xác định đột biến gen alpha globin gây bệnh thalassemia bằng kỹ thuật PCR đa mồi

Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đã xây dựng “Chương trình thalassemia quốc gia” nhằm hạn chế sự phổ biến của gen bệnh trong cộng đồng và giảm số trẻ sinh ra mang bệnh.. Vì vậy chúng t

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Trần Tuấn Anh

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN ALPHA GLOBIN

GÂY BỆNH THALASSEMIA BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Trần Tuấn Anh

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN ALPHA GLOBIN

GÂY BỆNH THALASSEMIA BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60 42 01 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hướng dẫn: PGS TS Võ Thị Thương Lan

Hà Nội - 2014

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành luận văn này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS TS Võ Thị Thương Lan, người đã chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình em thực hiện đề tài Cô không chỉ truyền thụ cho em nhiều kiến thức về chuyên môn mà còn giúp em bồi đắp lòng say mê, sự nghiêm túc, tính cẩn thận trong nghiên cứu khoa học Đó là nền tảng cho quá trình thực hiện luận văn, là hành trang giúp em

tự tin vững bước trên con đường khoa học sau này Em cũng xin trân trọng cảm ơn ThS Tạ Bích Thuận Cô đã luôn động viên, dành cho em nhiều lời khuyên quý báu trong những lúc em gặp khó khăn

Về phía nhà trường, em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo Khoa Sinh học đã giảng dạy cho em nhiều kiến thức quý báu; em xin cảm ơn Bộ môn Di truyền học, Phòng sau đại học, Phòng công tác chính trị Học sinh - Sinh viên đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn thạc sỹ Em cũng xin cảm ơn Phòng thí nghiệm Sinh Y, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym - Protein là nơi em thực hiện đề tài nghiên cứu cho luận văn thạc sỹ

Về phía cơ quan, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể Khoa Di truyền & SHPT, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương là nơi em đang công tác Các anh chị luôn chia sẻ với em trong công việc, thường xuyên động viên về tinh thần giúp em vững tin trong suốt quá trình thực hiện luận văn Những kiến thức chuyên môn anh chị chia sẻ đã giúp em hoàn thiện luận văn tốt nhất có thể

Em xin chân thành cảm ơn NCS Ngô Thị Hà và các bạn sinh viên Phòng thí nghiệm Sinh Y đã giúp đỡ và cổ vũ em trong suốt thời gian qua Đặc biệt em xin cảm

ơn ThS Nguyễn Thị Thu Hường đã luôn kề bên động viên tinh thần, giúp đỡ tận tình mỗi khi em gặp khó khăn trong quá trình thực hiện luận văn cũng như những vấn đề trong cuộc sống

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Viết đầy đủ

ADN : Acid Deoxyribonucleic

ARN : Acid Ribonucleic

dNTP : Deoxynucleotide Triphosphates

G6PD : Glucose-6-phosphate dehydrogenase

MCH : Mean Cell Hemoglobin

MCV : Mean Corpuscular Hemoglobin

PCR : Polymerase Chain Reaction

WHO : World Health Organization

Hình 6. Sơ đồ thiết kế mồi phát hiện 5 mất đoạn phổ biến trong bệnh alpha

Hình 8. Kết quả điện di ADN tổng số trên gel agarose 1% 32 Hình 9. Kết quả tối ưu điều kiện cho đoạn α2 và đoạn nội kiểm LIS 33 Hình 10. Kết quả sàng lọc đột biến SEA

34 Hình 11. Kết quả sàng lọc đột biến T HAI

35

Hình 12. Kết quả sàng lọc và tối ưu điều kiện phản ứng PCR đơn khuếch đại

đoạn -α3.7 (A) và đoạn -α4.2

Hình 18. Kết quả so sánh đoạn SEA với ngân hàng dữ liệu NCBI 41 Hình 19. Kết quả so sánh đoạn 4.2 với ngân hàng dữ liệu NCBI 42 Hình 20. Kết quả tối ưu điều kiện phản ứng PCR với hai cặp mồi LIS và α2 44 Hình 21. Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng ba cặp mồi LIS, α2, SEA 45

Hình 22. Kết quả tối ưu điều kiện phản ứng PCR sử dụng ba cặp mồi LIS, α2,

Bảng 3 Thành phần và điều kiện nối đoạn đột biến vào vector pTZ5T-R/T 37

Bảng 4 Thành phần và điều kiện sàng lọc khuẩn lạc với cặp mồi vector

Bảng 9 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đa mồi có bổ sung DMSO 50

Bảng 10 Thành phần và điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR sử dụng 5 cặp

MỤC LỤC M Đ U 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.TỔNGQUAN VỀBỆNH ALPHATHALASSEMIA 3

1.1.1 Sơ lược về bệnh thalassemia 3

1.1.2 Cơ chế sinh bệnh 3

1.1.3 Bệnh alpha thalassemia, đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng 5

1.1.4 Cơ sở phân tử bệnh alpha thalassemia 8

1.1.4.1 Cấu trúc và tổ chức cụm gen globin ở người 8

1.1.4.2 Cơ chế phát sinh đột biến 9

1.2.SÀNGLỌCNGƯỜIMANGGENVÀCHẨNĐOÁNBỆNH ALPHA THALASSEMIA 13

1.2.1 Chiến lược sàng lọc người mang gen bệnh thalassemia 13

1.2.2 Các phương pháp sàng lọc và chẩn đoán bệnh 16

1.2.2.1 Phương pháp huyết học 16

1.2.2.2 Phân tích thành phần hemoglobin 17

1.2.2.3 Phân tích tỷ lệ tổng hợp chuỗi alpha/beta-globin 17

1.2.2.4 Phương pháp sinh học phân tử 18

1.3.PHƯƠNGPHÁPPCRĐAMỒITRONGCHẨNĐOÁNBỆNH ALPHA THALASSEMIA 19

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1.NGUYÊNLIỆU,HÓACHẤTVÀTHIẾTBỊ 22

