Nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb.) chuyển gen kháng bệnh virus đốm vòng PRSV

Các phương pháp chọn giống truyền thống cũng đã đạt được một số thành công trong việc ứng dụng các nguồn gen thực vật có khả năng kháng tự nhiên đối với virus vào việc lai tạo để tạo giố

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ THANH NGA

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG CÂY DƯA HẤU

CHUYỂN GEN KHÁNG BỆNH VIRUS ĐỐM VÒNG PRSV

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2015

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Nguyễn Thị Thanh Nga

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG CÂY DƢA HẤU

CHUYỂN GEN KHÁNG BỆNH VIRUS ĐỐM VÒNG PRSV

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS LÊ TRẦN BÌNH

Viện Công nghệ Sinh học

HÀ NỘI, 2015

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Nguyễn Thị Thanh Nga

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG CÂY DƢA HẤU

CHUYỂN GEN KHÁNG BỆNH VIRUS ĐỐM VÒNG PRSV

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS LÊ TRẦN BÌNH

Viện Công nghệ Sinh học

HÀ NỘI, 2015

Tôi xin cũng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Bộ phận Đào tạo, các phòng chức năng

và Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và bảo vệ luận án

Tôi xin cảm ơn Trại Sinh học thực nghiệm Cổ Nhuế, Viện Công nghệ Sinh học đã

hỗ trợ tôi trong việc trồng cây thu hạt giống trong quá trình thực hiện luận án Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới lãnh đạo Trường Đại học Tây Bắc, Ban Chủ nhiệm Khoa Nông – Lâm cùng các đồng nghiệp đã luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ để tôi yên tâm học tập và hoàn thành luận án

Cuối cùng, tôi xin dành lòng biết ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!

Hà Nội, ngày 7 tháng 01 năm 2015

Nguyễn Thị Thanh Nga

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu và kết quả trình bày trong luận án

là trung thực, đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng

ý và cho phép của các đồng tác giả

Hà Nội, ngày 7 tháng 01 năm 2015

Nguyễn Thị Thanh Nga

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 4

1.1 Giới thiệu về cây dưa hấu và bệnh hại dưa hấu……… 4

1.1.1 Cây dưa hấu……… 4

1.1.2 Các loại bệnh hại dưa hấu……… …… 10

1.1.3 Bệnh virus hại dưa hấu……….……… 11

1.2 PRSV và PRSV gây hại trên dưa hấu……… ……… 13

1.2.1 Phân loại ……… 13

1.2.2 Cấu trúc……… 14

1.2.3 Phạm vi kí chủ, cơ chế truyền bệnh ……… 19

1.2.4 Biện pháp phòng trừ ……… 20

1.2.5 PRSV gây bệnh trên dưa hấu……… 20

1.3 Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây trồng chuyển gen kháng virus… 21

1.3.1 Kỹ thuật RNAi……… 21

1.3.2 Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây trồng kháng virus……… 26

1.3.3 Một số hạn chế của công nghệ RNAi và giải pháp……… 28

1.3.4 Một số nghiên cứu chuyển gen tạo tính kháng virus cho dưa hấu …… 29

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 31

2.1 Vật liệu, địa điểm nghiên cứu……… 31

2.1.1 Vật liệu thực vật……… 31

2.1.2 Chủng vi sinh vật, vector……… 31

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị, vật tư……… 32

2.1.4 Hóa chất……… 33

2.1.5 Địa điểm……… 33

2.2 Phương pháp nghiên cứu……… 33

2.2.1 Xây dựng quy trình tái sinh in vitro cây dưa hấu……… 34

2.2.2 Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen vào cây dưa hấu thông qua chuyển gen gus ……… 39

2.2.3 Chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu……… 44

2.2.4 Phân tích cây chuyển gen kháng PRSV 45

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……… 49

3.1 Xây dựng quy trình tái sinh cây dưa hấu ……… 49

3.1.1 Khả năng tái sinh chồi và cụm chồi ……… 49

3.1.2 Kết quả kích thích kéo dài chồi……… 54

3.1.3 Kết quả tạo rễ cho chồi ……… 55

3.1.4 Ảnh hưởng của giá thể tiếp nhận đến khả năng thích ứng cây in vitro… 56 3.1.5 Tổng kết quy trình tái sinh ……… 58

3.2 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen vào cây dưa hấu thông qua chuyển gen gus ……… … 59

3.2.1 Đánh giá khả năng sống sót của cây dưa hấu trên môi trường chứa chất

chọn lọc Km 59

3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn (OD600) đến hiệu quả chuyển gen 60

3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu quả chuyển gen 61

3.2.4 Kết quả biến nạp gen gus vào dưa hấu ……… 63

3.2.5 Kết quả phân tích các dòng cây chuyển gen gus ……… 65

3.2.6 Kết quả chuyển gen gus vào cây dưa hấu 67

3.3 Kết quả biến nạp cấu trúc RNAi vào dưa hấu 68

3.4 Kết quả phân tích biểu hiện gen và đánh giá khả năng kháng virus của các dòng cây chuyển gen 69

3.4.1 Phân tích các dòng cây chuyển gen T0 69

3.4.2 Phân tích các dòng cây chuyển gen T1 79

Chương 4 BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU….……… 83

4.1 Khả năng nuôi cấy in vitro cây dưa hấu……….…

4.2 Khả năng chuyển gen ở dưa hấu……….……

4.3 Tạo tính kháng virus bằng chuyển gen ở dưa hấu………

4.4 Triển vọng của các dòng chuyển gen trong bối cảnh GMO chung

83 86 90 94 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 96

1 KẾT LUẬN 96

2 ĐỀ NGHỊ 97

SUMMARY 98 NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Axit Deoxyribonucleic

ARN Axit Ribonucleic

BAP 6 - Benzyl Amino Purin

IAA Indol - 3 - Axetic Axit

IBA 3 - Indol Butyric Axit

NAA α - Naptalen Axetic Axit

CP Coat protein

Nib Nuclear Inclusion Body protein

HC-Pro Helper component-proteinase

miRNA microRNA

siRNA small interfering RNA

mRNA messenger RNA

dsRNA double-stranded RNA

RISC RNA-induced silencing complex

Taq Thermus aquaticus

PRSV Papaya ringspot virus

Cefo Cefotaxime

X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide

gus beta-glucuronidase

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng trong dưa hấu……… 9

Bảng 1.2 Danh sách các vi sinh vật gây hại chủ yếu trên dưa hấu ………… 10

Bảng 2.1 Thành phần các loại môi trường tái sinh có bổ sung IBA và BAP… 36 Bảng 2.2 Thành phần các loại môi trường tái sinh có bổ sung IBA, BAP, NAA……… 36

Bảng 2.3 Nồng độ GA3 sử dụng trên MT kéo dài chồi……… 37

Bảng 2.4 Nồng độ IBA sử dụng trên MT tạo rễ ……… 37

Bảng 2.5 Thành phần các loại giá thể thích ứng cây in vitro ……… 38

Bảng 2.6 Các nồng độ Km sử dụng 39

Bảng 2.7 Thành phần các loại môi trường 40

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của tuổi lá mầm tái sinh chồi……… 50

Bảng 3 2 Ảnh hưởng của tổ hợp IBA, BAP, NAA đến sự phát sinh chồi… 53

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của GA3 và IBA đến sự kích thích kéo dài chồi có kích thước < 1cm……….…….… 54

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của IBA và môi trường cơ bản đến khả năng tạo rễ của chồi dưa hấu……… … 56

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng thích ứng cây ra môi trường 58

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ Km đến sự phát triển của chồi 60

Bảng 3.8 Kết quả biến nạp gen gus vào dưa hấu……… 64

Bảng 3.9 Kết quả chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu 67

Bảng 3.10 Kết quả biến nạp cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu 69

Bảng 3.11 Kết quả chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu 72 Bảng 3.12 Kết quả lây nhiễm virus các dòng dưa hấu chuyển gen RNAi/Cp-Nib-HCpro thế hệ T0 và WT 75 Bảng 3.13 Kết quả PCR phân tích các dòng dưa hấu chuyển gen thế hệ T1 80 Bảng 3.14 Kết quả lây nhiễm virus các dòng dưa hấu chuyển gen RNAi/Cp-Nib-HCpro thế hệ T1 và cây WT 82

