Nghiên cứu thu nhận và xác định một số đặc tính enzyme chitosanase từ vi khuẩn bacillus licheniformis VKNN1

2.5 Thu nhận và tinh sạch enzyme chitosanase 15 2.5.1 Nguồn thu nhận enzyme chitosanase ñã ñược dùng trong sản xuất 2.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến khả năng sinh tổng hợp chitosanase 17 2

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề ñược sử dụng

Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này ñã ñược ghi rõ nguồn gốc

Hà nội, ngày 12 tháng 06 năm 2014

Học viên

Bùi Thị Hường

Tôi xin cảm ơn sự giúp ñỡ của các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Thực phẩm, khoa Công nghệ sinh học ñã tạo ñiều kiện thuận lợi trong quá trình tôi thực hiện ñề tài tốt nghiệp

ðặc biệt, con xin bày tỏ tình cảm sâu sắc nhất ñến bố mẹ và những người thân trong trong gia ñình ñã luôn luôn quan tâm, lo lắng và tạo ñiều kiện tốt nhất cho con trong quá trình học tập, ñể con hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này

Mặc dù ñã rất cố gắng nhưng bản luận văn này không tránh khỏi những thiếu sót và hạn chế Vì vậy, tôi kính mong nhận ñược sự quan tâm và ñóng góp ý kiến của quý thầy cô ñể bản luận văn này ñược hoàn thiện hơn

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, ngày 12 tháng 06 năm 2014

Học viên

Bùi Thị Hường

2.2.2 Dựa vào sự phân cắt ñặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase 5

2.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ và pH tới sự hoạt ñộng của enzyme

2.3.5 Ảnh hưởng của ion kim loại và các chất phản ứng khác tới sự hoạt

2.4 Ứng dụng của enzyme chitosanase và chitosan oligosaccharide 12

2.5 Thu nhận và tinh sạch enzyme chitosanase 15

2.5.1 Nguồn thu nhận enzyme chitosanase ñã ñược dùng trong sản xuất

2.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến khả năng sinh tổng hợp chitosanase 17

2.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme chitosanase 20

2.6.1 Tình hình nghiên cứu enzyme chitosanase trên thế giới 20

3.4.2 Xác ñịnh hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford 32

3.4.4 Phân chia protein bằng phương pháp sắc ký trao ñổi ion trên cột

4.1 Xác ñịnh ñiều kiện nuôi cấy tối ưu vi khuẩn Bacillus licheniformis

VKNN1 sinh tổng hợp cao chitosanase 34

4.1.2 Mô hình hóa và tối ưu hóa quá trình nuôi cấy từ vi khuẩn Bacillus

4.1.4 Xác ñịnh ñường cong ñộng học sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus

4.2 Xác ñịnh ñiều kiện thu nhận và tinh sạch chitosanase từ vi khuẩn

4.2.1 Tủa phân ñoạn enzyme chitosanase bằng muối amoni sunphate 43

4.2.2 Phân chia enzyme chitosanase bằng phương pháp sắc ký trao ñổi ion 44

4.3 Xác ñịnh một số ñặc tính chitosanase thu nhận từ vi khuẩn Bacillus

4.3.3 Ảnh hưởng pH và nhiệt ñộ ñến ñộ bền của enzyme chitosanase 47

4.3.3 Ảnh hưởng của một số ion kim loại ñến hoạt tính của enzyme

DANH MỤC BẢNG

2.2 Phân loại Chitosanase dựa vào sự phân cắt ñặc hiệu của cơ chất 5

2.4 Cơ chất ñặc hiệu của enzyme chitosanase từ Bacillus sp KCTC

4.5 Hoạt tính, hàm lượng protein và hoạt tính riêng của enzyme

4.6 Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme chitosanase phân chia 45

4.6 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ tới hoạt tính xúc tác của enzyme chitosanase 46

4.7 Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính của enzyme chitosanase 47

4.9 Ảnh hưởng của các ion kim loại ñến hoạt tính enzyme chitosanase 49

DANH MỤC HÌNH

2.1 Cấu trúc protein 3D của enzyme chitosanase thu ñược từ

4.1 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase từ vi

4.2 Ảnh hưởng của pH tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase từ vi khuẩn

4.3 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan tới quá trình sinh tổng hợp

4.4 Ảnh hưởng của các yếu tố nghiên cứu ñến hoạt tính chitosanase 39

4.6 ðường cong sinh trưởng và hoạt tính chitosanase của vi khuẩn

4.9 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ và pH ñến ñộ bền của enzyme chitosanase 48

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CHOS Chitosan Oligosaccharide

DA Degree of deacetylation

DP Degree of polymerization DNS Acid dinitro salisylic DEAE Diethylaminoethyl

GlcN D – Glucosamine GlcNAc N-acetyl-D-Glucosamine

PHẦN 1 MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Công nghệ enzyme là một trong bốn bộ phận của công nghệ sinh học Trong

một vài thập kỷ gần ñây việc nghiên cứu và ứng dụng của enzyme ngày càng ñược

quan tâm và chú trọng Công nghệ enzyme ñã từng bước làm thay ñổi và nâng cao

chất lượng của một số quá trình công nghệ sản xuất các sản phẩm có chất lượng

trong chế biến thực phẩm cũng như trong nông nghiệp, dược phẩm, y tế

Hàng năm lượng enzyme ñược sản xuất ra trên thế giới ñạt khoảng trên

300,000 tấn với trị giá trên 500 triệu USD và ñược phân bố trên các lĩnh vực khác

nhau Tuy nhiên việc nghiên cứu tìm kiếm các loại enzyme mới, và nghiên cứu các

ñặc ñiểm, tính chất, ứng dụng nó luôn là mục tiêu của các nhà khoa học Một trong

số các enzyme ñó là enzyme chitosanase

Chitosanase là một enzyme ngoại bào thủy phân liên kết nội phân tử cơ chất

chitosan Enzyme chitosanase ñược ứng dụng chủ yếu ñể sản xuất ra Chitosan

Oligosaccharides (CHOS)

Chitosan có nhiều ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp,

nông nghiệp, thực phẩm, mỹ phẩm, xử l í nước thải và bảo vệ môi trường… CHOS

ñược ứng dụng giống chitosan nhưng do ñặc tính dễ hòa tan trong nước mà CHOS

ñược ứng dụng nhiều trong y học và dược phẩm: CHOS giúp kích thích tiêu hóa

thức ăn, tăng tính thèm ăn ở vật nuôi, tăng cường sức ñề kháng, tăng khả năng miễn

dịch, ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư… [8, 48] Enzyme chitosanase có thể thu nhận ñược từ nhiều nguồn khác nhau như vi

khuẩn, nấm, hay một số thực vật…Nhưng enzyme thu nhận từ vi khuẩn thường có

hoạt tính cao hơn cả Hơn nữa, các vi sinh vật này lại có khả năng sinh sản, phát triển

với một tốc ñộ cực kỳ lớn, do ñó cho phép thu ñược một lượng enzyme trong thời gian

ngắn một cách dễ dàng Mặt khác, môi trường nuôi cấy lại dễ kiếm, rẻ tiền

Trong các loại vi sinh vật thu nhận enzyme chitosanase ñược sử dụng hiện

nay, thì vi khuẩn Bacillus licheniformis có ưu ñiểm là sẵn có và chưa ñược khai thác

nhiều trong các nghiên cứu trước ñây ở Việt Nam

Trên thế giới cũng ñã có khá nhiều ñề tài nghiên cứu về enzyme chitosanase ñược tổng hợp từ các loài vi sinh vật Tuy nhiên, ở Việt Nam cho ñến thời ñiểm này, những nghiên cứu về chitosanase và các loài vi sinh vật sản sinh ra nó còn rất hạn chế Chính vì những lí do ñó, ñể góp phần vào việc nghiên cứu và ứng dụng

chitosanase, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu thu nhận và xác

