Nghiên cứu quan hệ di truyền một số giống lúa đặc sản, chất lượng, trồng phổ biến ở việt nam bằng chỉ thị phân tử SSR

Để góp phần giúp nhận dạng các giống phục vụ cho công tác bảo tồn và cung cấp thông tin hữu ích cho công tác chọn tạo giống lúa chất lƣợng cao chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu qua

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Trang 2

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Hà Nội, Tháng 10-2013

Trang 3

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố

Hà Nội, ngày tháng năm 2013

Tác giả

Trần Thị Lương

Trang 4

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Đức Thành đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đặc biệt đến TS Lê Thị Bích Thủy và tập thể cán bộ Phòng Di truyền tế bào thực vật đã giúp đỡ tôi về mặt tinh thần, cũng như tạo mọi điều kiện về vật chất, các phương tiện kỹ thuật cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong ban đào tạo Viện sinh thái Tài nguyên Sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành chương trình đào tạo

Cuối cùng tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt thời gian làm luận văn

Tác giả

Trần Thị Lương

Trang 5

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

DNA : Deoxyribonucleic acid

RNA : Axit ribonucleotide

AFLP : Amplyfied Fragment Length Polymorphism

Bp : Cặp base (base pair)

CTAB : Cetyltrimethyl amoniumbromide

dNTP : Deoxynucleosid triphosphat

EDTA : Ethylene diamin tetra acetate

EtBr : Ethidium bromide

RFLP : Đa hình độ dài các đoạn cắt hạn chế

(Restriction Fragment Length Polymorphism) RAPD : Random Amplyfied Polymorphic DNA

SSR : Các trình tự lặp lại đơn giản

(Simple Sequence Repeats) Taq Polymerase: Thermus aquaticus Polymerase TBE : Tris base, Boric acid, EDTA

Trang 6

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại gạo dựa vào hàm lượng amylose 10 Bảng 1.2 Tương quan giữa nhiệt độ hóa hồ và độ tan rã của gạo trong môi trường kiềm 11 Bảng 1.3 Phân loại gạo theo độ bền thể gel 12 Bảng 1.4 Phân loại các giống gạo tẻ (nonwaxy) ở các nước Á châu dựa trên hàm lượng amylose, độ trở hồ - BEPT (kiểm định kiềm) và độ bền thể gel .13 Bảng 1.5 Biến thiên các tính trạng phẩm chất hạt theo mùa vụ tại Cần Thơ .14 Bảng 2.1 Danh sách 60 giống lúa nghiên cứu 23 Bảng 3.1 Số alen thể hiện, số alen hiếm và hệ số PIC của 33 cặp mồi SSR 33 Bảng 3.2 Các chỉ thị SSR cho alen đặc trưng ở 12 giống lúa 36 Bảng 3.3 Tỉ lệ khuyết số liệu (M) và tỉ lệ dị hợp tử (H) của các giống lúa nghiên cứu 40

Trang 7

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 3.1 Kết quả điện di DNA genome của 25 mẫu lúa (số 1-25 trên ảnh tương ứng với các giống theo thứ tự 1-25 ở bảng 2.1) 32Hình 3.2 Ảnh điện di trên gel polyacrylamide của cặp mồi RM18 với các mẫu lúa D30 – DS55 tương ứng với số 1-60 (bảng 2.1) 36Hình 3.3 Ảnh điện di trên gel polyacrylamide của cặp mồi RM510 với các mẫu lúa DS1 - DS25 tương ứng với số 1-25 (bảng 2.1) 37Hình 3.4 Ảnh điện di trên gel polyacrylamide của cặp mồi RM20 với các mẫu lúa DS1 - DS25 tương ứng với số 1-25 (bảng 2.1) 37Hình 3.5 Ảnh điện di trên gel polyacrylamide của cặp mồi RM17 với các mẫu lúa DS1 – DS60 tương ứng với số 1-60 (bảng 2.1) 37Hình 3.6 Ảnh điện di trên gel polyacrylamide của cặp mồi RM223 với các mẫu lúa DS1 - DS25 tương ứng với số 1-25 (bảng 2.1) 38Hình 3.7 Ảnh điện di trên gel polyacrylamide của cặp mồi RM19 với các mẫu lúa DS30 – DS55 tương ứng với số 1-25 (bảng 2.1) 38Hình 3.8 Ảnh điện di trên gel polyacrylamide của cặp mồi RM72 với các mẫu lúa DS1 – DS60 tương ứng với số 1-60 (bảng 2.1) 39Hình 3.9 Sơ đồ quan hệ di truyền của 60 giống lúa dựa trên số liệu phân tích DNA với 33 chỉ thị phân tử SSR 44

Trang 8

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I :TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đại cương về cây lúa 3

1.2 Lúa đặc sản 4

1.2.1 Khái niệm chung 4

1.2.2 Ý nghĩa khoa học và giá trị kinh tế 6

1.2.3 Tình hình nghiên cứu lúa đặc sản trong nước và thế giới 6

1.3 Lúa chất lượng 8

1.3.1 Khái niệm chung và nhu cầu thị yếu sử dụng lúa gạo ở các quốc gia 8

1.3.2 Một số tính trạng chất lượng ở lúa 9

1.4 Tình hình nghiên cứu lúa chất lượng ở Việt Nam và trên thế giới 15

1.5 Đa dạng di truyền lúa Việt Nam 19

1.5.1 Khái niệm, vị trí và tầm quan trọng của đa dạng di truyền 19

1.5.2 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 20

1.6 Chỉ thị phân tử SSR 20

1.6.1 Khái niệm 20

1.6.2 Ứng dụng chỉ thị phân tử SSR trong nghiên cứu đa dạng di truyền 21

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…23 2.1 Vật liệu 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA genome 26

