Nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm moldtex và bao bì đến chất lượng thức ăn chăn nuôi công nghiệp trong quá trình bảo quản tại công ty cổ phần tập đoàn dabaco việt nam

ðể theo kịp ñược sự phát triển của ngành chăn nuôi thì việc tạo ra các sản phẩm thức ăn chăn nuôi TACN công nghiệp CN là rất cần thiết vì nó giúp làm tăng nhanh năng suất, tạo sản phẩm c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

ðỖ TUẤN ANH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ PHẨM MOLDTEX

VÀ BAO BÌ ðẾN CHẤT LƯỢNG THỨC ĂN CHĂN NUÔI CÔNG NGHIỆP TRONG QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN TẠI CÔNG TY CỔ PHẦN TẬP ðOÀN DABACO VIỆT NAM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS NGÔ XUÂN MẠNH

HÀ NỘI - 2014

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là ñề tài nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề ñược sử dụng trong bất

kỳ một nghiên cứu nào

Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm

ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Tác giả

ðỗ Tuấn Anh

Tơi xin được bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến các thầy, cơ giáo đã dạy dỗ tơi trong suốt thời gian qua ðặc biệt xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngơ Xuân Mạnh - Khoa Cơng nghệ thực phẩm - Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội

đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi trong quá trình thực hiện đề tài và hồn thành bản luận văn này

Tơi xin gửi lời chân thành cảm ơn:

- Cơng ty Cổ phần Tập đồn DABACO Việt Nam

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Tác giả

ðỗ Tuấn Anh

MỤC LỤC

LỜI CAM ðOAN Error! Bookmark not defined LỜI CẢM ƠN Error! Bookmark not defined MỤC LỤC Error! Bookmark not defined DANH MỤC CÁC BẢNG Error! Bookmark not defined DANH MỤC CÁC HÌNH Error! Bookmark not defined

DANH MỤC TỪ VIẾT TĂT viii

1 MỞ ðẦU 1

1.1 ðặt vấn ñề 1

1.2 Mục ñích – yêu cầu 2

1.2.1 Mục ñích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tình hình sản xuất và sử dụng nguyên liệu TACN ở Việt Nam hiện nay 3

2.2 Giới thiệu về chế phẩm Moldtex 4

2.3 Những ảnh hưởng của ñộc tố do nhiễm nấm mốc gây ra trong chăn nuôi 5

2.4 Những kết quả nghiên cứu sử dụng acid hữu cơ trong TACN 6

2.4.1 Ảnh hưởng của PA ñến sinh trưởng phát triển của gia cầm 9

2.4.2 Ảnh hưởng của PA ñến khả năng ăn vào và chuyển hóa thức ăn 10

2.5 Hiệu quả của việc sử dụng PA 10

2.5.1 Hiệu quả kháng khuẩn của PA 10

2.5.2 Hiệu quả làm chất kháng nấm và bảo quản TACN 12

2.6 Sử dụng chất hóa học có khả năng gắn kết dính, hấp phụ ñộc tố trong sản xuất TACN 14

2.7 Màng bao gói 16

3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Vật liệu nghiên cứu 18

3.1.1 ðối tượng – ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 18

3.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 18

3.2 Nội dung nghiên cứu 20

3.3 Phương pháp nghiên cứu 20

3.3.1 Phương pháp ñiều tra, thu mẫu 20

3.3.2 Phương pháp xác ñịnh thành phần nấm hại trên TACN 21

3.3.3 Phương pháp phân lập nấm 22

3.3.4 Phương pháp phân loại nấm 23

3.3.5 Phương pháp ñịnh tên nấm bằng kỹ thuật sinh học phân tử 23

3.3.6 Phương pháp bố trí thí nghiệm ñánh giá hiệu quả sử dụng chế phẩm Moldtex trong phòng chống nấm trên môi trường PDA và trên TACN D42 27

3.3.7 Khảo sát hiệu quả của Moldtex ñến chất lượng của TACN D42 trong quá trình bảo quản 33

3.3.8 Nghiên cứu ảnh hưởng của ñộ dày bao bì ñến chất lượng TACN trong thời gian bảo quản 33

3.3.9 Phương pháp lấy mẫu phân tích 34

3.3.10 Phương pháp phân tích 34

3.3.11 Phương pháp xử lý số liệu 37

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

4.1 Thành phần và ñặc ñiểm hình thái nấm gây hại trên TACN D42 trong quá trình bảo quản tại Công ty Cổ Phần Tập ðoàn DABACO Việt Nam 38

4.1.1 Thành phần nấm gây hại trên TACN D42 38

4.1.2 PCR và giải trình tự 41

4.1.3 Tìm kiếm trình tự tương ñồng trên GenBank 41

4.1.4 Phân tích phả hệ 42

4.1.5 ðặc ñiểm hình thái một số loài nấm gây hại TACN D42 bảo quản trong kho 43

4.2 Tỉ lệ nhiễm nấm TACN D42 bảo quản tại kho công ty cổ phần

tập ựoàn DABACO Việt Nam, Bắc Ninh 2013 47

4.3 Thắ nghiệm ựánh giá ảnh hưởng của chế phẩm Moldtex ựối với Aspergillus flavus phân lập ựược trên môi trường PDA 48

4.4 Hiệu quả sử dụng chế phẩm Moldtex trong phòng trừ nấm nhiễm trên TACN D42 50

4.4.1 Hiệu quả của chế phẩm Moldtex ựối với TACN D42 (không lây nhiễm nấm Aspergillus flavus) 50

4.4.2 Hiệu quả của việc xử lý chế phẩm Moldtex ựối với TACN D42 sau khi nhiễm nấm Aspergillus flavus (hiệu quả chống nấm) 52

4.4.3 Hiệu quả của việc xử lý chế phẩm Moldtex ựối với TACN D42 trước khi nhiễm nấm Aspergillus flavus (hiệu quả phòng nấm) 53

4.5 đánh giá hiệu quả sử dụng chế phẩm Moldtex ựến chất lượng TACN D42 trong quá trình bảo quản 55

4.6 Xác ựịnh ựộ dày bao bì thắch hợp ựể bảo quản TACN D42 56

4.6.1 Ảnh hưởng của ựộ dày bao bì tới ựộ ẩm TACN sau thời gian bảo quản 57

4.6.2 Ảnh hưởng của ựộ dày bao bì tới hàm lượng protein của TACN sau thời gian bảo quản 58

4.6.3 Ảnh hưởng của ựộ dày bao bì tới hàm lượng lipid của TACN sau thời gian bảo quản 59

4.6.4 Ảnh hưởng của ựộ dày bao bì tới ựộc tố aflatoxin B1 trong TACN D42 sau thời gian bảo quản 60

5 KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ 62

5.1 Kết luận 62

5.2 đề nghị 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Nhu cầu thức ăn chăn nuơi của Việt Nam đến 2020 4

Bảng 2.2 Nồng độ ức chế tối thiểu của PA đối với các nhĩm vi sinh vật 13

Bảng 2.3 ðộ thấm khí O2 và CO2 của các bao bì thơng dụng 17

Bảng 4.1 Thành phần nấm phân lập từ TACN dựa vào đặc điểm hình thái 38

Bảng 4.2 Thành phần nấm hại TACN D42 bảo quản tại kho Cơng ty CP tập đồn DABACO Việt Nam, năm 2013 40

Bảng 4.3 Giải trình tự và tìm kiếm các chuỗi gần gũi trên Ngân hàng Gen (GenBank) 41

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản TACN D42 đến tỉ lệ nhiễm một số lồi nấm tại kho Cơng ty cổ phần tập đồn DABACO Viêt Nam năm 2013 47

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của chế phẩm Moldtex đến sự phát triển của nấm Aspergillus flavus trên mơi trường PDA cĩ bổ sung chế phẩm 49

Bảng 4.6 Hiệu quả của chế phẩm Moldtex đối với TACN D42 khi khơng lây nhiễm nấm Aspergillus flavus 51

Bảng 4.7 Hiệu quả của việc xử lý chế phẩm Moldtex đối với TACN D42 sau khi nhiễm nấm Aspergillus flavus (hiệu quả chống nấm) 52

Bảng 4.8 Hiệu quả của việc xử lý chế phẩm Moldtex đối với TACN D42 trước khi nhiễm nấm Aspergillus flavus (hiệu quả phịng nấm) 54

Bảng 4.9 Chất lượng của TACN D42 sau 60 ngày bảo quản 55

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của độ dày bao bì tới độ ẩm (%) trong TACN D42 trong thời gian bảo quản 57

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của độ dày bao bì tới hàm lượng protein (%) trong TACN D42 sau thời gian bảo quản 58

Bảng 4.12 Ảnh hưởng của độ dày bao bì tới hàm lượng lipid (%) trong TACN D42 sau thời gian bảo quản 59

Bảng 4.13 Ảnh hưởng của độ dày bao bì tới hàm lượng aflatoxin B1 (ppb) trong TACN D42 sau thời gian bảo quản 60

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Sơ ñồ minh họa các cụm gen ITS của sinh vật nhân thật 26