ñịnh một số ñặc tính enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1”

1.2 Mục ñích – yêu cầu

1.2.1 Mục ñích

Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1

ñể tổng hợp enzyme chitosanase, bước ñầu làm sạch và xác ñịnh một số ñặc tính của enzyme này

1.2.2 Yêu cầu

- Xác ñịnh ñược các ñiều kiện nuôi cấy và xây dựng ñược quy trình nuôi cấy

tối ưu vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 có khả năng sinh tổng hợp enzyme

chitosanase cao

- Xác ñịnh ñược ñiều kiện thu nhận enzyme chitosanase thô từ vi khuẩn

Bacillus licheniformis VKNN1 ñã chọn ñể thu nhận enzyme chitosanase chế phẩm

- Xác ñịnh ñược một số ñặc tính của enzyme chitosanase thu nhận từ vi

khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Khái niệm về enzyme chitosanase

Enzyme chitosanase có tên gọi ñầy ñủ theo danh pháp quốc tế là: Chitosan N–acetylglucosaminohydrolase

Chitosanase (EC 3.2.1.132) là enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân chitosan bắng cách cắt ñứt liên kết β–1,4–glucoside trừ liên kết giữa các N–acetyl–D–glucosamine (GlcNAc–GlcNAc) và giải phóng ra các Chitosan oligosaccharide

Hoạt tính của chế phẩm enzyme ñặc trưng cho khả năng xúc tác phân giải chitosan thành các COS có phân tử thấp hơn Hoạt tính chitosanase ñược biểu thị bằng số ñơn vị hoạt tính trong 1ml (hay 1g) chế phẩm [43]

2.2 Phân loại enzyme chitosanase

2.2.1 Dựa vào sự tương ñồng của chuỗi amino acid

Dưới ñây là một số vị trí tác dụng của enzym chitosanase ñã tìm thấy ñược

Bảng 2.1: Các chủng vi sinh vật ñại diện cho mỗi họ enzyme

Họ

chitosanase

Các chủng vi sinh vật sinh chitosanase ñặc trưng cho mỗi

họ

Những ñiều lưu ý

Họ 5 Streptomyces griseus HUT 6037

Các chitosanase của nhóm này còn có khả năng xúc tác phản ứng vận chuyển nhóm glycoside, ngoài ra còn thủy phân ñược cả carboxymethylcellulose (CMC)

họ 80 này có những trình tự bảo thủ như của enzyme chitosanase thuộc họ 40

Nguồn: [44]

2.2.2 Dựa vào sự phân cắt ñặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase

Chitosanase có khả năng nhận dạng liên kết ñặc trưng trong chuỗi chitosan ñể tiến hành phân cắt Vị trí ñó là liên kết β–1,4 glucoside giữa các phân tử D–Glucosamine hoặc giữa D–Glucosamine và N–acetyl–D–Glucosamine

Tuy nhiên không phải bất kỳ enzyme chitosanase nào cũng tấn công vào bất

kỳ vị trí liên kết này, mà có một số chitosanase chỉ có khả năng tấn công vào vị trí β–1,4 glucoside giữa hai D–Glucosamine, còn một số chitosanase lại có khả năng tấn công vào liên kết này giữa hai D–Glucosamine và giữa D–Glucosamine với phần N–acetyl–D–Glucosamine còn lại Dưới ñây là một số vị trí tác dụng của

enzym chitosanase ñã tìm thấy ñược chia theo họ

Các liên kết ñặc hiệu cho nhận của các enzyme chitinolytic và chitosanolytic

ñã ñược ñiều tra bằng cách sử dụng cơ chất thông thường là acetylated chitosan 20–30%

Dựa theo sự phân cắt ñặc hiệu của cơ chất chitosanase thì enzyme chitosanase ñược phân thành ba loại khác biệt theo ñề nghị của Fukamizo và CS [ 12]

Bảng 2.2: Phân loại Chitosanase dựa vào sự phân cắt ñặc hiệu của cơ chất

Chitosanase loại I: Bao gồm các enzyme chitosanase cắt các liên kết GlcNAc–GLcN và GlcN–GlcN

Chitosanase loại II: Bao gồm các enzyme chitosanase cắt các liên kết GlcN–GLcN

Chitosanase loại III: Bao gồm các enzyme chitosanase cắt các liên kết GlcN–GLcNAc và GlcN–GlcN

2.3 Một số ñặc tính của enzyme chitosanase

2.3.1 Cấu tạo và khối lượng phân tử enzyme chitosanase

Chitosanase hầu hết là các enzyme ngoại bào, có cấu tạo ñơn phân tử, thủy phân liên kết β–1,4 glucoside giữa gốc Glucosamine và N–acetyl–D–glucosamine trong chuỗi N–acetylate Chitosan Chitosanase có khả năng tấn công chitosan nhưng không có khả năng tấn công chitin

Hình 2.1: Cấu trúc protein 3D của enzyme chitosanase

thu ñược từ Streptomyces sp.174

Chitosanase cũng giống như mọi enzyme khác ñều có bản chất là protein Chúng có khối lượng phân tử khoảng từ 30–70kDa và kích thước mỗi loại enzyme chitosanase thu ñược từ các nguồn khác nhau thì khác nhau Khối lượng phân tử của enzyme chitosanase thu ñược từ một số loài vi sinh vật khác nhau ñược trình bày ở bảng 2.3

Bảng 2.3: Khối lượng phân tử của một số enzyme chitosanase

Chitosanase Khối lượng phân tử

2.3.2 Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase

Fukamizo và cs (1999) ñã xác ñịnh ñược các sản phẩm dị vòng thu ñược từ quá trình thuỷ phân chitosan ñều là dạng α, ñiều ñó cho thấy rằng chitosanase là một enzyme chuyển hoá

Cùng với những kết quả thu ñược khi quan sát dạng tinh thể học và các vùng biến ñổi cho phép chúng ta kết luận rằng ñầu Glu22 hoạt ñộng như là nơi cho proton, trong khi ñầu Asp4 hoạt hoá 1 phân tử nước sau ñó tấn công vào vị trí C–1 của phân tử ñường khử tại vị trí xúc tác

Cơ chế chuyển hoá này ñược duy trì liên tục trên thực tế là nhờ 2 ñầu xúc tác có

khoảng cách 13.8Å, cao hơn những enzyme chuyển hoá khác gần 10Å [12]

Cơ chế xúc tác của chitosanase ñược thể hiện trong hình sau:

Hình 2.2: Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase

Sản phẩm phản ứng của enzyme chitosanase ñược nghiên cứu bằng cách sử dụng dung dịch chitosan và một vài CHOS làm cơ chất Phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC) (thin–layer chromatography) cho thấy rằng enzyme chitosanase ñã giải phóng ra CHOS từ chitosan, phần lớn là các CHOS dài hơn (GlcN)2 bằng cách phân cắt nội phân tử Enzyme này không thể thuỷ phân ñược (GlcN)2 hoặc (GlcN)3 Còn (GlcN)4 và (GlcN)5 thì bền với hoạt tính xúc tác của enzyme này Tuy nhiên, chitosan oligosaccharide (GlcN)6 và (GlcN)7ñược thuỷ phân hoàn toàn sau 15h ủ (GlcN)6 chủ yếu ñược phân cắt thành (GlcN)3 + (GlcN)3 và (GlcN)2 + (GlcN)4 nhưng (GlcN)2 + (GlcN)4 thì ít hơn nhiều [Rồi sau ñó, (GlcN)4 → (GlcN)2 + (GlcN)2] Nó cũng cho thấy rằng (GlcN)7 ñược phân cắt thành (GlcN)3 + (GlcN)4 Kết quả này chỉ ra rằng ñể phản ứng xảy ra nhanh, cơ chất chitosan nên

có chiều dài chuỗi phân tử bằng hoặc dài hơn (GlcN)6, sự phân cắt liên kết glycoside xảy

ra tốt nhất tại trung tâm của mối liên kết hexameric và sinh ra (GlcN)3 là sản phẩm chủ yếu Thực tế, enzyme chitosanase thể hiện hoạt tính ñối với chitosan cao hơn so với các oligosaccharide mạch ngắn hơn [43]

2.3.3 Tính ñặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase

Trong số các cơ chất ñược thử nghiệm như: Chitosan, CHOS, dịch keo chitin, carboxymethyl cellulose (CMC) và peptidoglucan thì enzyme chitosanase thường thể hiện

hoạt tính cao nhất ñối với cơ chất chitosan hoà tan (Bảng 2.4)

Mặc dù ñã kéo dài phản ứng enzyme qua ñêm nhưng nó vẫn không thể thuỷ phân ñược (GlcNAc)6, chitin tinh thể và peptidoglycan nhưng nó lại có khả năng thuỷ phân ñược dung dịch keo chitin và CMC ðộ bền của (GlcNAc)6 ñối với hoạt ñộng của enzyme

chitosanase cho thấy rằng enzyme này không có hoạt tính chitinase Hoạt tính chitinase là khả năng phân cắt liên kết β–1,4 giữa GlcNAc – GlcNAc Hoạt tính nhỏ ñối với cơ chất keo chitin có thể ñược giải thích là do enzyme chitosanase phân cắt β–1,4 của GlcN – GlcN, GlcN – GlcNAc và GlcNAc – GlcN, chúng ñược tìm thấy trong dung dịch keo chitin với DDA 10%

Bảng 2.4: Cơ chất ñặc hiệu của enzyme chitosanase

từ Bacillus sp KCTC 0377BP

Chitosan oligosaccharide

Chitobiose………

Chitotriose………

Chitotetraose………

Chitopentaose………

Chitohexaose………

Chitoheptaose………

– – 15.0 16.8 20.0 23.8

Nguồn: [38]

Như ñã nói ở trên, chitosan có tính ña dạng hoá học trong DDA của chúng Tính ña dạng của chitosan có thể tác ñộng ñến tính nhạy cảm của enzyme chitosanase Khi hoạt tính tương ñối của chitosanase ñối với cơ chất chitosan ñược thử nghiệm với các mức ñộ DDA khác nhau, người ta nhận thấy hoạt tính của chitosanase tăng lên cùng với sự tăng của giá trị DDA của chitosan

2.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ và pH tới sự hoạt ñộng của enzyme chitosanase

Nhìn chung, vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác thường tăng lên theo nhiệt ñộ nhưng chỉ tăng lên trong một giới hạn xác ñịnh mà ở ñó phân tử enzyme vẫn còn bền và chưa bị biến tính Nhiệt ñộ thích hợp cho sự hoạt ñộng của mỗi enzyme thường tương ñối rộng ðối với chitosanase, người ta ñã nghiên cứu và cho thấy rằng chúng có thể hoạt ñộng

trong khoảng 30 – 700C và ña số ñều hoạt ñộng tốt nhất trong khoảng nhiệt ñộ 50 – 600C Nhưng nhiệt ñộ mà ứng với hoạt tính enzyme cao nhất thường chỉ tồn tại một ñiểm và nhiệt ñộ ñó là nhiệt ñộ tối ưu của enzyme (topt) Nhiệt ñộ tối ưu của chitosanase thu ñược từ các nguồn khác nhau thì cũng khác nhau và topt thường không cố ñịnh mà có thể thay ñổi tuỳ theo cơ chất, pH môi trường, thời gian phản ứng…

– ðộ bền pH và pH tối ưu cho sự hoạt ñộng của enzyme chitosanase

Giá trị pH của môi trường ảnh hưởng rõ rệt ñến phản ứng enzyme vì nó ảnh

hưởng ñến mức ñộ ion hoá cơ chất, enzyme và ñộ bền của protein enzyme ða số các enzyme bền trong giới hạn pH giữa 5 ñến 9 ðối với enzyme chitosanase, pH thích hợp cho hoạt ñộng của chúng thường vào khoảng 4.0 – 8.0 Tuy nhiên, pH tối ưu (pHopt) cho hoạt ñộng của chitosanase thu ñược từ các nguồn khác nhau là khác nhau

Bảng 2.5: Nhiệt ñộ và pH tối ưu cho hoạt ñộng của chitosanase thu ñược

Bảng 2.6: So sánh ñặc tính của một số enzyme chitosanase ñược sản xuất từ vi sinh vật

Vi sinh vật

Khối lượng phân tử (kDa) a

Kiểu hoạt ñộng (b)

pH opt

Hoạt tính riêng (U/mg)

Cơ chất ñặc hiệu (%DDA)

Sản phẩm cuối cùng( c)

Nguồn: [43]

Chú thích:

(a)

ðược xác ñịnh bằng phương pháp ñiện di trên gel polyacrylamide (SDS – PAGE)

(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) với enzyme tinh sạch

(b)

Exo: kiểu phân cắt ngoài; Endo: kiểu phân cắt trong

(c) Sản phẩm cuối cùng khi sử dụng chitosan làm cơ chất

(d)

ND (not determined): không xác ñịnh ñược

2.4 Ứng dụng của enzyme chitosanase và chitosan oligosaccharide

2.4.1 Ứng dụng của enzyme chitosanase

Cho ñến nay, ứng dụng lớn nhất và chủ yếu nhất của enzyme chitosanase là ñể sản xuất CHOS từ chitosan Sản xuất CHOS từ chitosan bằng phương pháp enzyme có những

ưu ñiểm vượt trội so với phương pháp hoá học Phương pháp enzyme là phương pháp sản xuất rất nhanh chóng, rẻ tiền, mang lại lợi ích kinh tế rất lớn, do enzyme chitosanase ñược phân lập từ những nguồn vi sinh vật rất phong phú trong tự nhiên