2.2.2 Phương pháp chạy PCR với các mồi SSR 28

2.2.3 Phương pháp điện di trên gel agarose 28

2.2.4 Phương pháp điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide 29

2.2.5 Phương pháp phân tích số liệu 31

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

Trang 9

3.1 Kết quả tách DNA genome 32

3.2 Đa dạng di truyền các giống lúa bằng chỉ thị phân tử SSR 33

3.2.1 Số alen, hệ số PIC, tổng số băng thể hiện trên từng cặp mồi 33

3.2.2 Các alen hiếm và alen đặc trƣng 35

3.2.3 Tỉ lệ khuyết số liệu (M) và tỉ lệ dị hợp tử (H) của các giống lúa nghiên cứu 39

3.2.4 Quan hệ di truyền giữa các giống lúa nghiên cứu 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ………55

Trang 10

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Lúa đặc sản là loại lúa cho sản phẩm chất lượng cao và mang tính đặc thù của vùng Lúa đặc sản bao gồm các giống lúa thơm, lúa nếp và một số lúa japonica được trồng ở các vùng sinh thái khác nhau của nước ta Trong các giống lúa thơm có Hương cốm, Hương chiêm, lúa Nàng nhen thơm Các giống lúa nếp đặc sản có nếp Hoa vàng 1,2, nếp Cẩm đen, nếp Lá xanh v v Các giống lúa này cùng với một số giống đặc sản cải tiến đã góp phần vào sự phát triển lúa gạo nước ta Việc nghiên cứu đa dạng nguồn gen tập đoàn lúa đặc sản không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn các giống lúa đặc sản bản địa

mà còn có ý nghĩa trong công tác chọn tạo giống lúa chất lượng cao

Bên cạnh những giống lúa đặc sản, những giống lúa chất lượng là một trong những giống đóng vai trò quan trọng nhất, tác động ảnh hưởng đến giá

cả thị trường và người tiêu dùng Nhu cầu về giống lúa chất lượng cao những năm gần đây thay đổi bởi sở thích của người tiêu dùng và yêu cầu thị trường mạnh mẽ Phát triển giống lúa chất lượng cao là một trong những hướng đi chính trong tiến trình cải biến giống cây trồng mới

Sự tăng trưởng và phát triển các nguồn tài nguyên nông nghiệp chủ yếu phụ thuộc vào đa dạng di truyền giữa các giống cây trồng khác nhau Các giống có cấu trúc di truyền khác biệt là nguồn nguyên liệu tốt để tạo ra các giống lúa cải tiến trong tương lai Như vậy, xác định kiểu gen và mối quan hệ giữa các các kiểu gen là vô cùng quan trọng Sự phát triển của kỹ thuật công nghệ sinh học mới đã cung cấp công cụ hữu hiệu hỗ trợ đánh giá sự biến đổi

di truyền ở cả hai cấp độ kiểu gen và kiểu hình Chỉ thị phân tử là công cụ mạnh mẽ trong việc đánh giá các biến dị di truyền, giải thích mối quan hệ di

Trang 11

truyền trong và giữa các loài, hỗ trợ việc quản lý các nguồn tài nguyên di truyền thực vật (Virk et al., 2000; Song et al., 2003; Teixeira da Silva., 2005)

Trình tự lặp lại đơn giản (SSR) là công cụ quan trọng để xác định sự biến đổi di truyền nguồn gen (Powell et al., 1996; Ma et al., 2011) Nhờ có ƣu điểm là đánh giá nhanh chóng, chính xác, cho đa hình cao và ổn định, do đó chỉ thị SSR đƣợc sử dụng rộng rãi trong phân tích đa dạng di truyền, lập bản

đồ phân tử (Zhang et al., 2007; Ma et al., 2011), xây dựng dấu vân tay DNA (Xiao et al., 2006; Ma et al., 2011), kiểm tra độ tinh khiết di truyền (Peng et al., 2003; Ma et al., 2011), phân tích sự đa dạng các nguồn gen (Zhou et al., 2003; Jin et al., 2010; Ma et al., 2011.)

Để góp phần giúp nhận dạng các giống phục vụ cho công tác bảo tồn và cung cấp thông tin hữu ích cho công tác chọn tạo giống lúa chất lƣợng cao

chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu quan hệ di truyền một số giống lúa

đặc sản, chất lƣợng, trồng phổ biến ở Việt Nam bằng chỉ thị phân tử SSR”

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

Nghiên cứu quan hệ di truyền của các giống lúa để phân loại và cung cấp các thông tin về lúa đặc sản, chất lƣợng, trồng phổ biến ở Việt Nam cho công tác bảo tồn, khai thác sử dụng và chọn tạo các nguồn gen quý

3 Nội dung nghiên cứu

- Tách DNA genome của 60 giống lúa nghiên cứu

- Phân tích DNA genome với các mồi SSR xác định các mồi cho đa hình,

số lƣợng allele của mỗi mồi, hệ số PIC, hệ số dị hợp tử

- Phân nhóm di truyền các giống lúa

Trang 12

CHƯƠNG I :TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương về cây lúa

Chi lúa Oryza thuộc họ Graminae, họ phụ Oryzoideae Cây lúa (Oryza sativa L) còn được gọ ợc thuần hoá từ lúa dại ở

ba trung tâm đầu tiên vùng Đông Nam Á: Assam (Ấn Độ), biên giới Thái Lan

– Myanmarr, Trung du Tây Bắc Việt Nam (Đinh Văn Lữ, 1998) Theo tài liệu

của Trung Quốc thì khoảng năm 2800 – 2700 TCN, ở Trung Quố ề

Oryza là một cây hoang dại trên siêu lục địa Gondwana cách đây ít nhất 130

triệu năm và phát tán khắp các châu lục trong quá trình trôi dạt lục địa Gutschin cho rằng cái nôi của nghề trồng lúa là ở chân dãy Himalaya đổ xuống các vùng đồng bằng Bengale, Assam, Thái Lan vì ở ều

loại lúa hoang dại và các giống lúa trồng phong phú (Bùi Huy Đáp, 1999)

ều các tài liệu khác nhau, các khảo cổ đã chứng minh nguồn gốc khác nhau của cây lúa nhưng đa số các tài liệu đều cho rằng nguồn gốc cây lúa là ở vùng đầm lầ ể thuộc nhiều quố

ậu nhiệt đớ ẩm cây lúa đã lan rộng ra các vùng khác nhau (Nguyễn Văn Lẫm, 1998; Đinh Văn Lữ, 1998)

Lúa thuộc ngành thực vậ (Angios Permes), lớp một lá mầm

(Graminae), lúa trồng thuộc chi Oryza 24 hoặc 48 nhiễm sắc thể 23 loài phân bố khắp thế giớ ồng Loài Oryza sativa L trồng phổ biến trên thế giới và phần lớn tập trung ở châu Á bao gồm ba loài phụ: Japonica phân bố ở độ cao (Bắc Trung Quốc, Nhật Bản,

Triều Tiên), chịu rét cao, ít chịu sâu bệnh; Indica ( được trồng ở các nước

nhiệt đới và cận nhiệt đới như Việt Nam, Thái Lan, Ấn Độ ặc

Trang 13

điểm hạt dài, thân cao, mềm dễ đổ, chịu sâu bệnh, năng xuất thấp, mẫn cảm

với ánh sáng; Javanica ặc điểm trung gian, hạt dài, dày và rộng hơn hạt

của Indica, chỉ được trồng ở vài nơi thuộc Indonesia (Nguyễn Văn Lẫm, 1998) Loài Oryza gluberrima S được trồng với một diện tích nhỏ thuộc Tây

