Hoàn thiện công nghệ sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp làm vật liệu che phủ đất

+ Phương pháp kiểm tra hoạt hoạt tính: Hoạt tính của VSV được kiểm tra bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch, trong đó hoạt tính sinh học được xác định bằng đường kính vòng phân gi

BÁO CÁO MỘT SỐ KẾT QUẢ DỰ ÁN SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM

HOÀN THIỆN CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM VI SINH VẬT XỬ LÝ PHẾ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP LÀM VẬT LIỆU CHE PHỦ ĐẤT

REPORT RESULTS THE TRIAL PRODUCTION PROJECT PERFECTING

ANUFACTURE TECHNOLOGIES AND APPLICATIONS MICROBIAL PRODUCTS ROCESSING AGRICULTURAL WASTE PRODUCTS AS SOIL COVER MATERIAL

TS Hoàng Minh Tâm ThS Trần Tiến Dũng Đơn vị chủ trì: Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Duyên hải Nam Trung bộ

SUMARY

Technology used in the project is modern biotechnology and suitable for the development of

a sustainable agriculture is being government and local development priorities The project has selected 04 strains of microorganisms metabolize organic compounds rich in carbohydrates is SHX01, SHX15, SHX012, SHXDL47; 03 strains of microorganisms convert insoluble phosphate compound is SHV7, SHV10, SHV17; 05 strains of microorganisms countervailing pathogenic rhizosphere upland crops is NA1, SHB17, SHB18, SHB19, SHB21 At the same time, has identified the strains including 06 strains of microorganisms in accordance with the Central South Coastal conditions as a basis for the production of microbial preparations processing agricultural waste products as soil cover material is SHX012, SHXDL47, SHX01, SHB17, SHV7, SHY06 Perfecting processes using of the bio-organic cover substances and inspect and evaluate the quality

of bio-organic overlay and build technological processes produce microbial products processing agricultural waste products as soil cover material with the full range of specifications, the density of microbial cells ≥ 108 CFU / g Besides, the project has identified the conditions of storage products, best used after 3 months of storage, test methods and established basic standards for quality products

I THÔNG TIN CHUNG

Công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh vật (VSV) là kết quả nghiên cứu thuộc đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước “Nghiên cứu công nghệ sản xuất phân bón VSV chức năng phục vụ chăm sóc cây trồng cho một số vùng sinh thái” (Mã số KC04.04) nằm trong chương trình nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học giai đoạn 2001 - 2005 do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam chủ trì và được Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn công nhận là tiến bộ khoa học kỹ thuật Sản phẩm được ứng dụng xử lý nhiều loại cơ chất hữu cơ như: phân gia súc, bã nấm, thân xác thực vật, phế phụ phẩm của sản xuất nông nghiệp và một số ngành sản xuất công nghiệp…làm phân bón hữu cơ sinh học và làm nguyên liệu sản xuất cơ chất hữu cơ vi sinh Công nghệ sản xuất chế phẩm VSV đã được hoàn thiện và ứng dụng sản xuất thành công tại tỉnh Nghệ An, Đăklăk

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Các chủng VSV chuyển hoá hợp chất hữu cơ giàu hydratcacbon

+ Phương pháp kiểm tra mật độ: Sử dụng phương pháp Kock, kiểm tra mật độ VSV tổng

số trên môi trường thạch thịt, kiểm tra mật độ xạ khuẩn trên môi trường Gause, kiểm tra mật

độ nấm men trên môi trường Hansen

+ Phương pháp kiểm tra hoạt hoạt tính: Hoạt tính của VSV được kiểm tra bằng phương

pháp khuyếch tán trên đĩa thạch, trong đó hoạt tính sinh học được xác định bằng đường kính vòng phân giải; đó là vòng tròn trong suốt bao quanh lỗ thạch (đối với trường hợp khoan lỗ thạch)

+ Xác định hoạt độ enzym phân giải: Hoạt độ enzym phân giải xenluloza được xác định

thông qua hoạt độ endo- glucanse (CMCase) do VSV sinh tổng hợp

- Các chủng VSV đối kháng

+ Đánh giá hoạt lực của vi khuẩn đối kháng: Chủng vi khuẩn đối kháng cần kiểm tra được

cấy bằng tăm vô trùng lên điểm giữa của bề mặt môi trường KB (môi trường đặc)