Hình 4.1 Hình thái tản nấm 5 loại nấm phân lập ñược từ TACN D42 38

Hình 4.2 Hình thái bào tử, cơ quan sinh sản vô tính của 5 mẫu nấm 39

Hình 4.3 Phả hệ dựa trên trình tự toàn bộ vùng ITS của các mẫu nấm 42

Hình 4.4 ðặc ñiểm hình thái của nấm N1 43

Hình 4.5 ðặc ñiểm hình thái của của nấm Lichtheimia corymbifera 44

Hình 4.6 ðặc ñiểm hình thái của của nấm Rhizopus sp1 45

Hình 4.7 ðặc ñiểm hình thái của nấm Aspergilus flavus 46

Hình 4.8 ðặc ñiểm của của nấm Penicilium simplicissimum 46

DANH MỤC TỪ VIẾT TĂT

Tỉ lệ hạt nhiễm ở công thức ñối chứng Công thức

Thức ăn dành cho lợn từ 30kg ñến xuất bán ðối chứng

Hiệu quả Internal Transcribed Spacer Kiểm dịch thực vật

Axit propionic Potato dextrose agar Thức ăn chăn nuôi

Tỉ lệ hạt nhiễm ở công thức thí nghiệm

Tỷ lệ nhiễm

Thị trường thức ăn chăn nuôi hiện nay ở Việt Nam phát triển rất mạnh mẽ Bằng chứng là có nhiều công ty sản xuất thức ăn chăn nuôi công nghiệp ra ñời và các công ty cũ mở rộng sản xuất ñể ñáp ứng nhu cầu của thị trường Mặt khác, trình

ñộ và kỹ thuật chăn nuôi của nước ta ngày một phát triển Trước kia chủ yếu là chăn nuôi nhỏ lẻ tại các hộ gia ñình thì ngày nay ñã chuyển thành các trang trại, công ty chăn nuôi với các sản phẩm ña dạng như gia súc, gia cầm và thủy cầm

Ngày nay, cùng với sự phát triển của nền kinh tế thị trường thì ngành chăn nuôi cũng phát triển theo xu hướng hàng hóa Do vậy, năng suất và chất lượng thịt luôn ñược quan tâm ñặc biệt Nhờ việc áp dụng các tiến bộ của khoa học kỹ thuật (lai tạo giống, dinh dưỡng, thú y,…) ngành chăn nuôi trong nước ngày càng phát triển ðể theo kịp ñược sự phát triển của ngành chăn nuôi thì việc tạo ra các sản phẩm thức ăn chăn nuôi (TACN) công nghiệp (CN) là rất cần thiết vì nó giúp làm tăng nhanh năng suất, tạo sản phẩm có chất lượng cao ñồng thời giảm chi phí cho một ñơn vị sản phẩm từ ñó sẽ ñạt ñược hiệu quả kinh tế cao

Khó khăn nhất trong quá trình bảo quản TACN CN là vấn ñề chất lượng thức

ăn suy giảm trong thời gian bảo quản Trong các nguyên nhân gây làm giảm chất lượng thức ăn thì nấm mốc là một trong những nguyên nhân chủ yếu Nấm mốc phát triển làm biến ñổi chất lượng thức ăn, ngoài ra còn có thể sản sinh ñộc tố, dẫn ñến những thiệt hại về kinh tế cũng như uy tín của nhà sản xuất Chế phẩm Moldtex

là sản phẩm của công ty TNHH Linqtex có trụ sở tại Thái Lan, ựược sử dụng ựể ức chế sự phát triển của nấm mốc trong quá trình bảo quản các nguyên liệu TACN Tuy nhiên Moldtex mới chỉ ựược ựưa vào sử dụng tại Tập ựoàn Dabaco Việt Nam, chưa qua nghiên cứu nên chưa có một hướng dẫn cụ thể về việc sử dụng loại hóa chất này

Một trong những yếu tố có ảnh hưởng quan trọng ựến chất lượng và thời gian bảo quản TACN là bao bì của sản phẩm Lựa chọn ựược loại bao bì phù hợp có thể góp phần duy trì chất lượng và kéo dài thời gian bảo quản TACN

đáp ứng nhu cầu của thị trường thì chất lượng thức ăn ựóng vai trò tiên

quyết, xuất phát từ những thực tế trên chúng tôi tiến hành ựề tài: ỘNghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm Moldtex và bao bì ựến chất lượng thức ăn chăn nuôi công nghiệp trong quá trình bảo quản tại Công ty cổ phần tập ựoàn Dabaco Việt NamỢ

1.2 Mục ựắch Ờ yêu cầu

1.2.1 Mục ựắch

Nghiên cứu ảnh hưởng của việc xử lý Moldtex và ựộ dày bao bì ựến chất lượng thức ăn chăn nuôi công nghiệp trong quá trình bảo quản nhằm lựa chọn nồng

ựộ hóa chất xử lý và loại bao bì phù hợp ựể bảo quản TACN tại Công ty cổ phần tập

ựoàn Dabaco Việt Nam

1.2.2 Yêu cầu

- Xác ựịnh ựược thành phần và mô tả ựặc ựiểm hình thái nấm gây hại TACN D42 trong thời gian bảo quản;

- Xác ựịnh ựược tỷ lệ nhiễm nấm trên TACN D42 trong thời gian bảo quản;

- Thắ nghiệm ựánh giá ảnh hưởng của chế phẩm Moldtex ựối với Aspergillus flavus phân lập ựược trên môi trường PDA;

- đánh giá hiệu quả sử dụng chế phẩm Moldtex phòng trừ nấm nhiễm trên TACN D42;

- đánh giá hiệu quả sử dụng chế phẩm Moldtex ựến chất lượng TACN D42 trong quá trình bảo quản;

- Xác ựịnh ựược ựộ dày bao bì thắch hợp ựể bảo quản TACN D42;

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình sản xuất và sử dụng nguyên liệu TACN ở Việt Nam hiện nay

Theo báo cáo của Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn năm 2012 thì trong những năm gần ñây chăn nuôi nước ta phát triển mạnh với tốc ñộ tăng trưởng hàng năm 6%, hiện nay ñàn lợn ñã ñạt 26,5 triệu con, ñàn gia cầm ñạt 350 triệu con

và ñàn trâu bò ñạt 9,5 triệu con Cùng với sự gia tăng về số lượng vật nuôi như trên thì một lượng lớn thức ăn ñã ñược sử dụng, tổng nhu cầu thức ăn sử dụng trong chăn nuôi gia súc, gia cầm của Việt Nam khoảng 20 triệu tấn năm 2011: trong ñó sản lượng thức ăn chăn nuôi công nghiệp xấp xỉ 11,5 triệu tấn (chiếm 50% tổng nhu cầu) Mức tăng trưởng toàn ngành sản xuất TACN công nghiệp ñạt 15% giai ñoạn 2002-2011 Nhờ sự tăng trưởng ñó mà sản lượng thực phẩm tăng lên ñáp ứng cho nhu cầu thiết yếu cho xã hội, khối lượng thịt hơi các loại bình quân cho một nhân khẩu ñã tăng từ 24kg năm 2000 lên 45kg năm 2010 Trong số các nguyên liệu trên thì có 80% lượng ngô là do nguồn nội ñịa cung cấp còn lại hạt mì và khô ñậu tương

là nhập 100% [10]

Tuy nhiên, bên trong sự phát triển của TACN công nghiệp còn có rất nhiều những khó khăn, thách thức làm cho các nhà quản lý và doanh nghiệp sản xuất kinh doanh phải suy tính và tìm giải pháp ñể khắc phục Khó khăn lớn nhất hiện nay của ngành ñó là sự thiếu hụt nguồn nguyên liệu tại chỗ ñể sản xuất, vì phải phụ thuộc nhiều vào nhập khẩu ðiều này không những gây khó khăn cho sản xuất trong sự chủ ñộng nguyên liệu mà còn khó khăn về giá, chất lượng và những phát sinh khác Tổng lượng thức ăn tinh sử dụng cho chăn nuôi năm 2011 ñã lên tới con số 8,930 ngàn tấn, tăng gần 3 lần so với năm 2006 Trong ñó, thức ăn giàu năng lượng (Ngô, lúa mì, cám mỳ): 3,86 triệu tấn chiếm 43,2%; thức ăn giàu ñạm (ñỗ tương, khô dầu các loại, bột cá, bột thịt xương, ngô lên men ) 4,76 triệu tấn chiếm 53,28%; thức ăn

bổ sung (Premix vitamin khoáng, acid amin, ): 0,29 triệu tấn chiếm 3,2% ðể ñáp ứng chiến lược phát triển chăn nuôi ñến năm 2020 nhu cầu sử dụng thức ăn của Việt Nam ước tính là 27,4 triệu tấn tăng 1,3 lần so với năm 2012 bảng 2.1 [10]

Bảng 2.1 Nhu cầu thức ăn chăn nuôi của Việt Nam ñến 2020

Nguồn: Cục chăn nuôi - Bộ NNPTNT (2012)

2.2 Giới thiệu về chế phẩm Moldtex

* Theo thông tin từ Công ty Linqtex có nhà máy sản xuất ở Thái Lan thì Moldtex gồm có: propionic acid là thành phần chính, benzoic acid, sorbic acid , axetic acid…

+ Propionic acid (PA): là một cacboxilic acid có nguồn gốc tự nhiên, công thức phân tử C3H6O2 Ở trạng thía tinh khiết và trong ñiều kiện thông thường, nó là một chất lỏng không màu có tính ăn mòn và mùi hăng

Tính chất vật lý: Propionic acid có các tính chất vật lý trung gian giữa các tính chất của các cacboxylic acid nhỏ hơn như formic acid và acetic acid, với các acid béo lớn hơn

Tính chất hoá học: PA thể hiện các tính chất chung của cacboxylic acid, và tương tự như phần lớn các cacboxylic acid khác, nó tạo ra các hợp chất amit, este, alhydride và clorua Nó cũng có thể tham gia phản ứng halogen hoá