Phi Sự tiế ủa cây lúa gắn liền với sự tiế ủa loài người đặc biệt ở

châu Á

Lúa là cây trồng rất cổ xưa, có tính đa dạng về di truyền và hình thái hơn các loại cây trồng khác, là cây trồng nhiệt đới, hoa tự thụ phấn và được coi là cây ngắn ngày (cây hàng niên) Cơ bản lúa là một cây cạn thích nghi với điều kiện nước Nói chung nó ít chịu hạn hơn và khi gặp hạn nó cũng bị hại nhiều hơn các loài lương thực khác Lúa là loại cây trồng mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh Quá trình sinh trưởng, phát triển và năng suất cây lúa chịu ảnh hưởng rất lớn của yếu tố môi trường Hiện nay, lúa được trồng ở những điều kiện sinh thái và khí hậu khác nhau, tuy vậy những loài quan trọng đều ưa ẩm, sinh trưởng và phát triển ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, thường có đủ ánh sáng và nhiệt độ nên nước là yếu tố hạn chế năng suất chính (Bùi Huy Đáp, 1999)

1.2 Lúa đặc sản

1.2.1 Khái niệm chung

Lúa đặc sản là loại lúa cho sản phẩm chất lượng cao và mang tín đặc thù của vùng Các giống lúa đặc sản có quy trình sản xuất ổn định và quảng

bá thương hiệu mang tính chuyên nghiệp

Ở Việt Nam, các giống lúa đặc sản nổi tiếng như: giống lúa Nàng thơm Chợ Đào, giống lúa Huyết rồng của huyện Vĩnh Hưng – tỉnh Long An, giống lúa Khẩu Mang của huyện Đồng Văn – tỉnh Hà Giang, giống Séng Cù ở tỉnh vùng cao Lào Cai, giống lúa Tám thơm Hải Hậu, Nam Định…Trên thế giới

Trang 14

một số giống lúa đặc sản nổi tiếng như: giống lúa Basmati của Ấn Độ, giống lúa Khaw Dawk Mali của Thái Lan…Phần lớn các giống lúa đặc sản là các giống bản địa Các giống này thường có yêu cầu rất chặt chẽ về nơi trồng, khó tìm được cách mở rộng diện tích mà vẫn giữ được mùi thơm và độ dẻo đặc trưng Như giống Nàng thơm chợ đào ở đồng bằng Sông Cửu Long, chỉ trồng được ở xã Mỹ Lệ, Cần Đước, Long An mới giữ được đặc tính cơm mềm dẻo, hạt cơm bóng , mùi thơm rất lâu Giống lúa Sén cù ở vùng cao biên giới Bát Xát, Lào Cai, lúa được cấy trên ruộng bậc thang cao trên 700 m so với mặt nước biển, chịu lạnh, chịu hạn, ngày nắng, sương mù, bông và hạt dài, hạt gạo trắng, thơm ngậy, cơm để nguội vẫn thơm dẻo Giống lúa thơm Hải Hậu được trồng ở vùng đất Hải Hậu ven sông Ninh Cơ, nhờ mương nước từ sông Ninh

về tưới tiêu và mang theo phù xa sông Hồng bồi lắng cho đồng ruộng nên giống lúa Tám thơm nơi đây có đặc điểm cho cơm dẻo thơm ngon, không có loại lúa Tám nơi nào sánh bằng… Các loại gạo kể trên có trên thị trường tiêu thụ chủ yếu là các siêu thị với thương hiệu tín nhiệm

Các giống lúa thơm đặc sản bản địa khác cũng được kể đến khá nhiều như: Dự thơm, Dự lùn, Dự đen, Di hương, gié thơm, Hương cốm, Hương chiêm, lúa Nàng nhen thơm, nếp Hoa vàng 1,2; nếp Cẩm đen, nếp Lá xanh…Các giống lúa này cũng cho cơm thơm và mềm dẻo nhưng giá trị xếp hạng sau so với các giống lúa đặc biệt kể trên Gần đây, có nhiều giống lúa thơm cao sản mới, có tính thích ứng rộng hơn, trồng được diện tích lớn hơn cũng được quan tâm như OMC21, ST Jamin, ST thơm, hương cốm Các giống này tuy không cho gạo có chất lượng bằng các giống lúa đặc sản kể trên nhưng rất có ý nghĩa về sản lượng lúa gạo hàng hóa giá cao

Trang 15

1.2.2 Ý nghĩa khoa học và giá trị kinh tế

Các giống lúa đặc sản là nguồn gen quý cho việc nghiên cứu, lưu giữ nguồn gen và phát triển các giống lúa mới có nhiều đặc điểm tốt như mong muốn

Về giá trị kinh tế, các giống lúa đặc sản là mặt hàng quý hiếm đem lại lợi nhuận cao cho người sản xuất Giống lúa hiện nay đang đứng hàng đầu trên thế giới về chất lượng gạo và giá cao là giống lúa thơm Basmati giá bán một tấn gạo đến hàng ngàn USD Giống lúa thuộc hạng kế cận là Khaw Dawk Mali có giá 800 USD – 1000 USD/tấn Các giống lúa đặc sản khác cho gạo với giá bán thấp hơn các loại gạo đặc biệt kể trên đây một ít nhưng so với gạo thường cũng gấp đôi gấp ba như gạo dự, gạo tám

1.2.3 Tình hình nghiên cứu lúa đặc sản trong nước và thế giới

Ở nước ta, trước đây các giống lúa đặc sản được trồng để tự cung tự cấp và phần lớn phục vụ Vua chúa Ngày nay, lúa đặc sản còn là mặt hàng xuất khẩu quan trọng, đem lại lợi nhuận cao cho người sản xuất Vì vậy, trong Nông nghiệp đã và đang thực hiện những mô hình sản xuất vừa có lãi vừa bền vững trong môi trường sinh thái trong lành Trong đó, đặc biệt là mô hình làm lúa thơm đặc sản bản địa ở nơi thích hợp Như trồng lúa đặc sản Khẩu Mang của huyện Đồng Văn đang được huyện chủ trương mở rộng diện tích vừa để tạo điều kiện giúp bà con nông dân phát triển kinh tế vừa tạo nền tảng tư duy sản xuất hàng hóa của người dân trong huyện

Gần đây, với sự phát triển của công nghệ sinh học, ở nước ta các chương trình nghiên cứu và phát triển các giống lúa đặc sản chất lượng cao, nguồn giống có như cầu lớn trong sản xuất đã và đang được quan tâm đặc biệt Những giống lúa thơm đặc sản hàng đầu như Basmati, Khaw dawk mali đang được phục tráng giống theo phương pháp mới (MAS – marker asisted