+ Tuyển chọn: Sử dụng phương pháp đục lỗ thạch và cấy chấm điểm

+ Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn đối kháng: Xác định một số

đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các chủng vi khuẩn đối kháng theo phương pháp của N.W Schaad - 2001

- Các chủng VSV chuyển hóa hợp chất phosphat khó tan

+ Môi trường kiểm tra: Môi trường dùng để kiểm tra mật độ VSV phân giải hợp chất

photpho khó tan được sử dụng là môi trường chứa nguồn photpho duy nhất là Tricanxi phophat [Ca3( PO4)2] hoặc Lexitin

+ Xác định hoạt độ enzym phân giải: Xác định hoạt tính phân giải photphataza của các

chủng VSV lựa chọn được định thông qua hoạt tính enzym phytase (cơ chất chứa photphat hữu cơ) bằng dung dịch màu Amonium molypdate

- Xác định bộ chủng VSV phù hợp: Sử dụng những kỹ thuật VSV thường quy phòng thí

nghiệm nhằm xác định mật độ và hoạt tính các chủng VSV đã lựa chọn trong điều kiện tổ hợp

- Xây dựng và hướng dẫn kiểm tra chất lượng chế phẩm: Phương pháp kiểm tra chất

lượng chế phẩm được xây dựng trên cơ sở các tiêu chuẩn Việt Nam và tiêu chuẩn ngành TCVN 6168:1996, 6167:1996, 10TCN:714-2006, 10 TCN 867-2006 về chất lượng và phương pháp kiểm tra chất lượng chế phẩm và phân bón VSV Kiểm tra chất lượng chế phẩm thông qua việc xác định mật độ VSV, tính số lượng VSV trên ml hoặc trên g mẫu từ

số khuẩn lạc phát triển trong các đĩa được chọn

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Lựa chọn chủng giống VSV chuyển hóa hợp chất hữu cơ giàu hydratcacbon phù hợp với điều kiện vùng DHNTB

3.1.1 Lựa chọn bộ chủng xạ khuẩn vật phân giải cellulose

- Hoạt tính sinh học của các chủng VSV:

Bảng 1: Hoạt tính sinh học của chủng VSV

giải CMC (D-d) cm Đường kính vòng phân giải tinh bột (D-d) cm

Ghi chú: (+): Vòng phân giải nhỏ (<1 cm), (-): Không có hoạt tính

Kết quả kiểm tra hoạt tính phân giải cellulose của các chủng VSV trong bảng 1 cho thấy chủng SHXDL47 và SHX012 có hoạt tính sinh học phân giải CMC cao nhất Chủng SHXDL47 có đường kính vòng phân giải CMC (D-d) = 5,6 cm, Chủng SHX012 có đường kính vòng phân giải CMC (D-d) = 4,8 cm, kết quả đánh giá cũng cho thấy ngoài khả năng phân giải cellulose chủng SHXDL47 và SHX012 còn có hoạt tính phân giải tinh bột (đường kính vòng phân giải tinh bột của chủng SHXDL47 và chủng SHX012 là (D-d) = 2,0 cm), tính chất đa hoạt tính sinh học này làm tăng thêm hiệu quả xử lý chất thải hữu cơ khi ứng dụng trong thực tế Dựa vào kết quả nghiên cứu thu được dự án lựa chọn chủng SHXDL47

và SHX012 làm vật liệu phục vụ cho nghiên cứu tiếp theo

- Đặc điểm sinh lý, hình thái các chủng SHXDL47 và SHX012 :

+ Chủng SHXDL47 được tuyển chọn trên môi trường Gauze trong điều kiện nhiệt độ nuôi cấy 370C Sau 72-96 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc tròn, có đường kính 2-2,5mm, màu trắng đục,

có mùi thơm ngái, chân khuẩn lạc bám sâu, chặt vào môi trường Khi được nuôi cấy lắc trên môi trường dịch thể (Gauze), sau 72 giờ chủng SHXDL47 tạo thành hạt nhỏ kích cỡ ≤ 1

mm, làm trong môi trường nuôi cấy, trên thành bình tạo vòng váng màu trắng và bám chặt vào thành bình, kết quả kiểm tra mật độ tế bào sau 72 giờ nuôi cấy cho thấy SHXDL47 đạt

mật độ ≥ 8.108 CFU/ml Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, sau 72-96 giờ chủng SHXDL47 phát triển làm môi trường dịch thể chia làm 2 trạng thái, phía dưới ở trạng thái huyền phù, phía trên trong hơn, bề mặt môi trường không đóng váng, kết quả kiểm tra mật độ tế bào sau 96 giờ nuôi cấy cho thấy SHXDL47 đạt mật độ ≥ 3.106 CFU/ml

