BÁO CÁO THỰC TẬP-ĐỀ CƯƠNG AMINO ACID

giá trị dinhdưỡng đó chính là các acid amin như Lysine, Valine, Glutamic, Arginine,Methionine, Tyrosine, PhenylAlanine, Threonine, Leucine, IsoLeucine… - Hiện nay để đánh giá chất lượng

1 Phần mở đầu

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

- Nước mắm là một loại gia vị và nước chấm quen thuộc, được sử dụng rộng rãi trongẩm thực của các nước ở Châu Á Ở Việt Nam, nước mắm là một phần không thểthiếu trong bữa ăn hàng ngày của hầu hết mọi gia đình

- Tuỳ theo từng vùng khác nhau, nước mắm sẽ được chế biến và mang những hương

vị đặc trưng riêng cho từng vùng miền Như ở Phú Quốc, nước mắm được chế biếntừ cá cơm, tại Phan Thiết thì nước mắm được chế biến từ cá nục hoặc tại đồn bằngsông Cửu Long thì nước mắm từ cá linh, ở một số thì nước mắm còn được làm từ concà cuống Một số thương hiệu nước mắm nổi tiếng ở Việt Nam như: nước mắm PhúQuốc, nước mắm Phan Thiết, nước mắm Nha Trang…

- Trong nước mắm thành phần chủ yếu và quyết định đến chất lượng giá trị dinhdưỡng đó chính là các acid amin như Lysine, Valine, Glutamic, Arginine,Methionine, Tyrosine, PhenylAlanine, Threonine, Leucine, IsoLeucine…

- Hiện nay để đánh giá chất lượng và giá thành của nước mắm, chúng ta vẫn đangdựa vào tiêu chuẩn xác định độ đạm tổng của nước mắm bằng phương phápKjiehdahl rồi quy ra hàm lượng đạm amin Phương pháp này có khuyết điểm làkhông thể phân biệt được các loại hợp chất có chứa đạm dinh dưỡng và các hợpchất chứa đạm không dinh dưỡng Một số cơ sở sản xuất đã lợi dụng vào tiêu chuẩntrên, làm tăng độ đạm bằng cách thêm urê vào nước mắm để làm giảm giá thànhsản xuất, điều đó gây ra những ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêudùng

- Trước thực trạng trên, tôi thực hiện đề tài này nhằm xây dựng được phương phápxác định acid amin trong nước mắm(cụ thể là nhóm acid amin không thay thế) bằng

phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ 2 lần (LC/MS/MS) để làm cơ sở chophương pháp xác định chất lượng nước mắm bằng các chỉ tiêu về acid amin

1.2 Tổng quan

1.2.1 Tồng quan về nước mắm

1.2.1.1 Giới thiệu về nước mắm

Nước mắm là hỗn hợp muối các acid amin được thủy phân từ protein trong thịt cá vớitác nhân là hệ enzyme có sẵn trong nội tạng cá cùng với một số vi khuẩn kỵ khí

Tại Việt Nam, các vùng miền biển đều có làm nước mắm và có một số thương hiệunước mắm nổi tiếng tại Việt Nam như nước mắm Phú Quốc, nước mắm Phan Thiết,nước mắm Nha Trang… Các loại cá biển dùng để làm nước mắm là cá cơm, cá nục, cálinh Tuỳ theo độ đạm trong nước mắm mà người ta phân loại nước mắm thành các cấpđộ: nước mắm đặc biệt (khoảng 400 đạm), nước mắm thượng hạng(350 đạm), hạng 1(300

đạm), hạng 2(250 đạm), hạng 3(dưới 200 đạm)

1.2.1.2 Thành phần của nước mắm

- Các chất đạm: chiếm chủ yếu và là thành phần quyết định giá trị của nước mắm.Các chất đạm được phân thành 3 loại:

+ Đạm tổng: Là tổng số Nitơ có trong nước mắm (g/L), dùng để phân hạng nước mắm+ Đạm amin: Là tổng lượng đạm nằm dưới dạng acid amin (g/L), quyết định giá trịnước mắm

+ Đạm amoni: Lượng đạm này có trong nước mắm càng nhiều thì nước mắm càng kémchất lượng