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc của PRSV……… 15

Hình 1.2 Bản đồ tổ chức genome của PRSV……… 15

Hình 1.3 Con đường tạo thành RNAi……… 25

Hình 2.1 Sơ đồ vector pCB-gusplus……… 31

Hình 2.1 Sơ đồ vector pK7GWIWG2(II)/CP-Nib-HCpro …… ……… 32

Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát……… 34

Hình 3.1 Ảnh hưởng của tuổi lá mầm dưa hấu đến khả năng tái sinh chồi… 50

Hình 3.2 Ảnh hưởng của vị trí trên lá mầm đến khả năng tái sinh chồi……… 50

Hình 3.3 Kết quả tái sinh chồi dưa hấu từ lá mầm sau 6 tuần nuôi cấy……… 52

Hình 3.4 Hình ảnh chồi có hình thái bất thường so với đối chứng……… 52

Hình 3.5 Ảnh hưởng của tổ hợp GA3 và IBA đến sự kích thích kéo dài chồi 55

Hình 3.6 Kết quả tạo rễ cho chồi dưa hấu D2……… 56

Hình 3.7 Kết quả thích ứng cây in vitro……… 57

Hình 3.8 Một số hình ảnh về xây dựng quy trình tái sinh cây dưa hấu……… 59

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn (OD600) đến biểu hiện gus 61

Hình 3.10 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến biểu hiện Gus 62

Hình 3.11 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến biểu hiện gus……… 62

Hình 3.12 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy và nồng độ vi khuẩn đến biểu hiện Gus……… 63

Hình 3.13 Hình ảnh chuyển gen gus vào cây dưa hấu 65

Hình 3.14 Biểu hiện bền vững của gus ở các dòng dưa hấu chuyển gen 66

Hình 3.15 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen

nptII trên gel agarose 0,8% 67

Hình 3.16 Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng dưa hấu chuyển gen T0với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri 70 Hình 3.17 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu PRSV-Nib-F3/PRSV-CP-R1trên gel agarose 0,8% 71 Hình 3.18 Một số hình ảnh chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro……….… 72 Hình 3.19 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu PRSV-Nib-F3/PRSV-CP-R1trên gel agarose 0,8% 73 Hình 3.20 Mẫu lá bí ngô bị nhiễm PRSV……… 74 Hình 3.21 Các mức độ biểu hiện bệnh ở lá dưa hấu chuyển gen 76 Hình 3.22 Một số hình ảnh về tính kháng bệnh PRSV của các dòng dưa hấu chuyển gen 78 Hình 3.23 Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng dưa hấu chuyển gen D2.7 thế hệ T1với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri 79 Hình 3.24 Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng dưa hấu chuyển gen L2.3 thế hệ T1với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri 80

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết

Dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb.) là cây trồng quan trọng có giá trị dinh

dưỡng và thương mại cao, được trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong đó quá nửa diện tích được trồng ở vùng Đông Nam Á, châu Phi, vùng biển Caribê và miền Nam nước Mỹ Trong quá trình sản xuất dưa hấu, cây rất dễ bị nhiễm các bệnh do vi khuẩn, virus hay do nấm gây ra, ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng quả Trong các nguyên nhân gây bệnh, virus là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất cũng như chất lượng dưa hấu

Có hơn 10 loại virus gây bệnh khá nghiêm trọng cho dưa hấu, trong đó virus đốm vòng đu đủ (papaya ringspot virus type W - PRSV-W) là một trong những virus gây hại nặng nề nhất Chiến lược kiểm soát virus chủ yếu dựa vào thuốc trừ sâu để tiêu diệt các loại côn trùng truyền bệnh, sử dụng thuốc diệt cỏ để tiêu diệt cỏ dại cũng như các thực vật khác mang mầm bệnh Tuy nhiên, các phương pháp này chỉ có tác dụng phòng bệnh, khi cây đã bị nhiễm virus thì các phương pháp kiểm soát trên không còn tác dụng Biện pháp có hiệu quả nhất trong việc phòng và chống bệnh virus hại thực vật nói chung là tạo ra các giống cây trồng kháng bệnh

virus Tuy nhiên, các giống cây trồng có khả năng kháng bệnh virus một cách tự

nhiên không nhiều Các phương pháp chọn giống truyền thống cũng đã đạt được một số thành công trong việc ứng dụng các nguồn gen thực vật có khả năng kháng

tự nhiên đối với virus vào việc lai tạo để tạo giống kháng virus, tuy nhiên hiệu quả còn chưa cao Tạo cây trồng chuyển gen mang gen hoặc đoạn gen có nguồn gốc từ chính virus tỏ ra thực sự có hiệu quả trong việc tạo tính kháng virus cho cây trồng Trong những năm gần đây, đã có những thành công trong việc tạo ra nhiều loại cây trồng có khả năng kháng lại virus dựa theo nguyên lý bất hoạt gen thông qua RNA interference (RNAi) Ở thực vật, RNAi có thể được thực hiện bằng cách chuyển đoạn gen đích có cấu trúc biểu hiện sự phiên mã cao RNA sense, anti-sense

hoặc cấu trúc RNA kẹp tóc bổ sung với chính nó Hiện nay, RNAi là kỹ thuật triển vọng được nghiên cứu ứng dụng trong việc tạo tính kháng virus ở thực vật

Xuất phát từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên, chúng tôi đã tiến hành

đề tài: “Nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (Citrulus lanatus Thumb.) chuyển gen kháng bệnh virus đốm vòng PRSV”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng được quy trình tái sinh và chuyển gen vào cây dưa hấu Việt Nam

- Tạo dòng dưa hấu chuyển gen có khả năng kháng với virus PRSV

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng

tái sinh in vitro các giống dưa hấu thu thập được

3.2 Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen vào các

giống dưa hấu dựa vào gen chỉ thị gus trong vector pCB-gusplus sử dụng phương pháp Agrobacterium;

3.3 Chuyển gen kháng virus PRSV vào dưa hấu thông qua việc sử dụng

chủng Agrobacterium tumefaciens CV58C1 chứa vector

pK7GWIW2(II)/CP-Nib-HCpro

3.4 Phân tích cây chuyển gen và đánh giá khả năng kháng với PRSV Việt Nam của các dòng cây chuyển gen thu được

4 Những đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam ứng dụng thành công nguyên lý làm câm gen RNAi và kỹ thuật chuyển gen ở thực vật để tạo được các dòng dưa hấu

kháng bệnh đốm vòng đu đủ do PRSV gây ra Khả năng kháng virus của dòng cây

chuyển gen đã được di truyền ổn định sang thế hệ T1

Luận án đã đạt được các đóng góp cụ thể như sau:

1 Đã xây dựng được quy trình tái sinh vào 4 giống dưa hấu

2 Đã tối ưu hóa được quy trình chuyển gen vào 2 giống dưa hấu nghiên cứu

3 Chuyển thành công cấu trúc RNAi/CP-Nib-Hcpro vào 2 giống dưa hấu nghiên cứu nhằm tạo tính kháng đối với PRSV Việt Nam

4 Đã tạo được 2 dòng dưa hấu chuyển gen có khả năng kháng hoàn toàn với PRSV Việt Nam, khả năng kháng virus của 2 dòng cây chuyển gen này đã được di truyền ổn định sang thế hệ T1

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

Kết quả nghiên cứu thu được trong luận án này là cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu tái sinh invitro, chuyển gen vào các giống dưa hấu khác có nguồn gốc Việt Nam

Bên cạnh đó, kết quả luận án đã khẳng định khả năng tiếp nhận đoạn gen chuyển trong chuyển gen của 2 giống dưa hấu nghiên cứu (D2 và L2), làm cơ sở để chuyển các gen mục tiêu theo những mục đích khác vào 2 giống dưa hấu này như chuyển gen làm tăng tính chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường, chuyển gen kháng các virus khác,…

Các dòng dưa hấu chuyển gen mang cấu trúc RNAi/CP-Nib-Hcpro có khả năng kháng với PRSV tạo được trong nghiên cứu này rất có triển vọng để làm giống hoặc lai tạo giống mới theo mục đích tạo giống kháng với PRSV

6 Bố cục của luận án

Luận án gồm 138 trang, trong đó phần mở đầu 3 trang, tổng quan tài liệu 26 trang, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 17 trang, kết quả 33 trang, thảo luận 13 trang, kết luận 2 trang, danh mục các công trình công bố 1 trang, tài liệu tham khảo

19 trang với 159 tài liệu tham khảo, tóm tắt kết quả nghiên cứu bằng tiếng Anh 3 trang Trong luận án có 7 bảng và 21 hình

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về cây dưa hấu và bệnh hại dưa hấu

1.1.1 Cây dưa hấu

Dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb.) là cây trồng quan trọng thuộc họ bầu bí

Quả dưa hấu có giá trị dinh dưỡng và thương mại cao, có thể dùng ăn trực tiếp, làm salad, nước ép, kẹo và ăn hạt Ở vùng sa mạc, người ta sử dụng dưa hấu như một nguồn cung cấp nước cho cơ thể (Niao et al., 2005) Giá trị dinh dưỡng của dưa hấu không chỉ bởi vị ngọt, mát của nó mà còn vì quả dưa hấu chứa một hàm lượng lớn chất xơ, nhiều loại vitamin và khoáng chất, hạt dưa hấu rất giàu chất béo và protein (Niao et al., 2005; Swain & Powell, 2004) Hiện nay, dưa hấu được trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong đó quá nửa diện tích được trồng ở vùng Đông Nam Á, Châu Phi, vùng biển Caribê và miền Nam nước Mỹ (Niao et al., 2005; Swain & Powell., 2004; Ellul et al., 2007)