Hơn nữa, nếu kiểm soát ñược sự hoạt ñộng của enzyme chitosanase (nhiệt ñộ, pH, thời gian…) sẽ tạo ra ñược các chitosan oligosaccharide theo mong muốn ðiều này có ý nghĩa quan trọng khi sản xuất CHOS ở quy mô công nghiệp Từ ñó, CHOS với những ñặc tính

ưu việt ñược ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như ñã trình bày ở trên [20]

2.4.2 Ứng dụng của CHOS

Chitosan Oligosaccharide (CHOS) là sản phẩm thủy phân chitosan, nó có khả năng tan ñược trong nước Tên hóa học 2–amino–A–1,4–glucose polymer và công thức phân tử (C6H11O4N)n£ CHOS là một loại Oligosaccharide thu ñược từ sản phẩm thủy phân chitin hoặc chitosan bằng hóa chất hay enzyme Phương pháp hóa học sử dụng acid thủy phân cho năng suất thấp lại tốn kém nên phương pháp ñược sử dụng chủ yếu là enzyme chitosanase Enzyme chitosanase phân cắt liên kết β–1,4–glycoside của chitosan tạo ra CHOS Do ñó cấu tạo của CHOS là một chuỗi phân tử ñược cấu tạo bởi một số ñơn vị D–glucosamine (GlcN) (thường là từ 2 ñến

10 ñơn vị GlcN) Chiều dài chuỗi phân tử và mức ñộ deacetyl (DDA) ñược coi là 2 yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng ñến hoạt tính sinh học của CHOS CHOS dài hơn hexamer có khả năng ức chế vi sinh vật, chống ưng thư, tăng cường miễn dịch tốt hơn so với các CHOS ngắn Sự tăng mức ñộ deacetyl làm tăng hoạt tính sinh học của CHOS Bởi vậy, kiểm soát chặt chẽ chiều dài chuỗi phân tử và DDA là ñiều kiện tiên quyết ñể sản xuất CHOS có giá trị cao [18]

2.4.2.1 Sản phẩm Prebiotic

Choi et al (2006) cũng nghiên cứu sử dụng CHOS vào sữa cho thấy CHOS có thể sử dụng trong các sản phẩm sữa thương mại có lợi cho sức khỏe mà rất ít ảnh

hưởng tới các ñặc tính vật lý và cảm quan của sản phẩm

CHOS là chất có khả năng ngăn chặn sự tích lũy các chất béo bên trong các

cơ quan cỏ thể sinh vật, ñặc biệt là ở trong thận của những người sau khi uống rượu Quan trọng hơn CHOS ngăn chặn những tác ñộng xấu của rượu lên gan ngăn chặn những ảnh hưởng xấu ñến các bệnh về gan cho những người nghiện rượu

Không giống với chitosan, CHOS dễ ñồng hóa bên trong cỏ thể và bên cạnh

ñó nó có thể làm tăng sự ñồng hóa của một số nguyên tố vi lượng như sắt, Canxi, Ứng dụng của Oligosaccharide cho phép giải quyết một số vấn ñề về dinh dưỡng liên quan ñến thiếu hụt một số nguyên tố vi lượng Nó loại bỏ một cách hoàn toàn Cholesterol và lipoprotein mật ñộ thấp từ mạch máu Bởi vậy việc bổ sung CHOS vào cơ thể của các bệnh nhân bị bệnh béo phì thì có kết quả tốt CHOS là cation dương vì vậy nó có thể liên kết với các ion Clcó trong mạch máu rồi thải ra ngoài làm giảm huyết áp

CHOS có nhiều ñặc ñiểm nổi bật hơn so với chitin và chitosan Tỉ lệ hấp thụ Chitosan Oligosaccharide trong cơ thể người là 100%, hoạt tính và chức năng sinh học của nó cao hơn chitosan rất nhiều Do vậy nên ñưa vào cơ thể hàng ngày ñể duy trì sức khỏe

CHOS còn có thể sử dụng ñể ức chế sự tiêu hóa các chất béo và nó ñóng vai trò như một tác nhân vận chuyển và nó ñược sử dụng như là tác nhân làm giảm Cholesterol CHOS phá vỡ khối mỡ thể hiện là nó có thể cản trở sự hấp thụ chất béo bằng cánh tạo keo với chất béo trong ruột non

Có nhiều nghiên cứu ñã chứng minh CHOS có chức năng tăng cường hệ thống miễn dịch, ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư, tạo thành các kháng thể trong gan và lá lách, kích thích sự tiêu hóa Canxi và các chất khoáng, kích thích sản sinh ra các tế bào vi khuẩn có thể chữa bệnh như: Vi khuẩn lactic, làm giảm chất béo trong máu, giảm huyết áp và lượng ñường trong máu, ñiều chỉnh Cholesterol, giảm cân và ngăn ngừa các bệnh ở người trưởng thành Ngoài ra CHOS còn ñược ứng dụng ñể cầm máu, chữa bỏng da, băng bó vết thương [16]

2.4.2.2 Trong công nghệ thực phẩm

CHOS ñược dùng trong các quá trình xử l í sản phẩm, ñể bảo quản rau quả, một số loại trái cây tươi (cà chua, dâu tây, cam, bưởi ) Tạo gel, tạo ñộ mịn, bề dày cho sản phẩm, ñặc biệt hơn CHOS có thể hút nước trong các sản phẩm nhằm tránh một số quá trình lên men xảy ra trong khi bảo quản Màng mỏng chitosan trên bề mặt có tác dụng ức chế hô hấp, giữ lại khí cacbonic, giảm thiểu lượng ethylene, diệt ñược một số loại nấm và kìm hãm quá trình biến màu của quả trong khi bảo quản, vận chuyển tiêu thụ

Nghiên cứu của Wenshui & Xia (2010) cũng sử dụng CHOS trong bảo quản nước táo ñã kéo dài thời gian bảo quản ở 370C từ 9 ngày ñến 70 ngày với nồng ñộ CHOS là 4g/l [22]

Chitosan tạo ra bột Chitofood thay thế hàn the ñộc hại nhưng ñảm bảo sản phẩm vẫn dai, ngon Phụ gia này ñược dùng trong chế biến bảo quản các sản phẩm

từ nhóm thịt (giò, chả, thịt hộp, nem), thực phẩm tươi sống, thịt nguội, ñồ uống, nước giải khát, sản phẩm sữa

CHOS là chất dinh dưỡng có lợi cho sức khỏe những nghiên cứu ñã cho thấy rằng CHOS có khả năng liên kết với các chất béo và cholesterol, làm giảm cholesterol trong máu có tác dụng tốt ñối với những người bị cao huyết áp, những người béo CHOS có cấu trúc dạng sợi và có các thuộc tính giống như các cấu trúc dạng sợi như Cellulose nên có thể dùng cho những người ăn kiêng, thay thế thức ăn chứa nhiều calo

Sử dụng bao bì làm từ chitosan ñể bảo quản thực phẩm Từ trước ñến nay, việc bảo quản các loại thực phẩm tươi sống giàu ñạm, dễ hư hỏng như thịt, cá trong ñiều kiện khí hậu nóng ẩm của nước ta là một trong những vấn ñề ñã và ñang ñược các nhà sản xuất, chế biến và các nhà khoa học quan tâm, nên sau khi vỏ bọc chitosan

từ vỏ tôm ñược hoàn thành, các nhà nghiên cứu ñã nghĩ ngay ñến việc dùng màng bọc chitosan từ vỏ tôm nay ñể làm vỏ bọc xúc xích ñể có tác dụng kéo dài thời gian

sử dụng mà không ñộc hại, an toàn cho người sử dụng, không làm mất màu, mùi vị dặc trưng của nguyên liệu xúc xích