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.1.3 Các cặp mồi 23

2.1.4 Thiết bị 24

2.2.PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 25

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 25

2.2.2 Phương pháp xác định nồng độ ADN bằng đo quang phổ 27

2.2.3 Kỹ thuật PCR đa mồi 27

2.2.4 Phương pháp điện di 28

2.2.5 Phương pháp tách dòng 28

2.2.5.1 Biến nạp bằng sốc nhiệt 29

2.2.5.2 Sàng lọc khuẩn lạc và nuôi tế bào bão hòa 29

2.2.5.3 Tách plasmid 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1.ĐẶCĐIỂMNHÓM BỆNHNHÂNNGHIÊNCỨU 31

3.2.KẾTQUẢSÀNGLỌCĐỘTBIẾNĐƠN 32

3.2.1 Sàng lọc mất đoạn SEA 33

3.2.2 Sàng lọc hai mất đoạn THAI, FIL 34

3.2.3 Sàng lọc mất đoạn -α4.2 và -α3.7 35

3.3.BIẾNNẠP ,TÁCHDÒNGVÀGIẢITRÌNHTỰ ĐOẠNĐỘTBIẾN 37

3.3.1 Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn đột biến SEA 37

3.3.2 Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn đột biến α4.2 39

3.3.3 Kết quả giải trình tự đoạn đột biến 40

3.4.KẾTQUẢTỐIƯUHÓAĐIỀUKIỆNPHẢNỨNGPCRĐAMỒI 43

3.4.1 Tối ưu P CR với cặp mồi LIS và α2 .43

3.4.2 Tối ưu PCR với 3 c ặp mồi LIS, α2 và SEA 44

3.4.3 Tối ưu PCR với 4 c ặp mồi LIS, α2, SEA và α4.2 .47

3.4.4 Tối ưu PCR với 5 c ặp mồi LIS, α2, SEA, α4.2 và α3.7 51

3.5.KẾTQUẢPHÁTHIỆNĐỘTBIẾNBẰNG PCRĐA MỒI 53

3.6.THẢO LUẬN .54

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

Tiếng Việt 62

Tiếng Anh 62

Phụ lục 1 - Kết quả giải trình tự đoạn đột biến SEA 69

Phụ lục 2 - Kết quả giải trình tự đoạn đột biến α4.2 70

Phụ lục 3 - Kết quả phát hiện đột biến trên 100 mẫu bằng kỹ thuật PCR đa mồi 71

Phụ lục 4 - Bảng tổng hợp kết quả xét nghiệm cận lâm sàng 74

Phụ lục 5 - Những đột biến điểm gây α-thalassemia 79

Phụ lục 6 - Những đột biến alpha-thalassemia trong khu vực Đông Nam Á 80

M Đ U

Hàng năm ước tính khoảng 7,9 triệu trẻ em (chiếm khoảng 6%) trên toàn thế giới sinh ra với di tật bẩm sinh nghiêm trọng có nguồn gốc di truyền Theo thống kê năm 2001 có 5 dị tật bẩm sinh nghiêm trọng có nguồn gốc di truyền phổ biến nhất là: (1) bệnh tim bẩm sinh (1.040.835 trẻ), (2) dị tật ống thần kinh (323.904 trẻ), (3) rối loạn hemoglobin gồm thalassemia và bệnh hồng cầu hình liềm (307.897 trẻ), (4) hội chứng Down (217.293 trẻ), (5) thiếu hụt G6PD (177.032 trẻ) Năm dị tật bẩm sinh này chiếm 25% trong tổng số 7.000 dị tật bẩm sinh do di truyền

Trong những năm gần đây, nhiều công trình nghiên cứu về mô hình bệnh trên trẻ em Việt Nam cho thấy các bệnh ung thư và bệnh di truyền ngày càng phát hiện nhiều và có xu hướng gia tăng Đặc biệt nghiêm trọng là bệnh thalassemia, ước tính khoảng 5,3 triệu người mang gen bệnh, với 2.400 trẻ sinh ra mang gen bệnh hàng năm Đây là nguyên nhân gây giảm chất lượng dân số và tăng gánh nặng chi tiêu ngân sách cho y tế

Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đã xây dựng “Chương trình thalassemia quốc gia” nhằm hạn chế sự phổ biến của gen bệnh trong cộng đồng và giảm số trẻ sinh ra mang bệnh Theo chương trình này, việc sàng lọc trước hôn nhân và sàng lọc trước sinh với đối tượng nguy cơ cao là bắt buộc Với đặc trưng dân số theo khu vực địa lý mà phác đồ sàng lọc ở mỗi quốc gia có thể khác nhau Trong đó, xét nghiệm gen sẽ cho biết chính xác những đột biến và kiểu gen bệnh lý Một trong những trở ngại lớn nhất là việc xác định đồng thời nhiều đột biến gen rất tốn kém chi phí và thời gian Từ năm 2000 đến nay đã có nhiều nghiên cứu công bố về việc

phát hiện đồng thời nhiều mất đoạn lớn trên cụm gen α-globin trong một phản ứng

PCR đa mồi Tuy nhiên những nghiên cứu này không đề cập đến cách thức tối ưu

hóa phản ứng PCR đa mồi cho vùng giàu trình t ự GC như c ụm gen α-globin

Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Xác định đột biến gen alpha globin gây

bệnh thalassemia bằng kỹ thuật PCR đa mồi” với mục đích tìm hiểu sâu hơn về

nguyên lý kỹ thuật như vấn đề thiết kế nhiều cặp mồi cho một phản ứng, việc tối ưu phản ứng P CR trên những vùng trình tự giàu GC và trên cơ sở quy trình tối ưu để đánh giá tỷ lệ đột biến trên đối tượng nghiên cứu Đề tài nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y thuộc Khoa Sinh học của Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên và Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH ALPHA THALASSEMIA