1.1.1.1 Nguồn gốc

Dưa hấu có nguồn gốc từ sa mạc Kalahari ở Châu Phi Năm 1857, Livingstone (Nhà thám hiểm người Scotland thế kỷ 19, một trong những người đầu tiên khám phá khu vực Châu Phi) đã quan sát thấy dưa hấu mọc tràn lan ở sa mạc Kalahari và ngày nay người ta vẫn có thể tìm thấy những loài được coi là tổ tiên của dưa hấu ở Châu Phi, được gọi là Tsamma melon (Swain & Powell, 2004)

Việc thu hoạch dưa hấu đã được mô tả trong chữ tượng hình ở các tòa nhà cổ xưa của Ai Cập hơn 4000 năm trước, hạt giống dưa hấu cũng được tìm thấy trong các lăng mộ của các Pharaoh Tutankhamen Từ Ai Cập, dưa hấu lan rộng ra khắp các nước dọc theo biển Địa Trung Hải theo các chuyến tàu chở hàng Đến thế kỷ 10 dưa hấu đã được du nhập vào Trung Quốc – một trong những quốc gia sản xuất dưa hấu lớn nhất thế giới hiện nay Đến thế kỷ 13, dưa hấu được tìm thấy ở châu Âu và thế kỷ 16, dưa hấu được tìm thấy ở châu Mỹ Thuật ngữ “watermelon” lần đầu tiên

được đề xuất bởi John Mariani vào năm 1615 trong từ điển thực phẩm và đồ uống của Mỹ (Davis et al., 2004; Niao et al., 2005; Adrian, 2008) Ở Việt Nam, dưa hấu được biết đến từ câu chuyện truyền thuyết Mai An Tiêm

Citrullus colocynthis được xem là một trong những tổ tiên của dưa hấu hiện

nay Loại dưa hấu này có quả nhỏ, đường kính tối đa là 7,5 cm, thịt quả màu trắng,

có vị đắng, hạt nhỏ có màu nâu C colocynthis là loại dưa hấu hoang dã được trồng

xen với sắn, ngô, khoai lang ở nhiều quốc gia ở miền Bắc và miền Đông của Châu Phi như Ả rập, Nigieria, Ai cập, Iran, Namibia,… Tổ tiên của dưa hấu không có vị

ngọt, thậm chí đôi khi có vị đắng, thịt quả cứng và màu trắng giống như colocynthis

(Swain & Powell, 2004; Guner et al., 2004)

1.1.1.2 Phân loại

Dưa hấu thuộc: Bộ Cucurbitales

Họ: Cucurbitaceae Chi: Citrullus

Loài: C lanatus, C colocynthis, C ecirrhorus và C sp

Tên tiếng Anh: Watermelon

Tên Trung Quốc: Tây Hoa

1.1.1.3 Đặc điểm hình thái

Dưa hấu là cây thân leo, có bộ rễ lan xa nên dù ở vùng khô cằn cũng có thể cho ra loại trái cây chứa đến 90% nước, làm cho dưa hấu trở thành nguồn hyđrat hoá quan trọng ở những nơi khan hiếm nước

Quả dưa hấu có vỏ cứng, là loại quả phổ biến và có giá trị quan trọng nhất trong họ Bầu bí Quả dưa hấu rất đa dạng về hình dạng và màu sắc Màu sắc vỏ quả dưa hấu cũng thay đổi từ màu xanh sáng đến xanh đậm, có hoặc không có sọc Về màu sắc thịt quả có màu đỏ, màu hồng, màu vàng, màu cam và màu trắng Hạt dưa hấu cũng rất đa dạng về kích cỡ (lớn, trung bình, nhỏ) và có màu đen, màu nâu và

màu trắng Về hình dạng, trên mặt phẳng cắt dọc, quả dưa hấu có các hình dạng chính như sau: thuôn dài, oval và tròn

Trong các loại dưa hấu, dưa hấu ruột đỏ, hạt đen là phổ biến nhất, tiếp theo là dưa hấu ruột vàng, dưa hấu mini, dưa hấu không hạt Mặc dù việc tạo ra dưa hấu không phải ruột đỏ khó khăn hơn nhưng hiện nay chúng đã có mặt phổ biến trên thị trường

1.1.1.4 Đặc điểm sinh trưởng phát triển

Dưa hấu là loại cây trồng nhiệt đới, sinh trưởng, phát triển kéo dài trong điều kiện thời tiết ấm áp, khô ráo và đầy đủ ánh nắng Cây dưa hấu rất nhạy cảm với nhiệt độ Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của dưa hấu ở vào khoảng 25-30oC, cho hoa nở và thụ phấn là 25oC, và cho quả lớn và chín là 30o

C Dưa hấu có rễ mọc sâu, chịu úng kém, nhất là khi cây đã trổ bông và đậu quả Khi bị úng, dưa hấu dễ bị thối rễ, có thể dẫn đến cây bị chết hoặc khó trổ bông, thụ phấn và đậu quả, và khi đã đậu quả thì lại dễ thối, chất lượng kém Ẩm độ không khí cao dễ phát sinh bệnh Dưa hấu có thể trồng được trên nhiều loại đất, tuy nhiên đất phải thoát nước tốt, cơ cấu nhẹ, tầng canh tác sâu, không quá phèn Các vùng đất cát gần biển, đất phù sa ven sông là những vùng đất lý tưởng để trồng dưa hấu Đất cát pha có đặc điểm là tơi xốp, nhiệt độ đất dễ tăng cao, dễ thoát nước rất có lợi cho bộ rễ dưa hấu phát triển, chất lượng dưa tốt, tốn ít công chăm sóc Nơi đất cao, thoáng, không bị bóng râm che, không bị gió bão, pH trong khoảng 5 – 7 là thích hợp để trồng dưa hấu

Dưa hấu có thể được trồng quanh năm ở những vùng gần xích đạo Ở Việt Nam, dưa hấu được trồng quanh năm ở các tỉnh phía Nam, tập trung vào các vụ chính như: vụ dưa noel (gieo hạt tháng 9), vụ dưa hấu tết (gieo hạt tháng 11), vụ dưa hè thu (gieo trồng trong suốt mùa mưa),… Ở miền Bắc, dưa hấu được trồng 2

vụ chính: vụ dưa hè thu (gieo hạt trong tháng 3) và vụ đông xuân (gieo hạt trong tháng 10, một số tỉnh miền Núi phía Đông Bắc gieo hạt vào tháng 12)

1.1.1.5 Tình hình sản xuất dưa hấu

Năm 2012, trên thế giới có khoảng 34,7 triệu ha diện tích trồng dưa hấu, giảm 2,88% so với năm 2011 (35,7 triệu ha) Trung Quốc là nước sản xuất dưa hấu lớn nhất với khoảng 18,2 triệu ha (51,2%), tiếp theo là Thổ Nhĩ Kỳ (165 nghìn ha), Iran (145 nghìn ha), Liên bang Nga (125 nghìn ha), Brazil (95 nghìn ha), Ukrane (61 nghìn ha), Ai cập (57 nghìn ha), Mỹ (50 nghìn ha),… Năng suất dưa hấu năm 2012 đạt 30,34 tấn/ha, tăng 4,37% so với năm 2010 (29,07 tấn/ha), sản lượng đạt 105,4 triệu tấn, tăng 0,67% so với năm 2011 (104,5 triệu tấn) Trong đó, Trung Quốc sản xuất 70,2 triệu tấn (chiếm 66,6% tổng sản lượng dưa hấu trên toàn thế giới), đứng sau Trung Quốc là các quốc gia như Thổ Nhĩ Kỳ 4,04 triệu tấn, Iran 3,8 triệu tấn, Brazil 2,07 triệu tấn, Mỹ 1,77 triệu tấn, Ai cập 1,87 triệu tấn (FAO, 2014)

Năm 2012, Việt Nam có khoảng 31 nghìn ha (tăng 14% so với năm 2011 – 27,2 nghìn ha) diện tích đất trồng dưa hấu, năng suất trung bình đạt 15,16 tấn/ha (tăng 6,39% so với năm 2011), tổng sản lượng đạt 470 nghìn tấn, tăng 0,43% so với năm 2011 (FAO, 2014) Dưa hấu được trồng rất phổ biến ở vùng đồng bằng sông Cửu Long đặc biệt là Long An và Tiền Giang, Quảng Ngãi, năng suất đạt từ 15-25 tấn/ha Ở miền Bắc, dưa hấu được trồng nhiều ở một số tính như Vĩnh Phúc, Thái Bình, Hải Dương, Hà Nội, Bắc Giang, Hòa Bình, Bắc Kạn,…