Công dụng: PA ngăn cản sự phát triển của mốc và một số vi khuẩn Do vậy, phần lớn PA ñược sản xuất ñể sử dụng làm chất bảo quản cho cả thực phẩm dành cho người cũng như thức ăn gia súc ðối với thức ăn gia súc, nó ñược sử dụng trực tiếp hoặc dưới dạng muối amoni ðối với thực phẩm dành cho con người, ñặc biệt

là bánh mì và các sản phẩm nướng khác, nó ñược dùng dưới dạng các muối natri hay canxi

+ Benzoic acid có công thức hoá học C6H6COOH, là một chất rắn không màu, tinh thể dạng hình kim hoặc tấm lá nhỏ, màu trắng lụa óng ánh trắng, dạng cacboxylic thơm ñơn giản nhất Acid yếu này và các muối của nó ñược sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm ðây là một chất ban ñầu quan trọng ñể tổng hợp nhiều chất hữu cơ khác Năm 1875, Salkowski ñã phát hiện ra khả năng kháng nấm của benzoic acid, do ñó nó ñã ñược sử dụng bảo quản trái cây có chứa benzoat

+ Sorbic acid có công thức hoá học C6H8O2 , dạng hợp chất kết tinh, bột trắng, dễ tan trong nước, ít tan trong rượu etylic lạnh, tan tốt khi ñun nóng Tác dụng ức chế nấm men, nấm mốc, có ý nghĩa trong môi trường pH từ 3,2- 6 và nồng

ñộ 1g/1kg thực phẩm, dùng bảo quản nước rau quả Giữ tốt thời gian dài với liều lượng 0.05- 0,06%

+ Acetic acid có công thức hoá học CH3 COOH là một acid hữu cơ, acetic acid có tính chất kháng khuẩn nhẹ

+ Liều khuyến cáo từ 500 ppm ñến 1000 ppm

2.3 Những ảnh hưởng của ñộc tố do nhiễm nấm mốc gây ra trong chăn nuôi

Bên cạnh giá trị dinh dưỡng, chất lượng thức ăn có ảnh hưởng tích cực ñến tình trạng sức khỏe của vật nuôi Nguyên liệu thức ăn có chứa lẫn vi khuẩn, nấm, nấm mốc Quá trình xử lý nguyên liệu trong sản xuất thức ăn giúp giảm nhiễm vi khuẩn nhưng không thể tránh khỏi việc tái nhiễm ở các giai ñoạn sau Nấm mốc gây

hư hại thức ăn ñặc biệt là trong ñiều kiện bảo quản không tốt Tất cả các nấm mốc ñều làm giảm giá trị dinh dưỡng của thức ăn, ñồng thời trong quá trình ký sinh trên

thức ăn chúng sinh trưởng phát triển và sản sinh ra ñộc tố mycotoxin gây hiểm họa nghiêm trọng cho vật nuôi và sức khỏe con người [32]

Trong nông nghiệp và sản xuất TACN nói chung, năm nhóm ñộc tố quan trọng cần ñược quan tâm nhất là aflatoxin, fumonisin, deoxynivalenol (DON, hoặc vomitoxin), zearalenone, và ochratoxin A Những ñộc tố này sản sinh ra rất nhiều ñộc tố hoặc là nguyên nhân gây ung thư cho con người và vật nuôi [52] Aflatoxin

chủ yếu ñược sản sinh ra bởi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus,

chúng ảnh hưởng tới hầu hết các loại cây trồng quan trọng như là ngô, ñậu ñỗ, lạc,

và bông Aflatoxin ñược biết là chất gây ung thư gan ở người, gây ra khoảng 25 ñến

155 nghìn ca mắc bệnh ung thư hàng năm trên toàn thế giới [39], hoặc khoảng 24% tổng số ca mắc bệnh ung thư gan trên toàn thế giới [38] Aflatoxin gây ra vô số các ảnh hưởng nghiêm trọng và nguy hại cho nhiều loại ñộng vật khác nhau thông qua sự biến ñổi làm cho quá trình tổng hợp DNA và di truyền trong tế bào diễn ra không bình thường Những ảnh hưởng này bao gồm làm tổn thương, hư hỏng gan, hỏng chức năng ñường ruột, không sinh trưởng, thiểu năng, giảm rối loại quá trình sinh trưởng phát triển và suy giảm hệ thống miễn dịch [50] [15] ðối với gia cầm, aflatoxin cũng là nguyên nhân gây giảm tỷ lệ ñẻ, mỏng vỏ trứng, giảm chất lượng thịt xẻ, và tăng khả năng nhiễm bệnh [21] [51] ðối với lợn, aflatoxin là nguyên nhân gây ra giảm trọng, lợn chậm lớn, còi cọc, kém ăn, tiêu chảy, ngộ ñộc, và có thể

21-tử vong nếu hàm lượng ñộc tố cao [19] Ở ñại gia súc như trâu bò thì ít mẫn cảm với ñộc tố aflatoxin trong thức ăn Tuy nhiên, sản lượng sữa cũng bị giảm và aflatoxin M1, một dạng chuyển hóa của aflatoxin B1 có thể làm ảnh hưởng ñến quả trình tiết sữa [34] [46]

2.4 Những kết quả nghiên cứu sử dụng acid hữu cơ trong TACN

Những acid hữu cơ có cấu trúc mạch carbon ñược biết ñến như là

“carboxylic acid” bao gồm formic (HCOOH), acid acetic (CH3COOH), và propionic (CH3CH2COOH) acid, những acid này thường thấy trong quá trình trao ñổi chất và chuyển hóa hoàn toàn trong tự nhiên Năng lượng của chúng có thể ñược ước tính vào thành phần của thức ăn ñặc biệt khi có hàm lượng propionic acid cao Propionic acid và formic ñược sử dụng trong dinh dưỡng cho vật nuôi ñặc biệt

cho việc bảo quản và ủ chua thức ăn Hơn nữa, trong một vài trường hợp chúng có thể ñóng góp hiệu quả về mặt dinh dưỡng Những acid này hoạt ñộng bới qua những bước chuyển hóa ñặc biệt trong quá trình trao ñổi chất của vi sinh vật liên quan ñến quá trình làm hư hại thức ăn Ngoài ra, acid tạo ra môi trường có pH thấp không thích hợp cho vi sinh vật có hại hiện diện trong thức ăn Những chất phụ gia này bổ sung vào thức ăn mang lại hiệu quả về mặt tiêu hóa các chất dinh dưỡng ñối với gia súc dạ dày ñơn, phòng chống hiện tượng tiêu chảy ñặc biệt ñối với gia súc còn non PA ñặc biệt thích hợp cho việc bảo quản thức ăn và nguyên liệu dựa vào ñặc tính kháng nấm mốc Formic acid là một acid mạnh có ñặc tính kháng khuẩn và nấm men Cả hai loại acid này ñược sử dụng rất hiệu quả trong việc kiểm soát vi

khuẩn có hại Samonellae trong nguyên liệu thô [13] Sử dụng những acid hữu cơ có

hoạt tính kháng nấm ñó là một cách hiệu quả ñể ñảm bảo chất lượng của nguyên liệu cũng như thức ăn trong quá trình bảo quản [32]

Theo cơ quan an toàn thực phẩm Châu Âu (European Food Safety Authority gọi tắt là EFSA) năm 2012, acetic acid cùng với muối của acid này như muối calcium acetate và sodium diacetate ñược ñăng kí sử dụng là phụ gia bảo quản thức

ăn chăn nuôi ñược sử dụng cho tất cả các loại gia súc không có sự hạn chế Hiện có một ứng dụng khác của acetic acid và những muối này như là chất chất bảo quản thức ăn cho mục ñích như chất bảo quản cho nước uống Chúng có thể sử dụng ñơn

lẻ hoặc kết hợp với một vài loại acid hữu cơ khác ở nồng ñộ 200-2500 mg acetate/kg trong hỗn hợp thức ăn Acetic acid và muối của nó ñược xem như có hiệu quả ngang nhau khi so sánh ở cấp ñộ phân tử Dựa trên so sánh giữa vật nuôi

sử dụng acetic acid có trong khẩu phần như chó, gà lượng sử dụng 2500mg acetic acid/kg thức ăn hỗn hợp (1000mg/lít cho nước uống) thì coi như an toàn ñối với gia cầm, lợn và thú cảnh Với gia súc nhai lại có thể chịu ñựng ñược mức cao hơn Acetic acid ñược chuyển hóa nhanh trong quá trình trao ñổi chất, việc sử dụng acetic acid và muối của nó cho vật nuôi không có nguy cơ phơi nhiễm cho con người Acetic acid và muối của nó là hóa chất dạng hàng rời thô khi vận chuyển và

sử dụng cũng ñã ñược hướng dẫn chi tiết trong tài liệu Acetic acid và acetate là thành phần bình thường hiện diện trong khẩu phần cho người và vật nuôi và chúng

ñược sản sinh khối lượng lớn ở dạng phân tử trong ñường tiêu hóa Acetic acid và muối acetate chuyển hóa hoàn toàn trong quá trình trao ñổi do ñó không có nguy hại ñối với môi trường, và chúng có tiềm năng trong việc sử dụng ñóng vai trò làm chất bảo quản trong thức ăn chăn nuôi và nước uống [22]