+ Chủng SHX012 được tuyển chọn trên môi trường Gauze trong điều kiện nhiệt độ nuôi cấy 370C Sau 72-96 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc chủng SHX012 tròn, đường kính 2-2,5 mm, rìa ngoài màu trắng đục, tâm màu xanh, có mùi hắc, chân khuẩn lạc bám sâu, chặt vào môi trường Khi được nuôi cấy lắc trên môi trường dịch thể (Gauze), sau 72 giờ chủng SHX012 tạo thành hạt nhỏ kích cỡ ≤ 1 mm, làm trong môi trường nuôi cấy, trên thành bình tạo vòng váng màu trắng và bám chặt vào thành bình, kết quả kiểm tra mật độ tế bào sau 72 giờ nuôi cấy cho thấy SHX012 đạt mật độ ≥ 8.108 CFU/ml Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, sau 72-96 giờ chủng SHX012 phát triển làm môi trường dịch thể chia làm 2 trạng thái, phía dưới ở trạng thái huyền phù, phía trên trong hơn, bề mặt môi trường không đóng váng, kết quả kiểm tra mật độ tế bào sau 96 giờ nuôi cấy cho thấy SHX012 đạt mật độ ≥ 106 CFU/ml

3.1.2 Lựa chọn bộ chủng xạ khuẩn phân giải tinh bột

- Hoạt tính sinh học của các chủng VSV:

Bảng 2: Hoạt tính sinh học của chủng VSV

TT Ký hiệu

chủng Đường kính vòng phân giải tinh bột (D-d) cm Đường kính vòng phân giải CMC(D-d) cm

Ghi chú: (+) Vòng phân giải <1 cm, (-) Không có hoạt tính

Kết quả kiểm tra hoạt tính phân giải tinh bột của các chủng VSV trong bảng 2 cho thấy chủng SHX01 và SHX15 có hoạt tính sinh học phân giải CMC cao nhất Chủng SHX01 có đường kính vòng phân giải CMC (D-d) = 2,8 cm, chủng SHX15 có đường kính vòng phân giải CMC (D-d) = 4,2 cm, kết quả kiểm tra cũng cho thấy ngoài khả năng phân giải tinh bột chủng SHX01 và SHX15 còn có hoạt tính phân giải cellulose (đường kính vòng phân giải CMC của chủng SHX01 (D-d) = 1,8 cm và chủng SHX 15là (D-d) = 2,2 cm)

- Đặc điểm sinh lý, hình thái các chủng SHX01 và SHX15 :

+ Chủng SHX01 được tuyển chọn trên môi trường Gauze trong điều kiện nhiệt độ nuôi cấy

370C Sau 72-96 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc tròn, có đường kính 3-4 mm, màu trắng xám, có mùi thơm ngái, chân khuẩn lạc bám sâu, chặt vào môi trường Khi được nuôi cấy lắc trên môi trường dịch thể (Gauze), sau 72 giờ chủng SHX01 tạo thành hạt nhỏ kích cỡ ≤1 mm, làm trong môi trường nuôi cấy, trên thành bình tạo vòng váng màu trắng và bám chặt vào thành bình, kết quả kiểm tra mật độ tế bào sau 72 giờ nuôi cấy cho thấy SHX01 đạt mật độ

≥ 8.108 CFU/ml Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, sau 72-96 giờ chủng SHX01 phát triển làm môi trường dịch thể chia làm 2 trạng thái, phía dưới ở trạng thái huyền phù, phía trên trong hơn, bề mặt môi trường không đóng váng, kết quả kiểm tra mật độ tế bào sau 96 giờ nuôi cấy cho thấy SHX01 đạt mật độ ≥4,06 CFU/ml