1.1.1.6 Giá trị dinh dưỡng và thương mại của dưa hấu

Dưa hấu được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau: thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm và hóa phẩm Vì có giá trị dinh dưỡng rất cao, dưa hấu được xếp vào nhóm 10 thực phẩm tốt nhất Người ta không chỉ yêu thích dưa hấu bởi vị ngọt, mát của nó mà còn bởi trong dưa hấu chứa một hàm lượng lớn các vitamin và khoáng chất, một lượng nhỏ protein và chất béo (Niao et al., 2005; Adrian, 2008) Theo khuyến cáo của Hoa Kỳ, 280 gram thịt quả dưa hấu cung cấp 25% nhu cầu vitamin

C và 20% nhu cầu vitamin A, 8% nhu cầu kali, 4 % nhu cầu sắt và 2% nhu cầu canxi mỗi ngày cho con người Thịt quả dưa hấu rất giàu lycopene (2300 – 7200 µg / 100 g), là chất chống oxi hóa mạnh có tác dụng làm giảm nguy cơ ung thư tuyến

tụy, tuyến tiền liệt và dạ dày… Hàm lượng lycopene của dưa hấu ruột đỏ cao hơn so với cà chua, bưởi đào và ổi (Compton et al., 2004; Rimando & Perkins-Veazie, 2005; Swain & Powell, 2004) Ngoài ra dưa hấu còn chứa hàm lượng lớn chất xơ, có tác dụng chống một số bệnh về tiêu hóa như táo bón, trĩ, làm giảm hàm lượng

cholesterol và giảm nguy cơ bị các bệnh tim mạch cho cơ thể (Niao et al., 2005)

Dưa hấu giàu citrulline, một axit amin có thể được chuyển hóa thành arginine - một axit amin không thay thế, đóng vai trò quan trọng trong việc chữa lành vết thương, loại bỏ amoniac ra khỏi cơ thể và tham gia tổng hợp nitric oxit (NO) - chất đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học như tập hợp tiểu cầu và điều chế quá trình miễn dịch của cơ thể Các nghiên cứu cho rằng có sự gia tăng tế bào limpho – tế bào đóng vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch sau khi uống arginine (Febres et al., 2008; Fire et al., 1998)

L-Ở các vùng khác nhau trên thế giới, dưa hấu được sử dụng theo những cách khác nhau Dưa hấu thường được dùng làm món tráng miệng sau bữa ăn, làm salad, nước ép, kem, thạch hoa quả và dùng cùng với một số loại rượu như vodka, rum… Tại miền Nam nước Nga, bia được làm từ nước ép dưa hấu hoặc nước ép dưa hấu

có thể được đun sôi để uống như một loại siro Tại Iraq và Ai cập và nhiều quốc gia khác ở Châu Phi, dưa hấu được sử dụng như một loại thực phẩm chủ yếu, là nguồn cung cấp nước cho cơ thể và làm thức ăn chăn nuôi

Bảng 1.1 Thành phần dinh dƣỡng trong dƣa hấu

(nguồn: USDA)

STT Thành phần Giá trị dinh dƣỡng trong 100g

1 Năng lượng 127 kJ (30 kcal)

1.1.2 Các loại bệnh hại dƣa hấu

Bệnh hại dưa hấu có thể gây ra bởi nấm, vi khuẩn, virus và một số tuyến trùng (Bảng 1.2) (Kucharek et al., 2005)

Bảng 1.2 Danh sách các vi sinh vật gây hại chủ yếu trên dƣa hấu Nhóm

phân loại STT Sinh vật gây bệnh Triệu chứng đặc trƣng

Nấm

quả

Nấm

20 Phymatotrichum omnivorum Thối rễ

Vi khuẩn

Khảm lá và quả

Virus

Tuyến

trùng

1.1.3 Bệnh virus hại dƣa hấu

Virus cũng là một nguyên nhân chính làm giảm năng suất cũng như chất lượng dưa hấu Các triệu chứng bệnh virus xuất hiện ở dưa hấu cũng như các cây trồng khác trong họ bầu bí có thể phân thành 3 nhóm điển hình: (1) khảm lá, lá biến dạng, hình dạng và màu sắc vỏ quả bị biến dạng; (2) Các lá già bị vàng, sau đó toàn bộ

cây bị vàng lụi đi, lá thường dày lên bất thường; (3) Cháy lá Trên thế giới, có hơn

10 loại virus gây ảnh hưởng khá nghiêm trọng cho dưa hấu, trong đó phổ biến và gây hại nặng nề nhất là virus đốm vòng đu đủ (papaya ringspot virus type W - PRSV-W), virus khảm dưa hấu (watermelon mosaic virus - WMV), virus khảm vàng bí ngô (zucchini yellow mosaic virus -ZYMV và virus khảm dưa chuột (cucumber mosaic virus -CMV và rất khó kiểm soát Triệu chứng đặc trưng của 4 loại bệnh virus này khá giống nhau gây ra triệu chứng khảm và biến dạng ở lá và quả, vì thế rất dễ gây nhầm lẫn khi nhận biết virus (Krubphachaya et al., 2007; Lê Thị Ánh Hồng, 2002)

Trong công tác kiểm soát các bệnh virus hại cây trồng, việc sử dụng các loại thuốc kháng sinh là không có tác dụng Các biện pháp kiểm soát chủ yếu nhằm vào việc đề phòng virus thông qua việc tiêu diệt các vector truyền bệnh, thường dùng là phun thuốc trừ sâu để tiêu diệt các loại côn trùng truyền bệnh, sử dụng thuốc diệt cỏ

để tiêu diệt cỏ dại cũng như các thực vật khác mang mầm bệnh, tạo tính kháng đối với virus cho cây trồng Khi cây đã bị nhiễm virus, các phương pháp kiểm soát trên không còn tác dụng Trong các biện pháp phòng bệnh virus hại cây trồng hiện nay, biện pháp có hiệu quả nhất là tạo ra tính kháng đối với virus cho cây

Do dưa hấu là loại cây trồng rất nhạy cảm với nhiều loài vi khuẩn, nấm và virus gây bệnh nên việc cải thiện khả năng kháng bệnh của dưa hấu bằng kỹ thuật di truyền đã và đang rất được quan tâm nghiên cứu Khả năng kháng tự nhiên đối với một số loại virus đã được xác định trong một số loài dưa hấu hoang dã, như kháng WMV 2 (Xu et al., 2004), ZYMV (Ling et al., 2009; Xu et al., 2004) hoặc PRSV-w (Strange et al., 2002; Guner et al., 2002), tuy nhiên quả của những loài dưa hấu này lại có chất lượng kém, đòi hỏi phải mất nhiều năm để đánh giá, lựa chọn, lai tạo để tạo giống có khả năng kháng được virus và chất lượng quả tốt Các phương pháp truyền thống đã tạo ra các giống dưa hấu có khả năng kháng bệnh thán thư, bạc lá,

bệnh héo do nấm Fusarium (Mohr, 1986; Crall et al., 1994), nhưng đối với một số

bệnh như bệnh đốm quả do vi khuẩn, bệnh đốm vòng đu đủ do PRSV, bệnh khảm dưa hấu do WMV, bệnh khảm vàng bí xanh do ZYMV đang gặp rất nhiều khó khăn

trong việc tạo giống kháng bệnh bằng các phương pháp này Trong khi đó, công nghệ chuyển gen ngoài việc giúp rút ngắn thời gian chọn tạo giống so với phương pháp truyền thống đồng thời vẫn không làm mất đi những đặc tính tốt sẵn có ở các cây chuyển gen do đó được coi là phương pháp có hiệu quả để kiểm soát các bệnh virus hại cây trồng nói chung, trong đó có dưa hấu Cho đến nay, đã có nhiều công

bố về nghiên cứu chuyển gen vào dưa hấu như chuyển gen để tăng cường tính

kháng đối với bệnh héo rũ do nấm Fusarium gây ra thông qua ống phấn (Chen et al., 1998), chuyển gen chỉ thị gus và gen kháng thuốc diệt cỏ bar thông qua A

tumefaciens (Akashi et al., 2005; Park et al., 2005; Suratman et al., 2010; Cho et al.,

2008), chuyển gen biểu hiện protein HAL1 của Saccharomyces để làm tăng tính

chịu mặn (Ellul et al., 2003), chuyển gen kháng CGMMV (Park et al., 2005), WMV-2 (Zhong et al., 2003), chuyển gen kháng đồng thời WMV, ZYMV và PRSV (Niao et al., 2005) hoặc ZYMV và PRSV (Yang et al., 2010) Tuy nhiên, cho đến nay, việc chuyển gen vào các giống dưa hấu chưa được tiến hành ở Việt Nam

1.2 PRSV và PRSV gây hại trên dƣa hấu

Năm 1949, Jensen lần đầu tiên phát hiện virus đốm vòng đu đủ ở Mỹ và phân lập virus từ đu đủ Hawaii Sau đó virus lần lượt được tìm thấy ở khắp các quốc gia trên thế giới, đặc biệt là ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (các nước vùng Caribê,