Propionic acid (PA) là một chất diệt nấm và vi khuẩn ñược dùng ñể kiểm soát nấm, vi khuẩn trong bảo quản ngũ cốc, cỏ khô, kho bảo quản hạt tinh bột, chất ñộn lót chuồng cho gia cầm và nước uống cho gia súc và gia cầm ở Châu Âu PA ñược chứng nhận như là một chất bảo quản cho hạt giàu tinh bột và hiệu quả nhất

trong việc kiểm soát Salmonella và nguồn bệnh khác, PA ñược sử dụng là chất bảo

quản an toàn trong thực phẩm ñối với người và cũng sử dụng thành công ñối với gia cầm Ảnh hưởng tích cực của PA như là phụ gia trong thức ăn chăn nuôi có thể ñược giải thích bởi nhiều cơ chế hoạt ñộng, acid này có thể bẻ gãy DNA(deoxyribonucleic acid) cấu trúc di truyền của tế bào vi khuẩn và làm mất khả năng nhân lên của chúng Hơn thế nữa, vi khuẩn thường mẫn cảm với pH như

E.Coli, Salmonela spp., Listeria monocytogenes, Clostridium perfingens, trong khi

ñó nhóm khác lại không mẫn cảm pH như Bifidobacteria, Lactobacillus spp Việc

giảm pH trong ñường tiêu hóa và ñặc biệt ở dạ dày bởi sự hiện diện và bổ sung PA trong thức ăn sẽ ức chế vi khuẩn và cải thiện hiệu suất của vật nuôi Cũng theo nghiên cứu của tác giả này trong năm 2009 thì liều sử dụng PA là 0.2 ñến 0.4% có thể cải thiện năng suất chăn nuôi gia cầm Khi bổ sung PA vào thức ăn, do ñặc tính khác vi khuẩn và hiệu quả ức chế việc nấm mốc phát triển do pH giảm trong cả thức

ăn và ñường tiêu hóa qua quá trình hoạt hóa dược học nên hệ vi sinh vật ñường ruột

ức chế nhóm vi sinh vật có hại từ ñó tăng hiệu quả sử dụng tiêu hóa thức ăn Propionic acid có vai trò như một chất kích sinh trưởng, nâng cao sức khỏe, kháng khuẩn hiệu quả có thể sử dụng thay thế cho nguồn kháng sinh trong thức ăn trong chăn nuôi [27]

Trong một nghiên cứu của Wei Mushan và cs., (1995) về ảnh hưởng của hỗn hợp của 5 loại chất kháng nấm mốc, Kemei, Calcium propionate, Fangmeiling, Meizheng và Shanchangzhiyou (Lisea cubeba oil) ñến sự phát triển của nấm mốc trong thức ăn trong thời gian bảo quản Kết quả thí nghiệm cho thấy số lượng nấm

mốc tăng dần trong 168 ngày bảo quản và không có thấy xuất hiện nấm mốc trong giữa thời gian cho tới khi kết thúc thí nghiệm khi ẩm ñộ thức ăn ở 11% Khi ẩm ñộ của thức ăn tăng lên 14% và thức ăn ñược bảo quản trong ñiều kiện ẩm với thời gian 1 tháng, thì có sự xuất hiện của nấm mốc Từ kết quả thí nghiệm tác giả ñã kết luận rằng, chất kháng nấm mốc ñã ảnh hưởng ñến sự phát triển của nấm trong thức

ăn ñược xử lý ngoại trừ Pullularia pullulans Hỗn hợp kháng nấm có ảnh hưởng rõ

rệt trong việc kiểm soát sự phát triển của nấm trong thức ăn [49]

Trong các axit hữu cơ thì formic axit là axit có hiệu quả cao trong việc kháng lại vi khuẩn và nấm men, acid hữu cơ kiểm soát vi sinh vật bằng cách can thiệp vào quá trình chuyển hóa năng lượng bởi việc vô hiệu hóa enzym pyruvatedecarboxylase và ảnh hưởng ñến tổng hợp DNA, việc nhân lên và phát triển của vi khuẩn và nấm bị giảm ñáng kể khi có sự hiện diện của formic acid Ngoài ra, các loại acid khác như acetic, bytyric và benzoic cũng cho thấy có hiệu quả thấp hơn so với propionic hay formic [11]

2.4.1 Ảnh hưởng của PA ñến sinh trưởng phát triển của gia cầm

Trong nghiên cứu về sự kích thích tăng trưởng của propionic acid (PA) có thể giảm mầm bệnh khi pH ñường ruột giảm và từ ñó tăng tỷ lệ hấp thụ và tăng việc

sử dụng protein, amino axit, khoáng và các chất dinh dưỡng ñối với con vật Theo kết quả nghiên cứu của tác giả này khi nghiên cứu ảnh hưởng của propionic acid làm chất ñệm trong khẩu phần thức ăn ñến sinh trưởng phát triển và hệ vi sinh vật ñường ruột và chất lượng thịt ở gà thịt cho thấy khi bổ sung Luprosil có chứa 53.5% propionic acid với lượng 0.4% làm tăng ñáng kể khả năng tăng trọng của gà thịt giai

ñoạn 49 ngày tuổi [31]

Marcos và cs., (2004) báo cáo rằng khi gà thịt ñược bổ sung hỗn hợp acid (70% formic acid và 30% PA) với liều 0.25 và 0.5% trong khẩu phần cho thấy tăng trọng cao hơn so với ñàn gà cho ăn hỗn hợp axit ñó với liều cao hơn (1 và 2%) [40] Việc cải thiện có ý nghĩa ñáng kể về khối lượng cơ thể và tăng trọng ở gà tây khi bổ sung MC (myco curb chứa PA) với liều bổ sung 0.625 và 1.25% [48]

Trong một nghiên cứu của Paul và cs., (2007) với muối acid hữu cơ (calcium propionate, ammonium formate và calcium lactate) với liều dùng 1g/kg

như là chất thay thế cho kháng sinh (virginiamycin 0.5g/kg) kết quả cho thấy tăng trọng tăng ñáng kể trong nhóm bổ sung muối axit hữu cơ so với nhóm dùng kháng sinh [44]

2.4.2 Ảnh hưởng của PA ñến khả năng ăn vào và chuyển hóa thức ăn

Như là chất bảo quả thức ăn PA giảm pH của thức ăn, nâng cao ñiều kiện vệ sinh và cải thiện tính ngon miệng của thức ăn từ ñó tăng khả năng ăn vào của con vật nhưng với liều dùng cao có khả năng giảm khả năng ăn vào của vật nuôi Khi

PA bổ sung vào thức ăn với hàm lượng 100g/kg từ 0 ñến 28 ngày, lượng thức ăn ăn vào của gà thịt bị giảm khi lượng axit trong khẩu phần tăng dần Muối axit hữu cơ (Calcium propionate, ammonium formate và calcium lactate với lượng 1g/kg) có thể dùng thay thế kháng sinh (virginiamycin liều dùng 0.5g/kg) kết quả cho thấy lượng thức ăn ăn vào ở gà thịt cao hơn ñáng kể ở nhóm dùng kháng sinh so với nhóm khác [16] Nghiên cứu của Celik và cs., (2003) chỉ ra rằng hệ số chuyển hóa thức ăn FCR (Feed conversion ration) ñược cải thiện ý nghĩa ở nhóm gà có bổ sung muối acid hữu cơ [44] Trong nghiên cứu khác chỉ ra rằng hệ số chuyển hóa thức ăn FCR của gà tây khi bổ sung acid hữu cơ (PA, formic acid, acetic acid) ñã ñược cải thiện tốt hơn so với nhóm gà không ñược bổ sung PA tăng lượng ăn vào bằng việc cải thiện tính ngon miệng của thức ăn và có thế tăng tính thấm hấp thụ dinh dưỡng của tế bào ñường tiêu hóa làm cho tăng tỷ lệ sử dụng các chất dinh dưỡng và kết quả là chuyển hóa thức ăn ñược tốt hơn [17]

Với chất lượng thịt xẻ, khi PA ñược thiết lập như là một tác nhân kích thích tăng trưởng cải thiện tỷ lệ sử dụng dinh dưỡng ñặc biệt là protein từ ñó tỷ lệ thân thịt ñược cải thiện hơn Với gà mái nuôi thịt ñược cho ăn 7.3kg/tấn (0.8% Luprosil

NC có chứa 53.3% propionic acid), kết quả cho thấy có sự cải thiện ý nghĩa về tỷ lệ thân thịt [31] Ảnh hưởng ñáng kể ñến năng suất thịt xẻ của gà thịt khi khẩu phần ñược bổ sung PA [29]

2.5 Hiệu quả của việc sử dụng PA

2.5.1 Hiệu quả kháng khuẩn của PA

Hoạt ñộng kháng khuẩn của axit propionic liên quan tới việc giảm pH cũng như là khả năng phân ly bởi vì chúng là dạng có thể hòa tan trong môi trường lipid

ở dạng không phân ly, ở ñó nó có khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn ðộ pH của ñường ruột là một môi trường ñặc biệt ñược thiết lập như yếu tố quyết ñịnh ñến

sự cân bằng vi sinh vật tồn tại trong ñường ruột và ảnh hưởng trực tiếp ñến khả năng tiêu hóa cũng như hấp thu ñối với hầu hết các chất dinh dưỡng ða số vi khuẩn mang mầm bệnh phát triển ở pH gần với trung tính (pH=7) hoặc cao hơn Ngược lại, những nhóm vi sinh vật có lợi tồn tại ở ñường ruột thích hợp với môi trường có

pH (5.8-6.2) và ñối lập với vi sinh vật có hại [24] Hơn nữa, ở môi trường pH thấp hơn khi có sự hiện diện của acid hữu cơ làm giảm vi sinh vật có hại ở ñường ruột

và cải thiện sự hấp thu dinh dưỡng [14]