+ Chủng SHX 15 được tuyển chọn trên môi trường Gauze trong điều kiện nhiệt độ nuôi cấy

370C Sau 72-96 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc chủng SHX15 tròn, đường kính 2-2,2 mm, rìa ngoài mọc thành sợi, có mùi hắc, chân khuẩn lạc bám sâu, chặt vào môi trường Khi được nuôi cấy lắc trên môi trường dịch thể (Gauze), sau 72 giờ chủng SHX15 tạo thành hạt nhỏ kích cỡ ≤1 mm, làm trong môi trường nuôi cấy, trên thành bình tạo vòng váng màu trắng và bám chặt vào thành bình, kết quả kiểm tra mật độ tế bào sau 72 giờ nuôi cấy cho thấy

SHX15 đạt mật độ ≥8,108 CFU/ml Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, sau 72-96 giờ chủng SHX15 phát triển làm môi trường dịch thể chia làm 2 trạng thái, phía dưới ở trạng thái huyền phù, phía trên trong hơn, bề mặt môi trường không đóng váng, kết quả kiểm tra mật

độ tế bào sau 96 giờ nuôi cấy cho thấy SHX15 đạt mật độ ≥ 106CFU/ml

3.1.3 Nghiên cứu điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV có khả năng chuyển hóa các hợp chất hydratcabon phù hợp với điều kiện vùng DHNTB

Bảng 3: Các điều kiện tối ưu cho sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV phân giải

hydratcacbon

Lưu lượng không khí

(dm3 không khí/dm3 môi

Ảnh hưởng tốc độ cánh

3.2 Lựa chọn chủng giống VSV chuyển hóa hợp chất phosphat khó tan phù hợp với điều kiện vùng DHNTB

3.2.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các chủng VSV

Việc lựa chọn các chủng VSV chuyển hóa hợp chất photphat khó tan có hoạt tính sinh học cao và ổn định từ các mẫu đã phân lập phù hợp điều kiện vùng DHNTB cho kết quả

Bảng 4: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng VSV STT Kí hiệu chủng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc

Bảng 5: Hoạt tính sinh học của các chủng VSV

Phân giải Ca 3 (PO 4 ) 2 (D-d=mm)

Số liệu bảng 4, 5 cho thấy, đã lựa chọn được 3 mẫu VSV có khả năng chuyển hóa các hợp chất photphat khó tan với hoạt tính cao, ổn định và chủng VSV SHV7 có hoạt tính sinh học cao hơn chủng SHV10 và chủng SHV17

3.2.2 Nghiên cứu điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV có khả năng chuyển hóa các hợp chất photphat khó tan phù hợp với điều kiện vùng DHNTB

Dự án đã tiến hành nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV có khả năng chuyển hóa các hợp chất photphat khó tan

Bảng 6: Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV

phân giải photphat khó tan

SHV7 SHV10 SHV17

Lưu lượng không khí (dm3 không khí/dm3

môi trường/phút)

0,70-0,75 0,70-0,75 0,70-0,75

3.3 Lựa chọn chủng giống VSV đối kháng VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn phù hợp với điều kiện vùng DHNTB

3.3.1 Đặc điểm hình thái các chủng VSV đối kháng với VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn

Dự án đã tiến hành tuyển chọn được 5 chủng VSV đối kháng vi sinh gây bệnh vùng

rễ cây trồng cạn phù hợp với vùng DHNTB

Bảng 7: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng VSV STT Ký hiệu

chủng Đặc điểm hình thái khuẩn lạctrên môi trường King B Hình dạng Kích cỡ Màu sắc

Bảng 8 Hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn với đại diện các chủng vi khuẩn

gây bệnh héo xanh R solanacearum STT Vi khuẩn gây

bệnh héo xanh

Đường kính vòng ức chế tạo ra bởi các chủng vi khuẩn đối kháng trên thảm vi khuẩn gây bệnh chỉ thị (cm)

3.3.2 Nghiên cứu điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV có khả năng đối kháng với VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn

Tiến hành nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV có khả năng đối kháng với VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn cho kết quả

Bảng 9: Điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV có

khả năng chuyển hóa

Lưu lượng không khí (dm3 không

Ảnh hưởng tốc độ cánh khuấy (vòng/

phút)