Trang 16

selection) và chọn dòng thuần (pure line selection) mà vẫn giữ được đặc tính nguyên thủy Các nhà chọn giống đang có những lỗ lực đáng khích lệ về dùng những phương pháp mới để nhận diện nhằm cải thiện và nâng cao phẩm chất các giống lúa nhanh hơn và chính xác hơn như: gene marker, điện di Protein SDS – Page (Trần Danh Sửu và cs., 2001; Bùi Chí Bửu và cs., 1999) Nhiều phương pháp tạo chọn giống mới hướng vào mục tiêu “thơm đặc sản” được

áp dụng và đã có nhiều giống phục vụ sản xuất tốt như giống OMCS21, TNĐB, Tám thơm đột biến, Hương cốm, Nàng thơm chợ Đào đột biến…(Lê Xuân Thám và cs., 2003; Trần Danh Sửu và cs., 2006; Đỗ Khắc Thịnh và cs., 2006; Đỗ Như Toản và cs., 2006)

Tuy nhiên, các giống lúa mới được cải tạo này còn xếp hạng dưới so với các giống lúa đặc sản bản địa cao cấp kể trên Ngoài ra, việc sử dụng các chỉ thị phân tử để nghiên cứu và xác định gen liên quan đến chất lượng lúa gạo cũng được tiến hành có hiệu quả tại nhiều phòng thí nghiệm Lê Việt Dũng và cộng sự (1999) đã ứng dụng các chỉ thị phân tử để nghiên cứu đa dạng di truyền của gen waxy ở lúa Phan Thị Bảy và cộng sự (2008) đã sử dụng chỉ thị SSR để nghiên cứu và xác định các microsatellites trong các gen

Wx và gen SBE- gen điều khiển quá trình tổng hợp Amylose và Amylopectin

ở một số giống lúa nếp đặc sản Việt Nam Nguyễn Minh Công và cộng sự (2006) đã xác định sự khác nhau giữa các giống lúa Tài Nguyên đột biến và Tép hành đột biến với giống gốc của chúng bằng chỉ thị phân tử Kết quả các nghiên cứu nhằm giúp các nhà chọn giống có cơ sở để nhanh chóng phát triển những giống lúa mới quy tụ nhiều gen quý phục vụ cho sản xuất

Trên thế giới, việc sử dụng các chỉ thị phân tử vào nghiên cứu và phát triển các giống lúa chất lượng cao cũng được phát triển mạnh mẽ Tan và cộng sự (1999) đã nghiên cứu và xác định 3 đại lượng: hàm lượng amylose, nhiệt độ hóa hồ và nhiệt độ bền thể gel là các đại lượng chủ yếu để đánh giá

Trang 17

chất lượng nấu và ăn của gạo Yoshihashi và cộng sự (2005) đã sử dụng chỉ thị SSR để xác định giống lúa thơm Khao dawk mali đặc sản của Thái Lan Garland và cộng sự (1999) đã sử dụng các đoạn lặp lại (T)n trong đoạn RG28

để xác định các giống lúa thơm Bao và cộng sự (2002, 2006) đã sử dụng các

mồi đặc hiệu SSR để nhân các đoạn lặp lại (CT)n có trong các gen Wx (gen ghi mã cho enzyme tổng hợp Amylose), gen SBE (gen mã hóa cho enzyme tổng hợp Amylopectin) và gen SSS (gen mã hóa cho enzyme tổng hợp tinh bột

hòa tan có trong nội nhũ lúa) để nghiên cứu sự đa dạng các microsatellites trong các gen tổng hợp tinh bột ở lúa Đồng thời, nhiều nhà nghiên cứu và xác định hàm lượng amylose và amylopectin ở lúa (Ayre et al., 1997; Bergman et al., 2001; Shu et al., 1999;…)

1.3 Lúa chất lượng

1.3.1 Khái niệm chung và nhu cầu thị yếu sử dụng lúa gạo ở các quốc gia

Chất lượng gạo là sự kết hợp của các đặc tính vật lý và hóa học được yêu cầu cho việc sử dụng cụ thể của một người dùng cụ thể

Chất lượng gạo là một đặc điểm rất phức tạp, chủ yếu được xác định bởi bốn thành phần: Chất lượng xay xát, dáng vẻ bên ngoài, chất lượng nấu và

ăn, chất lượng dinh dưỡng Tiêu chuẩn chất lượng gạo cũng có biến đổi theo thị yếu của từng vùng, từng dân tộc khác nhau Ví dụ ở Nhật Bản, người ta thích gạo tròn loại japonica, mềm, tương đối dẻo khi nấu Nhật Bản và Hàn Quốc thích gạo có hàm lượng amylose thấp vì nó dẻo, mềm, bóng và có vị ngọt Người Thái Lan thì chuộng gạo dài loại indica, chà trắng, mềm nhưng giòn khi nấu Trong khi ở Bangladesh, Ấn độ, Pakistan, Sri Lanka, Nigeria, Liberia thích gạo đồ

Các giống lúa có hàm lượng amylose trung bình, có cơm hơi dẻo và vẫn mềm ngay khi để qua đêm, được ưa thích ở Philippines, Indonesia, Việt

Trang 18

Nam và Malaysia Các giống nầy có thể có nhiệt độ hóa hồ (độ trở hồ) thấp tới trung bình và trung bình tới cao

Cộng đồng chung châu Âu (EC) có mức tiêu thụ gạo trung bình hàng năm khoảng 700.000 t/năm (khoảng giữa thập niên 1970s), tăng lên 940.000 t/năm (đầu thập niên 1980s) Sản lượng lúa sản xuất tại chỗ khoảng 1,9 triệu tấn, trong đó, Ý (60%), Tây Ban Nha (24%), còn lại 16% từ Pháp, Hy Lạp và

Bồ Đào Nha Các quốc gia Bắc EC (Bắc Pháp, Đức, Thụy Sĩ và các quốc gia Benelux) thích gạo indica khô cơm, trong khi Nam EC (Nam Pháp, Tây Ban Nha, Ý thích gạo japonica hạt tròn và trung bình Người Đức thích gạo dễ nấu, bời rời và tương đối cứng cơm, hạt gạo nguyên; chiều dài hạt, độ chà trắng không quan trọng lắm Người Đức quan tâm đến giá cả hơn là chất lượng gạo Người Ý thích gạo bạc bụng, thể gel tương đối cứng, dạng hạt gạo thì không quan trọng

Nhu cầu chất lượng gạo rất khác nhau ở từng quốc gia và dân tộc Do vậy, việc phân tích đa dạng di truyền của các giống lúa đặc sản bản địa là việc làm rất cần thiết để tìm ra các nguồn gen quý, giúp tạo ra những giống lúa mới chất lượng nhằm đáp ứng thị yếu của người tiêu dùng ngày càng mạnh