Ấn Độ, Nam Mỹ, Trung Quốc, Thái Lan, Philippin, Malaisia, Việt Nam,…) (Shinichiro et al., 2005)

1.2.1 Phân loại

PRSV là virus thực vật, thuộc chi Potyvirus, họ Potyviridae Potyvirus có

khoảng 160 loài, là chi gây ảnh hưởng lớn nhất đến sự sinh trưởng, phát triển của cây trồng trong số các virus gây bệnh ở thực vật (Gonsalves et al., 2009) Dựa vào hình thái phân tử virus, khả năng lan truyền thông qua các loài rệp, quan hệ huyết thanh và khả năng tạo thể vùi hình bánh xe trong tế bào kí chủ, PRSV được chia thành hai chủng: PRSV-w và PRSV-p (James, 2011 ; Shinichiro et al., 2007)

PRSV-p phổ biến hơn, gây thiệt hại lớn nhất tới đu đủ và một số cây họ bầu

bí, còn PRSV-w chỉ gây hại trên họ bầu bí mà không gây hại trên cây đu đủ (Edwardson & Christie, 1986) Các triệu chứng do PRSV-p gây ra trên cây trồng bao gồm những vết đốm vòng và sự biến dạng của lá, quả, thân và cuống lá xuất hiện những vệt thối hoặc úng nước Trong khi đó, PRSV-w gây ra những triệu chứng đặc trưng như khảm và biến dạng ở lá và quả Mức độ biểu hiện triệu chứng phụ thuộc vào chủng virus, giai đoạn nhiễm bệnh cũng như thể trạng của cây trồng (Purcifull et al., 1984)

Nghiên cứu trình tự gen của các dòng virus từ Thái Lan, Việt Nam, Philippin,

Ấn Độ,… cho thấy mức độ tương đồng giữa hai dạng PRSV-p và PRSV-w khá cao,

sự sai khác có thể do quá trình tiến hóa cũng như sự khác nhau về vùng phân bố Từ phân tích sự tương đồng giữa hai dạng có giả thuyết cho rằng PRSV-p tiến hoá từ PRSV-w do đột biến

1.2.2 Cấu trúc

PRSV không có vỏ bọc, nucleocapsid có dạng hình sợi, xoắn, dài khoảng 760-800nm, đường kính 12nm (Purcifull et al., 1984) Bộ gen của virus là một sợi RNA đơn dương chứa 5,5% acid nucleic liên kết với protein (VPg) ở đầu 5’

và có đuôi poly(A) ở đầu 3’ Sợi RNA genome này được bao bọc bằng vỏ protein (capsid) Vỏ protein là sự lặp lại của những tiểu phần nhỏ là protein vỏ (coat protein) (Bernsein et al., 2001; Gonsalves et al., 2009)

Hệ gen của PRSV có kích thước 10326 nucleotide, ngoại trừ đầu poly(A),

và chứa một khung đọc mở lớn bắt đầu từ vị trí nucleotide 86-88 và kết thúc ở vị trí 10118-10120, mã hoá cho một polyprotein chứa 3344 amino acid Polyprotein này được xử lý hậu dịch mã tạo thành 12 loại protein Trình tự bảo thủ cao (AAAUAAAANANCUCAACACAUA) ở đầu 5’ của PRSV đóng vai trò quan trọng cho sự tái bản của virus (Park et al., 2005; Nishantha J, 2004; Bateson et al., 2002)

(Nguồn: Gonsalves et al., 2009)

Trong các protein của Potyvirus, bao gồm PRSV, hai protein được quan tâm

nhiều nhất là protein vỏ (CP) và protein sao chép (Nib), ngoài ra, Hc-Pro gần đây cũng được quan tâm nghiên cứu trong việc tạo cây chuyển gen kháng virus

1.2.2.1 Protein vỏ (coat protein – CP)

Protein vỏ là một protein đa chức năng cần thiết cho sự bao bọc acid nucleic, tham gia vào sự lan truyền của virus thông qua các loài rệp, sự di chuyển của virus trong tế bào thực vật (Boulton, 2002)

Chức năng quan trọng nhất của protein vỏ là tham gia tạo capsid bao bọc acid nucleic của virus nhằm tránh tác dụng phá hủy của enzyme nuclease, giữ cho hình thái

(Nguồn: Gonsalves et al., 2009)

A: PRSV dưới kính hiển vi điện tử, B: Cấu trúc bên ngoài

và kích thước virus ổn định, tham gia vào sự hấp thụ virus lên vị trí đặc hiệu trên tế bào mẫn cảm, protein vỏ mang tính kháng nguyên đặc hiệu của virus Vì vậy, gen CP và protein vỏ của nó đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện sự có mặt của PRSV, nghiên cứu đa dạng di truyền và tạo cây chuyển gen kháng PRSV (Cuong Viet Ha, 2007)

Protein vỏ được chia thành 3 vùng điển hình, trong đó vùng đầu N- và đầu C- là những vùng có trình tự bảo thủ cao và là vùng của virion tiếp xúc với bề mặt tế bào kí chủ Ngoài ra, vùng N- của CP là vùng có trách nhiệm tương tác với protein HC để lan truyền thành công virus trong cây trồng Sự lây nhiễn virus cho cây trồng sau khi loại

bỏ vùng N- và C- bằng trypsin cho thấy rằng các vùng này có liên quan nhiều đến khả năng lây nhiễm của virus Vùng thứ 3 có ảnh hưởng quan trọng trong CP là vùng DAG, vùng này cũng có trình tự bảo thủ cao, nằm gần đầu N-, có vai trò quan trọng trong sự lan truyền của virus thông qua các loài rệp, sự thay thế hay loại bỏ vùng DAG đều dẫn đến sự giảm mạnh mẽ khả năng lan truyền virus trong cây trồng (Hallan & Gafni, 2001; Urcuqui-Inchima et al., 2001; Cuong Viet Ha, 2007)

Trong quá trình lây nhiễm, cDNA tương ứng với RNA bộ gen của virus cần phải

di chuyển đến nhân của các tế bào Sự di chuyển này được thực hiện với sự tham gia của các protein của virus, các thành phần của tế bào chủ và có thể cả các protein được tổng hợp từ gen nhân của tế bào chủ (Gafni & Epel, 2002) Mặc dù, việc đưa genome của virus vào nhân tế bào theo hình thức vận chuyển cả virion nguyên vẹn hay chỉ vận chuyển phức hợp nucleoprotein còn chưa rõ ràng nhưng sự có mặt của protein vỏ của virus trong nhân tế bào sau quá trình lây nhiễm đã cho thấy protein vỏ có thể có vai trò trong quá trình vận chuyển genome của virus vào nhân tế bào Sự vận chuyển phức hợp nucleoprotein của virus từ tế bào chất vào nhân tế bào qua các lỗ màng nhân và có sự tham gia gián tiếp của các thụ thể vận chuyển có nguồn gốc từ tế bào chủ, gọi là các karyopherin Các karyopherin liên kết với phức hợp nucleoprotein của virus, sau đó chúng liên kết với các lỗ màng nhân giúp cho quá trình vận chuyển genome của virus vào trong nhân được thực hiện Trong quá trình liên kết giữa các karyopherin với phức hợp nucleoprotein của virus, protein của virus sẽ được gắn với tín hiệu đặc trưng của

nhân, và những dấu hiệu đó chủ yếu được gắn vào vùng đầu N-, một số ít được gắn vào vùng đầu C- của CP (Gafni & Epel, 2002; Kunik et al., 1998; Liu et al., 1999; Unseld

et al., 2001)

Protein vỏ cũng tham gia vào quá trình vận chuyển acid nucleic của virus từ nhân

tế bào chủ ra tế bào chất Trong trường hợp này, một tín hiệu vận chuyển acid nucleic cũng được các karyopherin gắn vào vùng đầu C- hoặc vùng trung tâm của protein vỏ của virus (Rhee et al., 2000; Unseld et al., 2001) Có thể khẳng định rằng, ngoài chức năng bao bọc, bảo vệ acid nucleic, protein vỏ còn có vai trò quan trọng trong việc vận chuyển genome của virus trong tế bào chủ

1.2.2.2 Protein Nib

Protein Nib là RNA polymerase phụ thuộc RNA (RNA-dependent RNA polymerase, RdRp), chịu trách nhiệm tái bản sợi RNA dương và âm của virus, có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm và sao chép genome của virus trong ký chủ RdRp cùng với các thành phần khác của virus và tế bào chủ tạo thành một phức hợp sao chép thực hiện quá trình tái bản genome của virus RdRp đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn sớm của sự tái bản genome của virus và làm tăng khả năng ức chế của enzyme này, được xem như chìa khóa tổng hợp một phân tử đặc biệt, ví dụ như scFv

