1 VI NHÂN GIỐNG LAN GẤM ANOECTOCHILUS FORMOSANUS HAYATA Lê Linh Dung1, Nguyễn Thị Kiều Linh2 linhdungsh@gmail.com1,nguyenkieulinh9x@gmail.com2 Tóm tắt: Đề tài: “Vi nhân giống lan Gấm
Trang 11
VI NHÂN GIỐNG LAN GẤM ANOECTOCHILUS FORMOSANUS HAYATA
Lê Linh Dung1, Nguyễn Thị Kiều Linh2 linhdungsh@gmail.com1,nguyenkieulinh9x@gmail.com2
Tóm tắt: Đề tài: “Vi nhân giống lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata” khảo sát vai trò các
chất điều hòa sinh trưởng đến sự tái sinh cây lan Gấm hoàn chỉnh trong điều kiện in vitro Môi trường TS5
cho sự tái sinh chồi Kết quả đạt 94,3 % số lượng mẫu tái sinh Môi trường KC7 sử dụng môi trường nền Knudson C có bổ sung 0,35 ppm BAP + 0,1 ppm NAA + 0,25 ppm B1 thích hợp nhất cho sự nhân chồi Kết quả đạt 96,2 % số lượng mẫu tái sinh với 5,55 chồi/ mẫu Các chồi có chiều cao từ 4 - 5cm được sử dụng
để ra rễ in vitro Tỷ lệ ra rễ là 98,1 % và số rễ/ mẫu ( 4,5 rễ/ mẫu) cao nhất trên môi trường có bổ sung 0,7 ppm NAA + 0,2 ppm BAP
Từ khóa: Lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata, nhân giống invitro
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Sự phát triển của y học cổ truyền đặc biệt là Đông y Trung Quốc đã khiến cho lan Gấm, đặc
biệt là loài lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata trở thành một loài dược liệu quý Theo y học cổ truyền Đài Loan, A formosanus Hayata tươi hoặc khô nấu nước uống trị các chứng bệnh
đau ngực, đau bụng, tiểu đường, viêm thận, sốt, huyết áp cao, liệt dương, rối loạn gan, lá lách và chứng đau nhói ngực (Lin và Wu 2007) Đại học Công nghệ Y dược và Cao đẳng Y học Quốc gia
Dương Minh Đài Loan đã sử dụng A formosanus Hayata làm thuốc kháng viêm, hạ sốt, giảm suy nhược cơ thể và kháng virus cúm A A formosanus Hayata chứa hợp chất chuyển hoá arachidonic acid liên quan đến chức năng tim mạch Dịch chiết A formosanus Hayata có khả năng kháng virus,
kháng sưng viêm và bảo vệ gan (Takatsuki, 1992) Ngoài ra trên thị trường còn có một số thực phẩm chức năng chiết xuất từ lan Gấm có tác dụng mát gan giải độc, tăng cường sức khỏe…Ở Việt Nam cây lan Gấm chủ yếu dùng làm cảnh, chưa có tài liệu nghiên cứu và chưa dùng làm thuốc Với nhu cầu nguyên liệu lớn, Trung Quốc tận thu nguồn lan Gấm trong khu vực Đông Nam
Á mà chủ yếu ở Việt Nam Lan Gấm tươi được thu mua từ 200 – 300 USD/ kg (thân, rễ, lá, hoa), cây khô có giá 3.200 USD/ kg, nếu thu hái trong tự nhiên giá cao gấp 3 lần Với giá trị kinh tế cao dẫn đến việc khai thác quá mức nguồn nguyên liệu này đã khiến lan Gấm đứng trước nguy cơ tuyệt chủng
Nhận thức được tiềm năng, giá trị kinh tế của loài lan này, nhiều nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống các loài lan Gấm trong điều kiện in vitro ra đời
Chen ZY và cs (1992) nghiên cứu môi trường thích hợp ra rễ lan Gấm là môi trường ½ MS + 0,7 μg/l NAA Nồng độ BA 1,0 – 2,0 μg/l, IBA 0,5 – 0,7μg/l, 0,1 – 0,5 μg/l zeatin cho chồi phát triển tốt nhất
Fan Zinan và cs (1997) nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đối với sự phát triển rễ của lan Gấm, kết quả cho thấy bổ sung 0,2% than hoạt tính giúp rễ phát triển tốt, lão hóa chậm Wang Yaying, Linrong Yao (2005) đã chỉ ra bổ sung 3,5 ppm BA, 0,5 ppm KT, 0,2 ppm NAA vào môi trường ½ MS là tốt nhất cho sự phát triển rễ lan Gấm