Trang 19

(9-20% amylose), trung bình (20-25% amylose) và cao (25-33% amylose) Tỉ

lệ amylose/amylopectin của gạo hoặc tinh bột được thể hiện rõ bằng cách xét nghiệm hàm lượng amylose bằng phương pháp so màu Iodine Tinh bột dẻo nhuộm màu nâu đỏ với Iodine, tinh bột không dẻo nhuộm màu xanh tím với Iodine, và amylose nhuộm màu xanh với Iodine Viện Nghiên cứu lúa quốc tế (2003) đã phân loại gạo theo hàm lượng amylose như (bảng 1.1):

Bảng 1.1 Phân loại gạo dựa vào hàm lượng amylose

Độ nở, khả năng hấp thụ nước, và tính kháng đối với sự phân hủy của gạo trong khi nấu, có liên quan trực tiếp đến tỉ lệ Amylose/Amylopectin của tinh bột Tính mềm và dẻo của cơm có tương quan nghịch với hàm lượng Amylose Các giống lúa có hàm lượng Amylose tương đương, có thể có sự khác biệt về độ cứng gel (gel consistency) và nhiệt độ hóa hồ (độ trở hồ) (Birefringence end-point temperature – BEPT)

Nhiệt độ không khí trong thời kỳ phát triển của hạt ảnh hưởng đến tốc

độ tích lũy tinh bột và đặc tính của tinh bột Nhiệt độ càng cao có thể làm cho hàm lượng amylose càng thấp và nhiệt độ hóa hồ hay độ trở hồ (BEPT) của các hạt tinh bột càng cao Nhiệt độ mát hơn sẽ có ảnh hưởng ngược lại

Trang 20

Thời gian tồn trữ làm cho năng suất gạo nguyên và gạo nói chung thu được cao hơn; khả năng hấp thụ nước và độ nở lớn hơn, sự mất mát tính rắn chắc trong khi nấu nướng thấp hơn và độ bở, độ cứng của cơm cao hơn

1.3.2.2 Nhiệt độ hóa hồ

Nhiệt độ hóa hồ hay độ trở hồ (BEPT) là nhiệt độ, mà ở đó 90% hạt tinh bột bị hóa hồ hoặc phồng lên trong nước nóng không thể trở lại dạng cũ được; nó được xếp loại thấp (55 - 69,5o

C), trung bình (70 - 74 oC) và cao (74,5 - 79 oC)

Độ trở hồ xác định thời gian cần thiết để nấu gạo thành cơm Điều kiện môi trường như nhiệt độ trong giai đoạn chín có ảnh hưởng đến độ trở hồ Nhiệt độ cao trong giai đoạn tạo hạt sẽ làm cho tinh bột có độ trở hồ cao Ở nhiều quốc gia trồng lúa, người ta ưa thích gạo có độ trở hồ trung bình Độ trở

hồ (BEPT) được ước lượng bằng trị số trải rộng dưới tác dụng của dung dịch kiềm (alkali spreading value), trong đó gạo có nhiệt độ hóa hồ thấp (BEPT thấp) bị phân rả hoàn toàn; gạo có BEPT trung bình bị phân rả 1 phần; và gạo với BEPT cao chỉ phồng lên trong dung dịch KOH 1,7%

Bảng 1.2 Tương quan giữa nhiệt độ hóa hồ và độ tan rã của gạo trong môi

Trang 21

1.3.2.3 Độ bền thể gel

Độ bền thể gel là giá trị đo lường đặc tính chảy của hồ (100mg) trong 2ml KOH 0,2N và được thể hiện bằng chiều dài hồ nguội đặt theo chiều ngang, tính bằng mm trong ống nghiệm 13x100 mm Nó được xếp loại cứng (26-40 mm), trung bình (41-60 mm) và mềm (61-100 mm) Độ bền thể gel được xác định bằng cách đun một lượng gạo trong alkali hòa tan rồi để nguội trong 1 giờ đồng hồ trong ống nghiệm đặt nằm ngang

Bảng 1.3 Phân loại gạo theo độ bền thể gel

Lúa trồng ở các nước khác nhau, thì có sự khác biệt rất lớn về sự liên kết 3 đặc tính này của tinh bột (hàm lượng amylose, độ trở hồ và độ bền thể gel) Lúa nhiệt đới hay Indica có các đặc tính tinh bột này biến động nhiều hơn loại lúa japonica và javanica (Buler) Không có loại lúa japonica nào có hàm lượng amylose cao và hầu hết chúng có BEPT thấp và gel mềm Hầu hết các giống Bulu có hàm lượng amylose trung bình, BEPT thấp, và gel mềm (Bảng 1.4)

Trang 22

Bảng 1.4 Phân loại các giống gạo tẻ (nonwaxy) ở các nước Á châu dựa trên hàm lượng amylose, độ trở hồ - BEPT (kiểm định kiềm) và độ bền thể gel

Quốc gia Số mẫu Loại

Amylose (a)

Loại BEPT cuối cùng (a)

Loại độ cứng gel (b)

L H>LI L>I I,L H>I

L>I, HI I,L I,L L>I I,L I>L

L HI>I,L L>I I>HI I,L>HI

S>M>H M,S>H S>M>H S>H S>M,H S>M>H S>M H>S

S

- S,M>H

(a) L: thấp

(Low)

I: Trung bình (Intermediate) HI: TB-cao H: Cao (High)

(b) S: mềm

(soft)

M: Trung bình (Medium) H: cứng (Hard)

Nguồn: IRRI 1978

1.3.2.4 Mùi thơm

Mùi thơm được xác định là do chất 2-acetyl-1-pyrroline tìm thấy trong thành phần dầu dễ bay hơi của cơm (Buttery et al 1983) Gạo thơm có giá cao

ở các thị trường Nam Á, Thái Lan và Trung Đông

Gen kiểm soát mùi thơm là một gien lặn, fgr (Berner and Hoff., 1986),

liên kết với RG28 nằm trên nhiễm sắc thể số 8, có khoảng cách di truyền 4,5

cM Lang và cộng sự (2002), đã thiết kế bản đồ mùi thơm trên nhiễm sắc thể

và kết luận RM223 liên kết khá chặt với fgr, giá trị khoảng cách di truyền 1,6

cM

Tuy nhiên, một số tác giả khác cho rằng mùi của cơm chủ yếu là sự kết hợp của formaldehyde, ammonia, và hydrogen sulfide (Obata and Tanaka,