1.1.1 Sơ lược về bệnh thalassemia

Thalassemia là một trong những rối loạn di truyền nhiễm sắc thể thường,

gây thiếu hụt tổng hợp một trong hai chuỗi alpha globin (α-globin) hoặc beta globin

(β-globin) Bệnh thalassemia được bác sĩ Thomas Cooley mô tả lâm sàng lần đầu tiên vào năm 1925 trên một số trẻ em người Ý, Hy Lạp và Xy-ri - với hồng cầu nhỏ, nhược sắc cùng hiện tượng tan máu mãn tính [10] Do đó, bệnh được đặt tên là bệnh thiếu máu Cooley (hay bệnh thalassemia thể nặng sau này) Đến năm 1932,

Wipple và Bradford đã đổi tên bệnh thiếu máu Cooley thành bệnh “Thalassemia” –

bởi vì đến thời điểm đó bệnh chủ yếu được phát hiện ở vùng ven biển Địa Trung Hải (“thalassemia” có nguồn gốc từ chữ “thalasa” - trong tiếng Hy Lạp có nghĩa là “the sea” hay là bệnh vùng biển)

Thalassemia được coi là hệ quả của một loạt các đột biến gen nhằm chống lại bệnh sốt rét Theo ưu thế dị hợp tử thì những người mang gen đột biến hay dị hợp tử đột biến có sức sống và khả năng kháng ký sinh trùng sốt rét tốt hơn người bình thường Do đó bệnh rất phổ biến ở các vùng sốt rét lưu hành, các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới như Địa Trung Hải, Đông Nam Á, Ấn Độ, Đông Nam Trung Quốc, Bắc Mỹ [13]

tố và xuất hiện tình trạng bệnh lý Số lượng chuỗi globin thừa sẽ trùng hợp tạo nên các thể vùi huyết sắc tố Những thể vùi này không có tác dụng vận chuyển oxy mà chúng lắng xuống màng hồng cầu và nguyên sinh chất của hồng cầu Với hồng cầu

ở máu ngoại vi, thể vùi huyết sắc tố làm thay đổi tính thấm, tính mềm dẻo của màng Mặt khác nó cũng làm cho màng hồng cầu tăng diện tích tiếp xúc và dễ bị phá hủy bởi các tác nhân oxi hóa Những tác hại trên của thể vùi huyết sắc tố làm hồng cầu bị vỡ sớm gây nên hiện tượng tan máu Còn ở tủy xuơng, các thể vùi trên gắn lên nguyên sinh chất và màng của các hồng cầu non, làm hồng cầu bị chết trước khi trưởng thành, dẫn đến tăng sinh mạnh các hồng cầu non trong tủy, gây nên các biến dạng xương, tăng hấp thụ sắt gây ra nhiễm sắt cho cơ thể Đây là cơ chế chủ yếu gây ra những biến đổi về lâm sàng và huyết học ở những bệnh nhân thalassemia thể nặng [65] Do vậy mà người mắc bệnh thalassemia thể nặng đòi hỏi phải được điều trị bằng truyền hồng cầu thay thế suốt đời và thải sắt định kỳ Điều trị này khá tốn kém và dai dẳng làm số đông người bệnh hiện nay không được điều trị đầy đủ, đặc biệt tại các nước đang phát triển

Ngày nay, bệnh thalassemia được xem là một trong những nhóm bệnh

di truyền đơn gen phổ biến nhất trong dân số thế giới Bệnh tập trung chủ yếu trong khu vực địa lý trải dài từ vùng biển Địa Trung Hải qua nhiều nước nhiệt đới bao gồm các nước Châu Phi cận Sahara, Trung Đông, Ấn Độ, Đông Nam Á và Indonesia [65] Tần suất người mang gen bệnh dao động từ khoảng 3 – 10 % dân số, một số tộc người Ấn Độ tần suất mang gen rất cao 80 – 90 % dân số [25] Theo số liệu của eatherall và Clegg năm 2001, số người mang gen bệnh chiếm khoảng 7 % dân số thế giới; mỗi năm có xấp x 300.000 trẻ em sinh ra bị mắc bệnh thalassemia, trong đó 80 % ở các nước thu nhập thấp và trung bình [65, 66]

Việt Nam, bệnh thalassemia được phát hiện lần đầu vào năm 1960 tại Bệnh viện Bạch Mai Những nghiên cứu được tiến hành từ đó đến nay cho t hấy tần suất mang gen bệnh thalassemia ở Việt Nam khá cao: alpha thalassemia (α-

[48] Việt Nam hiện đứng thứ 2 trong khu vực Đông Nam Á về số người mang gen với 5,3 triệu người mang gen bệnh và có tới 2.400 trẻ mang gen bệnh trong tổng số 1,4 triệu trẻ mới sinh hàng năm (430 mang β-thalassemia, 520 β-thalassemia/HbE, 1,050 HbH, 435 Hb Bart) [48] 2,1 % dân số mang gen bệnh α-thalassemia và 62 % trẻ mang gen bệnh α-thalassemia (trong số 2.400 trẻ sinh ra mang gen thalassemia)

là một cảnh báo nghiêm trọng về sự phổ biến của gen bệnh α-thalassemia trong cộng đồng