350-400 350-400 350-400 350-400 350-400

3.4 Lựa chọn bộ chủng giống VSV phù hợp với điều kiện vùng DHNTB

3.4.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các chủng VSV được tuyển chọn

Tiến hành tổ hợp các cặp đôi, cặp ba, cặp bốn, cặp năm, cặp sáu và chủng SHY06 đã lựa chọn ra được tổ hợp gồm 6 chủng VSV

Bảng 10: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng VSV STT Ký hiệu

chủng

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc

1 SHX012 Tròn, bề mặt khô, nhăn, chân khuẩn

lạc bám sâu vào môi trường thạch 2 - 2,5mm Trắng xám

2 SHXDL47 Tròn, bề mặt khô, nhăn, chân bám sâu

vào môi trường

2,5 - 3mm Vàng đen

3 SHX01 Khuẩn lạc tròn, có mùi thơm ngái,

chân bám sâu vào môi trường 2 - 2,5mm Trắng đục

4 SHB17 Khuẩn lạc không tròn đều, có mùi hôi 1,5 - 2mm Vàng nhạt

Bảng 11: Hoạt tính sinh học của chủng VSV ((D-d) cm)

vòng phân giải CMC

Đường kính vòng phân giải tinh bột

Đường kính vòng phân giải phosphat

Đường kính vòng kháng VSV gây bệnh

-Ghi chú: (+): có hoạt tính, (-): Không có hoạt tính

3.4.2 Các điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của bộ chủng VSV phù hợp với điều kiện Vùng DHNTB

Bảng 12: Điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV có

khả năng chuyển hóa

Các yếu tố SHX012 SHXDL47 SHX01Chủng VSVSHB17 SHV7 SHY06

Lưu lượng không khí

(dm3 không khí/dm3 môi

trường/phút)

Ảnh hưởng tốc độ cánh

khuấy (vòng/phút)

350-400 350-400 350-400 350-400 350-400 350-400

Trên cơ sở kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sinh khối của các chủng VSV và kế thừa các kết quả nghiên cứu đã được thực hiện trước đây, dự án

đã xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm VSV xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp làm vật liệu che phủ đất

3.5.Qui trình sản xuất chế phẩm VSV

3.5.1 Sơ đồ qui trình

Các chủng giống gốc ở dạng ống thạch nghiêng bảo quản trong điều kiện lạnh hoặc chế phẩm gốc Có thể cấy truyền giống gốc sang ống thạch nghiêng thứ cấp, song phải bảo đảm tuyệt đối mức độ thuần của chủng giống

3.5.2 Nội dung quy trình

3.5.2.1 Chuẩn bị

- Dụng cụ, thiết bị:

Bên cạnh các thiết bị dụng cụ sử dụng cho phòng thí nghiệm VSV (thiết bị, dụng cụ khử trùng, thiết bị dụng cụ nuôi, cấy VSV và thiết bị dụng cụ phục vụ đánh giá kiểm tra VSV), để sản xuất sinh khối VSV cần hệ thống lên men (nồi lên men, thiết bị lên men xốp), thiết bị đóng gói và bảo quản chế phẩm VSV

- Hoá chất, vật tư:

+ Môi trường nhân sinh khối các VSV

+ Môi trường kiểm tra hoạt tính các vi sinh

+ Cơ chất sử dụng cho sản xuất chế phẩm VSV có thành phần chủ yếu là cám gạo đã nghiền mịn, khô (độ ẩm <12%) được sản xuất từ thóc mới và than bùn không bị nhiễm nấm mốc, tốt nhất đã được khử trùng

+ Dinh dưỡng là các nguồn cung cấp năng lượng (đường, mật rỉ…), cung cấp N (hợp chất nitơ vô cơ và hữu cơ) và một số hoạt chất kích thích sự sinh trưởng, phát triển của VSV + Thành phần nguyên liệu của cơ chất xốp được phối trộn với nhau theo tỷ lệ 90% than bùn, 9% cám gạo và 1% rỉ mật

- Khử trùng

+ Các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong sản xuất phải tiệt trùng bằng một trong các phương pháp: Trong tủ sấy ở nhiệt độ từ 170 oC đến 180 oC, không ít hơn 1 giờ; Trong nồi hấp áp lực 1 at (121 0C), không ít hơn 15 phút

Vi khuẩn PG Xenlulose Vi khuẩn PG Lân Nấm men phân giải protein

Kiểm tra hoạt tính các chủng VSV

Giống gốc chủng 1

Giống gốc chủng 2

Giống gốc chủng 3

Lên men cấp 1, 2.