Trang 23

1965) Có đến 100 hợp chất tạo mùi của cơm đã đƣợc xác định (Yajima et al., 1978)

Phẩm chất hạt thay đổi theo mùa trồng do điều kiện canh tác, thời tiết trong qua trình sản xuất và, thu hoạch, phơi sấy khác nhau theo mùa Bảng 1.5 cho thấy biến động các tính trạng phẩm chất hạt theo mùa vụ

Bảng 1.5 Biến thiên các tính trạng phẩm chất hạt theo mùa vụ tại Cần Thơ

Trang 24

hiện diện trong gạo ở dạng có màng đơn (single-membraned particle) kích thước 0,5-4μm trong phôi nhũ

Protein chỉ là yếu tố thứ yếu trong phẩm chất hạt, nhưng nó đóng góp rất cơ bản vào chất lượng dinh dưỡng của gạo Gạo có hàm lượng protein càng cao càng có giá trị dinh dưỡng cao và ngày càng được lưu tâm trong giới tiêu dùng

Giống lúa và môi trường ở vùng nhiệt đới trong giai đoạn chín, đặc biệt

là giai đoạn từ 14-21 ngày sau khi trổ, có ảnh hưởng rất lớn tới tính chất của tinh bột và hàm lượng protein, vì các hạt tinh bột bắt đầu xuất hiện 4 ngày sau khi trổ và protein khoảng 7 ngày sau khi trổ và thời kỳ tích lũy tinh bột và protein thật sự trong hạt lúa rất ngắn

Độ chín của hạt cũng có ảnh hưởng đến phẩm chất hạt Hạt chín sớm hoặc độ chín không đồng đều sẽ làm giảm phẩm chất hạt

1.4 Tình hình nghiên cứu lúa chất lượng ở Việt Nam và trên thế giới

Trong những năm gần đây, chiến lược chọn giống nhờ chỉ thị phân tử

đã được sử dụng để chọn những tính trạng mà việc thực hiện đo đếm ghi chép rất khó khăn và tốn kém Sự ưu việt của chỉ thị phân tử đó là sự chọn lọc không cần các số liệu hình thái và rất ít ảnh hưởng bởi môi trường và có thể chọn lọc từ lúc cây còn non đã mang lại những thành tựu đáng kể cho công tác chọn giống Đối với chọn lọc tính trạng chất lượng nhờ chỉ thị phân tử đặc biệt là ở lúa đã được quan tâm rất nhiều (Ayres et al., 1992; Hwang et al.,1998; He et al., 1999) Hàm lượng amylose và mùi thơm là hai tính trạng được quan trọng đối với chất lượng gạo, đặc biệt là đối với các giống lúa đặc sản Một số gen và chỉ thị phân tử liên quan đến hai tính trạng này đã được xác định như các gen Wax cho hàm lượng amylose (He et al., 1999), một số chỉ thị phân tử liên quan đến mùi thơm cũng được công bố như RG28 (Ahn et

Trang 25

al., 1992) Các chỉ thị SSR như RM342, RM210, RM223, RM350 cũng được xác định liên kết với gen thơm (Vanavitit et al., 2004)

Năm 2004, Jain và cộng sự đã phân tích mối quan hệ di truyền lúa thơm và lúa chất lượng của Ấn Độ Nghiên cứu này, đã sử dụng 30 chỉ thị đánh dấu huỳnh quang trên 69 kiểu gen khác nhau Kết quả cho thấy lúa thơm và lúa chất lượng của Ấn Độ có sự khác nhau về mặt di truyền và là sản phẩm của mô hình tiến hóa độc lập và lâu dài

Năm 2007, Thomson và cộng sự đã phân tích đa dạng di truyền của

246 giống lúa bản và 64 giống lúa cải tiến địa của Indonesia sử dụng 30 chỉ thị phân tử Kết quả phát hiện 394 alen, trung bình 13 alen/locus, hệ số Pic trung bình 0,66 Trong số 309 giống lúa nghiên cứu có 68% theo nhóm indica, 32% là Japonica

Nhận dạng giống và DNA của các giống lúa thơm là việc rất hữu ích cho công tác chọn tạo giống lúa chất lượng cao Rahman và cộng sự (2012)

đã đánh giá đặc tính phân tử và phân tích đa dạng di truyền của 21 giống lúa ưu tư ở Bangladesh Kết quả phát hiện được 57 alen hiếm ở trên 24 locus và chỉ ra rằng RM401 có thể sử dụng để xác định giống tốt nhất, tiếp

đó là RM566, RM3428, RM463, RM8094

Cùng với tính trạng chất lương mùi thơm, hàm lượng amylose…thì chất lượng nấu và ăn cũng được Tabkhkar và cộng sự (2012) nghiên cứu Nhóm tác giả đã sử dụng 7 chỉ thị phân tử SSR liên kết chặt chẽ với QTL kiểm soát ba thành phần chính trong nấu ăn và chất lượng ăn uống tức là hàm lượng amylose, nhiệt độ hồ hóa, và độ bền thể gel Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, chỉ thị phân tử liên quan đến gen điều khiển tính trạng nấu ăn

và chất lượng ăn uống là công cụ phù hợp để lựa chọn xác định chất lượng gạo

Trang 26

Về vấn đề chất lượng lúa gạo, một số viện nghiên cứu ở nước ta trong những năm gần đã được quan tâm nghiên cứu Trên thị trường tiêu thụ lúa gạo hiện nay, các giống lúa có mùi thơm, ngon cơm luôn được ưa chuộng và có giá trị cao

Việc chọn tạo các giống lúa chất lượng cao đã và đang được tiến hành theo phương pháp truyền thống như chọn tạo bằng chọn giống đơn bội, đột biến (Nghiêm Như Vân và cs., 2003; Lê Xuân Thám và cs., 2003) Một số giống tám thơm đã được chọn tạo bằng đột biến nhằm rút ngắn thời gian sinh trưởng cũng như cải tạo một số đặc điểm bất lợi của giống lúa tám như cao cây và tính cảm quang (Nguyễn Minh Công và cs., 1999; Lê Xuân Đắc, 2008), quá trình chọn lọc này cũng đem lại kết quả đáng kể nhưng đòi hỏi thời gian chọn lọc dài Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử, những năm gần đây nước ta đã có những nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử trong đánh giá sự đa dạng di truyền của nguồn gen nhằm đưa vào ứng dụng trong chọn tạo giống cây trồng nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử (Bùi Chí Bửu và cs., 1999; Nguyễn Đức Thành và cs., 1999; Phan Thị Bảy và cs., 2003; Lê Thị Bích Thủy và cs., 2005)