Giá trị pH thấp hơn ở diều và ở dạ dày cơ ñã phát hiện ở gà thịt khi bổ sung propionic acid và calcium acetate trong khẩu phần so với nhóm ñối chứng Cũng có nhiều báo cáo kết luận rằng khi bổ sung formic và propionic acid trong khẩu phần

ở dạng Bio-add vào thức ăn của gà mái ñẻ ñã không có sự khác nhau về pH của ñường ruột, nhưng kết quả cho thấy nồng ñộ những acid này cao hơn ở diều và dạ dày cơ Hiệu quả của MC (Myco curb có chứa PA) kháng ñược nhiều loại vi khuẩn

và nấm ñã ñược báo cáo bởi nhiều nhà khoa học [33] [29]

PA rất có hiệu quả trong việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn E.coli trong

ñường ruột Cùng thời ñiểm ñó nó không ức chế sự phát triển của vi khuẩn có lợi

Lactobacillus Một nghiên cứu trước ñây của Mathew và cs., (1991) cho thấy khi bổ sung Luprosil NC cho lợn ñang sinh trưởng, số lượng E.coli trong ñường ruột giảm, Lactobacillus tăng pH của dịch tiêu hóa ñường ruột giảm do quá trình lên men của

nhóm vi khuẩn lên men gia tăng Mặt khác, sự có mặt của PA trong thức ăn có vai trò

ñáng kể trong việc giảm Salmonella spp trong ñường ruột của gà [41] Kwon và cs.,

(2003) cho thấy propionic acid có khả năng ñệm làm giảm rõ rệt sự phát triển của

Salmonella và nhóm vi khuẩn yếm khí khác trong ñường ruột khi pH giảm từ 7 xuống

5 và tối ña hiệu quả ức chế khi dùng 3% ở gà thịt Kết quả nghiên cứu này chỉ ra rằng

hiệu quả ức chế sinh trưởng của PA chống lại nhóm vi khuẩn S.typhimurium ñã cải

thiện bởi việc giảm pH và ức chế nhóm vi khuẩn yếm khí [35]

2.5.2 Hiệu quả làm chất kháng nấm và bảo quản TACN

Kháng nấm trong thức ăn chăn nuôi trong quá trình bảo quản không thể tách rời khi không có sự hiện diện hiệu quả của chất bảo quản Nếu ñộ ấm quá 15% với nhiệt ñộ không khí cao hơn 20 oC [47] Sự phát triển của nấm trên thức ăn có thể phần nào làm giảm chất lượng thức ăn, do nấm ký sinh và sử dụng phần lớn nguồn dinh dưỡng như mỡ, cacbonhydrat, và kể cả thành phần khoáng trong từ nguồn nguyên liệu thức ăn chăn nuôi, dẫn tới hậu quả là thức ăn biến màu, sinh nhiệt, mốc, thối và gây biến ñổi chuyển hóa sinh gây tích tụ hợp chất ñộc tố trong hầu hết các trường hợp khi nấm mốc xuất hiện Sự xuất hiện và phát triển của nấm mốc và sản sinh ñộc tố mycotoxin trong thức ăn làm giảm dinh dưỡng, giảm tính ngon miệng dẫn ñến giảm lượng ăn vào, giảm hiệu quả sử dụng và tỷ lệ chuyển hóa thức ăn, ñồng thời tăng nguy cơ rủi ảnh hưởng ñến khả năng sinh sản và năng suất vật nuôi [37] ðộc tố của nấm mốc như là aflatoxin, zearalenone, ochratoxin và fumonisin, trong số các ñộc tố thì aflatoxin là chủ yếu [26] [53] Chiến lược trong việc kiểm soát nấm mốc, thích hợp ñối với ngành công nghiệp sản xuất TACN thì cần ñược áp dụng cẩn thận các chất bảo quản và chống nấm mốc [28] [26] Một chất bảo quản TACN lý tưởng nhất thiết phải hiệu quả, giá thành hợp lý, không ăn mòn và an toàn với vật nuôi [28] [37] Tuy nhiên, các chất bảo quản hiện nay thì chủ yếu là các acid hữu cơ ñược tổng hợp như propionic, acetic, sorbic và formic [24]

PA ñã ñược chứng minh và sử dụng hiệu quả rộng rãi trong nhóm acid hữu

cơ ñể kháng lại nhiều chủng nấm và nấm men như trong bảng 2.2 Do ñó, propionic acid có hiệu quả trong việc phòng chống sự hình thành ñộc tố mycotoxin từ nấm mốc Tuy nhiên, cách hiệu quả nhất ñể giữ thành phần thức ăn ở ñiều kiện vệ sinh

là dùng propionic acid Phương pháp hiệu quả kinh tế nhất ñối với bảo quản nguyên liệu TACN dạng hạt bột ngũ cốc là dùng Luprosil có chứa propionic acid 53.5% Vi khuẩn và nấm nhiễm trong thành phần thức ăn có ảnh hưởng tiêu cực ñến hệ vi sinh vật ñường ruột, kết quả là gây ra mất dinh dưỡng và ảnh hưởng tiêu cực ñến lượng thức ăn thu nhận của con vật Tạp nhiễm vi khuẩn trong thức ăn chăn nuôi không những gây hậu quả giảm giá trị dinh dưỡng, mà còn có ảnh hưởng xấu làm giảm tính ngon miệng của thức ăn, gây ra hậu quả giảm lượng thức ăn ăn vào cũng như

giảm năng suất của vật nuôi ðể tránh những vấn ñề ảnh hưởng không tốt tức thức

ăn chăn nuôi, thì sản phẩm thức ăn chăn nuôi cần ñược bảo quản tốt, không chứa nấm mốc và có thời gian bảo quản ñược dài, ñể ñảm bảo vấn ñề này thì việc áp dụng thực hành tốt trong sản xuất từ khâu kiểm soát lựa chọn nhập nguyên liệu ñầu vào cho tới quá trình vận hành chế biến sản xuất, sử dụng chất bảo quản có nguồn gốc hữu cơ, bảo quản nguyên liệu trong kho, cũng như bảo quản thành phẩm cần ñược áp dụng tốt [13]

Bảng 2.2 Nồng ñộ ức chế tối thiểu của PA ñối với các nhóm vi sinh vật Nhóm vi sinh vật kiểm tra Nồng ñộ propionic tối thiểu (%) Nhóm vi khuẩn (bacteria) 1

0,25 0,25 0,50 0,125 0,125 0,125 0,10 0,125

1

-pH 7-7.2; 2-pH 5.0,

Nguồn BASF, 2010

2.6 Sử dụng chất hóa học có khả năng gắn kết dính, hấp phụ ñộc tố trong sản xuất TACN

Việc sử dụng các hợp chất hóa học có khả năng kết dính hấp phụ ñộc tố trong thức ăn chăn nuôi cũng ñã ñược nhiều nhà khoa học nghiên cứu in vitro và in vivo ñã ñược cho thấy có hiệu quả về mặt hóa sinh học và thực tế áp dụng rộng rãi Những phương pháp hóa học không những chỉ yêu cầu phù hợp với trang thiết bị khả năng áp dụng mà còn phải dễ dàng áp dụng trong quá trình sản xuất ñảm bảo vệ sinh an toàn; ñiều này làm cho tăng chi phí và tốn kém thời gian ñối với nhà sử dụng Hơn thế nữa, ngoài các chất là acid hữu cơ ñược sử dụng trong TACN ñể kháng kháng khuẩn và nấm mốc còn rất nhiều chất hóa học bao gồm các chất oxi hóa, bazơ, muối, chloriate cũng ñã ñược kiểm nghiệm ñể làm giảm tác nhân gây ra ñộc tố mycotoxin trong hàng hóa nông sản cũng như sản xuất chế biến thực phẩm

và TACN Chỉ có một số ít trong các các chất này thì hiệu quả không có bất kỳ dấu hiệu giảm giá trị dinh dưỡng hoặc giảm tính ngon miệng của thức ăn Về mặt hóa học, một số ñộc tố mycotoxin có thể bị phá hủy hoặc bị biến tính bởi canxi hydroxide (Ca(OH)2), monoethylamine, ozone hoặc amonia [43] [36] [30] ðặc biệt, sự ammon hóa ñã ñược chấp nhận là một chất giảm ñộc tính của aflatoxin trong thức ăn bị tạp nhiễm ở nhiều quốc gia [30] Chi phí trung bình ñối với amon hóa dao ñộng khoảng 5-20% giá trị hàng hóa [45] Hạn chế chính của loại hợp chất giảm ñộc này chính là kém hiệu quả ñối với mycotoxin và có thể làm giảm sức khỏe của vật nuôi khi lượng tồn dư vượt cao trong thức ăn

Một phương pháp khác ñã ñược thực nghiệm trong việc cố gắng làm giảm sự hấp thu ñộc tố mycotoxin từ thức ăn chăn nuôi bị tạp nhiễm là sử dụng các chất bám kết dính và hấp phụ ñộc tố (mycotoxin binders) Chất này ñược bổ sung vào thức ăn với mục ñích ñể cho thấy một hình thức hoàn toàn khác biệt về mặt hoạt ñộng so với tất cả những vấn ñề xử lý hóa học hay vật lý ñã ñược ñề cập trước ñây Mục ñích của những phụ gia này là ñể hạn chế sự hấp thu ñộc tố ở con vật khi sử dụng thức ăn nhiễm ñộc tố Việc sử dụng các tác nhân kết dính hấp phụ ñộc tố thì thường xuyên ñược khuyến cáo ñối với những người chăn nuôi ñể bảo vệ ñàn vật nuôi chống lại những ảnh hưởng có hại gây ra bởi ñộc tố nâm mốc có trong thức ăn