Sinh khối cấp 2 chủng 1

Sinh khối cấp 2 chủng 2

Sinh khối cấp 2 chủng 3

Lên men bề mặt với cơ chất xốp khử trùng hoặc không khử trùng

Chế phẩm VSV

+ Các loại môi trường được pha chế theo thứ tự các hoá chất trong thành phần đã cho Sau

đó phân phối vào các dụng cụ thuỷ tinh hoặc nồi lên men đã chuẩn bị trước và đưa đi khử trùng dưới áp lực 1 at (121 0C) không ít hơn 30 phút

+ Cơ chất xốp dùng cho sản xuất chế phẩm là than bùn được khử trùng bằng hơi nước bão hoà trong thời gian 1 giờ

5.5.2.2 Các bước tiến hành

BƯỚC 1 Kiểm tra đánh giá hoạt tính VSV

Để đảm bảo chất lượng chế phẩm, trước mỗi đợt sản xuất, hoạt tính sinh học của các chủng VSV cần được kiểm tra đánh giá

BƯỚC2 Nhân sinh khối cấp I

- Môi trường lên men cấp 1 được pha chế theo đúng thành phần đã hướng dẫn cho từng loại chủng giống Hoà tan thành phần môi trường trong nước ấm, điều chỉnh pH cho phù hợp với yêu cầu từng loại Phân chia môi trường vào các bình tam giác Làm nút bông, bọc giấy sạch

và khử trùng bằng hơi nước bão hoà (nồi hấp khử trùng) trong thời gian 20 phút (chú ý với môi trường có hàm lượng đường cao thời gian khử trùng không quá 15 phút)

- Có thể cấy giống trực tiếp từ ống giống gốc vào các bình tam giác môi trường đã chuẩn bị sẵn, mỗi bình tam giác 1 vòng que cấy đầy Tuy nhiên với cách cấy này cần thiết phải lên men cấp 1 trong thời gian dài hơn Cách tốt nhất là chuẩn bị giống thứ cấp trước 48-36 giờ

và sau đó cấy trực tiếp từ ống giống thứ cấp Mỗi bình tam giác cần sử dụng 1 ống giống Khử trùng miệng ống giống và miệng bình môi trường Từ bình tam giác lấy một ít môi trường cho vào ống giống, sao cho lượng dịch lỏng phủ hết bề mặt lớp thạch nghiềng Dùng que gạt gạt hết sinh khối VSV trên bề mặt thạch Lắc đều và đổ trở lại vào bình tam giác (các thao tác phải bảo đảm vô trùng tuyệt đối) Cũng có thể nuôi cấy vi sinh trong các ống nghiệm chứa môi trường lỏng trước 48-36 giờ sau đó sử dụng sinh khối này làm giống gốc

- Sau khi cấy giống các bình tam giác được đưa lên giàn máy lắc, tốc độ lắc 150-200 vòng/phút Trong điều kiện 30-400 sinh khối VSV đảm bảo yêu cầu sau 48-96 giờ tùy yêu cầu của từng chủng VSV

BƯỚC 3 Nhân giống cấp II

- Chuẩn bị môi trường lên men: tương tự như chuẩn bị môi trường cho quá trình lên men cấp I, tuy nhiên lượng môi trường lên men có số lượng lớn sau đó cho vào các thùng lên men và đặt chế độ khử trùng tự động trong thời gian 30 phút Làm nguội môi trường đến

450C500C

- Cấy truyền từ giống cấp 1 sang nồi lên men, lượng dịch cấp 1 cần thiết cho quá trình lên men cấp 2 là 5,0-10,0% so với lượng môi trường Dùng đuốc, đền cồn cháy to hoặc đèn gas khử trùng miệng bình tam giác và nồi lên men Chuyển sinh khối trong bình tam giác vào nồi lên men Chú ý thao tác nhanh dưới đèn khử trùng Khử trùng bề mặt các điểm nối dây dẫn khí và lắp đặt hệ thống cấp khí Chú ý kiểm tra độ an toàn của dây dẫn và nồi lên men trước khi khởi động máy nén (hệ thống dây dẫn, bộ lọc khí và các nắp đậy nồi lên men phải được khử trùng và kiểm tra độ vô trùng trước khi sử dụng)