Trần Danh Sửu và cộng sự tại Trung tâm Tài nguyên thực vật đã sử dụng

50 chỉ thị SSR nghiên cứu đa dạng di truyền của 45 giống lúa nếp ở các tỉnh đồng bằng miền Bắc Việt Nam, kết quả cho thấy 45 chỉ thị cho các băng DNA đa hình tại 46 locus Trong đó 18 locus SSR cho nhận dạng đặc trưng với 28 allele duy nhất của 16 giống trong số 45 giống lúa nếp nghiên cứu Hệ

số tương đồng di truyền giữa các giống lúa nếp dao động từ 0,10 - 0,98

Trong số 45 giống lúa được nghiên cứu, 43 giống thuộc loài phụ Japonica và

2 giống (Nếp nõn tre và Nếp hạt chanh) thuộc loài phụ Indica dựa trên DNA lục lạp

Trang 27

Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long) khi sử dụng 20 mồi SSR trên NST số 6 để xem xét đa hình trong các cặp bố

mẹ và con lai đã xác định được một cặp mồi định vị tại locus WxF-R kết hợp rất chặt với tính trạng quy định hàm lượng amyloza Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị SSR, Lang và cộng sự (2002) đã thiết kế bản đồ mùi thơm trên NST và kết

luận RM223 liên kết chặt với gen mùi thơm fgr, có khoảng cách di truyền là

1,6 cM Tác giả còn chuyển đổi RFLP thành STS để đánh giá mùi thơm thông qua chỉ thị phân tử RG28F-R trên quần thể F2 Khao Dawk Mali 105/OM 1490 cho đa hình giữa 2 nhóm thơm và không thơm, bản đồ liên kết mùi thơm đã

được thiết lập cho khoảng cách di truyền RG28 với gen fgr là 1,8 cM

Năm 2010, Khuất Hữu Trung và cộng sự đã nghiên cứu đa dạng di truyền và nhận dạng một số giống trong tập đoàn lúa Tám đặc sản của Việt Nam bằng chỉ thị phân tử SSR Kết quả nghiên cứu cho thấy tập đoàn Tám nghiên cứu khá đa dạng Phân tích 36 cặp mồi SSR trên 26 giống lúa Tám thu được 938 băng DNA thuộc 88 loại allele khác nhau, trung bình 2,44 allele/cặp mồi Hệ số PIC dao động từ 0 đến 0,65 (trung bình 0,27) Các giống lúa Tám nghiên cứu có độ thuần di truyền khá cao, tỉ lệ dị hợp tử trung bình của cả tập đoàn là 0,86 Hệ số tương đồng di truyền các giống lúa trong tập đoàn nghiên cứu dao động từ 0,14 - 1,00 Ở mức độ tương đồng di truyền là 40 %, tập đoàn 26 giống lúa Tám được chia thành 8 nhóm nhỏ thuộc 3 nhóm lớn khác nhau Sử dụng các cặp mồi SSR có thể nhận dạng chính xác được một số giống lúa trong tập đoàn nghiên cứu: cặp mồi RM211 nhận dạng giống Tám trắng Vĩnh Phúc, cặp mồi RM346 nhận dạng giống Tám thơm Hải Dương, cặp mồi RM333 nhận dạng được giống Tám đen Hà Đông và cặp mồi RM314 nhận dạng được giống Tám Xuân Hồng

Năm 2011, Trần Danh Sửu và cộng sự đã nghiên cứu đa dạng di truyền các giống lúa địa phương tỉnh Lào Cai Tác giả sử dụng 36 cặp mồi SSR để

Trang 28

phân tích quan hệ di truyền của 124 giống lúa Lào Cai Có từ 3 - 14 allele trên các locus, trung bình 6,53 allele trên mỗi locus Tổng số allele được phát hiện trên 36 locus là 235 Số lượng allele nhiều nhất nằm trên locus RM335 Hệ số

đa dạng di truyền (PIC) tại các locus dao động từ 0,68 đến 0,88 Trong số 36 chỉ thị SSR, chỉ có 3 chỉ thị cho nhận dạng đặc biệt với giống T7499, 1984, T7022 Hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,08 đến 0,95

1.5 Đa dạng di truyền lúa Việt Nam

Các dẫn liệu của nhiều ngành khoa học khác nhau đã khẳng định khu vực đa dạng di truyền tối đa của cây lúa nằm trong vùng địa lý kéo dài từ Nepal đến bắc Việt Nam Trải qua quá trình gieo trồng và thuần hoá cây lúa hàng nghìn năm, cùng với sự đa dạng về địa lý, sinh thái trên toàn lãnh thổ đất nước, dân tộc Việt Nam đã tạo nên tài nguyên di truyền lúa đa dạng và phong phú Theo Đào Thế Tuấn (1996), trên lãnh thổ Việt Nam tồn tại ba nhóm giống lúa cổ truyền có các đặc tính di truyền khác nhau là nhóm giống lúa Việt - Thái, nhóm giống lúa Việt mang đặc tính thâm canh ở vùng đồng bằng sông Hồng, nhóm lúa Việt - Kh’mer mang đặc tính quảng canh ở vùng đồng bằng sông Cửu Long

1.5.1 Khái niệm, vị trí và tầm quan trọng của đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền là biểu hiện sự đa dạng của các biến dị có thể di truyền trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã Xét cho cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành phần axít nucleic, tạo thành mã di truyền (Cục Bảo vệ môi

trường, 2007)

Đa dạng di truyền là sự thể hiện phong phú kiểu hình và kiểu gen của cây trồng Các gen đa hình là nguyên nhân dẫn đến sự tồn tại các kiểu gen dị hợp trong quần thể Sự khác biệt về kiểu gen của các cá thể trong quần thể

Trang 29

cho phép các quần thể này thích nghi hơn quần thể khác khi chịu những thay đổi của môi trường Đa dạng di truyền là cơ sở tạo nên ưu thế lai Trong một chuẩn mực nhất định nếu tính đa dạng di truyền giữa bố và mẹ càng lớn thì ưu thế lai càng cao Nghiên cứu đa dạng di truyền có ý nghĩa rất lớn trong công tác chọn giống Đó là nhân tố giúp cho sinh vật duy trì được nòi giống kháng được các loại dịch bệnh và thích nghi với những biến đổi của ngoại cảnh (Trương Trọng Ngôn và cs., 2013)

1.5.2 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền

Nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền được tiến hành bằng nhiều phương pháp khác nhau, mỗi phương pháp cung cấp cho người sử dụng các loại thông tin khác nhau Việc lựa chọn phương pháp đánh giá phụ thuộc vào mục đích của người nghiên cứu Có hai phương pháp được sử dụng rộng rãi