2.4.2.3 Trong nông nghiệp

CHOS ñược sản xuất dưới hai dạng rắn và lỏng Trong thành phần của nó chứa Cacbon và giàu Nitơ vì vậy nó trở thành nguồn cung cấp các chất này cho cây trồng Nó có thể ñược dùng như một chất kích thích sinh trưởng ñược bón cho cây trồng ñể cải thiện lượng rau, hoa, quả và nó có thể ngăn chặn sự nhiễm sâu bệnh, sinh ra các chất kháng khuẩn trong ñất và làm phân bón sinh học Sản xuất phân bón và chất trừ sâu sinh học từ CHOS ñang là lĩnh vực mới mẻ trong tương lai Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên tố vi lượng lên một số chỉ tiêu sinh lí, sinh hóa của mạ ở nhiệt ñộ thấp, kết quả cho thấy hàm lượng diệp lục tổng số và hàm lượng nitơ tăng, ñồng thời các enzyme như amylase, catalase, peroxidase cũng tăng lên và chitosan còn góp phần cải tạo ñất khô cằn, bạc màu, giữ ẩm cho cây trồng [47]

2.5 Thu nhận và tinh sạch enzyme chitosanase

2.5.1 Nguồn thu nhận enzyme chitosanase ñã ñược dùng trong sản xuất chitosanase

Enzyme chitosanase ñược tìm thấy từ nhiều loài sinh vật khác nhau Người ta thường thu nhận enzyme chitosanase từ các loài vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, virus,

xạ khuẩn), tế bào thực vật (lúa, ñại mạch nảy mầm, chè, ñu ñủ, ñậu tương, thầu dầu…), tế bào ñộng vật (dạ dày, tụy tạng, tim, gan…).Tuy nhiên, hiện nay nguồn cung cấp enzyme chitosanase chủ yếu là từ vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm Nguồn vi sinh vật này chủ yếu ñược phân lập từ ñất, nơi có xác của các loài giáp xác (tôm, cua…) phân hủy Dựa theo nguyên tắc ở ñâu có cơ chất, thì ở ñó có vi sinh vật phân giải cơ chất ñó

2.5.2 Vi khuẩn Bacillus licheniformis

2.5.2.1 ðặc ñiểm hình thái của vi khuẩn Bacillus licheniformis

Vi khuẩn Bacillus licheniformis là trực khuẩn gram dương, sinh bào tử hình ô van

không phình, thuộc nhóm hai theo phân loại của Pries và CS [45] Các tế bào vi khuẩn này ñứng riêng rẽ hoặc có thể sắp xếp với nhau tạo thành chuỗi Tế bào vi khuẩn ngắn, nhỏ có

thể thay ñổi tùy theo chuỗi từ 1 – 5µm, ñuờng kính từ 0.5 – 1µm

2.5.2.2 ðặc ñiểm sinh lý hóa sinh của vi khuẩn Bacillus licheniformis

Trong tự nhiên có thể phân lập Bacillus licheniformis ở khắp nơi từ ñất, nước, cây

trồng, Nhiệt ñộ tăng trưởng tối ưu của nó là 500C, nhưng nó cũng có thể tồn tại ở nhiệt ñộ cao hơn nhiều Tuy nhiên, nhiệt ñộ tốt nhất ñể tiết một số enzyme là 370C [45] Khi ñiều kiện môi trường khắc nghiệt nó sẽ chuyển sang dạng bào tử ñể chống chịu tốt hơn và quay

về trạng thái sinh dưỡng khi gặp ñiều kiện thuận lợi

Hiện nay hầu hết các quá trình lên men vi khuẩn ñều ñược thực hiện bằng các phương pháp nuôi cấy chìm có sục khí, khả năng sinh sinh khối và sinh tổng hợp enzyme chitosanase của vi sinh vật phụ thuộc rất nhiều vào ñiều kiện môi trường

2.5.2.3 Một số ứng dụng của Bacillus licheniformis

Hiện nay vi khuẩn này ñang ñược chú ý và sử dụng cho mục ñích công nghiệp như sản xuất enzyme, kháng sinh và các chất chuyển hóa Nó có khả năng sản sinh ra nhiều enzyme ngoại bào có liên quan tới các chu trình dinh dưỡng trong tự nhiên

Bacillus licheniformis cũng ñược ứng dụng là một thành phần quan trọng trong chất

giặt tẩy Do nó có khả năng phát triển trong môi trường kiềm và sản sinh ra một protease

có thể tồn tại ở pH cao Protease có pH tối ưu ở khoảng 9 và 10, do vậy nó có thể loại bỏ protein bao gồm bụi bẩn trong quần áo [54]

Bacillus licheniformis ñược sử dụng ñể sản xuất kháng sinh Bacitracin Bacitracin bao gồm một hỗn hợp của các polypeptide tuần hoàn do Bacillus licheniformis tạo ra nhưng nó lại ñược tạo ra ñể ức chế sự tăng trưởng của Bacillus licheniformis

Ngoài ra, Bacillus licheniformis cũng ñược sử dụng ñể sản xuất penicillinase,

pentosanases, proticin, citric acid

Hiện nay ñã có rất nhiều những nghiên cứu trên thế giới thu nhận chitosanase từ

Bacillus sp như: Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus alvei, và Bacillus licheniformis Theo Yasushi Uchida et

al (1994), Bacillus licheniformis UTK ñược phân lập từ ñất cho thấy khả năng sinh

chitosanase ngoại bào Sau khi nuôi cấy và thu dịch thô enzyme, thực hiện các bước làm sạch ñã thu ñược hai enzyme chitosanase C1, C2 có khối lượng khoảng 31 và 26kDa

Nhiệt ñộ tối ưu khoảng 40 - 450C và pH tối ưu 4.6 - 4.9 [30]

Nghiên cứu gần ñây của Ekowati et al (2006) cũng ñược thực hiện thu nhận chitosanase từ Bacillus licheniformis MB2 ñược phân lập từ suối nước nóng ở Manado,

Indonesia Cũng sau quá trình làm sạch thu ñược hai enzyme chitosanase chitosanase thứ hai thu ñược có khối lượng phân tử khoảng 75kDa, nhiệt ñộ hoạt ñộng tối ưu là 700C và

khoảng pH tối ưu là 6 – 7 [10]

2.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến khả năng sinh tổng hợp chitosanase

2.5 3.1 Ảnh hưởng của một số thành phần môi trường

Môi trường dinh dưỡng là môi trường sống và cũng là nơi vi sinh vật sinh trưởng, phát triển và thực hiện mọi hoạt ñộng của một cơ thể sống Nhưng ñể duy trì phát huy những tính chất ñặc trưng của vi sinh vật thì nó yêu cầu môi trường dinh dưỡng phải thích hợp Nói cách khác sự phát triển của vi sinh vật chịu ảnh hưởng rất lớn bởi thành phần dinh dưỡng trong môi trường