Những chất kết dính hấp phụ ñộc tố (absorbents) ñược dùng với mục ñích ñể hoạt ñộng như một màng lọc hóa học “Chemical sponge” và hấp phụ ñộc tố trong ñường tiêu hóa, bởi vậy chánh ñược sự hấp thu và sự phát tán ñộc tố về sau tới các cơ quan quan trọng trong cơ thể con vật Hiệu quả của việc hấp phụ ñối với chất hấp phụ ñộc

tố phụ thuộc vào cấu trúc hóa học của cả chất kết dính hấp phụ và cấu trúc của từng ñộc tố ðặc tính quan trọng nhất của chất hấp phụ ñộc tố là cấu trúc vật lý hóa học của chất ñó như là: tổng ñiện tích, khả năng phân cực, phân ly, kích thước, số lượng phần tử hoạt hóa, diện tích bề mặt tiếp xúc Mặt khác, chất hấp phụ phải tương ứng

và hiệu quả với tính chất của ñộc tố bị hấp phụ kết dính như ñộ phân cực, khả năng hòa tan, hình dạng cấu trúc, ñiện tích phân bố cũng ñóng một vai trò rất quan trọng [30] [12]

Rất nhiều nghiên cứu ñã chỉ ra rằng có rất nhiều các chất hấp phụ có liên kết khá ổn ñịnh ñối với ñộc tố mycotoxin như: than hoạt tính, hydrate sodium calcium aluminosilicates (HSCAS) và một số polymer Một số ñã ñược nghiên cứu rất kỹ và ñược khuyến khích sử dụng như là phụ gia trong TACN Tuy nhiên, hầu hết chúng chỉ bắt dính ñược với một số lượng nhỏ các nhóm ñộc tố ñồng thời cho thấy rất ít hoặc không bắt dính những nhóm ñộc tố còn lại do Huwig và cs., (2001) ví dụ như HSCAS thì khá hiệu quả với aflatoxin nhưng lại không phòng ñược ảnh hưởng của

ñộc tố Fusarium như là fumonisin, trichothecene hay zearalenone [12]

Làm mất hoạt tính ñộc tố bởi các chất hấp thụ ñã ñược nghiên cứu và cho kết quả khả thi, hầu hết nghiên cứu tập trung vào việc giảm ñộc sử dụng các chất alluminosilicate, zeolites, HSCAS, và aluminosilicate-clays, chủ yếu bao gồm aluminates, silicates và một số có khả năng trao ñổi ions, alkaline [30] Khoáng sét (mineral clays) bentonites, zeolites, và aluminosilicate phổ biến dùng làm phụ gia thức ăn chăn nuôi chúng có hiệu quả trong việc hấp phụ kết dính ñộc tố aflatoxin [12]

Hydrated sodium calcium aluminosilicates bổ sung với lượng 1% vào thức

ăn ñã ñược báo cáo giảm ñáng kể ảnh hưởng xấu từ aflatoxin ñối với gia súc còn non Aluminosilicate ñược sử dụng tới 2% trong khẩu phần hoàn chỉnh như là chất chống gãy vỡ viên (anti-caking) Do ñó, mục ñích chính của sản phầm này bổ sung

hơn là kết dính ñộc tố Aluminosilicate ñược dùng lựa chọn ñể hấp phụ aflatoxin và không có hiệu quả với zearalenone, fumonisin B1, ochratoxin A và trichothecenes, T2 Toxin Montmorillonite nanocomposite, zeolites cho thấy có hiệu quả bắt dính

và hấp thụ ñộc tố ñối với zearalenone [43]

2.7 Màng bao gói

Theo Nguyễn Mạnh Khải, (2007): Low Density Polyethylene hay Polyethylenee tỷ trọng thấp (LDPE) có cấu trúc ñơn giản nhất trong tất cả các polime: một chuỗi dài các ñơn vị ethylene nối với nhau LDPE ñược làm từ ethylene trong ñiều kiện áp suất rất cao (khoảng 25000 psi) và nhiệt ñộ khoảng

300oF và chịu ảnh hưởng của các gốc hoạt hóa tự do [2]

Màng bao gói làm từ LDPE có ñộ mềm, khả năng ñàn hồi ñặc trưng và rất dễ kéo căng, có ñộ trong tốt nhưng chưa thật sự tuyệt hảo, có khả năng ngăn ẩm tốt nhưng ngăn ôxi kém, không gây mùi khó chịu cho thực phẩm, bản thân có thể tạo mối ghép nhiệt Các tính chất ñược ưa chuộng này cùng với giá thành trên một ñơn vị diện tích thấp (thấp nhất trong tất cả các loại màng làm bao bì) làm cho LDPE trở thành loại vật liệu bao gói bằng platic ñược sử dụng rộng rãi nhất hiện nay Ứng dụng chính của nó trong thực phẩm là làm bao bì cho các sản phẩm ñông lạnh, làm lớp dán dính trong bao bì nhiều lớp, làm lớp bọc ngăn nước, ngăn chất béo cho các vật liệu bao gói bằng giấy bìa và làm màng cho sản xuất bao bì các sản phẩm nướng [2]

Polypropylen (PP) có tỷ trọng 0,92 g/cm2 Màng PP có ñặc ñiểm chắc hơn, bền với nhiệt hơn (130-1450C) và trong hơn so với màng PE, nhưng khả năng chống thấm hơi, khí và chịu băng giá lại kém hơn Màng PP có thể làm bao bì cứng

và bao bì mềm dẻo Có thể dùng bao bì PP ñể ñựng sản phẩm thanh trùng theo phương pháp Pasteur trong nước sôi hoặc tiệt trùng [3]

Phương pháp dùng màng bao bọc như: PE, PP, có thể sử dụng ñể bảo quản rất nhiều rau, củ, quả ñặc biệt là rau củ quả trong mùa ñông như : bắp cải, cải thảo, bí ñao, …Phương pháp MAP làm giảm cường ñộ hô hấp và các quá trình biến ñổi sinh lý, sinh hóa của rau, kéo dài thời gian sống của rau lâu hơn so với bình thường [18]

Theo Cao Văn Hùng và cs., (2006), trong báo cáo tổng kết ñề tài cấp Nhà nước ñã nghiên cứu ñộ thấm khí của một số bao bì thông dụng ñược trình bày ở bảng 2.3

Bảng 2.3 ðộ thấm khí O 2 và CO 2 của các bao bì thông dụng

3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 ðối tượng – địa điểm và thời gian nghiên cứu

♦ ðối tượng nghiên cứu:

+ Trên TACN D42: dành cho lợn từ 30 kg đến xuất bán

+ Bao bì LDPE

+ Chế phẩm Moldtex của Cơng ty Linqtex ở Thái Lan

♦ ðịa điểm nghiên cứu:

+ Các thí nghiệm in vitro được thực hiện tại phịng thí nghiệm khoa Cơng

nghệ thực phẩm trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội

+ Các thí nghiệm trên TACN và bao bì được thực hiện tại Cơng ty cổ phần Tập đồn Dabaco Việt Nam – Tỉnh Bắc Ninh Phân tích các chỉ tiêu được thực hiện tại phịng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn VILAS thuộc Cơng ty

♦ Thời gian nghiên cứu:

+ Từ tháng 8/2013 đến tháng 3/2014

3.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hĩa chất

Các loại thiết bị

- Cân phân tích điện tử hãng BOECO (d=0,1mg, Max 210g, ðức)

- Tên máy: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agillent 1200 Agillent Technologies (Mỹ) Năm sx: 2009

- Detecto huỳnh quang kích thích ở bước sĩng 365 và phát ra ở bước sĩng 435

mm

- Máy chiết mỡ: Hãng Velp – Italia

- Máy cất đạm: 2100 Kjeltec Distillation Unit hãng Foss Tecator Thụy Sỹ

- Thiết bị cất quay chân khơng

- Máy lắc cơ

- Bể siêu âm

- Bếp cách thủy ñược ñiều nhiệt ở 600c

- Máy nghiền mẫu (blender)

Dụng cụ

- Ống falcon 15ml, 50 ml; ống ependoff; bình tam giác thể tích 100ml, 250 ml; bình ñịnh mức 10ml, 50ml, 100ml, 500ml, 1000ml; pipetmen 100µl, 1000µl,…; pipet 5ml, 10ml; ống nghiệm, cốc ñong; ống ñong

- Lọc dung môi; màng lọc PTPE kích thước lỗ 0,45 µm

- Micro si – ranh, pipet man

- Ống thủy tinh chuẩn có nắp (10 ml)

- Bình tam giác dung tích 500 ml

- Hỗn hợp Acetonitril và nước theo tỷ lệ 90:10 (theo thể tích)

- Hỗn hợp Metanol và nước: theo tỷ lệ 1:1 (theo thể tích)

- Pha ñộng cho HPLC: Nước + Metanol + Acetonitril theo tỷ lệ 57:17:26 theo thể tích

- Chất chuẩn Mycotoxin Mix I

Thêm từ từ 105 ml H2SO4 ựậm ựặc và 895 ml H2O, khuấy ựều tránh làm dung dịch quá nóng

Trước khi dùng tất cả ựồ thủy tinh tiếp xúc trực tiếp với dung dịch Afla phải ựược ngâm vài phút trong acid, sau ựó rửa sạch bằng nước, kiểm tra tồn dư axit bằng giấy