Phùng Văn Phê và cs (2010) nghiên cứu môi trường phù hợp nhất để nhân nhanh chồi Lan
kim tuyến - Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl in vitro là Knudson C Thể chồi 8 tuần tuổi
từ phôi hạt chín, cao 2-3 cm là phù hợp nhất để nhân nhanh trong môi trường có bổ sung 0,5 ppm BAP + 0,3 ppm Kinetin + 0,3 ppm
Trang 22
Nguyễn Quang Thạch, Phí Thị Cẩm Miện (2012) nghiên cứu xác định môi trường thích hợp
nhất để nhân nhanh thể chồi và mắt đốt ngang thân lan Kim Tuyến - Anoectochilus setaceus
Blume là Knudson C bổ sung 0,5 ppm BAP + 0,3 ppm Kinetin + 0,3 ppm αNAA
Những nghiên cứu trên đã đóng góp thiết thực khôi phục và bảo tồn nhiều loài lan Gấm Tuy
nhiên, ở Việt Nam loài Anoectochilus formosanus - Loài có giá trị thương mại cao trên thế giới
chưa được quan tâm nghiên cứu
Đề tài “Vi nhân giống lan gấm Anoectochilus formosanus Hayata” được thực hiện với mục đích nhân nhanh số lượng lớn cây lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata in vitro làm cơ sở
cho việc nhân nhanh nguồn vật liệu khởi đầu và cung cấp cơ sở khoa học nhằm khôi phục lại nguồn giống cũng như đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nước và xuất khẩu
2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô trường Đại học Lạc Hồng, thời gian
từ 07/2013 - 11/2013
Đề tài “Vi nhân giống lan gấm Anoectochilus formosanus Hayata” nghiên cứu tái sinh chồi,
nhân chồi và tái sinh rễ tiến hành qua 3 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm gồm 10 nghiệm thức, lặp lại
3 lần trong đó có nghiệm thức đối chứng Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên Điều kiện nuôi cấy trong tất cả các thí nghiệm đều giống nhau Nhiệt độ nuôi cấy 24 ± 20
C, sử dụng đèn huỳnh quang ánh sáng trắng, cường độ chiếu sáng 1800 - 2000 lux, chiếu sáng 16h/ ngày, pH của môi trường là 5,5 – 5,8 Tiến hành xác định số chồi, đặc điểm chồi, số rễ, đặc điểm rễ tạo thành sau mỗi lần cấy chuyền Số liệu thô được thống kê bằng phần mềm Excel
2010, sau đó được xử lý bằng phần mềm của chương trình thống kê STATGRAPHICS
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, Kinetin, GA 3 tới môi trường tái sinh chồi
Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng và tìm ra các khoảng nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự tái sinh chồi
Vật liệu: Các đốt thân lan Gấm được nuôi cấy trong điều kiện in vitro Số lượng mẫu cấy: 6 mẫu/ bình Mỗi nghiệm thức pha 3 bình (3 lần lặp lại) Dung tích mỗi bình là 500 ml, thể tích môi trường là 65 ml/ bình Thời gian theo dõi: 6 tuần
Môi trường nuôi cấy: Sử dụng môi trường Knudson C có bổ sung: 20 g/l sucrose; 0,2 g/l than hoạt tính; 150 ml/l nước dừa; 100 ml/l dịch chiết khoai tây; 8 g/l agar và bổ sung chất điều hòa sinh trưởng theo bảng sau:
Bảng 1: Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường tái sinh chồi
CĐHSTTV
Trang 33
Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu sống sót, số mẫu tái sinh, số chồi, hình thái chồi sau 2, 4, 6 tuần
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, NAA, B1 đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi
Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng và tìm ra các khoảng nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự nhân chồi
Vật liệu: Chồi non được tái sinh từ thí nghiệm 1 Số lượng mẫu cấy: 6 mẫu/ bình Mỗi nghiệm thức pha 3 bình (3 lần lặp lại) Dung tích mỗi bình là 500ml, thể tích môi trường là 65ml/ bình Thời gian theo dõi: 6 tuần