Thành phần môi trường dinh dưỡng của từng chủng vi sinh vật ñược xác ñịnh bằng thực nghiệm Việc chọn môi trường dinh dưỡng ñể nuôi cấy nhằm mục ñích thu ñược một lượng sản phẩm tối ña do chủng sản xuất tạo thành là một quá trình lâu dài và vất vả, ñòi hỏi người làm công việc này phải có kiến thức sâu về sinh lý vi sinh vật Lựa chọn các chế

ñộ môi trương tối ưu có ñược xác ñịnh bằng hai cách: chọn lựa thực nghiệm lâu dài qua nhiều giai ñoạn và sử dụng phương pháp toán học mô hình hóa thử nghiệm

Cách thứ nhất là phổ biến từ trước tới nay trong công tác nghiên cứu vi sinh vật học Trên cơ sở hiểu biết về sinh lý vi sinh vật người ta xác ñịnh tính chất thành phần môi trường, còn nồng ñộ của lượng thành phần ñược xác lập bằng hàng loạt thí nghiệm, trong ñó một cấu tử của môi trường ñược thay ñổi trong khoảng giới hạn, còn cấu tử khác giữ nguyên Cách này ñáng tin cậy nhưng mất nhiều thời gian Cách thứ hai sử dụng phương pháp toán học kế hoạch hóa thực nghiệm cho phép xác ñịnh nhanh các chế ñộ và thành phần tối ưu của môi trường dinh dưỡng Việc tối ưu hóa quá trình gồm hai giai ñoạn cơ bản Ở giai ñoạn ñầu làm thí nghiệm với các yếu tố nhằm xác ñịnh ý nghĩa của các yếu tố nghiên cứu, xác ñịnh phương hướng và mức ñộ biến ñổi của mỗi yếu tố trong các thí nghiệm tiếp theo của bản

thân quá trình tối ưu hóa

Cơ sở của việc kế hoạch hóa thực nghiệm theo yếu tố 2n là việc thể hiện tất

cả các tổ hợp có thể có giữa n các yếu tố nghiên cứu Mỗi yếu tố ñều ñược kiểm tra ñồng thời và không phụ thuộc lẫn nhau ở hai mức ñộ trên (+) và dưới (–) khi tối ưu hóa thành phần môi trường Trung tâm của thực nghiệm là mức trung bình, hay mức

cơ bản (0), tức là số trung bình cộng giữa mức trên và mức dưới của mỗi yếu tố

- Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Vi sinh vật cũng như tất cả các cơ thể sống khác cần nitơ trong suốt quá trình sống ñể xây dựng tế bào và tạo ra các sản phẩm sinh tổng hợp: Bởi lẽ các thành phần quan trọng của tế bào và sản phẩm sinh tổng hợp ñều có chứa nitơ ( protein, axit nucleic, enzyme ) Chính vì vậy, trong môi trường nuôi cấy cần thiết có nitơ mà vi sinh vật có thể ñồng hóa ñược Việc chọn nguồn nitơ là cần thiết ñể ñảm bảo ñược hiệu suất sinh tổng hợp cao và có lợi về mặt kinh tế

- Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Sự sinh tổng hợp enzyme chitosanase ñược tổng hợp trong tế bào vi sinh vật chịu ảnh hưởng khá lớn của nguồn cacbon có mặt trong môi trường nuôi cấy Nếu môi trường chỉ chứa nguồn cacbon ñể ñồng hóa như glucose, tinh bột tan thì vi sinh vật phát triển về mặt sinh khối có nghĩa là lượng sinh khối thu ñược nhiều nhưng lượng enzyme chitosanase mà vi sinh vật có thể tiết ra môi trường là rất ít Muốn thu ñược enzyme cao thì phải có cơ chất ñể cảm ứng ñể vi sinh vật có thể sinh tổng hợp enzym ñể thủy phân nguồn cơ chất ñó nguồn cacbon ñóng vai trò là chất cảm ứng cho sinh tổng hợp chitosanase là Chitosan, Chitin

2.5 3 2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ môi trường

ða số vi sinh vật tổng hợp enzyme chitosanase là vi sinh vật ưa ẩm, nhiệt ñộ tối thích cho vi sinh vật phát triển và tổng hợp enzyme chitosanase nằm trong khoảng từ 30 – 450 C

Thông thường các vi sinh vật có nhiệt ñộ tối thích cho sự phát triển và sinh tổng hợp enzyme cao thì tính bền nhiệt của enzyme tạo thành cũng cao ðiều này rất có lợi

vì hầu hết các quá trình thủy phân ñều tỏa nhiệt Nếu enzyme bền nhiệt thì hiệu quả sử dụng enzyme cao hơn và không phải dự kiến các phương án làm giảm nhiệt ñộ môi trường [15]

2.5 3 3 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy

Mỗi loài vi sinh vật ñòi hỏi một ñộ pH nhất ñịnh và pH của môi trường có ảnh hưởng rất lớn ñến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật bởi lẽ ion H+ vàOH– trong môi trường tác ñộng trực tiếp lên màng nguyên sinh chất làm thay ñổi sự vận chuyển của cơ chất cảm ứng vào tế bào và vận chuyển enzyme ra ngoài môi trường

Mặt khác ion H+ vàOH- cũng ảnh hưởng ñến hệ sinh vật của enzyme của vi sinh vật, tham gia vào hoạt ñộng sống của vi sinh vật Thông thường nấm men, nấm mốc phát triển tốt trên môi trường axít, vi khuẩn phát triển tốt trên môi trường kiềm hoặc trung tính Các vi sinh vật sinh tổng hợp chitosanase ñược nghiên cứu chủ yếu

là các vi sinh vật ưa pH trung tính, có ñộ pH thích hợp từ 5.5 – 7

Bảng 2.6 ðiều kiện nhiệt ñộ, pH và thời gian nuôi cấy của một số chủng vi sinh

2.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme chitosanase

2.6.1 Tình hình nghiên cứu enzyme chitosanase trên thế giới

Chitosan là một loại polyme sinh học, ñược nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm không chỉ vì nó có nhiều tính năng vượt trội ứng dụng trong công nghiệp mà quan trong hơn nó có những tác ñộng tốt trên bệnh nhân ung thư Hai nước nghiên cứu nhiều về chitosan hiện nay là Trung Quốc và Nhật Bản Ngoài ra còn có Canada, Mỹ, Hàn Quốc… cũng ñang tiến hành nhiều nghiên cứu Tuy nhiên quá trình nghiên cứu chitin/chitosan chỉ thực sự có hệ thống vào giữa thế kỷ 20, quy trình sản xuất chitosanase hiện nay chưa có trên quy mô công nghiệp chỉ tiến hành nghiên cứu trong viện và ở các trường ñại học

Bảng 2.7: Sơ lược kết quả nghiên cứu về enzyme chitosanase trên thế giới

pH tối thích 4.5–6.5, và nhiệt ñộ

450C, hai enzyme còn lại có khối lượng 43 kDa và 22 kDa

A Pelletieer and J Sygusch (1990), thuộc trường ñại học Sherbrooke Canada

Nghiên cứu trên

550C trong 10 phút, 600C trong 5 phút enzyme bị vô hoạt, pH tối thích

là 5

Yeon Jin Choi, Eun Jung Kim, Zhe Pion (2003), ðại học Quốc gia Gyeongsans Hàn Quốc