Ngoài các chất đạm trên, trong nước mắm còn có các loại đạm khác như dipeptide,tripeptide, peptone Đây là những thành phần trung gian làm cho nước mắm dễ bị hưhỏng do hoạt động của vi sinh vật

- Các hợp chất bay hơi: gồm nhiều nhóm và quyết định đến hương vị nước mắm

Hàm lượng một số chất bay hơi có trong nước mắm (mg/100g nước mắm):

+ Các hợp chất carbonyl bay hơi: 407 – 512 (VD: Formaldehyde)

+ Các acid bay hơi: 404 – 533 ( acid propionic)

+ Các amin bay hơi: 9,5 - 11,3 (isopropylamine)

- Các chất vô cơ: NaCl chiếm nhiều nhất(250 – 280 g/L) và một số chất khoáng khácnhư Ca, Mg, S, P, I

- Các vitamin: B1 B2 B12 PP

1.2.1.3 Các hệ enzym trong sản xuất nước mắm:

Gồm 3 hệ lớn:

- Hệ Metalo-protease( hay còn gọi là Aminodipeptidase):

Hệ enzyme này có trong nội tạng cá, chịu được nồng độ muối cao, hoạt động mạnhtrong thời gian đầu lên men nước mắm, giảm dần ở tháng thứ 3 về sau Hệ enzyme cóhoạt tính mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối với các nhóm peptide khác nhau.Nhóm enzyme này là nhóm enzyme trung tính, pHopt = 5-7, pI = 4-5, ổn định với ion

Ca2+ và Mg2+ và mất hoạt tính khi có các ion Zn2+, Pb2+, Hg2+

- Hệ enzyme serine – protease:

Điển hình là enzyme trypsine, có nhiều trong nội tạng cá Ở giai đoạn đầu, hệ enzymenày hoạt động yếu, tới tháng thứ 2 hoạt động mạnh tới cực đại, và tới tháng thứ 3 bắtđầu giảm dần khi protein trong nước mắm phân giải gần như hoàn toàn Hệ enzymenày hoạt động ở pH = 5-10, pHopr= 9

- Hệ enzyme acid – protease:

Có trong nội tạng cá Hệ enzyme này dễ bị ức chế bởi nồng độ muối khoảng 15% nênchỉ hoạt động trong thời gian đầu của quá trình thủy phân Hệ này chỉ đóng vai trò thứyếu trong quá trình sản xuất nước mắm

1.2.1.4 Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng nước mắm

Hiện nay các nhà sản xuất nước mắm tại Viện Nam đều áp dụng tiêu chuẩn TCVN5107:2003 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn của Bộ Khoa Học và Công nghệ ban hành Tiêuchuẩn này có các quy định về hoá học như hàm lượng nitơ tổng, hàm lượng nitơ amin,hàm lượng muối… Các chỉ tiêu về vi sinh như tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc

E.coli, Coliform…

1.2.2 Tổng quan về Acid Amin [1]

1.2.2.1 Giới thiêụ chung về acid amin:

- Acid amin là 1 loai hợp chất hữu cơ có chứa nhóm amino -NH2 và nhóm cacboxyl –COOH trong phân tử

-Tuỳ theo vị trí cuả nhóm -NH2 so với –COOH mà có các α ,β… acid amin

- Các α- acid amin là đơn vị cơ sở câú tạo nên cấu trúc cuả protein của cơ thể sống.Công thức cấu tạo tổng quát cuả α-acid amin là:

- R-CH-COOH

NH2

Protein có trên 20 loại acid amin khác nhau tham gia vào cấu trúc của nó, các acid amin chỉ khác nhau ở gốc R Các tính chất lý học như khả năng tan trong nước , hoạt động hóa học, khả năng tạo liên kết hiđro của acid amin cũng phụ thuộc vào bản chất hóa học của gốc R đó

1.2.2.2 Phân loại các acid amin:

- Dựa vào đặc tính mạch bên ngoài , ngươì ta phân chia các acid amin thường gặp thành

1 số nhóm chính sau:

• Nhóm 1: Acid amin mạch thẳng :