1.1.3 Bệnh alpha thalassemia, đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng

Người bình thường có 4 alen trên 2 nhiễm sắc thể tương đồng được kí hiệu là αα/αα, bốn alen này chịu trách nhiệm tổng hợp nên chuỗi α-globin Chuỗi α-globin được tổng hợp tham gia cấu thành một số phân tử hemoglobin bao gồm: HbA ở người trưởng thành (alpha2 beta2), HbF trong bào thai (alpha2 gamma2) và một

lượng nhỏ HbΑ2 (alpha2 delta2) Đột biến xảy ra trên cụm gen α-globin làm giảm

hoặc mất tổng hợp chuỗi α-globin là nguyên nhân gây ra bệnh α-thalasemia Đặc điểm lâm sàng của bệnh α-thalassemia được báo cáo lần đầu tiên vào cuối những năm 1950 và đầu năm 1960 với những bất thường về hemoglobin liên quan tới bệnh thiếu máu hồng cầu nhỏ, hồng cầu nhược sắc trong trường hợp không thiếu sắt [41,

46, 53] Căn cứ vào đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và số lượng alen bị đột biến, bệnh α-thalassemia được chia thành 4 thể bệnh, cụ thể như sau:

Người mang α-thalassemia thể ẩn phần lớn là do mất một alen (-α/αα) Đặc

điểm cận lâm sàng ở trẻ sơ sinh là huyết sắc tố Hb Bart (γ4) tăng nhẹ (1 - 2 %) do chuỗi gamma (γ) dư thừa so với chuỗi alpha Còn ở người trưởng thành có đặc trưng hồng cầu nhỏ và nhược sắc vừa phải, lượng HbΑ2 và HbF bình thường

Do đó, người mang α-thalassemia thể ẩn không phải sử dụng các liệu pháp điều trị

Bệnh α-thalassemia thể nhẹ là trường hợp còn hai alen có chức năng Hai

alen còn lại có thể trên cùng một nhiễm sắc thể (cis α-thalassemia) - phổ biến ở Châu Á và Trung Đông hoặc trên hai nhiễm sắc thể (trans α-thalassemia) - phổ

Bệnh HbH là tình trạng ch còn lại một alen có chức năng, thường do đột biến

mất 3 alen ( /-α) hoặc mất 2 gen α kết hợp với một đột biến điểm ( /αNDα), dẫn đến dư thừa chuỗi β-globin và hình thành nên huyết sắc tố bất thường HbH (β4) Dạng bệnh có đột biến điểm kết hợp thường có đặc điểm lâm sàng nặng hơn dạng mất 3 gen Theo báo cáo thố ng kê từ hơn 500 bệnh nhân tại bệnh viện Siriraj (Thái Lan), tần suất bệnh HbH do đột biến điểm (60 %) cao hơn đột biến mất đoạn (40 %) [63] Đặc điểm lâm sàng của bệnh HbH từ nhẹ đến rất nặng là hội chứng phù thai HbH Hội chứng này được quan sát ở số ít trường hợp mang đột biến mất đoạn 2 gen kết hợp với một đột biến điểm tại codon 31 (GA) hoặc codon 59 (GA), tuy nhiên chưa có những hiểu biết rõ ràng về hội chứng này Cấu trúc phân tử huyết sắc

tố HbH không ổn định và chủ yếu bị tủa trong tế bào hồng cầu (ở dạng thể vùi) sau

đó bị phá hủy sớm ở lách gây nên tình trạng tan máu [49] Đặc điểm cận lâm sàng của bệnh HbH là thiếu máu, tan máu hồng cầu nhỏ, nhược sắc; các thông số tế bào máu: MCH ~ 18 pg, MCV kho ảng 58 fl ở trẻ em và 64 fl ở người lớn, nồng độ hemoglobin 7 - 10 g/dL và tỷ lệ hồng cầu lưới 5 – 10 %; tỷ lệ tổng hợp chuỗi alpha/beta globin gi ảm còn 0,2 – 0,6 [19, 26] Đặc điểm lâm sàng của bệnh là gan

to, lách to, có biến dạng xương ở những bệnh nhân quá tải sắt Tuy nhiên, trường hợp quá tải sắt ch gặp ở những người bệnh lớn tuổi do việc truyền máu lặp lại hoặc

do tăng hấp thu sắt Khi người bệnh mang thai, tình trạng thiếu máu có thể xấu đi do

Hội chứng phù thai Hb Bart thường gắn liền với sự vắng mặt cả 4 alen ( / )

Do đó máu thai nhi không có HbF và HbA mà chủ yếu là huyết sắc tố Hb Bart (γ4) và một lượng nhỏ Hb Portland 1 và Hb Portland 2 (zeta2 gamma2 và zeta2 beta2) Bệnh đặc trưng bởi thiếu máu rất nghiêm trọng (lượng Hb kho ảng 3 – 8 g/dL); đặc điểm lâm sàng gan to, lách to, phù thai và suy tim [67] Trẻ sơ sinh không thích ứng được với tình trạng này nên thường chết ngay sau khi sinh [67] Một số biến chứng của sản phụ bao gồm tiền sản giật, đa ối (Polyhydramnios) hoặc thiểu ối (Oligohydramnios) do tăng ho ặc giảm tích tụ dịch ối, xuất huyết, thiếu máu và nhiễm trùng huyết Với mức độ nghiêm trọng của hội chứng này và những biến chứng của người mẹ trong thời kỳ mang thai, việc chấm dứt thai kỳ được khuyến cáo Hội chứng Hb Bart tương đối phổ biến ở khu vực Đông Nam Á, trong khi hiếm gặp ở Địa Trung Hải do tần suất mang αo-thalassemia thấp [19, 21, 37] Tuy nhiên,

sự di dân trên thế giới và tập quán kết hôn đang làm gia tăng hội chứng Hb Bart ở nhiều quốc gia và hiện tại chưa có điều trị đặc hiệu cho hội chứng này