San Lang Wang, Pe Yi

Ye (2007), ðại học Tamkang

Ho Geun Yoon, Hee Yum Kim, Hye Kyung Kim, Hong Yon Choie (2000), ðại học Hanseo, Chungnam, Hàn quốc

Nguồn: [10, 38, 24, 28]

2.6.2 Tình hình nghiên cứu enzyme chitosanase trong nước

ðối với Việt Nam, nghiên cứu về chitosan, CHOS, glucosamine và chitosanase mới ñược chú ý trong những năm gần ñây và ñang có những kết quả bước ñầu

Năm 1998-2001 ñề tài nghiên cứu “Hoàn thiện công nghệ sản xuất Chitin-Chitosan

và sản xuất một số chế phẩm công nghệ và dược học từ vỏ tôm, ghẹ” ñã ñược nghiên cứu

và hoàn thành tại ðại học Thủy sản Nha Trang Căn cứ vào kết quả và tính ứng dụng của

ñề tài, Bộ giáo dục và ñào tạo ñã giao cho trường ðại học Thủy sản Nha Trang thực hiện tiếp dự án thử nghiệm: “Sản xuất Chitin, Chitosan từ phế liệu sản xuất thủy sản (vỏ tôm,

vỏ ghẹ)” (2003) Kết quả thu ñược ñã hoàn thiện quy trình sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hóa học với các mức deacetyl khác nhau, sản xuất thử nghiệm ñược 25 tấn chitin, 100kg chitosan với chất lượng tốt

Năm 2006, ñề tài: “Nghiên cứu sử dụng các hoạt chất sinh học biển ñể thay thế các chất ñộc hại trong bảo quản nông thủy sản sau thu hoạch và chế biến thực phẩm” PGS TS Trần Thị Luyến khoa Chế biến, Trường ðại học Thủy sản Nha Trang lần ñầu tiên ñã ñưa

ra quy trình công nghệ sản xuất CHOS bằng phương pháp hóa học cùng với khả năng bảo quản nông thủy sản của chitosan, CHOS trên các ñối tượng cam, quýt, cà chua, hành tím

và dứa quả, thịt lợn, thịt bò, xúc xích

Ngoài ra còn rất nhiều những ñề tài nghiên cứu tại các trường ðại học, các Viện nghiên cứu trong việc phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chitosanase hoạt tính cao và các nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm trong lĩnh vực bảo quản và chế biến nông sản, bảo vệ môi trường, y dược…như: Viện Vacxin Nha Trang cũng ñã nghiên cứu và sản xuất 2 sản phẩm chữa béo phì và ñiều trị thoái hóa khớp ñã ñược Bộ Y tế cấp phép lưu hành toàn quốc vào ñầu tháng 6/2005

Dưới ñây là một số ñề tài nghiên cứu về chitosanase:

Tên ñề tài Thời gian Người thực hiện

Phân lập và tuyển chọn chủng sinh tổng hợp

chitosanase ñể thu nhận chitooligosaccharide 2007 Lê Thanh Hà, Bộ môn Công nghệ

sinh học, Viện Công nghệ sinh học

và Công nghệ thực phẩm

Nghiên cứu thu nhận hoạt chất sinh học

chitooligosaccharide bằng enzyme chitosanase

cho y dược Việt Nam

2009

Bước ñầu nghiên cứu thu nhận chế phẩm

chitosanase kỹ thuật từ Streptomyces griseus 2008

Phạm Ngọc Hồng Thùy, Khoa Chế biến, Trường ðại học Nha Trang Lựa chọn ñiều kiện nuôi cấy tối ưu ñể sản xuất

chitosanase từ Streptomyces griseus (Chủng

NN2)

2009 PGS TS Ngô Xuân Mạnh, Khoa

Công nghệ Thực phẩm, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội Chọn lựa ñiều kiện nuôi cấy và thu nhận

enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus sp 2009

Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzyme

chitinase và chitosanase tái tổ hợp 2010-2011

TS Phí Quyết Tiến, Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học – Viện Khoa học và Công

nghệ Việt Nam

Có thể nói chế phẩm chitosan, chitosanase và CHOS sẽ còn là một lĩnh vực mở rộng

và ñang ñược quan tâm không chỉ của các nhà nghiên cứu mà còn của các nhà sản xuất trong nước và quốc tế

PHẦN 3 VẬT LIỆU – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu

3.1.1 ðối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 ñược phân lập từ suối nước nóng Kênh

Gà (Gia Viễn – Ninh Bình) do bộ môn công nghệ vi sinh, khoa Công nghệ sinh học, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội cung cấp

3.1.2 Môi trường nuôi cấy

Môi trường cấy truyền vi khuẩn Môi trường hoạt hoá và nuôi cấy

vi khuẩn Thành phần Hàm lượng (%)

Thành phần tương tự môi trường cấy truyền, chỉ thay Agar bằng dung dịch chitosan 0,2%

Dụng cụ: Ống nghiệm, ñĩa Petri, các loại bình tam giác, bình ñịnh mức, cốc

thủy tinh, ống ñong, ñũa thủy tinh, các loại pipet, que gạt, que cấy

Thiết bị: Buồng cấy vô trùng (BSC – ECO, Singapore), hệ thống lên men 3

bình 250ml Qplus (Sartorius steadim, ðức), nồi hấp, tủ ñịnh ôn, tủ sấy, cân ñiện tử Precisa, máy quang phổ U1600 (Shimadzu, Nhật Bản), máy ly tâm lạnh Mikro 220R (Hettich Zentrifugen, ðức), kính hiển vi quang học, máy khuấy từ IKA RH basic 2 (ðức), máy ño pH orion 3 star (Thermo scientific, Mỹ), hệ thống sắc ký lỏng Protein FPLC (AKTA purifier, Thuỵ ðiển), hệ thống ñiện di ñứng Mini protean 3 cell – Bio rad (Mỹ), bể ổn nhiệt (GFL, ðức), bếp ñiện

Hóa chất: Chitosan tinh khiết và dạng vảy, Amoni sunfate, NaCl , Na2SO3, NaOH, HCl, Na2SO3, agar, tinh bột tan, peptone, cao thịt, cao men, chitosan, manitol, acid dinitrosalicylic, acid citric, acid acetic, phenol, potassitum sodium tartrate, cồn

3.1.4 ðịa ñiểm nghiên cứu

Tiến hành nghiên cứu ñề tài tại

Phòng thí nghiệm trọng ñiểm Công nghệ sinh học Thực phẩm, khoa Công nghệ Thực phẩm, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội

Bộ môn công nghệ vi sinh, khoa công nghệ sinh học, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội

3.1.5 Thời gian nghiên cứu

Từ ngày 01/04/2013 ñến ngày 1/3/2014

3.2 Nội dung nghiên cứu

- Xác ñịnh ñiều kiện nuôi cấy tối ưu chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis

VKNN1 từ ñó xây dựng ñược mô hình nuôi cấy tối ưu của chủng vi khuẩn này bằng bài toán quy hoạch thực nghiệm

- Xác ñịnh quy trình tinh sạch enzyme chitosanase từ chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1