ức chế hoạt động của enzyme RdRp Nói cách khác, việc ngăn cản hay ức chế hoạt động RdRp có thể phá vỡ sự tái bản của virus ở giai đoạn sớm một cách hiệu quả hơn (Cuong Viet Ha, 2007; Anindia et al., 2005)

1.2.2.2 Protein HC

Helper component-proteinase (HC-Pro) là một protein đa chức năng có liên quan đến khả năng truyền qua vector côn trùng ở cây Mặt khác HC-Pro là một protease có vai trò phân cắt các polyprotein thành các protein chức năng do đó có vai trò quan trọng trong sự hoàn thiện các đa phân tử protein sau dịch mã, sự biểu hiện và ức chế biểu hiện các triệu chứng của virus sau phiên mã (Cuong Viet Ha, 2007)

Nghiên cứu ban đầu đã chứng minh sự tham gia của HC-Pro của các potyvirus trong sự truyền qua vector côn trùng ở cây trồng HC-Pro có hoạt tính sinh học cho phép truyền tải các virion, sự tương tác giữa protein HC và protein vỏ cũng như tương tác với chính cá thể rệp là cần thiết cho sự lan truyền của rệp trong cây trồng Các thử nghiệm cho thấy rằng sự tương tác giữa protein HC và protein vỏ của potyvirus tăng ở những cá thể rệp có sự lây nhiễm vào cây trồng hơn so với những

cá thể rệp không được lây nhiễm Những nghiên cứu về khả năng của một protein

HC trong việc giữ lại một virion trong các cá thể rệp đã cho thấy mức độ truyền potyvirus ở các loài rệp khác nhau là khác nhau (Wang et al., 1998)

Hai tiểu phần được coi là có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự lan truyền của rệp trong cây trồng là vùng đầu N và vùng trung tâm trong HC-Pro Sự bảo thủ cao của 3 liên kết peptide (Lys-Ile/ Leu-Thr/Ser-Cys) được tìm thấy trong một vùng giàu Cys trong khu vực đầu N của HC-Pro (vùng “KITC”) được cho là có liên quan đến sự tương tác của các potyvirus với ngòi chích của các cá thể rệp (Yap et al., 2009) Sự đột

biến từ Lys thành Glu trong vùng KITC trong HC-Pro của Potato virus C không có ảnh

hưởng đến khả năng truyền tải virion của HC-pro Tuy nhiên, các HC-Pro của PVY đã

có mặt trong đường ống tiêu hóa của rệp cho thấy rằng đột biến từ Lys thành Glu của PVC lại có ảnh hưởng đến khả năng tương tác của HC-Pro với CP hay cá thể rệp Ngược lại, sự ngăn cản khả năng lan truyền của rệp cũng như sự truyền tải các virion

do các đột biến ở trình tự bảo thủ cao Pro-Thr-Lys (PTK) trong vùng trung tâm của HC-pro của ZYMV lại cho thấy rằng khu vực cho phép truyền tải virion nằm bên ngoài vùng đầu N (Cuong Viet Ha, 2007; Yap et al., 2009)

Gal-on và Raccah (2000) đã báo cáo rằng sự thay thế Ile cho Arg trong trình tự bảo thủ Phe-Arg-Asn-Lys (FRNK) ở vùng trung tâm của HC-Pro có ảnh hưởng tới sự biểu hiện triệu chứng virus ở cây trồng (Gal-on & Raccah, 2000) Dưa chuột và dưa hấu bị nhiễm với ZYMV có chứa đột biến này thì bị mất triệu chứng bệnh trong khi các triệu chứng trên bí đao lại biểu hiện ở nhiều cấp độ nặng nhẹ khác nhau mặc dù sự tích lũy virus ở các cây trồng này đều đạt đến một mức độ như nhau đối với ZYMV

Những sự thay đổi một amino acid trong HC-Pro của Plum pox virus (PPV) cũng gây

ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự biểu hiện các triệu chứng ở các cây thân thảo (Sáenz et al., 2001)

Vùng trung tâm của HC-Pro còn có vai trò trong quá trình sao chép RNA của virus, đột biến trong trình tự bảo thủ cao Ile-Gly-Asn (IGN) dẫn đến kìm hãm quá trình sao mã RNA Mặt khác, đột biến trong trình tự bảo thủ cao Cys-Cys/Ser-Cys (CC/SC) cũng kìm hãm sự di chuyển của virus qua các tế bào (Urcuqui-Inchima et al., 2000) HC-Pro còn có vai trò ức chế một cách hiệu quả sự làm câm gen sau phiên mã (Kasschau & Carington, 2001) Kasschau & Carington (2001) đã chứng minh vai trò của HC-Pro trong sự di chuyển cũng như sao chép hệ gen của virus phụ thuộc vào sự

ức chế quá trình làm câm gen sau phiên mã, các đột biến ở vùng trung tâm của HC-Pro

đã gây ra những sai sót trong sự di chuyển, sao chép cũng như các sai sót trong sự ức chế quá trình làm câm gen sau phiên mã của virus (Kasschau & Carington, 2001)

1.2.3 Phạm vi kí chủ, cơ chế truyền bệnh

Phạm vi kí chủ :

PRSV-p gây hại trên 15 loài của 3 họ thực vật là Caricaceae, Cucurbitaceae và Chenopodiaceae trong khi PRSV-w gây hại trên 38 loài của 11 chi trong 2 họ thực vật Cucurbitaceae và Chenopodiaceae (Babadoost et al., 2000; Shinichiro et al., 2007)

Cơ chế truyền bệnh:

Nhìn chung, virus không thể tự lan truyền, chúng luôn phải nhờ một sự trợ giúp từ bên ngoài để có thể lây lan (Song et al., 2004) PRSV truyền bệnh bằng hai cách: Một là do tiếp xúc cơ giới như thông qua các vết thương cơ giới do trong quá trình canh tác con người vô ý tạo ra, do gió mưa, động vật gây xây sát; Hai là do

côn trùng môi giới chủ yếu là các loài rệp thuộc họ Aphididae như Aphis gosipii,

Aphis crasivora, đặc biệt loài rệp Myzus persicae, loài rệp này cũng thường gây hại

nhiều cho các loại rau cải, bầu bí, mướp, dưa Bệnh lây lan rất nhanh, nhất là những cây được 5 – 6 tháng tuổi trở lên

1.2.4 Biện pháp phòng trừ

Do tính chất gây hại chủ yếu trong hệ mạch dẫn, khả năng phát tán nhanh chóng qua các môi giới truyền bệnh nên bệnh có mức độ phát triển mạnh, dễ gây thành dịch Đây là một trong những loại bệnh khó phòng trừ, các biện pháp hóa học

ít có tác dụng

Trên thế giới, nhiều biện pháp phòng trừ bệnh virus hại thực vật đã được áp dụng như :

- Loại bỏ nguồn bệnh bằng cách chọn cây giống tốt, có sức đề kháng cao, xử

lý hạt giống (bằng nhiệt, hóa chất,…)

- Theo dõi và phá hủy cây bệnh ngay từ khi bắt đầu có biểu hiện bệnh lý nhằm tránh lây lan sang cây khác

- Phòng trừ môi giới truyền bệnh: dùng thuốc diệt trừ côn trùng truyền bệnh, dùng bẫy thu hút, bắt và tiêu diệt côn trùng có hại,

- Áp dụng các biện pháp xen canh, luân canh, phun thuốc diệt cỏ,…

Tuy nhiên, các biện pháp kể trên không mang lại hiệu quả cao trong việc phòng trừ đối với bệnh mà lại tốn rất nhiều công sức Vì thế, hướng giải quyết tốt nhất để phòng và trừ bệnh là cần thiết phải có những giống cây có khả năng kháng lại loại virus này Đây là biện pháp đang được các nhà khoa học Việt Nam cũng như thế giới quan tâm và coi đó như là một phương hướng trong chiến lược phòng trừ bệnh virus hại cây trồng hiện nay cũng như trong tương lai (Song et al., 2004)

1.2.5 PRSV gây bệnh trên dƣa hấu

Virus gây bệnh đốm vòng đu đủ là một trong những nguyên nhân chính gây bệnh trên họ bầu bí, trong đó có dưa hấu Các mô tả về triệu chứng do PRSV gây ra trên cây họ bầu bí cho thấy hầu hết cây trong họ bầu bí nhiễm bệnh đều do PRSV-w

gây ra (Strange et al., 2002; Guner et al., 2002), với triệu chứng như khảm loang lổ, biến dạng, hoại tử trên lá, quả và thân (Guner et al., 2002; Halliwell et al., 1979) Các đốm sáng xuất hiện là do hàm lượng diệp lục bị giảm mạnh, dẫn đến giảm khả năng quang hợp và ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng sản phẩm Cùng với ZYMV, PRSV-w thường xuyên lây nhiễm vào dưa hấu (đồng thời hoặc riêng lẻ) và lan truyền nhanh chóng thông qua các loài rệp, các vết thương cơ giới, gây ra sự sụt giảm năng suất nghiêm trọng (Ma et al., 2005; Provvidenti et al., 1984;