Phân tích các thể bệnh trong α-thalassemia cho thấy tương quan giữa kiểu gen với đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng bệnh rất phức tạp Mối tương quan này không ch đơn giản là kiểu gen quyết định đặc điểm lâm sàng và không ch liên

quan đến 2 gen globin mà còn liên quan đến cả những gen khác trong cụm gen globin như gen zeta mã hóa cho Hb Portland và gen theta chưa rõ chức năng Do

α-đó, rất khó để phân biệt rõ ràng những khác biệt lâm sàng dựa vào số lượng gen bị mất hoặc không có chức năng Ví dụ như đồng hợp tử mất đoạn –SE A (mất cả 4 gen α) là nguyên nhân gây phù thai khá phổ biến ở khu vực Đông Nam Á, tuy nhiên lượng hemoglobin bào thai (Hb Portland 1 và Hb Portland 2) vẫn đủ chức năng cho thai tiếp tục phát triển Trong khi, dạng đồng hợp tử đột biến ( FIL hoặc T HAI) mất

4 gen α và mất cả gen zeta do vậy mà không sản xuất được Hb Portland, cho nên phải sớm đình ch thai ngay khi xác định để tránh nguy hiểm cho thai phụ [7, 26]

Với số lượng đột biến gây bệnh lớn, tổ hợp các gen đột biến hình thành nhiều đặc điểm lâm sàng đa dạng thì việc phân loại bệnh không thể ch dựa vào đặc điểm lâm sàng Để có chẩn đoán bệnh chính xác và có những hiểu biết thấu đáo về từng trường hợp bệnh cụ thể cần phải xem xét đồng thời những biểu hiện lâm sàng và

cơ sở phân tử của bệnh

1.1.4 Cơ sở phân tử bệnh alpha thalassemia

1.1.4.1 Cấu trúc và tổ chức cụm gen globin ở người

người bình thường, chuỗi α-globin được tổng hợp bởi gen α1-globin và gen α2-globin nằm cạnh nhau trên nhiễm sắc thể 16 (băng 16p13.3) Cấu trúc cụm gen α-globin được xác định lần đầu bằng kỹ thuật lai ADN (blot hybridization) từ năm

1978 [50] Hình 1 mô tả cấu trúc cụm gen α-globin với 2 gen alpha1 và alpha2

mã hóa cho chuỗi α-globin, 1 gen zeta2 mã hóa cho chuỗi ζ-globin trong phôi,

3 gen giả (pseudo zeta1, pseudo alphal và pseudo alpha2) và 1 gen theta1 chưa rõ

chức năng [40] Các gen chức năng được sắp xếp theo thứ tự alpha1-centromer” và được điều hòa từ xa bởi 4 vùng (được gọi là trình tự bảo tồn

“telomer-zeta-alpha2-đa loài [MCS]-R1-R4) định vị khoảng 40 kb ở phần đầu cụm gen này [25]

Quá trình điều hòa làm cho mức độ biểu hiện của gen α2-globin gấp 2 - 3 lần mức

độ biểu hiện của gen α1-globin Sự khác biệt mức độ biểu hiện của 2 gen α-globin

liên quan đến sự đa dạng về kiểu gen cũng như đặc điểm lâm sàng trong thể mang

và bệnh sinh α-thalassemia [61] Cho đến nay đã xác định được hơn 40 loại đột biến mất đoạn và hơn 100 đột biến điểm liên quan đến bệnh α-thalassemia, những đột biến này gây giảm tổng hợp (α+

-thalassemia) hoặc mất tổng hợp chuỗi α-globin (αothalassemia)

Hình 1 Cấu trúc cụm gen α-globin nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 16 (16p13.3)

gồm 2 gen mã hóa cho chuỗi α-globin - alpha1 và alpha2, 1 gen zeta2 mã hóa cho chuỗi ζ-globin trong phôi, 3 gen giả (pseudo zeta1, pseudo alphal và pseudo alpha2)

và 1 gen theta1 chưa rõ chức năng [4, 40]

1.1.4.2 Cơ chế phát sinh đột biến

a) Cơ chế phát sinh alpha +

-thalassemia do đột biến mất đoạn

Hai gen α-globin nằm trong 2 vùng trình tự bảo thủ và tương đồng cao,

có chiều dài khoảng 4 kb [28, 40] Các vùng tương đồng (X, Y, Z) phân cách nhau bởi các yếu tố không tương đồng (I, II, III) được mô tả trong Hình 2 Tái tổ hợp tương đồng giữa hai vùng trình tự Z sẽ hình thành một nhiễm sắc thể mất đoạn 3.7 kb (-α3.7) ch còn 1 gen α-globin gây α-thalassemia và một nhiễm sắc thể mang 3 gen α-globin (αααanti3.7

) không bị thalassemia Tương tự, tái tổ hợp tương đồng giữa hai vùng trình tự X tạo thành một nhiễm sắc thể mất đoạn 4.2 kb (-α4.2

