định các trường hợp nhiễm HIV Tiêu chuẩn phòng xét nghiệmđược phép khẳng định các trường hợp HIV/AIDS dương tính [y]:

1 Tiêu chuẩn cán bộ xét nghiệm:

1.1 Có ít nhất 2 cán bộ cho phòng xét nghiệm HIV (1 bác sỹ, 1 kỹ thuật viênxét nghiệm hoặc 1 cử nhân, 1 kỹ thuật viên xét nghiệm)

1.2 Cán bộ phòng xét nghiệm phải qua các lớp tập huấn về xét nghiệm HIV tạicác Viện: Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Viện Pasteur Hồ Chí Minh, Viện PasteurNha Trang, Viện VSDT Tây nguyên và các Viện Trung ương khác được BanAIDS chỉ định, phải có chứng chỉ đào tạo do các Viện đào tạo, tập huấn cấp

1.3 Hiểu về các phương pháp xét nghiệm HIV ở Việt Nam, có khả năng phântích kết quả xét nghiệm và viết báo cáo kết quả

1.4 Có ít nhất 1 năm kinh nghiệm làm các xét nghiệm HIV, được các ViệnTrung ương và khu vực định kỳ kiểm tra kiến thức về các kỹ thuật xét nghiệm vàthực hành

2 Tiêu chuẩn trang thiết bị:

Phải có đủ các trang thiết bị để thực hiện được các kỹ thuật xét nghiệm HIV, baogồm:

2.1 Dàn ELISA: máy đọc, máy ủ, máy rửa, máy in

2.9 Đồng hồ đo thời gian

2.10 Phương tiện phòng hộ cho nhân viên xét nghiệm: áo choàng, găng tay tiệttrùng, mũ, khẩu trang, xà phòng và các dung dịch sát trùng và xử trí tai nạn laođộng như cồn iod, xà phòng

2.11 Đồ đựng chất thải riêng biệt

2.12 Phương tiện để hủy bơm kim tiên

3 Tiêu chuẩn phòng xét nghiệm:

3.1 Phòng xét nghiệm hoặc khu vực xét nghiệm phải được bố trí riêng biệt 3.2 Có bàn đá bằng Granid hoặc bàn đá được lát bằng gạch men trắng Tườngnhà lát gạch men trắng từ 1m6 trở lên và cao hơn mặt bàn xét nghiệm ít nhất là

4 Tiêu chuẩn kết quả xét nghiệm HIV:

Kết quả xét nghiệm HIV của địa phương phải được Viện Trung ương và khu vựckiểm tra và công nhận sau khi:

- Viện Trung ương và khu vực gửi pannel mẫu thử xuống phòng xét nghiệm củacác địa phương

- Các địa phương gửi mẫu huyết thanh và kết quả xét nghiệm do địa phương tựlàm về các Viện Trung ương và khu vực

5 Tiêu chuẩn đánh giá:

Phòng xét nghiệm chỉ được phép khẳng định các trường hợp HIV dương tính khi

đã đạt các tiêu chuẩn về cán bộ xét nghiệm, trang thiết bị, phòng xét nghiệm, kếtquả xét nghiệm được nêu ở trên và được Bộ Y tế công nhận

(***) Trường hợp kết quả xét nghiệm không xác định, đề nghị lấy máu xét

nghiệm lại lần thứ 2 sau 14 ngày và biện luận kết quả theo các tình

huống sau:

+ Nếu kết quả xét nghiệm lần 2 âm tính thì kết luận là âm tính

+ Nếu kết quả xét nghiệm lần 2 dương tính theo chiến lược 3 thì kết luận làdương tính

+ Nếu kết quả lần 2 không xác định nhưng mức độ phản ứng với sinh phẩmcủa lần xét nghiệm thứ 2 không có sự thay đổi so với mức độ phản ứng với

sinh phẩm đã sử dụng trong xét nghiệm lần 1 và người được xét nghiệm

không thuộc đối tượng có hành vi nguy cơ cao thì kết luận là âm tính

+ Đề nghị xét nghiệm lần thứ 3 sau 14 ngày nếu kết qụả xét nghiệm lần 2

vẫn không xác định trong các tình huống sau:

- Mức độ phản ứng với sinh phẩm củạ lần 2 có sự thay đổi tăng so với mức

độ phân ứng với các sinh phẩm đã sử dụng trong xét nghiệm lần 1

- Hoặc nghi ngờ chuyển đổi huyết thanh

- Hoặc trường hợp mức độ phán ứng với sinh phẩm của lần xét nghiệm thứ 2không có sự thay đổi so với mức độ phán ứng với sinh phẩm đã sử dụng

trong xét nghiệm lần 1 nhưng người được xét nghiệm có hành vi nguy cơ

cao

2.4.3 Các phương pháp xét nghiệm HIV

2.4.3.1 Phương pháp gián tiếp:

Phát hiện kháng thể kháng HIV trong máu, dịch tiết

Áp dụng:

- Giám sát dịch tễ

- Chẩn đoán nhiễm HIV trên 18 tháng tuổi

Các kỹ thuật tìm kháng thể được chia thành 2 loại:

* Các xét nghiệm phát hiện sàng lọc: cần có độ nhạy cao

* Các xét nghiệm khẳng định: cần độ đặc hiệu cao

2.4.3.1.1 Xét nghiệm phát hiện sàng lọc.

Các kỹ thuật: ELISA, các thử nghiệm nhanh có độ nhạy và độ đặc hiệu khácnhau Phối hợp các kỹ thuật khác nhau trong các phương cách xét nghiệm phảituân theo nguyên tắc:

* Thử nghiệm đầu tiên có độ nhạy cao

* Các thử nghiệm tiếp theo có nguyên lý hoặc cách chuẩn bị KN khác nhau vàcần có độ đặc hiệu cao

2.4.3.1.1.1 Thử nghiệm miễn dịch gắn men – Elisa (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)

2.4.3.1.1.1.1 ELISA gián tiếp:

2.4.3.1.1.1.2 ELISA sandwich: độ đặc hiệu và độ nhạy cao

Phản ứng màu tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể

2.4.3.1.1.1.3 ELISA cạnh tranh: Độ nhạy cao

ƯU VÀ NHƯỢC ĐIỂM THỬ NGHIỆM MIỄN DỊCH GẮN MEN – ELISA

* Ưu điểm:

- Thực hiện đồng thời được nhiều mẫu

- Đọc kết quả bằng máy không phụ thuộc vào chủ quan của con người

- Có thể lưu kết quả, thuận lợi cho kiểm tra đánh giá chất lượng xét nghiệm

- Giá thành tương đối rẻ

* Hạn chế:

- Phải đầu tư trang thiết bị ban đầu và bảo dưỡng máy

- Sinh phẩm phải bảo quản lạnh

- Nhân viên xét nghiệm phải được đào tạo

- Thời gian thực hiện: 3 – 4 giờ

- Nếu số lượng mẫu ít thì tốn kém vì phải làm nhiều chứng

2.4.3.1.1.2 Các thử nghiệm nhanh

2.4.3.1.1.2.1 Thử nghiệm ngưng kết hạt Serodia:

2.4.3.1.1.2.2 Các test nhanh:

- Kit Determine HIV1/2: dựa trên nguyên lý miễn dịch sắc ký (Thường sử dụng

để kiểm tra HIV gấp và luôn phải được kiểm chứng bằng kỹ thuật khác)

- Genie 2, SD

- Kit Multispot HIV1/2: là phương pháp miễn dịch trên màng lọc, dựa trênnguyên lý ELISA (Phân biệt được HIV1 và HIV2)

* Ưu điểm:

- Xét nghiệm với số lượng mẫu nhỏ

- Dễ thực hiện, cho kết quả nhanh

- Không đòi hỏi thiết bị đặc biệt, sinh phẩm dễ bảo quản

- Có thể thực hiện ở các tuyến cơ sở

- Xét nghiệm viên có thể được đào tạo nhanh

* Nhược điểm:

- Giá thành cao

- Không thuận lợi khi xét nghiệm số mẫu lớn

- Không lưu được dữ liệu kỹ thuật

- Một số test nhanh có độ nhạy kém hơn so với ELISA

- Phát hiện nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh được sinh ra từ mẹ nhiễm HIV

- Phát hiện sớm giai đoạn mới nhiễm HIV (giai đoạn cửa sổ) hoặc khi kết quảphát hiện KT không rõ ràng

- Theo dõi diễn tiến bệnh, đánh giá hiệu quả điều trị thuốc kháng virút và trongcác mục đích nghiên cứu khác

2.4.3.2.1 Phân lập virus bằng nuôi cấy tế bào

2.4.3.2.2 Phát hiện các axit nucleic (RNA) của virus hoặc DNA (provirut) trong

tế bào nhiễm

* RNA của virus HIV bằng kỹ thuật RT-PCR:

• RNA enzyme sao chép ngược và mồi cDNA

• Quá trình PCR là chuỗi nhiều chu kỳ kế tiếp nhau

* Ưu điểm: có độ nhạy cao, cho kết quả nhanh chóng

* Hạn chế: phải có cơ sở phòng thí nghiệm đủ tiêu chuẩn và trang thiết bị đắttiền Cán bộ cần đào tạo tốt

2.4.3.2.3 Phát hiện KN p24 của virus trong máu: Kit phát hiện p24: ELISAsandwich

2.4.3.3 Quy trình xét nghiệm bằng test SD HIV 1.2.0 ELISA:

- Nhỏ dung dịch vào các giếng:

+ Nhỏ 100µl Sample Diluent vào các giếng