ựo pH

3.2 Nội dung nghiên cứu

+ Xác ựịnh thành phần và ựặc ựiểm hình thái nấm mốc gây hư hỏng TACN lợn D42 trong thời gian bảo quản

+ Tỷ lệ nhiễm nấm trên TACN D42 trong thời gian bảo quản

+ Thắ nghiệm in vitro ựánh giá ảnh hưởng của chế phẩm Moldtex ựối với Aspergillus flavus phân lập ựược trên môi trường PDA

+ đánh giá hiệu quả sử dụng chế phẩm Moldtex phòng trừ nấm nhiễm trên TACN D42

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ựộ Moldtex xử lý ựến chất lượng TACN trong thời gian bảo quản

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của ựộ dày bao bì LDPE ựến chất lượng TACN trong thời gian bảo quản

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp ựiều tra, thu mẫu

+ Chọn ựiểm ựiều tra: ựiểm ựiều tra diễn biến bệnh phải ựại diện cho mức ựộ nhiễm bệnh khác nhau tại kho của Công ty cổ phần tập ựoàn DABACO Việt Nam

+ Thời gian ựiều tra: 01lần / tháng

+ Phương pháp ựiều tra:

* để xác ựịnh tình trạng nhiễm nấm của TACN lợn D42 trong kho bảo quản

về thành phần loại cũng như mật ựộ nhiễm bệnh tiến hành theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6404 : 2008 (tương ựương ISO 7218 : 2007)

*Xác ựịnh tình trạng nhiễm nấm của TACN lợn D42 ở các ựiều kiện: cách bảo quản, cấu trúc kho bảo quản

+ Xác ựịnh vị trắ các ựiểm lấy mẫu ban ựầu

+ Theo ựặc ựiểm sinh thái của kho bảo quản

+ Theo phân bố của lô hàng với quy ñịnh

Khối lượng lô hàng Số mẫu ban ñầu phải lấy

Dưới 1 tấn Không ít hơn 5 mẫu

Từ 1-10 tấn 5 mẫu , cứ thêm một tấn lấy thêm 1 mẫu

Từ11-50 tấn 14 mẫu,cứ thêm 2 tấn lấy thêm 1 mẫu

Từ 51-100 tấn 34 mẫu,cứ thêm 3 tấn lấy thêm 1 mẫu

Từ 501-1000 tấn 130 mẫu,cứ thêm 7 tấn lấy thêm 1 mẫu

Nếu lô hàng gồm nhiều ñống thì số ñiểm lấy mẫu ban ñầu (X1) của ñống hàng tính theo công thức:

Xi =

L DX

D: Khối lượng ñống hàng

L: Khối lượng lô hàng

- Tiến hành lấy mẫu và khối lượng mẫu ban ñầu 250 – 500g theo tiêu chuẩn ngành KDTV năm 2002

- Trộn ñều tất cả các mẫu ban ñầu của mỗi lô phân tán mẫu theo nguyên tắc ñường chéo ñể lấy mẫu trung bình

- ðiều tra cố ñịnh trên 5 ñiểm chéo góc Theo tầng của lô hàng

3.3.2 Phương pháp xác ñịnh thành phần nấm hại trên TACN

Giám ñịnh nấm hại TACN theo tài liệu giám ñịnh bệnh hại của Viện nghiên cứu Bệnh hại hạt giống ðan Mạch ( Mathur et al., 2001) kiểm tra nấm bệnh tồn tại trên TACN bằng phương pháp giấy thấm

Phương pháp chia mẫu: Mẫu TACN lấy về ñược trải ñều trên mặt phẳng theo hình vuông Chia mặt phẳng thành 2 ñường chéo ñều nhau Lấy mỗi phần một lượng viên nhất ñịnh sau ñó trộn ñều sao cho ñủ lượng mẫu kiểm tra Lượng mẫu kiểm tra 400 viên

- Lấy 400 viên/ 1 mẫu, chia thành 40 phần, mỗi phần 10 viên

- Chuẩn bị ñĩa Petri và giấy thấm

+ ðĩa Petri ñã ñược hấp khử trùng mỗi ñĩa ñặt 10 viên

+ Giấy thấm trong hộp ñược khử trùng

+ Lấy 3 tờ giấy thấm, nhúng vào nước cất sao cho toàn bộ giấy ñược thấm ướt ñều, sau ñó ñặt vào hộp Petri ( 3 tờ / hộp)

Cách ñặt : Khử trùng bề mặt : nhúng viên TACN vào dung dịch NaOCl 1%

từ 15-20s, sau nhúng lại bằng nước cất vô trùng ðặt 10 viên/ ñĩa Petri, ñặt thành 2 vòng ngoài cùng 9 viên, 1 viên ở trung tâm của ñĩa Sau khi ñặt xong phải ghi mã số mẫu, ngày ñặt và ngày kiểm tra trên mặt ñĩa, ñem toàn bộ số ñĩa ñã ñặt TACN ñể trong phòng nuôi cấy ñảm bảo 12 giờ sáng, 12 giờ tối ở nhiệt ñộ 25-300C Sau 7 ngày kiểm tra mẫu, ñem kiểm tra kỹ từng viên dưới kính hiển vi soi nổi, khi phát hiện thấy nấm ở trên ñó tiến hành dùng kim khêu nấm ñặt trên lam kính ñể kiểm tra dưới kính hiển vi quang học

Chỉ tiêu theo dõi tính tổng số viên TACN bị nhiễm bệnh trên tổng số viên, kiểm tra ñánh giá mức ñộ phổ biến của bệnh theo thang 4 cấp sau:

Mẫu nấm ñược phân lập từ TACN D42 sử dụng môi trường WA (water agar)

và PDA (Potato dextrose agar)

+ Cách chế tạo môi trường WA (Agar: 20 g và Nước: 1000 ml) ðun tan agar trong 800 mL nước Bổ xung nước cho ñủ 1000 ml Hấp khử trùng ở 121oC /20 phút ðể nguội 50-55 0C trước khi rót ra ñĩa petri

+ Cách chế tạo môi trường PDA (Khoai tây: 200g, Dextrose (D-glucose): 20g, Agar: 20g và Nước: 1000ml) Khoai tây rửa sạch, cắt lát, ñun trong nước 1 giờ Lọc qua vải lọc, bổ sung agar vào dịch lọc, ñun cho tan agar Bổ xung nước cho ñủ 1000

ml Hấp khử trùng ở 1210C /20 phút ðể nguội 50-550C trước khi rót ra ñĩa petri

Trình tự phân lập nấm

Chuẩn bị:

* Dao mổ, kéo, panh, que cấy nấm

* đèn cồn, giấy thấy thấm vô trùng, ựĩa môi trường

* Hoá chất khử trùng: Cồn (ethanol) 70%

Tiến hành:

*Khử trùng bề mặt cám trong dung dịch khử trùng bề mặt bằng Ethanol 700, NaOCl hoặc Ca(OCl)2 1-2 %

* Rửa lại nhanh bằng nước cất vô trùng

* Thấm khô viên cám bằng giấy thấm vô trùng

Dùng panh vô trùng ựặt các viên cám có nhiễm nấm vào môi trường thạch

WA (5 Ờ 10 viên / ựĩa) Phân phối cho các viên thức ăn cách ựều nhau để mẫu trong ựiều kiện nhiệt ựộ ( 25- 300C), ánh sáng thắch hợp Theo dõi sự phát triển của sợi nấm mọc ra từ mô bệnh Khi nấm ựã phát triển từ mô bệnh ra môi trường, lấy phần ựỉnh sợi nấm chuyển sang môi trường PDA

3.3.4 Phương pháp phân loại nấm

Phân loại nấm ựược xác ựịnh theo các tài liệu phân loại nấm bất toàn của Barnett & Hunter (1998), Singh etal (1991)

3.3.5 Phương pháp ựịnh tên nấm bằng kỹ thuật sinh học phân tử

3.3.5.1 Quy trình chiết DNA

DNA ựược tách chiết theo phương pháp ựược hiệu chỉnh bởi Gardes và Bruns (1993)

Dùng que cấy hoặc dao mổ sạch lấy khoảng 100 mg sợi nấm cho vào trong tube 1.5 mL Chú ý không lấy theo môi trường agar

Cho 500 ộL ựệm CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide) vào tube Dùng chày nhựa chuyên dụng nghiền nhuyễn nấm

Ủ tube ở 650C trong thời gian 10 phút Sau khi ủ, ựể tube khoảng 10 phút ựể nhiệt ựộ trở về nhiệt ựộ phòng

Li tâm 13000 g trong 5 phút => loại bỏ cặn, lấy phần dung dịch (~500 ộL)

Cho dung dịch Chloroform: Isoamylalcolhol (24 :1) vào tube với thể tích tương ñương Lắc nhẹ tube (không vortex)

Li tâm 13000 g trong 5 phút, thu phần dịch (~ 400 µL) Chú ý không lấy phần phân giới chứa kết tủa

Cho thể tích tương ñương (~400 µL) 2-propanol lạnh vào tube ðảo ñều tube

và ñể lạnh (-200C) trong 30 phút

Li tâm 13000 g trong 15 phút Loại bỏ dịch phía trên, thu lấy cặn DNA tổng

số

Rửa cặn bằng ethanol 70% hai lần (mỗi lần 0.7 – 1 mL)

Làm khô cặn DNA bằng cách mở nắp tube, ñể ở nhiệt ñộ phòng trong 30 phút (trong buồng cấy)

Hòa cặn DNA trong 20-50 µL nước cất 2 lần vô trùng hoặc ñệm TE và bảo quản dịch DNA ở -200C