) gây thalassemia và một nhiễm sắc thể mang 3 gen (αααanti4.2) không bị thalassemia (Hình 3) [31, 60] Mất đoạn -α3.7 và -α4.2 là hai mất đoạn đơn gen gây α-thalassemia phổ biến nhất trong các quần thể dân số Ngoài ra còn một số mất đoạn do tái tổ hợp tương hỗ khác, ít phổ biến hơn cũng gây α+

α thalassemia được mô tả trong Hình 2 và một số ít mất đoạn do tái tổ hợp không tương đồng được mô tả trong một vài nghiên cứu khác [29]

Nhiễm sắc thể 16

Cụm gen α-globin

Hình 2 Những mất đoạn ADN là nguyên nhân gây α+-thalassemia Các vùng lặp lại tương đồng X, Y, Z được xen kẽ với các vùng không tương đồng (I, II, III) Mỗi thanh ngang màu đen biểu hiện cho một mất đoạn Đường kẻ ch đen ở 2 đầu thanh ngang mô tả khu vực đứt gãy của mất đoạn đó Theo hình mô tả thì không có

đột biến mất cả 2 gen α-globin mà chủ yếu là đột biến mất một gen α2-globin;

khu vực đứt gãy nằm tại vị trí từ 145.000 đến 165.000 bp [29]

b) Cơ chế phát sinh alpha +

-thalassemia do đột biến điểm

Trong bệnh alpha-thalassemia, tỷ lệ đột biến mất đoạn chiếm chủ yếu so với đột biến điểm (đột thay thế, chèn hoặc mất nucleotide) Tuy nhiên, đột biến điểm trong α+

-thalassemia có thể gây giảm tổng hợp chuỗi α-globin nghiêm trọng hơn dạng mất đoạn Nhiều báo cáo đã mô tả đột biến điểm (gây α+

-thalassemia) có

tác động đến quá trình phiên mã, dịch mã và tính ổn định chuỗi α-globin Một số

đột biến phổ biến như αI VSI(-5)

(Địa Trung Hải); đột biến tại đuôi polyA α2AAT AA G,

và α2AAT A (Địa Trung Hải và Trung Đông) [24, 27, 30, 36, 70]; đột biến ở

bộ ba kết thúc gây kéo dài chuỗi như Hb Constant Spring (HbCS), Hb Icaria, Hb Koya Dora, Hb Seal Rock và Hb Paksé (Trung Đông, Địa Trung Hải và Đông Nam Á) [8, 9, 11, 64]; đột biến mất tính ổn định chuỗi như Hb Quong Sze, Hb Suan Dok,

Hình 3 Cơ chế hình thành 2 mất đoạn phổ biến gây α+-thalassemia Trao đổi chéo không cân giữa hai vùng trình tự Z tương đồng phát sinh một nhiễm sắc thể –α3.7

và một nhiễm sắc thể αααanti3.7 Trao đổi chéo không cân giữa hai vùng trình tự X tương đồng phát sinh một nhiễm sắc thể –α4.2

và một nhiễm sắc thể αααanti4.2

[29]

c) Cơ chế phát sinh alpha o

-thalassemia do đột biến mất đoạn

Hầu hết những mất đoạn lớn (gây αo

-thalassemia) loại bỏ cả 2 gen α-globin hoặc đôi khi loại bỏ toàn bộ cụm gen α-globin Những nghiên cứu về phân tử bệnh

αo

-thalassemia cho thấy nguyên nhân gây mất đoạn chủ yếu là trao đổi chéo không cân [36] Dạng tái tổ hợp phát sinh có thể liên quan đến một trình tự tương đồng ngắn trong vùng đứt gãy, không giống như tái tổ hợp tương đồng trong cơ chế

phát sinh alpha+-thalassemia Khi giải trình tự cụm gen α-globin phát hiện được

trình tự lặp thuộc họ Alu ở gần hoặc ngay tại vùng đứt gãy (trình tự lặp Alu xảy ra với tần suất cao trong hệ gen với khoảng 3 x 105

bản sao) Có một sự trùng hợp là

trong cụm gen α-globin thì trình tự lặp Alu khá phổ biến và nó chiếm khoảng ¼

kích thước của cụm gen [14] Ngoài ra, tại vị trí nối và vùng đứt gãy còn một số

Trao đổi chéo không cân vùng X

Trao đổi chéo không cân vùng Z

đặc điểm thú vị khác như có trình tự đối xứng, lặp lại trực tiếp, trình tự ít tương đồng và sự xuất hiện của motif GAGG Một số mất đoạn, ví dụ như –MED

liên quan đến việc tái sắp xếp phức tạp nối ADN giữa hai vùng đứt gãy Một trình

tự ADN chưa rõ nguồn gốc trong genome được tìm thấy như cầu nối trình tự vùng đứt gãy với mất đoạn –MED

1.2 SÀNG LỌC NGƯỜI MANG GEN VÀ CHẨN ĐOÁN BỆNH ALP HA THALASSEMIA

1.2.1 Chiến lược sàng lọc người mang gen bệnh thalassemia

Sàng lọc người mang gen bệnh là yếu tố quan trọng góp phần hạn chế gen bệnh phổ biến trong cộng đồng, đặc biệt là các cộng đồng thiểu số sống biệt lập Mỗi quốc gia thường có những phác đồ sàng lọc gen bệnh đặc trưng phụ thuộc vào mức độ phổ biến và sự phân bố của gen bệnh trong từng cộng đồng Tham khảo phác đồ sàng lọc của một số tác giả trong và ngoài nước [1, 33, 62], chúng tôi nhận thấy những phác đồ này có nhiều điểm chung tương tự như ở Thái Lan, được mô tả chi tiết trong Hình 5 Quá trình sàng lọc người mang gen bệnh gồm 3

giai đoạn chính Giai đoạn 1 - Sàng lọc bằng 3 xét nghiệm cơ bản là phân tích các

ch số máu ngoại vi (MCH, MCH, RD ), tủa huyết sắc tố HbE (DCIP), đánh giá

sức bền hồng cầu (OFT) Giai đoạn 2 - Phân tích hemoglobin (HPLC) trên những đối tượng nghi ngờ Giai đoạn 3 - Xác định đột biến bằng phương pháp sinh học

phân tử như xét nghiệm ADN, giải trình tự gen Chiến lược sàng lọc được diễn giải

cụ thể như sau:

Giai đoạn 1 - Sàng lọc

Máu ngoại vi được sử dụng trực tiếp cho 3 phân tích cơ bản là xét nghiệm công thức máu, tủa huyết sắc tố HbE và đánh giá sức bền hồng cầu Trường hợp người bình thường có những đặc điểm cận lâm sàng như: ch số thể tích hồng cầu trung bình MCV > 80 fl, lượng hemoglobin trong một tế bào hồng cầu MCH > 27 pg, không có huyết sắc tố HbE và sức bền hồng cầu từ 3,5 – 5 % Với những bệnh phẩm có kết quả xét nghiệm bình thường sẽ dừng kiểm tra nếu không có tiền sử gia

đình mang gen, vì khả năng thấp có mất đoạn 1 gen α-globin (α+

-thalassemia) Tất

cả những trường hợp mà kết quả có ít nhất 1 bất thường trong số 3 xét nghiệm cơ bản trên cần được tiếp tục kiểm tra trong giai đoạn 2 [1, 56, 62]

Giai đoạn 2 - Phân tích hemoglobin

Những mẫu nghi ngờ trong giai đoạn 1 tiếp tục được kiểm tra bằng phân tích huyết sắc tố Kết quả điện di huyết sắc tố của người bình thường không chứa các phân tử hemoglobin bất thường và lượng HbΑ2 dao động từ 2,0 đến 3,2 % Nếu HbΑ2 > 3,5 % thì khả năng rất cao mang đột biến β-thalassemia, trường hợp này phải tiếp tục kiểm tra bằng xét nghiệm gen Trường hợp có huyết sắc tố bất thường ví dụ như huyết sắc tố H, huyết sắc tố E, thì tùy thuộc vào loại và lượng huyết sắc tố bất thường để đưa ra lựa chọn tái khẳng định bằng xét nghiệm gen, được thực hiện trong giai đoạn 3 [1, 3, 56, 62]

Giai đoạn 3 - Xác định đột biến bằng phương pháp sinh học phân tử

Trường hợp HbΑ2 < 3,2 % được kiểm tra với đột biến mất đoạn gen

α-globin Trường hợp, HbΑ2 > 3,5 % trước tiên phải sàng lọc đột biến điểm trên gen β-globin, nếu ch phát hiện một đột biến gen β-globin dị hợp tử cần phải tiếp tục xét nghiệm phát hiện đột biến gen α-globin Trường hợp có huyết sắc tố HbH trước tiên phải xác định các mất đoạn lớn trên gen α-globin; nếu ch phát hiện một

mất đoạn 2 gen thì cần phải sàng lọc tiếp với các đột biến điểm phổ biến

Trường hợp có lượng HbF > 10 % cần phải xét nghiệm đột biến gen β-globin

Trường hợp có tỷ lệ HbE cao (khoảng 80 %) có thể khẳng định là đồng hợp tử

đột biến tại codon 26 gen β-globin Với những bệnh nhân nghi ngờ nhưng sàng lọc

qua giai đoạn 3 mà không xác định được đột biến thì khả năng cao mang đột biến hiếm gặp hoặc đột biến mới Để đưa ra được kết luận chính xác cho những trường hợp này, cần phải sử dụng những phương pháp nghiên cứu phức tạp hơn như điện di không biến tính sợi đơn và giải trình tự gen (không được mô tả trong phác

đồ sàng lọc) [1, 3, 56, 62]

Hình 5 Sơ đồ xét nghiệm sàng lọc bệnh thalassemia, gồm 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1 - Sàng lọc; Giai đoạn 2 - Phân tích hemoglobin; Giai đoạn 3 - Xác định

đột biến bằng phương pháp sinh học phân tử [1, 18, 62]

1.2.2 Các phương pháp sàng lọc và chẩn đoán bệnh

Những phương pháp trong sàng lọc và chẩn đoán bệnh thalassemia được chia làm 3 nhóm chính tương ứng với 3 giai đoạn trong quá trình sàng lọc (1) Nhóm phương pháp sàng lọc ban đầu gồm những kỹ thuật đơn giản, chi phí thấp, có thời gian thao tác nhanh, sử dụng lượng mẫu tối thiểu và có thể dễ dàng áp dụng ở

cả các cơ sở y tế tuyến dưới (2) Nhóm phương pháp thứ hai phân tích và định lượng hemoglobin cho phép phân loại bệnh thalassemia với 2 kỹ thuật là điện di mao quản

và sắc ký lỏng hiệu năng cao (3) Nhóm phương pháp sử dụng các kỹ thuật sinh học

phân tử nhằm xác định những sai hỏng di truyền trên cụm gen α và β-globin [1, 26]