- Nhân sinh khối cấp 2 ở điều kiện phù hợp với nhu cầu sinh trưởng phát triển của từng chủng VSV thông qua việc điều chỉnh các thông số kỹ thuật của hệ thống lên men Thời gian lên men là 24-36 giờ Trong suốt quá trình nhân sinh khối cần tiến hành kiểm tra độ thuần và mật độ các VSV theo phương pháp được trình bày chi tiết trong chuyên đề kiểm tra đánh giá chất lượng chế phẩm VSV Mật độ VSV đảm bảo khi đạt >108 VSV/ml dịch lên men

BƯỚC4 Sản xuất chế phẩm VSV

- Hỗn hợp cơ chất xốp và chất dinh dưỡng sau khi khử trùng được phối trộn với sinh khối VSV từ các quá trình nhân sinh khối cấp 2 và đưa vào các khay lên men (có thể sử dụng túi bóng đen) Thành phần chính của cơ chất xốp được sử dụng trong sản xuất chế phẩm là cám

gạo, than bùn với tỷ lệ 9:1 được phơi khô nghiền mịn (kích thước hạt < 0,5mm), xử lý loại

bỏ tạp nhiễm VSV và trung hoà bằng bột nhẹ sao cho pH đạt 6,8-7,0 Độ ẩm cơ chất xốp không vượt quá 15% Để đảm bảo điều kiện dinh dưỡng và môi trường sống tối ưu cho VSV

- Bổ sung sinh khối VSV sau quá trình lên men với tỷ lệ các chủng VSV là 1:1:1, liều lượng hỗn hợp VSV bổ sung vào so với cơ chất xốp là 10-20% Sau 3 ngày lên men tiến hành đảo trộn và tiếp tục để VSV phát triển trong khoảng 3 ngày tiếp theo

- Sản phẩm được coi là đảm bảo chất lượng khi VSV phát triển đều khắp, tạo màu trắng cho

cả khối cơ chất Hỗn hợp sau khi lên men được sấy ở nhiệt độ không quá 40oC để đảm bảo

độ ẩm cuối cùng đạt 15-20% Trong trường hợp sản xuất chế phẩm trên nền chất mang khử trùng, tất cả các công đoạn phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng Trước khi đóng bao gói, hỗn hợp cần được được kiểm tra mật độ các chủng VSV Sản phẩm đảm bảo chất lượng khi mật độ mỗi nhóm VSV chứa trong chế phẩm đạt >108 VSV/g

BƯỚC 5 Kiểm tra chất lượng chế phẩm

Chất lượng chế phẩm VSV được kiểm tra theo các tiêu chuẩn TCVN 6167:1996 về VSV phân giải lân, TCVN 6168:2002 về VSV phân giải xenlulo, TCVN 9300:2012 về VSV đối kháng VSV gây bệnh

3.6 Điều kiện bảo quản chế phẩm và tiêu chuẩn cơ sở về chất lượng chế phẩm

Chế phẩm vi sinh sau khi sản xuất được đóng gói và bảo quản ở các điều kiện nhiệt

độ thường, tiến hành kiểm tra thường xuyên mật độ để đánh giá chất lượng của chế phẩm

Bảng 13: Mật độ của chế phẩm tại các thời điểm bảo quản khác nhau Chủng

VSV 0h 1 tháng 2 tháng Mật độ tế bào (CFU/ml) 3 tháng 4 tháng 5 tháng 6 tháng

SHB17 3,44x105 2,34x109 3,06x108 3,74x108 4,12x107 4,2x107 3,32x106 SHV7 4,12x106 4,24x109 4,12x108 4,26x108 3,28x107 3,8x107 2,28x106 SHX012 5,26x105 3,44x108 5,24x108 5,38x108 4,16x107 4,6x107 2,16x106 SHXDL47 4,32x105 4,52x108 6,18x109 6,34x108 5,44x108 5,04x107 1,44x106 SHX01 5,46x105 4,36x108 4,62x108 5,34x108 5,42x108 5,2x107 2,42x106 SHY06 3,56x105 4,68x109 4,06x109 4,12x108 4,34x107 4,16x107 4,06x109