để nghiên cứu và đánh giá đa dạng di truyền là nghiên cứu, đánh giá đa dạng

di truyền thông qua các tính trạng hình thái (kiểu hình) và thông qua các chỉ thị phân tử (kiểu gen)

Nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền thông qua các chỉ thị phân tử là nghiên cứu, đánh giá ở mức độ phân tử Các phân tử được sử dụng chủ yếu trong nghiên cứu là các phân tử protein và DNA Các chỉ thị phân tử được sử dụng phổ biến trong đánh giá đa dạng di truyền lúa là chỉ thị đẳng men và chỉ thị DNA Lợi thế của các chỉ thị phân tử dựa trên DNA là có thể xác định được những khác biệt nhỏ nhất ở mức DNA, có khả năng tạo ra hàng chục, hàng trăm locut và alen

1.6 Chỉ thị phân tử SSR

1.6.1 Khái niệm

Simple sequence repeat (SSR) là một chỉ thị phân tử quan trọng trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở lúa Trong genome của Eukaryota tồn tại rất

Trang 30

nhiều các trình tự lặp lại rải rác như satellite, minisatellites, microsatellites Các đoạn lặp lại đơn giản (SSR) hay còn gọi là vi vệ tinh (microsatellites) là những đoạn DNA ngắn gồm một số cặp nu liên tiếp, mỗi đơn vị có chiều dài

từ 4 đến 6 cặp base, số lượng đơn vị lặp lại thay đổi từ 1 đến 40 đơn vị Những đoạn SSR phân bố ở đầu và cuối tâm động nhiễm sắc thể (NST) có tác dụng bảo vệ và liên quan đến sự di truyền của NST

Kỹ thuật SSR dựa trên nguyên lý PCR dùng các cặp mồi đặc hiệu để nhân các đoạn trình tự SSR Sự khác nhau trong cấu trúc đơn vị lặp lại dẫn đến sự thay đổi độ dài đoạn lặp lại được nhân lên và xác định khi chạy điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền trên nhiều đối tượng khác nhau SSR phát triển và được sử dụng rộng rãi do nó có khả năng phát hiện số lượng lớn các đoạn trình tự lặp lại ở tất cả các cơ thể bậc cao, nó có tiềm năng cho đa hình cao hơn và đơn giản hơn so với các chỉ thị phân tử khác SSR là chỉ thị đồng trội vì vậy nó chứa đựng thông tin cao Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là quá trình thiết kế mồi rất tốn kém do phải thiết kế mồi đặc hiệu cho từng locus SSR khác nhau, có bao nhiêu locus SSR thì cần bấy nhiêu mồi

mà mỗi loại mồi lại chỉ đặc trưng cho một loài Việc đọc trình tự SSR cũng gặp nhiều khó khăn Vì vậy, chỉ có một số loài được quan tâm như người, lúa, ngô được thiết kế mồi SSR

1.6.2 Ứng dụng chỉ thị phân tử SSR trong nghiên cứu đa dạng di truyền

Các phương pháp chọn giống và lai tạo truyền thống đã góp phần hình thành nên những vật nuôi cây trồng đa dạng và có hiệu quả kinh tế cao Trong phương pháp chọn giống truyền thống, các chỉ tiêu chọn thuộc về kiểu hình chủ yếu là các chỉ tiêu về hình thái và một số chỉ tiêu sinh hóa Các chỉ tiêu này thường không ổn định và chịu ảnh hưởng rất mạnh của các yếu tố môi

Trang 31

trường Hơn nữa, việc chọn lọc được tiến hành dựa trên kiểu hình quan sát được của các đối tượng chọn lọc hoặc những mối liên quan với chúng nhưng không biết gen nào thực sự đang được chọn lọc

Sự phát triển của các chỉ thị phân tử vì vậy được xem là một khám phá quan trọng hứa hẹn khác phục được hạn chế này SSR xuất hiện và phân bố rộng trong hệ gen của tất cả sinh vật nhân thực Các đoạn SSR đa hình về độ dài có thể được phát hiện khi lai DNA trên gel hoặc có thể được tách dòng, đọc trình tự và nhân bằng PCR với mồi là các đoạn oligonucleotide phụ cận Các vị trí SSR là các chỉ thị đồng trội vì vậy chứa đựng thông tin cao SSR cũng là một chỉ thị trong lập bản đồ và xác định chỉ thị trội (Gupta et al., 1996, Redona et al., 1998, Taramino et al., 1996 )

Các nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc và chức năng của các trình tự lặp lại thích hợp cho việc sử dụng trong phân tích hệ gen, cho di truyền quần thể, xác định các thứ và các loài có quan hệ gần gũi, chất lượng lai, đánh giá gen

và nghiên cứu hệ thống phát sinh loài SSR đã được dùng nhiều trong nghiên cứu quan hệ di truyền và sự đa dạng của các loài cây khác nhau như: lúa mạch, ngô…(Brown et al., 1996; Sanchez et al., 1996; Thanh et al., 1999) Trình tự SSR sẽ được dùng như chỉ thị phân tử rộng rãi hơn trong tương lai nhằm cải biến cây trồng do mức độ đa hình cao và tiềm năng cho phân tích tự động

Hầu hết các Locut SSR ở thực vật có sự đa hình cao hơn các chỉ thị khác Trong phân tích SSR không dùng phóng xạ hoặc bất cứ một bước nghiên cứu phức tạp nào khác vì vậy chỉ thị này được quan tâm hơn trong chọn giống thực vật (Gupta et al., 1996, Li et al., 1999)

Năm 1997, McCouch nhận định rằng trên lúa có khoảng 5.700 - 10.000 SSR có trình tự khác nhau 2, 3 hoặc 4 đơn vị lặp lại Với số lượng lớn, đa

Trang 32

dạng và phân bố rộng rãi trong bộ gen cây lúa sẽ rất thuận lợi cho việc phân tích đa dạng di truyền giữa các giống lúa cũng như ứng dụng lập bản đồ gen

Kỹ thuật này còn được ứng dụng trong chuẩn đoán những quần thể cách

ly, chọn lọc gen trong những gen biến nạp, trong lập bản đồ gen, nhận dạng các giống cây trồng, đánh giá quan hệ di truyền và đa dạng ở nhiều loài cây

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

60 giống lúa được nhận từ Viên Di truyền Nông nghiệp Việt Nam Các giống lúa có nguồn gốc khác nhau (Bảng 2.1)

Định dạng
Số trang	65
Dung lượng	1,25 MB

Nghiên cứu quan hệ di truyền một số giống lúa đặc sản, chất lượng, trồng phổ biến ở việt nam bằng chỉ thị phân tử SSR

Phƣơng pháp tách chiết DNA genome

Phƣơng pháp phân tích số liệu