Kiểm tra chất lượng mẫu chiết DNA bằng ñiện di gel agarose (dùng 1- 2 µL dịch DNA)

3.3.5.2 Nhân DNA của mẫu nấm bằng PCR và giải trình tự gen

Phản ứng PCR ñược thực hiện với cặp mồi ITS1 và ITS4 (White et al., 1990) ðiều kiện phản ứng: Các phản ứng PCR ñược thực hiện trong tube 0,5 mL với tổng thể tích phản ứng 25 µL, thành phần của mỗi phản ứng PCR:

H2O : 20,2µl

Bf : 2µl dNTPs : 0,5µl ITS4 : 0,5µl ITS5 : 0,5µl Blend Taq : 0,3µl DNA : 1µl

đĩ, đun trong lị vi sĩng 3 – 4’, bổ sung Ethidium Bromide theo tỉ lệ cứ 100ml dung dịch gel cho 4µl lắc đều, để lọ ở nhiệt độ phịng Khi dung dịch agarose 1% nằm trong khoảng 400C thì đổ vào khuơn cĩ đặt lược tạo lỗ khuơn ðể khuơn ở nhiệt độ phịng Lấy các tube 0.5ml chứa các sản phẩm PCR đánh số thứ tự cho vào mỗi tube 4µl loading Dye X6, đảo đều và spin trong 5 giây

Tiến hành: Sau 30 giây để khuơn ở nhiệt độ phịng thì tiến hành rút lược ðặt

cả khay khuơn gel vào bể điện di, đổ dung dịch đệm TAE1X phủ ngập gel Nhỏ mẫu vào giếng: dùng pipet hút 7 – 10µl dung dịch mẫu cần chẩn đốn cho vào mỗi giếng theo thứ tự Ngồi các mẫu chạy PCR cịn nhỏ thêm 1 giếng marker làm chuẩn Cắm nguồn điện cho máy điện di ðặt ở hiệu điện thế 100V trong 25’, tắt máy điện di, đặt bản gel được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại Quan sát các vệt DNA hiện lên và chụp ảnh

3.3.5.4 Xác định các mẫu nấm bằng giải trình tự vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) của RNA ribosome

Nguồn nấm

Các mẫu nấm được nuơi cấy thuần trên mơi trường PDA trước khi phân tích

Lựa chọn vùng gen nghiên cứu

Hiện nay, vùng liên gien ITS (internally transcribed spacers) của cụm gen rDNA là một trong các vùng gen phổ biến nhất để nghiên cứu đa dạng và xác định nhiều lồi nấm Các rDNA của nấm được tổ chức thành các đơn vị phiên mã Mỗi

ñơn vị phiên mã có thể ñược lặp lại nhiều lần trên bộ genome Về cấu trúc, ở sinh vật nhân thật, các ñơn vị phiên mã thường lặp lại nhiều lần và kề nhau thành các

cụm ñơn vị phiên mã Một ñơn vị phiên mã gồm các gen xếp theo thứ tự là 5.8S-28S Xung quanh vùng gen 5.8S là 2 vùng ITS ký hiệu là ITS1 ở ñầu 5’ và

18S-ITS2 ở ñầu 3’ (Hình 2.1 )

Hình 2.1 Sơ ñồ minh họa các cụm gen ITS của sinh vật nhân thật

Vùng ITS1 và ITS2 ñược chỉ bằng mũi tên

PCR và giải trình tự

DNA ñược chiết từ các mẫu nấm nuôi cấy trên môi trường theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) của Doyle & Doyle (1987) DNA ñược hòa trong 50 uL ñệm TE và bảo quản ở -20 OC

Hai mồi ITS4 và ITS5 (White et al., 1990) ñã ñược sử dụng ñể nhân toàn bộ vùng ITS của các mẫu nấm

Phản ứng PCR ñược thực hiện với DreamTaq Polymerase của hãng Fermentas với nhiệt ñộ gắn mồi ở 54 OC

Sản phẩm PCR ñược tinh chiết từ gel agarose dùng kít tinh chiết PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sản phẩm PCR ñược giải trình tự trực tiếp 1 chiều dùng mồi PCR tại Công ty Microgen (Hàn Quốc) Trình tự nucleotide ñược biên tập và lắp ráp dùng phần mềm Seqman (DNASTAR, LaserGene)

Phân tích trình tự

Dựa trên các trình tự thu ñược, việc tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu Genbank bằng dùng phần mềm trực tuyến BLAST tại NCBI (the National Center for

Biotechnology Information)

Phân tích trình tự ñược thực hiện dùng các phầm mềm ClustalX và MEGA5.1

3.3.6 Phương pháp bố trí thí nghiệm ñánh giá hiệu quả sử dụng chế phẩm Moldtex trong phòng chống nấm trên môi trường PDA và trên TACN D42

3.3.6.1 Khảo sát hiệu quả của chế phẩm Moldtex ñến sự phát triển của nấm Aspergillus flavus trên môi trường PDA

Loài nấm phân lập ñược từ mẫu TACN lợn D42 bị nhiễm nấm có tần suất nhiễm cao nhất ñược sử dụng ñể ñánh giá hiệu quả của chế phẩm Moldtex ñến sự phát triển của nấm trên môi trường PDA

Thí nghiệm sử dụng chế phẩm Moldtex (sản phẩm của công ty TNHH Linqtex) có nồng ñộ khuyến cáo là 500 – 1000 ppb Sử dụng 5 công thức ñể nghiên

cứu, mỗi công thức ñược tương ứng với các nồng ñộ Moldtex là:

Khi nhiệt ñộ của môi trường ñạt 50-550C thì ta bổ sung chế phẩm Moldtex với các nồng ñộ (theo các công thức trên) vào, khuấy ñều ñể cho chế phẩm tan hết trong môi trường Sau ñó ñổ môi trường ra ñĩa petri và ñậy nắp lại Khi môi trường

ñã nguội, ta lấy nguồn nấm thuần Aspergillus flavus cấy trên môi trường PDA ñã

pha chế phẩm Mỗi thí nghiệm làm lại 3 lần, mỗi lần làm 3 ñĩa petri Còn mẫu ñối chứng ta cấy nấm thuần trên môi trường PDA không xử lý chế phẩm

Dùng que cấy sau khi ñã khử trùng trên ngọn lửa ñèn cồn, lấy nguồn nấm thuần tại mép tản nấm ñang phát triển (khoảng 2 - 3 ngày), ñặt vào giữa ñĩa môi trường có chứa thuốc Các ñĩa môi trường ñể trong tủ ấm ở nhiệt ñộ, ánh sáng thích hợp Theo dõi mỗi ngày bằng cách ño 2 ñường kính tản nấm (vuông góc với nhau) của mỗi ñĩa

- Chỉ tiêu theo dõi: Khả năng phòng trừ nấm hại của chế phẩm Moldtex ñược ñánh giá sau 4 ngày nuôi cấy :

+ Màu sắc của tản nấm trên môi trường

+ Kích thước của tản nấm trên môi trường

+ Số lượng tản nấm trên môi trường ñã xử lý hóa chất

3.4.6.2 Khảo sát hiệu quả của chế phẩm Moldtex ñến sự phát triển của nấm Aspergillus flavus trên TACN lợn D42

ðể nghiên cứu ñánh giá hiệu quả của chế phẩm Moldtex trong phòng chống nấm trên TACN lợn D42, các thí nghiệm cụ thể ñược bố trí tương ứng như sau: xử

lý chế phẩm vào TACN, xử lý chế phẩm ñối với TACN sau khi nhiễm bào tử nấm

Aspergillus flavus, xử lý chế phẩm ñối với TACN trước khi nhiễm bào tử nấm Aspergillus flavus

* TN1: Xử lý chế phẩm vào TACN (không lây nhiễm nấm Aspergillus flavus)

Thức ăn chăn nuôi sau khi sản xuất

Theo dõi sau 7 ngày

Thức ăn ñã xử lý (15- 20s)

Nhận xét, ñánh giá Chế phẩm Moldtex

ðặt ẩm trên giấy thấm

Thức ăn chăn nuôi sau khi sản xuất xong ñược xử lý chế phẩm theo các nồng

ñộ khác nhau Thí nghiệm ñược bố trí theo các công thức như sau:

- CT6: 0 ppm (công thức ñối chứng, không xử lý chế phẩm)

Mức ñộ nhiễm bệnh trên TACN D42 ñược ñánh giá gồm:

* TN2: Xử lý chế phẩm ñối với TACN sau khi nhiễm bào tử nấm Aspergillus flavus (hiệu quả chống nấm)

TACN sau khi sản xuất ñược lây nhiễm nhân tạo với nấm Aspergillus flavus

Các viên TACN ở tất cả các công thức ñược lây nhiễm bằng cách nhúng vào dung dịch bào tử nấm (nồng ñộ 108CFU/ml) Sau khi nhúng, vớt các viên TACN ra ngoài

và ñể khô ở nhiệt ñộ phòng Tiếp theo, ta xử lý bằng chế phẩm Moldtex theo các công thức với các nồng ñộ khác nhau (15- 20s)

- CT10: 0 ppm (công thức ñối chứng, không xử lý hóa chất)

Thức ăn chăn nuôi

Thức ăn ñã xử lý (15- 20s)

kiểm tra nấm bệnh theo phương pháp giấy thấm Mỗi công thức gồm 100 viên ñược nhắc lại 3 lần

Mức ñộ nhiễm bệnh trên TACN D42 ñược ñánh giá gồm:

Thức ăn chăn nuôi

Theo dõi sau 7 ngày

Thức ăn ñã xử lý (15- 20s)