Môi trường nuôi cấy: Sử dụng môi trường Knudson C có bổ sung: 20 g/l sucrose; 0,5 g/l than hoạt tính; 150 ml/l nước dừa; 100 ml dịch chiết khoai tây; 8 g/l agar và bổ sung chất điều hòa sinh trưởng theo bảng sau:
Bảng 2: Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường nhân nhanh chồi
CĐHSTTV
Trang 44
Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu sống sót, số mẫu tạo chồi, số chồi, chiều dài chồi, đặc điểm chồi
Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp NAA, BAP tới sự phát sinh rễ
Mục đích: Khảo sát và tìm ra các khoảng nồng độ cũng như các chất điều hòa sinh trưởng thích
hợp cho sự phát sinh rễ lan Gấm trong điều kiện in vitro
Vật liệu: Các chồi xanh tốt thu được ở thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2 Số lượng mẫu cấy: 6 mẫu/ bình Mỗi nghiệm thức pha 3 bình (3 lần lặp lại) Dung tích mỗi bình là 500 ml, thể tích môi trường
là 65 ml/ bình Thời gian theo dõi: 6 tuần
Môi trường nuôi cấy: Sử dụng môi trường Knudson C có bổ sung: 20 g/l sucrose; 0,5 g/l than hoạt tính; 150 ml/l nước dừa; 100 ml dịch chiết khoai tây; 8 g/l agar và bổ sung chất điều hòa sinh trưởng theo bảng sau:
Bảng 3: Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường phát sinh rễ
Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu sống sót, số mẫu tạo rễ, số rễ và chiều dài rễ tái sinh được trên mỗi chồi sau 2, 4, 6 tuần
3 KẾT QUẢ
3.1 Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, Kinetin, GA 3 tới môi trường tái sinh chồi
Mẫu cây con in vitro được cắt thành từng đoạn có chứa đốt thân được cấy vào môi trường khảo sát Kết quả sau 6 tuần nuôi cấy thể hiện ở bảng 4
CĐHST
Trang 55
Bảng 4: Ảnh hưởng của môi trưởng nuôi cấy đến sự tái sinh chồi và hình thái chồi
Môi
trường Số mẫu
cấy
Số mẫu sống sót
Số mẫu tái sinh
Tỉ lệ mẫu tái sinh (%)
Tổng số chồi tái sinh
Số chồi / mẫu
Kết quả thí nghiệm sau 6 tuần cho thấy nghiệm thức TS5 gồm Knudson C + 2,0 ppm BAP + 0,2 ppm Kinetin + 0,1 ppm GA3 cho tỉ lệ tái sinh chồi cao nhất đạt 5,27 chồi/ mẫu cấy, chồi khỏe, phát triển tốt
Hình 1: Số chồi hình thành trên môi trường TS5 sau 2, 4, 6 tuần 3.2 Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, NAA, B1 đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi
Kết quả thí nghiệm sau 6 tuần nuôi cấy thể hiện ở bảng 5
Bảng 5: Ảnh hưởng của môi trưởng nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh chồi
Trang 66
Môi
trường
Số mẫu cấy
Số mẫu sống sót
Số mẫu tạo chồi
Tỉ lệ mẫu tạo chồi (%)
Tổng số chồi tạo thành
Số chồi / mẫu
Chiều cao chồi (cm)
Sau 6 tuần nuôi cấy cho thấy môi trường nhân nhanh lan Gấm phù hợp nhất là môi trường Knudson C + 0,35 ppm BAP + 0,1ppm NAA + 0,25 ppm B1 với tỉ lệ tái sinh chồi đạt 5,27 chồi/ mẫu cấy
Hình 2: Số chồi hình thành trên môi trường KC7 sau 2, 4, 6 tuần
Trang 77
3.3 Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp NAA, BAP tới sự phát sinh rễ
Chồi sau 6 tuần nhân nhanh được tách ra và chuyển qua môi trường tái sinh rễ để tạo cây con
in vitro hoàn chỉnh Kết quả sau 6 tuần nuôi cấy thể hiện ở bảng 6
Bảng 6: Ảnh hưởng của môi trưởng nuôi cấy đến sự tái sinh rễ và chiều dài rễ
Hình 3: Sự phát triển của rễ sau 6 tuần