Bảng 14: Hoạt tính của các chủng trong chế phẩm sau thời gian bảo quản

Chủng

VSV 0h 1 tháng 2 tháng Hoạt tính (mm) 3 tháng 4 tháng 5 tháng 6 tháng

Kết quả bảng 13, 14 cho thấy chế phẩm sản xuất và bảo quản sử dụng tốt nhất sau 3 tháng Với các kết quả đạt được chế phẩm xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp làm vật liệu che phủ đất sản xuất tại vùng DHNTB đã được công bố tiêu chuẩn cơ sở về chất lượng Sản phẩm được sản xuất tại Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp DHNTB và Công ty cổ phần Phân bón và Dịch vụ tổng hợp Bình Định có tên thương mại DHSH-01

A/ Yêu cầu kĩ thuật

Yêu cầu về nguyên liệu chính

- Môi trường nuôi cấy VSV: Than bùn, cám gạo, rỉ mật

- Các chủng VSV (Bacillus, Strepmomyces, Saccharomyces)

- Các enzym thủy phân (xenlluloza, proteaza, phytaza)

Yêu cầu đối với sản phẩm

Sản phẩm chế phẩm vi sinh xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp có các chỉ tiêu và mức chất lượng theo quy định sau:

1.Ngoại quan Tơi xốp, không vón cục, màu nâu nhạt hoặc

trắng xám

2.VSV(CFU/g):

- Bacillus không nhỏ hơn

- Strepmomyces không nhỏ hơn

- Saccharomyces không nhỏ hơn

107

107

107

3.Các enzim thủy phân:

Xenluloaza (D-d, cm) Không nhỏ hơn

Proteaza (D-d, cm) Không nhỏ hơn

Phytaza (D-d, cm) Không nhỏ hơn

3,0 2,5 2,0

4 Khối lượng đóng gói:

Gram

Gram

Gram

1.000 2.000 5.000

B/ Phương pháp thử

Ngoại quan: Dùng mắt và tay để kiểm tra dạng và màu sắc của sản phẩm

- Xác định thành phần và số lượng các nhóm VSV theo phương pháp cấy pha loãng trên môi trường thạch đĩa (Koch)

- Nhận biết Bacillus bằng kĩ thuật soi kính hiển vi, hoặc nhận dạng khuẩn lạc trên môi

trường thạch đĩa, hoặc bằng kĩ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 16s ARN reboxom

- Nhận biết Strepmomyces bằng kĩ thuật soi kính hiển vi hoặc nhận dạng khuẩn lạc trên môi

trường thạch đĩa, hoặc bằng kĩ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 16s ARN reboxom

- Nhận biết Saccharomyces bằng kĩ thuật soi kính hiển vi hoặc nhận dạng khuẩn lạc trên

môi trường thạch đĩa, hoặc bằng kĩ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 16s ARN reboxom

- Xác định hoạt lực enzym ngoại bào bằng phương pháp khuyêch tán trên thạch

C/ Khối lượng đóng gói theo quy định hiện hành

- Bao gói: Sản phẩm được đóng trong túi PE hoặc bao gói theo yêu cầu của khách hàng

- Ghi nhãn: Sản phẩm có nhãn ghi với nội dung sau

- Tên cơ sở

- Các chỉ tiêu, mức chất lượng chính:

- Địa chỉ

- Ngày, tháng, năm sản xuất:

- Tên sản phẩm

- Thời hạn sử dụng - Thành phần- Khối lượng tịnh

- Công dụng

- Sản xuất theo TCCS

- Hướng dẫn sử dụng

Tiến hành lấy mẫu chế phẩm VSV và kiểm tra chất lượng của sản phẩm sau khi sản xuất, kết quả cho thấy sản phẩm sản xuất đảm bảo được tiêu chuẩn Việt Nam

Bảng 15: Chất lượng chế phẩm VSV sản xuất tại Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp

DHNTB và Công ty cổ phần Phân bón và Dịch vụ tổng hợp Bình Định