Xu et al., 2004)

1.3 Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây trồng chuyển gen kháng virus

Chuyển gen vào cây trồng đã trở thành kỹ thuật thông dụng trong tạo giống cây trồng Cho đến nay, rất nhiều loại gen đã được chuyển vào cây trồng và nhiều loài cây chuyển gen được trồng thử ở điều kiện đồng ruộng, nhiều loại cây chuyển gen được sản xuất đại trà như cà chua, bông, cải dầu, ngô, khoai tây,… Năm 2011,

có hơn 160 triệu ha cây trồng biến đổi gen, tương đương với 10,67% tổng diện tích đất nông nghiệp trên toàn thế giới (1,5 tỷ ha), tập trung chủ yếu ở các quốc gia như

Mỹ (66,8 triệu ha), Brazil (25,4 triệu ha) Achentina (22,9 triệu ha), Ấn Độ (9,4 triệu ha), Canada (8,8 triệu ha), Trung Quốc (3,5 triệu ha), Cây trồng chuyển gen có thể được tạo ra với các đặc tính như kháng virus, kháng côn trùng, chín chậm, kháng chất diệt cỏ, tăng hàm lượng chất dinh dưỡng,… (Guner et al., 2002)

1.3.1 Kỹ thuật RNAi

1.3.1.1 Lịch sử phát triển

RNAi (RNA interference) là cơ chế tự nhiên của tế bào sống, làm bất hoạt sự hoạt động của một gen nào đó sau quá trình phiên mã thông qua cơ chế can thiệp của các RNA nhỏ Hiện tượng này được quan sát lần đầu tiên trên những cây thuốc

lá kháng bệnh đốm vòng do virus đốm vòng thuốc lá (Tobacco ring spot virus TRSV) gây ra (Wingard, 1928)

-Năm 1990, nhiều báo cáo gây bất ngờ của các nhà khoa học Mỹ và Hà Lan khi nghiên cứu chuyển gen sinh tổng hợp Chalcone, gen mã hóa cho enzyme quy định

màu sắc hoa (Chalcone synthase - CHS), nhằm tăng thêm màu tím đậm trên cây hoa

dã yên thảo (petunia) Tuy nhiên, kết quả không được như mong muốn, thay vì được làm đậm thêm màu hoa thì các cây hoa chuyển gen thu được lại có biểu hiện khảm trắng hoặc trắng tuyền Điều này chứng tỏ lượng Chalcone đã được tổng hợp

ít đi do sự hoạt động của gen chalcone đã bị ảnh hưởng dẫn đến sự giảm lượng sắc

tố của hoa Một điều thú vị nữa là qua các thế hệ, màu trắng của cánh hoa lại giảm

đi, các cánh hoa lại dần dần chuyển sang màu tím Những nghiên cứu sâu hơn về kiểu hình của cây đã cho thấy sự mất điều khiển ở đây là do sự ức chế sau phiên mã

sự biểu hiện gen tổng hợp chalcone thông qua việc tăng tỷ lệ phân hủy mRNA (Napoli et al., 1990; Van der Krol et al., 1990) Một vài trường hợp tương tự cũng được quan sát thấy trên một số đối tượng thực vật và nấm (Cogoni et al., 1994; Romano & Macino, 1992) Thuật ngữ “co-supperession” (đồng ức chế) được sử dụng để chỉ hiện tượng này

Các hiện tượng trên vẫn chưa thực sự giải thích được cho đến năm 1998, Fire

và Mello đã lây nhiễm sợi đôi RNA (double stranded RNA, dsRNA) bao gồm cả sợi

có nghĩa (sense) và sợi vô nghĩa (antisense), mã hóa cho một protein cơ bắp vào

giun tròn C elegans, cơ chế RNAi đã được làm sáng tỏ Họ phát hiện khi chỉ tiêm

phân tử RNA mã hóa cho protein cơ bắp (sợi có nghĩa) không làm thay đổi hành vi của giun tròn, khi tiêm phân tử RNA đối mã với RNA trên (sợi vô nghĩa) cũng không làm thay đổi gì Tuy nhiên, khi tiêm đồng thời cả sợi có nghĩa và sợi vô nghĩa thì giun tròn có những cử động lạ, cụ thể là co giật Các biểu hiện này tương

tự như ở những con giun tròn hoàn toàn thiếu gen tổng hợp protein cơ bắp này Fire

và Mello đã giải thích hiện tượng trên là do có trình tự nucleotide hoàn toàn bổ sung với nhau nên sợi có nghĩa và sợi vô nghĩa RNA đã kết hợp lại với nhau tạo ra RNA sợi đôi, và cho rằng phân tử RNA sợi đôi đó có thể làm bất hoạt gen mang cùng mật

mã với chúng Fire và Mello đã sử dụng thuật ngữ “RNA interference” (RNAi) để đặt tên cho cơ chế này Khám phá này đã làm sáng tỏ nhiều thí nghiệm tiến hành trước đó, đồng thời đề ra một cơ chế tự nhiên để kiểm soát thông tin di truyền, mở

ra một lĩnh vực nghiên cứu mới (Fire et al , 1998) Nhờ những phát minh quan trọng này, năm 2006 Fire và Mello đã được trao giải thưởng Nobel về Y học

1.3.1.2 Cơ chế hoạt động RNAi trong cây trồng

RNAi là cơ chế ức chế sự biểu hiện vật chất di truyền ở giai đoạn RNA Ở thực vật có 3 con đường ức chế RNA: (1) ức chế gen sau phiên mã (post-transcriptional gene silencing, PTGS) thông qua siRNA (short interfering RNA); (2)

ức chế gen sau phiên mã qua con đường tạo ra các miRNA (micro-RNA) trong điều chỉnh biểu hiện gen của tế bào; (3) sự câm gen phiên mã (transcriptional gene silencing – TGS) bằng cách liên kết với quá trình biến đổi nhiễm sắc thể trực tiếp qua siRNA, nó bao gồm sự methyl hóa histone và ADN (Baulcombe, 2004)

Các thành phần quan trọng tham gia vào cơ chế RNAi là enzyme Dicer, enzyme Argonaute, phức hệ RISC (RNA-incluced silencing complex), siRNA hoặc miRNA

Sự ức chế RNA thông qua siRNA xảy ra ở tế bào chất và là con đường quan

trọng trong tế bào thực vật nhiễm virus, nơi mà dsRNA có thể sao chép gián tiếp hoặc một đặc điểm cấu trúc thứ cấp của RNA virus sợi đơn Đối với những virus có genome là ADN, các dsRNA có thể được tạo ra nhờ quá trình phiên mã bổ sung gối nhau (Baulcombe, 2004) Khi chuỗi xoắn kép RNA (dsRNA) xuất hiện trong tế bào chất, Dicer – một loại ribonuclease III đặc hiệu cho các dsRNA được hoạt hóa thông qua sự phân hủy một phân tử ATP và lập tức cắt những chuỗi kép RNA này thành những đoạn ngắn khoảng 21 – 25 nucleotide, gọi là siRNA (Hammond et al., 2000; Zamore et al., 2000, Hannon, 2002, Pare & Hobman, 2007) Khi lai những RNA cho thấy, đó là những sợi đôi có chứa nhóm phosphate ở tận cùng đầu 5’ Sau khi bị cắt bởi Dicer, chuỗi kép siRNA đi vào phức hệ RISC và được các helicase trong phức hệ RISC cắt các liên kết hydro tách chúng ra làm hai chuỗi đơn, trong đó chỉ có một chuỗi đơn siRNA có đầu 5’ có hoạt lực với Argonaute mới được gắn với phức hệ RISC tạo phức hợp siRNA-RISC, quá trình này có tiêu tốn năng lượng ATP (Schwarz et al., 2002, Redfern et al., 2013, Riley et al., 2012, Ender &

Meister, 2010) Phức hợp siRNA-RISC nhận biết các phân tử mRNA của tế bào có trình tự tương đồng với trình tự của chuỗi đơn siRNA Sau quá trình nhận dạng, các mRNA và siRNA bắt cặp bổ sung với nhau ở đoạn tương đồng, mRNA bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi kép siRNA-mRNA tạo thành những đoạn nhỏ khoảng 12 nucleotide từ đầu 3’ Sau khi bị cắt đứt, mRNA bị tiêu hủy bởi các RNA nuclease (hình 1.4) (Verdel et al., 2004)