COOH CH

CH3

ValinSerine

HC COOH

NH2(CH2)4 NH2

Lys

Arginine

HC COOH

NH2

(CH2)3 N C

NH

NH2H

Arg

1.4: Acid amin chứa S

Tên gọi Công thức cấu taọ Kí hiệu viết tắtCysteine

HC COOH

CH2 CH COOH

NH2

His

HN HOOC

Pro

• Nhóm 4: Amit của acid amin

Tên gọi Công thức cấu taọ Kí hiệu viết tắt

Asparagine

HC COOH

ra ở trẻ em thêm 2 acid amin là: Histidine và Arginine

+ Nhóm các acid amin có thể thay thế: Alanine, Glycine, Glutamic Acid, Aspartic acid,Tyrosine, Asparagine, Cysteine, Cystine, Serine, Proline

1.2.2.3 Các tính chất chung cuả các Acid Amin:

a Tính tan:

Bảng tính tan cuả các acid amin trong nước ở 25oC

Acid amin S(g/l) Acid amin S(g/l)

- Các acid amin không phân cực như: Gly, Ala, Val, Leu, Ileu, Pro, Trp, Met, Tyr, Phe

- Các acid amin phân cực trong nước như: Thr, Glu, His, Ser, Asp, Gln, Lys, Arg, Cys, Asn

c Tính quang hoạt:

- Trừ Gly , các α-C củả các acid amin còn lạiđều là C bất đối Nghĩa lànó liên kết với 4nhóm khác nhau.Vì trung tâm bất đối này nên các acid amin này có tính quang hoạt, chúng làm xoay mặt phẳng đường đi của ánh sáng phân cực.Ngoài Cα bất đối thì Cβ

của Ile và Thr cũng bất đối.Vì thế Ile, Met có thể tồn tại 4 đồng phân quang học

- Tất cả các protein được tìm thấytrong tự nhiên là L-acid amin

Cách gọi tên khoa học này dựa trên sự sắp xếp D, L của Glyxeranđehit và không dựa trên nguyên tắc làm xoay mặt phẳng đường đi ánh sáng phân cực Có nghĩa là: L- cáchsắp xếpnày không liên quan tới việc làm xoay mặt phẳng ánh sáng phân cực sang trái như trong trường hợp của L- Glycalaldehyde Mặc dù vậy nhưng hầu hếtcác L-acid amin đều làm xoay mặt phẳng ánh sáng phân cực sang trái

1.2.2.4 Vai trò của acid amin

Các Acid amin là đơn vị cơ bản tạo nên các protein trong cơ thể sống, nói cách khác cácacid amin là các “viên gạch” tạo nên các phân tử protein

Trong các loại acid amin thì acid amin thay thế cơ thể có thể tự tổng hợp khi không đượccung cấp đủ khẩu phần thức ăn Còn các loại acid amin không thay thế thì cơ thể khôngthể tự sinh tổng hợp được mà phải bắt buộc bổ sung từ khẩu phần ăn hàng ngày Các acidamin không thay thế giúp kích thích cơ thể phát triển Nếu thiếu 1 trong các loại acidamin không thay thế có thể dẫn đến một số bệnh nguy hiểm

Vd:

Thiếu Lysine: cơ thể sẽ hấp thu Canxi không tốt làm xương mau chóng bị thoái hoá Thiếu Methionine: Ở nam giới sẽ thiếu hormone sinh dục testosterone

Thiếu Leucine: Việc điều hoà hàm lượng đường trong máu sẽ bị rối loạn

1.2.3 Tổng quan về các phương pháp phân tích acid amin

1.2.3.1 Phương pháp sắc ký giấy.

Phương pháp sắc ký giấy nhuộm màu với thuốc thử Ninhydrin dùng để định tính, và bánđịnh lượng các acid amin từ dịch thủy phân protein Đây là phương pháp cổ điển dùngtrong kiểm nghiệm thực phẩm Hệ dung môi phân tách thường được sử dụng là :Phenol:H2O, hoặc n-butanol:acetic acid: H2O Tùy theo hệ dung môi các acid amin có thứtự và giá trị Rf khác nhau

1.2.3.2 Phương pháp sắc ký bản mỏng

Các thuốc thử dùng để phân tách acid amin thường dùng: Ninhydrin, 2,4 – dinitrophenyl (DNP), 5 – dimethylaminonaphthalene – 1 – sulfonyl (dansyl)…

Một số dung môi dùng để phân tách acid amin:

- Acetone:H2O:Acetic acid:Formic Acid

- Ethanol:H2O:dimethylamine

- Chloroform:Methanol

- n – butanol:acetic acid:H2O

1.2.3.3 Phương pháp sắc ký khí (GC)

Phương pháp sắc ký khí là một kỹ thuật phân tích acid amin có rất nhiều ưu điểm: độnhạy cao, khả năng phân tách rất tốt Tuy nhiên hạn chế lớn nhất của phương pháp nàylà phải tạo dẫn xuất dễ bay hơi để phân tích với một số phản ứng tạo dẫn xuất thôngdụng như heptafluorobutyryl, trifluoroacetyl… có thời gian xử lý mẫu lâu

1.2.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC)

Các phương pháp phân tích acid amin bằng sắc ký lỏng truyền thống:

- Tạo dẫn xuất tiền cột(Pre-column): Tạo dẫn xuất và phân tích bằng cột pha đảo(RP) Các chất tạo dẫn xuất thường là o-phthaldialdehyde(OPA), 9 –flourenylmethyl chloroformate(FMOC – Cl), isothiocynate(PITC), 1 –dimethylaminonaphathalene – 5 – sulphonyl chloride (dansyl – Cl) Ưu điểm củaphương pháp này việc tạo dẫn xuất đơn giản, và thời gian phân tích nhanh Khuyếtđiểm của phương pháp này là độ tái lập của việc phân tích các mẫu thực phẩm thấp,

nguyên nhân là vì chưa loại bỏ việc tương tác nền của mẫu thực phẩm Ví dụ nhưCystine(Cys) nhiều lúc không phát hiện được khi tạo dẫn xuất với OPA Trong khiđó với PITC thì độ tái lập và độ tuyến tính thấp

- Tạo dẫn xuất hậu cột(Post – column): Tạo dẫn xuất và phân tích bằng cột trao đổiion Chất tạo dẫn xuất thường dùng là ninhydrin, OPA Phương pháp này rất thíchhợp cho các mẫu thực phẩm và có nền mẫu phức tạp Ưu điểm của phương pháp làloại bỏ được hiệu ứng nền mẫu trước khi tạo dẫn xuất, độ lập lại cao, độ tuyến tínhcao Khuyết điểm của phương pháp này là sự phức tạp của quá trình tạo dẫn xuấtsau cột, và thời gian phân tích trên máy dài ( 1- 2h) , và nồng độ acid amin trongdịch phân tích phải lớn (LOD = 10 – 50 pmol/mL cho mỗi acid amin)

Hiện nay có một phương pháp được áp dụng để phân tích các acid amin là phương phápsắc ký lỏng ghép khối phố một lần hoặc nhiều lần ( LC/MS, LC/MSn) Phương phápnày có các ưu điểm: độ nhạy rất cao, độ lập lại, độ tuyến cao, và không cần tạo dẫnxuất, thời gian phân tích cũng ngắn hơn Ngoài ra phương pháp này còn định danh rấttốt dựa trên phổ khối lượng đặc trưng của từng acid amin Khuyết điểm của phươngpháp này là giá thành thiết bị cao, và nồng độ mẫu phân tích phải rất nhỏ

2 Luận điểm mới của đề tài

- Hiện nay ở Việt Nam chưa có những nghiên cứu hoặc có quy trình định lượng acidamin trong nền mẫu nước mắm từ đó làm cơ sở để đưa ra chỉ tiêu mới cho chất lượngcủa nước mắm

- Phương pháp định lượng acid amin bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ làm tăng độ nhạycủa giới hạn phát hiện, định danh chính xác các hợp chất acid amin và rút ngắn thờigian phân tích so với việc phân tích các acid amin bằng các phương pháp khác

3 Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng được quy trình định lượng các acid amin không thay thế trong nước mắmbằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ 2 lần (LC/MS/MS):

+ Đưa ra được khoảng tuyến tính, các giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạnđịnh lượng (LOQ) của phương pháp

+ Đưa ra được hiệu suất thu hồi của phương pháp (H%)+ Đưa ra được độ không đảm bảm đo của phương pháp

4 Nội dung nghiên cứu

- Bước 1: Khảo sát các phương pháp xử lý, tách chiết acid amin trong nền mẫu, xácđịnh các thông số tối ưu