Kết quả cho thấy môi trường phù hợp nhất cho số lượng rễ lớn nhất 4,5 rễ/ mẫu cấy và chiều dài rễ dài nhất đạt được 2,8 cm là môi trường Knudson C bổ sung 0,7 ppm NAA + 0,2 ppm BAP
Môi
trường
Số mẫu
cấy
Số mẫu sống sót
Số mẫu tạo rễ
Tỉ lệ mẫu tạo rễ
(%)
Tổng số rễ tạo thành
Số rễ
/ mẫu
Chiều dài rễ
(cm)
Trang 88
4 BÀN LUẬN
“Vi nhân giống lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata” mục đích tái sinh chồi, nhân
chồi và tạo rễ, sử dụng môi trường nền tối ưu Knudson C bổ sung 20 g/l sucrose + 0,5 g/l than hoạt tính + 150 ml/l nước dừa + 100 ml dịch chiết khoai tây + 8 g/l agar
Kết quả đạt được có điểm giống và khác các nghiên cứu đi trước do sự phối hợp các chất chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác nhau với nồng độ khảo sát không giống nhau Đối tượng nghiên
cứu cùng chi (Anoectochilus) nhưng khác loài cũng như hàm lượng nước dừa, dịch chiết khoai tây
không xác định góp phần tạo sự khác biệt Ngoài ra thời gian nghiên cứu hạn chế cũng ảnh hưởng đến kết quả sau cùng
Quá trình tái sinh chồi sử dụng môi trường Knudson C bổ sung 2 ppm BAP + 0,2 ppm
Kinetin + 0, 1 ppm GA3 cho kết quả tái sinh chồi tốt nhất bởi vì với hàm lượng BAP thích hợp
đã kích thích sự tổng hợp các Cytokinin nội sinh dẫn đến hàm lượng Cytokinin nội sinh cao nên kích thích sự phân chia phân hóa và gia tăng kích thước của tế , mặt khác BAP còn có tác dụng kích thích tế bào huy động nguồn dinh dưỡng từ môi trường nhằm thúc đẩy quá trình tổng hợp protein và axit nucleic thúc đẩy tế bào phát sinh chồi Kinetin có hoạt tính tương tự như BAP nhưng khi hai Cytokinin BAP và Kinetin kết hợp với nhau có vai trò điều phối trong việc cảm ứng tạo chồi GA3 thuộc nhóm Giberelin kết hợp với Cytokinin làm tăng hiệu quả tạo chồi Kích thích sự tổng hợp amylase, protease và tăng hoạt tính của chúng, tăng quá trình thủy phân các polymer thành monomer tạo điều kiện về nguyên liệu và năng lượng cho nảy mầm, phá vỡ sự ngủ nghỉ của hạt và chồi
Quá trình nhân nhanh chồi tốt nhất là môi trường khoáng Knudson C bổ sung 0,35 ppm BAP + 0,1 ppm NAA + 0,25 ppm B1 Vì BAP có khả năng kích thích tạo chồi bên, vượt qua ảnh hưởng
ưu thế ngọn, sự cân bằng tỉ lệ giữa Auxin và Xytokinin có ý nghĩa quyết định trong quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy in vitro, trong thí nghiệm này tỉ lệ BAP cao hơn NAA đã kích thích
sự xuất hiện và phát triển của chồi NAA phối hợp với BAP giúp sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô giúp chồi phát triển tốt, cân đối B1 là vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả tế bào, xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau, duy trì sự phân chia tế bào để mô có sức sinh trưởng tốt Ghi nhận này cho thấy với hàm lượng BAP, NAA nhỏ hơn nhưng hệ số nhân chồi vẫn tương đương với kết quả của Phí Thị Cẩm Miện (2012) Đối với môi trường tạo rễ sử dụng môi trường khoáng Knudson C bổ sung 0,7 ppm NAA + 0,2 ppm BAP cho kết quả tái sinh rễ tốt nhất NAA là một Auxin có hoạt tính khá mạnh so với các Auxin khác Khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy, NAA có tác dụng hoạt hóa sự dãn thành tế bào cũng như sự tổng hợp các chất tham gia cấu tạo nên chất nguyên sinh và thành tế bào, cảm ứng cho sự tổng hợp chuỗi polyamine dẫn đến các tế bào vùng xuất hiện rễ để tạo nên mầm rễ, sau đó các mầm rễ này sẽ dài ra và chui ra khỏi vỏ tế bào và hình thành rễ Tỉ lệ NAA cao hơn BAP kích thích sự ra rễ mà vẫn đảm bảo sự phát triển tốt của cây Việc phối hợp Auxin và Cytokinin cho hệ