Cơ chế ức chế miRNA: Ngay sau khi phát hiện ra RNAi, người ta nhanh

chóng nhận ra rằng cơ chế này đã tồn tại từ lâu trong tế bào bởi một hệ thống điều hòa biểu hiện gen gọi là micro-RNA (miRNA) miRNA là một loại RNA nhỏ, kích thước khoảng 21-24 nucleotide, không mã hóa thông tin di truyền, có chức năng chủ yếu là điều khiển âm sau phiên mã vì cặp base có trình tự gần như bổ sung hoàn toàn với mRNA đích (Bartel et al., 2004) Khác với siRNA, miRNA có nguồn gốc

từ các mRNA có cấu trúc kẹp tóc được phiên mã từ hệ gen nhân trong khi siRNA thường có nguồn gốc từ mRNA sợi đôi hoặc những cấu trúc kẹp tóc kéo dài được phiên mã từ transposon, ADN virus hoặc ADN ngoài nhiễm sắc thể Trong nhân tế bào, các phân tử miRNA được tạo ra thông qua quá trình phiên mã từ các gene gọi

là các phân tử miRNA nguyên thuỷ (pri- miRNA), các phân tử này có chứa các cấu trúc kẹp tóc (hairpin) và bị cắt bởi enzyme Drosha để tạo thành những sợi pre-miRNA (phân tử tiền microRNA) Các pre-miRNAs sau đó được di chuyển ra ngoài

tế bào chất và bị enzyme Dicer cắt thành những đoạn ngắn miRNA sợi đôi (khoảng

19 – 21 nucleotide) Sau đó, các miRNA sợi đôi bị helicase cắt các liên kết hydro tạo ra miRNA sợi đơn, trong đó chỉ có một sợi có đầu 5’ có hoạt lực với Agronaute mới được kết hợp với phức hệ RISC tạo thành phức hợp miRNA-RISC Ở thực vật,

cơ chế tương tác giữa phức hợp miRNA-RISC với mRNA đích sẽ dẫn đến sự tiêu hủy mRNA, từ đó ức chế biểu hiện gen Tuy nhiên, ở động vật, phức hợp miRNA-RISC thường can thiệp chủ yếu bằng cách cản trở quá trình dịch mã của mRNA (Jones-Rhoades và Bartel, 2004) Mức độ tương đồng của miRNA trong phức hệ RISC với mRNA đích sẽ quyết định đến hiệu quả bất hoạt quá trình dịch mã của mRNA Nói chung, mRNA đích sẽ bị tiêu hủy nếu trình tự của nó tương đồng hoàn

toàn với trình tự của miRNA Mặt khác, nếu trình tự của miRNA chỉ cần tương đồng với mRNA đích từ vị trí nucleotide thứ 2 đến 8 tính từ đầu 5’ thì miRNA sẽ liên kết với mRNA đích và ngăn cản sự dịch mã mà không làm tiêu hủy mRNA (Denli et al., 2004) (hình 1.4)

Hình 1.3 Con đường tạo thành RNAi a, b: siRNA; c: miRNA

(nguồn: Dykxhoorn et al., 2003)

Phần lớn miRNA thực vật điều khiển đích của chúng bằng cách cắt mRNA trực tiếp ở vùng mã hóa (Bartel và Bartel, 2003; Bartel, 2004) Một vài miRNA thực vật được chứng minh là mấu chốt trong sự phát triển lá và ra hoa thông qua gen đích là các nhân tố phiên mã liên quan (Reinhart et al., 2002; Bartel và Bartel, 2003) Khác với nhân tố phiên mã, miRNA có thể nhắm tới một giới hạn phiên mã rộng, quy định sự phát triển theo hướng đặc hiệu mô hoặc phản ứng với một giới hạn áp lực môi trường (Jones-Rhoades và Bartel, 2004; Adai et al., 2005) Các kiểu biểu hiện khác nhau và sự phong phú tiềm năng gen đích mRNA gợi ý rằng miRNA

có thể điều khiển nhiều quá trình sinh lý và có thể đóng một vai trò trực tiếp trong

sự di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác ở thực vật (He và Hannon, 2004; Kidner và Martienssen, 2005)

Con đường làm câm gen thứ ba liên quan tới sự methyl hóa phân tử ADN và

sự ức chế phiên mã Cơ chế ức chế biểu hiện gen này lần đầu tiên được khám phá trên thực vật, khi cấu trúc đoạn gen chuyển và RNA virus có xu hướng methyl hóa ADN tạo nên trình tự nucleotide đặc hiệu (Jones et al., 2001; Mette et al., 2000; Wassenegger et al., 1994) Năm 2002, khi nghiên cứu sự sinh sản của nấm men, Volpe và cs đã quan sát thấy sự hình thành sợi tạp sắc ở xung quanh vùng tâm động được liên kết với siRNA (Volpe et al., 2002) Năm 2003, Zilberman và cs đã phát hiện sự methyl hóa ADN thông qua siRNA trên thực vật được liên kết với biến đổi histone (Zilberman et al., 2003) Một vai trò quan trọng của sự câm gen ở mức độ nhiễm sắc thể là bảo vệ genome tránh những biến đổi gây ra bởi transposon (Baulcombe, 2004)

1.3.2 Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây trồng kháng virus

Việc chuyển gen nhằm tạo ra những giống cây trồng có khả năng kháng virus bằng cách sử dụng chính các yếu tố gây bệnh (pathogen-derived resistance - PDR)

có nguồn gốc từ virus đó để chuyển vào cây trồng đang được xem là biện pháp có hiệu quả nhất để kiểm soát bệnh virus hại cây trồng (Satyajit et al., 2014) Biện pháp này đã giúp tạo ra nhiều loài cây trồng có khả năng kháng lại virus (Simón-Mateo and García, 2011)

Trong các kỹ thuật chuyển gen, RNAi được xem là một trong những kỹ thuật đem lại nhiều triển vọng và được ứng dụng trong việc tạo ra các giống cây trồng chuyển gen có khả năng kháng virus Cho đến nay, đã có nhiều loại cây trồng chuyển gen kháng nhiều loại virus khác nhau được tạo ra bằng kỹ thuật RNAi thông qua việc chuyển gen mã hóa cho các protein (CP, Nib, Pro,…) của chính virus đó

như: kháng Potato virus Y (Waterhouse et al., 1998; Smith et al., 2000), Barley

yellow dwarf virus – PAV (BYDV-PAV) (Wang et al., 2000), Curcumber mosaic virus (CMV) (Kalantidis et al., 2002), Tobaco mosaic virus (TMV) (Kai et al.,

2005); Curcumber green mottle mosaic virus (CGMMV) (Park et al., 2005),

Tobacco streak virus (TSV) (Pradeep et al., 2012), Rice stripe virus (Zhou et al.,

2012), African cassava mosaic virus (ACMV) (Vanitharani et al., 2003; Ruiz-Ferrer

& Voinnet, 2007), Cassava brown streak disease (CBSD) (Patil et al., 2011),

Tomato yellow leaf curl virus (TYLC) (Fuentes et al., 2006), Rice tungro bacilliform virus (RTBV) (Tyagi et al., 2008), Citrus tristeza virus (CTV) (López et

al 2010), Potato spindle tuber viroid (PSTVd) (Schwind et al., 2009),… Trong các

nghiên cứu này, người ta thường sử dụng cấu trúc RNAi chứa trình tự gen của virus lặp lại đảo chiều để chuyển vào cây Cấu trúc RNAi này sẽ được biểu hiện thành RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyển gen, từ đó kích thích cơ chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây

Hiệu quả làm câm gen đạt được cao nhất khi cấu trúc hpRNA được lặp lại với một trình tự intron (ihpRNA) (Smith et al., 2000; Wesley et al., 2001) Năm 2007, Shinichiro Kamachi và cs đã tạo được một số dòng thuốc lá chuyển gen có khả năng kháng virus CGMMV khi chuyển cấu trúc ihpRNA chứa gen mã hóa cho protein vỏ của virus CGMMV, hiệu quả kháng đối với CGMMV đạt 85,7% ở thế hệ T2 Khi phân tích RNA trong các dòng cây chuyển gen, các nhà khoa học đã xác định sự có mặt của các siRNA (Shinichiro et al., 2007) Cũng năm này, Bonfim và cs đã tạo được một dòng cây đậu chuyển gen kháng Bean golden mosaic virus (BGMV), hiệu quả kháng đạt được 93% (Bonfim et al., 2007) Nói chung, sự có mặt của các siRNA đã kìm hãm sự nhân lên của virus trong các tế bào của cây chuyển gen, từ đó làm chậm sự tích lũy virus, làm chậm hoặc giảm nhẹ các triệu chứng bệnh (Gottula

et al., 2009)

Cho đến nay, đã có nhiều loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus được công nhận và trồng thương mại như: đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng (PRSV) đã được công nhận và trồng ở Mỹ, Trung Quốc, Philippine; Bí đao chuyển gen kháng đồng thời ba loại virus CMV, WMV (Watermelon mosaic virus) và ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus) đã được công nhận và trồng ở Mỹ; Ớt và cà chua chuyển gen kháng CMV đã được công nhận và trồng ở Trung Quốc,… Ngoài

ra, rất nhiều các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus khác đang trong giai đoạn khảo nghiệm để được công nhận là giống cây trồng thương mại như: Sắn