- Xác ñịnh một số ñặc tính của enzyme chitosanase thu nhận từ vi khuẩn

Bacillus licheniformis VKNN1

3.3 Bố trí thí nghiệm

3.3.1 Nghiên cứu phương pháp nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1

3.3.1.1 Giữ và bảo quản giống

Sau khi thuần giống, giống ñược cấy truyền vào môi trường thạch nghiêng ở 370C ñể giữ giống Sau khi giống ñã mọc tốt, bảo quản các ống giống trong tủ lạnh ở nhiệt ñộ 3 –

40C, sau 2 – 3 tuần phải cấy truyền lại một lần

3.3.1.2 Nuôi cấy

Nuôi cấy quy mô phòng thí nghiệm: Môi trường nuôi cấy ñược phân chia vào các

bình lên men vô trùng ñịnh lượng 250ml của hệ thống lên men ñồng thời 3 bình Qplus (ðức) Cấy giống ñã hoạt hóa (hoạt hóa 1 vòng que cấy trong ống nghiệm với thể tích môi trường hoạt hóa 7 ml vào môi trường hoạt hóa ở chế ñộ vô trùng tiến hành trên máy lắc ở chế ñộ 200vòng/phút ở 370C) sau ñó ñược ñưa vào nuôi cấy ở chế ñộ vô trùng với tỷ lệ

tiếp giống 5 - 7%

3.3.1.3 Xác ñịnh ñiều kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 bằng

bài toán quy hoạch thực nghiệm

Quá trình sinh tổng hợp chitosanase của vi khuẩn phụ thuộc vào nhiều yếu tố của quá trình nuôi cấy, trong ñó các yếu tố nhiệt ñộ, pH và nồng ñộ cơ chất chitosanase ảnh hưởng rõ ràng tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase

Xét ảnh hưởng của ñơn yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng tổng hợp chitosanase:

 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ:

Thí nghiệm ñược tiến hành bằng cách thay ñổi nhiệt ñộ từ 25 - 500C với pH bằng 7 và nồng ñộ chitosan 0.2%

 Ảnh hưởng của pH:

Thí nghiệm ñược tiến hành bằng cách thay ñổi pH từ 4 – 9, với nhiệt ñộ ñã chọn và nồng ñộ chitosan: 0.2%

 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan:

Thí nghiệm ñược tiến hành bằng cách thay ñổi nồng ñộ chitosan từ 0.1 – 0.4%, với nhiệt ñộ và pH ñã chọn

Sau khi xác ñịnh ñược sự ảnh hưởng của các ñơn yếu tố, xác ñịnh các mức cơ

sở và cùng khảo sát ñể giải bài toán quy hoạch thực nghiệm và ñiểm tối ưu cho vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme cao

Tiến hành mô hình hóa và tối ưu hóa quá trình nuôi cấy vi khuẩn Bacillus

licheniformis VKNN1 nhằm tổng hợp chitosanase bằng phương pháp phản ứng bề

mặt (Response Surface Methodology – RMS)

Các yếu tố thí nghiệm bao gồm:

Với k là yếu tố ảnh hưởng (k=3)

Cách bố trí thí nghiệm ñược trình bày dựa trên bảng ma trận thực nghiệm

(Bảng 3.1) Sau ñó sử dụng phần mềm JUMP7 giải bài toán mô hình tối ưu hóa ñiền

kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1

Tương ứng mô hình có dạng:

Y = b0 + b1*X1 + b2*X2 + b3*X3 + b11*X21 + b22*X22 + b33*X32 + b12*(X1*X2) + b13*(X1*X3) + b23(X2*X3)

Y: Hoạt tính enzyme chitosanase (U/ml)

3.3.1.4 Xác ñịnh ñường cong ñộng học sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1

ðường cong sinh trưởng của vi sinh vật biểu diễn sự biến ñổi của số lượng tế bào vi sinh vật theo thời gian trong môi trường nuôi cấy tĩnh Tiến hành nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng (môi trường nuôi cấy) môi trường với các ñiều kiện tối ưu ñã lựa chọn, với chế

ñộ lắc 200 rpm Cứ sau 6 giờ ta hút dịch cho vào ống nghiệm, tiến hành ño hấp phụ quang

ở bước sóng A620 nm ñồng thời xác ñịnh hoạt tính enzyme chitosanase Từ ñó ta xác ñịnh

ñược ñường cong sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 chính là sự

thay ñổi của ñộ hấp thụ quang học trong quá trình nuôi cấy

3.3.1.5 Tinh sạch enzyme chitosanase

Dịch enzyme ñược tiến hành tủa phân ñoạn bằng muối amoni sunphate, kết tủa ñược hòa tan trong ñệm acetate 0.05M pH = 5.5 và tiếp tục làm sạch bằng phương pháp loại muối

Lần lượt khảo sát liên tiếp các phân ñoạn, 0–30%; 30–50%; 50–70%; ; 70–90% bão hòa của muối amoni sunphate với dịch enzyme thô, chọn phân ñoạn thích hợp ñể làm sạch sơ bộ enzyme

Chế phẩm enzyme thu ñược bằng phương pháp này chứa nhiều muối vì vậy cần loại muối bằng phương pháp thẩm tích (dialysis)

Cách tiến hành: Cho dung dịch protein vào túi cellophane, sau ñó ñặt cả túi

vào dung dịch ñệm acetate pH 5.5 0.01M trong ñiều kiện 40C trong vòng 24h Màng cellophane là màng bán thấm, có kích thước lỗ cho các chất có phân tử nhỏ xuyên

và ñi qua vào các dung dịch ñệm loãng theo ñịnh luật khuếch tán Còn lại trong màng là các chất protein có phân tử lớn

Phân chia hỗn hợp Protein bằng sắc ký cột DEAE cellulose:

Cách tiến hành:

Chuẩn bị cột: Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng cột sắc ký trao ñổi ion

là HiPrep DEAE FF 16/10 Với Gradient NaCl (0 – 1M)

Chuẩn bị dung dịch ñệm:

Dung dịch A: dung dịch ñệm acetate 0.05M, pH 5.5 gồm hai thành phần

CH3COOHvà CH3COONa

Dung dịch B: dung dịch A bổ sung thêm lượng muối NaCl 1M

Chuẩn bị mẫu: mẫu enzyme chitosanase sau khi tinh sạch bằng phương pháp tủa phân ñoạn amoni sunphate và ñã qua thẩm tích

Quy trình thực hiện:

Kết nối các bộ phận của hệ thống và thiết lập quy trình, sau ñó dùng syringe bơm mẫu vào máy Hệ thống sẽ thưc hiện quá trình phân chia, vẽ sắc ký ñồ trên màn hình theo dõi, và tiến hành thu mẫu tự ñộng bằng máy thu gom tự ñộng fraction collector

Kết thúc quy trình, ta ghi nhận ñược tất cả các thông số về các pic tách ra ñược trên màn hình ðể thu ñược kết quả tốt nhất, nên gom các ống từng pic ñể xác ñịnh hàm lượng protein và hoạt tính enzyme

Các thông số của quá trình sắc ký trao ñổi ion như sau:

Cột: DEAE FF (GE Health care, Sweden)

Thể tích bơm mẫu: 4ml