số tạo rễ và chất lượng cây cao hơn hẳn chỉ sử dụng Auxin mà các công trình trước đó đã nghiên cứu
5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1 Kết luận
Từ kết quả nghiên cứu đề tài chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:
Môi trường thích hợp cho sự tái sinh chồi sử dụng môi trường nền Knudson C + 2 ppm BAP + 0,2 ppm Kinetin + 0.1 ppm GA3 Kết quả đạt 94,3 % số lượng mẫu tái sinh
Trang 99
Môi trường thích hợp nhất cho sự nhân chồi sử dụng môi trường nền Knudson C + 0,35 ppm BAP + 0,1 ppm NAA + 0,25 ppm B1 Kết quả đạt 96,2 % số lượng mẫu tái sinh với 5,55 chồi/ mẫu
Các chồi có chiều cao từ 4 - 5cm được sử dụng để ra rễ in vitro Tỷ lệ ra rễ là 98,1 % và số rễ/ mẫu ( 4,5 rễ/ mẫu) cao nhất trên môi trường có bổ sung 0,7 ppm NAA + 0,2 ppm BAP
5.2 Kiến nghị
Lặp lại thí nghiệm nhiều lần và tăng số nghiệm thức, nhằm mở rộng nghiên cứu ảnh hưởng
của một số yếu tố đến quá trình nhân giống lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata
Nghiên cứu cụ thể tác động riêng lẻ của các thành phần như nước dừa, dịch chiết khoai tây,
ánh sáng, nhiệt độ, pH…lên sự tái sinh chồi, rễ của lan Gấm Anoectochilus fiormosanus Hayata
Tìm môi trường phù hợp để tạo mô sẹo nhằm giảm thiểu thoái hóa giống
Tiến hành đem cây ra thuần hóa ở vườn ươm và theo dõi, đánh gia ảnh hưởng của các điều
kiện ngoại cảnh lên sự sinh trưởng, phát triển của lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata
Lời cảm ơn
Chúng tôi xin trân trọng cảm ơn Khoa Công Nghệ Sinh Học – Môi Trường, trường Đại học Lạc Hồng đã cho phép và giúp đỡ chúng tôi thực hiện nghiên cứu này
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Walter Hood Fitch, (1844), "Curtis's botanical magazine", tập 70 tab 4123
Trần Văn Bảo (1999), Kỹ thuật nuôi trồng phong lan, nhà xuất bản Trẻ
Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2002), Công nghệ tế bào, Nhà xuất bản Đại học
quốc gia tp HCM
Dương Công Kiên (2003),Nuôi cấy mô thực vật(tập 1,2,3), Nhà xuất bản Đại học quốcgia tp
HCM
Guo Qiaosheng, Changlin (08/06/2012), “Agricultural technology in the production of
medicinal plants”, Chinesemedicine, truy cập ngày 10 tháng 07 năm 2013,
<http://jpkc.njau.edu.cn/Chinesemedicine/html/9/3.htm>
Vưu Ngọc Dung (8/2010), Giáo trình công nghệ Nuôi cấy mô, Đại học Lạc Hồng, Biên Hòa,
Đồng Nai
Nguyễn Ngọc Quỳnh, (25/10/2012), “Cây Lan Gấm (Anoectochilus formosanus Hayata), giá
trị kinh tế và tiềm năng phát triển trên vùng đất Tây Nguyên”, Phòng Công nghệ Sinh học-Viện
KHKT Nông nghiệp miền Nam, truy cập ngày 15 tháng 7 năm2013,
< http://iasvn.org/homepage/Cay-Lan-Ga%CC%81m-(Anoectochilus-formosanus-Hayata),-gia-tri-kinh-te-va-tiem-nang-phat-trien-tren-vung-dat-Tay-Nguyen-1973.html>
Fan Zinan (1997), “Anoectochilus cultured tissue culture studies”, Fujian Normal University,
số 13, tr 82-87
Phạm Cường (31/03/2007), “ Cymbidium( sym – BID – ee – um)”, Báo điện tử Hoa lan Việt Nam, truy cập ngày 12 tháng 7 năm 2013, <http://hoalanvietnam.org/a312/cymbidium-sym-bid-ee-um-tho-lan>
Nguyễn Đức Thành, 2000, Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu ứng dụng, Nhà xuất bản Đại học Nông nghiệp I HàNội
Trang 1010