- Bước 2: Khảo sát các thông số sắc ký lỏng và xác định các thông số tối ưu

- Bước 3: Khảo sát các thông số trên khối phổ và xác định các thông số tối ưu

- Bước 4: Thẩm định quy trình định lượng các acid amin bằng các phương pháp thốngkê

- Bước 5: Kết quả và bàn luận

- Bước 6: Kết luận

Chương 5: Phương pháp thực hiện

5.1 Nguyên liệu

5.1.1 Chất chuẩn

Các loại acid amin Hãng sản xuất Mã số Nồng độ

5.1.2 Đối tượng nghiên cứu

- Nước mắm Nam Ngư do công ty Masan sản xuất

- Chất điều vị: Monosodium Glutamate (621), Disodium Guanylate (627), Disodium Inosinate(631).

- Chất bảo quản: Potassium Sorbate(202), Sodium Benzoate(211)

- Chất ổn định xanthan gum (415)

- Màu tổng hợp brown HT (155), màu tự nhiên caramel (150a)

5.2 Dụng cụ, Trang thiết bị, hoá chất

5.2.1 Dụng cụ

- Oáng nghiệm có nắp

- Oáng nhựa ly tâm có nắp

- Bộ cô quay chân không Buchi R-210

- Bộ Vacumn Maninfold

- Máy cất nước 2 lần

- Cân phân tích 4 số lẻ (độ nhạy 0,1 mg) Satorius

- Máy ly tâm

- Hệ máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: Hiệu Shimadzu

+ Bơm LC – 20AD XR+ Autosampler SIL – 20AD XR+ Degasser DGU – 20 A5+ Interface CBM – 20A+ Cột sắc ký phân tích : Cột trao đổi cation Primesep 100 (250 x 4,6 mm)

- Đầu dò khối phổ 2 lần(MS/MS) AB Sciex TripleQuad 5500

5.2.3 Hoá chất

- Methanol, J.T Baker, HPLC grade

- Acetonitrile, J.T Baker, HPLC grade

- Trifluoroacetic acid, Merck, AR grade

- K4[Fe(CN)6].3H2O, Merck, AR grade

- ZnSO4 7H2O, Merck, AR grade

- NaHCO3, Merck, AR grade

- Nước cất 2 lần

5.3 Phương thức nghiên cứu

Khảo sát các quy trình chiết acid amin trong nước mắm

Chọn lựa các điều kiện sắc ký

Chọn lựa các điều kiện khối phổ

Thẩm định quy trình định lượng acid amin trong nước mắm

5.3.1 Khảo sát các quy trình chiết acid amin trong nước mắm [2]

Qua cột SPE SCX (đã được hoạt hóa)

Lọc Filter 0,45 µm vào vial

Phân tích trên máy LC/MS/MS

Acetonitrile/H2O

= 30/70 ,

TFA = 0,05%

Thuyết minh quy trình 1:

- Dùng pipette hút 2 mL mẫu nước mắm cần phân tích vào ống nghiệm

- Bổ sung 30 mL Methanol vào ống nghiệm, lắc đều, hoà tan mẫu

- Lọc dịch hỗn hợp qua giấy lọc thô vào một bình cô quay 100 mL

- Cô quay mẫu bằng máy cô quay chân không (t0 = 300C) cho đến cạn

- Thêm vào bình sau khi cô quay 30 mL nước cất, hoà tan đều mẫu

- Cho toàn bộ dung dịch mẫu qua cột SPE SCX (Strong cation exchange) đã được hoạt hoá bằng methanol

- Rửa giải mẫu bằng 6 mL pha động chạy máy là Acetonitrile/H2O = 30/70, bổ sung TFA 0,05%

- Định mức tới 50 mL bằng pha động bằng pha động Acetonitrile/H2O = 30/70, bổ sung TFA 0,05%

- Lọc dung dịch qua filter 0,45 µm vào vial

- Phân tích mẫu trên máy LC/MS/MS

Quy trình 2:

Trộn đều, hoà tan Trộn đều, hoà tan Định mức 50 mL

1 mL nước mắm

Ly tâm lấy dịch trong

30 mL

nước cất

Lọc Filter 0,45 µm vào vial

Phân tích trên máy LC/MS/MS

4 mL Thuốc

thử Carrez

nước cất