1.2.2.1 Phương pháp huyết học

Hầu hết các cơ sở y tế đều có thể thực hiện xét nghiệm công thức máu để sàng lọc người mang gen bệnh thalassemia Ch số đầu tiên cần quan tâm là thể tích hồng cầu trung bình (MCV); nếu ch số này < 80 fl có thể liên quan đến thiếu máu thiếu sắt hoặc bị thalassemia Thông số thứ 2 giúp sàng lọc thalassemia là lượng hemoglobin trong một tế bào hồng cầu (MCH), nếu MCH < 27 pg có nghĩa là hồng cầu nhược sắc Nếu MCH < 27 pg kết hợp với MCV < 80 fl sẽ có đặc điểm thiếu máu nhược sắc, biểu hiện đặc trưng của bệnh thalassemia Trong bệnh α-thalassemia dựa vào 2 thông số MCV và MCH có thể phỏng đoán được kiểu gen bệnh Chẳng hạn như kiểu gen (-α/-α) và ( /αα) có MCV và MCH luôn giảm, trong khi

trường hợp mất đoạn 1 gen α-globin lại có MCV và MCH ít dao động Đáng chú ý

là ở những bệnh nhân có MCH < 25 pg đột biến mất đoạn gen α-globin xuất hiện

trong khoảng 90 % trường hợp [1, 26]

1.2.2.2 Phân tích thành phần hemoglobin

Tất cả mẫu có kết quả xét nghiệm công thức máu MCV, MCH giảm phải tiếp tục kiểm tra bằng điện di huyết sắc tố Kết quả điện di huyết sắc tố cho biết lượng huyết sắc tố bình thường trong máu cũng như sự xuất hiện của các huyết sắc tố bất thường HbΑ2 là huyết sắc tố bình thường ở người trưởng thành (1,5 – 3,5 %), lượng HbΑ2 tăng (> 3,5 %) đặc trưng cho người mang β-thalassemia thể ẩn, trong khi tỷ lệ HbΑ2 bình thường hoặc giảm nhẹ liên quan đến người mang α-thalassemia thể ẩn [25, 56]

Đối với bệnh HbH có thể xác định rõ qua kết quả điện di huyết sắc tố với lượng HbΑ2 giảm (< 2 %) và lượng huyết sắc tố HbH có thể đến 30 % Với bệnh nhân HbH dưới 1 tháng tuổi, kết quả điện di hemoglobin đặc trưng bởi lượng Hb Bart cao (khoảng 25 %) Trong khi đó việc xác định thể mang α-thalassemia gặp khó khăn hơn bởi lượng HbΑ2 và HbF ít dao động (HbF bình thường, HbΑ2 bình thường hoặc giảm nhẹ) [25, 56] Sự phức tạp trong đặc điểm thể mang α-thalassemia có thể gây khó khăn trong chẩn đoán thậm chí bỏ sót người mang gen bệnh Do đó cần phải tiếp tục kiểm tra bằng các phương pháp khác

1.2.2.3 Phân tích tỷ lệ tổng hợp chuỗi alpha/beta-globin

Xác định tỷ lệ tổng hợp chuỗi α/β-globin là phương pháp phân tích trực tiếp (ở mức độ protein) trong chẩn đoán α-thalassemia Phương pháp được mô tả lần đầu vào năm 1965 bởi eatherall và Clegg [68] Quy trình gồm 5 bước: (1) loại bỏ

tế bào bạch cầu; (2) làm giàu tế bào hồng cầu; (3) tổng hợp chuỗi globin in vitro với

leucine đánh dấu phóng xạ; (4) phân tách chuỗi globin sau tổng hợp; (5) xác định tỷ

lệ chuỗi globin α và β dựa vào tín hiệu phóng xạ Kết quả giảm tổng hợp chuỗi globin khi tỷ lệ α/β-globin thấp hơn 0,8, cụ thể khi tỷ lệ khoảng 0,75 là mất biểu hiện

α-1 alen (-α/αα); 0,5 là mất biểu hiện 2 alen ( /αα) và 0,25 là mất biểu hiện 3 alen α) [68] Phương pháp này đặc biệt có ý nghĩa trong việc xác định việc tổng hợp

( /-dư thừa chuỗi α-globin trong trường hợp có 3 alen trên một nhiễm sắc thể (ααα/αα,

αα/ααα) Nhưng do sự nguy hại của đồng vị phóng xạ nên hiện tại phương pháp này không còn được sử dụng trong chẩn đoán bệnh thalassemia

1.2.2.4 Phương pháp sinh học phân tử

Những phương pháp đã đề cập ở trên ch dừng lại ở mức độ sàng lọc để phân loại bệnh mà chưa có giá trị trong tư vấn di truyền Để làm được điều này cần phải có hiểu biết cặn kẽ ở mức độ phân tử của bệnh Xét nghiệm sinh học phân tử sẽ cho biết chính xác kiểu gen của mỗi bệnh nhân và người mang thalassemia thể ẩn Bên cạnh đó, kết quả xét nghiệm sinh học phân tử sẽ làm sáng tỏ mối quan hệ giữa kiểu gen và biểu hiện lâm sàng bệnh Đây là những cơ sở quan trọng cho việc

tư vấn người mang thalassemia thể ẩn, giúp họ có chọn lựa để có những đứa con khỏe mạnh, đồng thời hạn chế sự phổ biến của gen bệnh trong cộng đồng

Tần suất những đột biến mất đoạn gen α-globin đặc trưng cho từng vùng lãnh thổ và từng tộc người Trong quá trình xét nghiệm đột biến trên gen α-globin,

những mất đoạn lớn phổ biến được xác định trước tiên bằng phương PCR khoảng cách hay gap PCR Kỹ thuật này đã được áp dụng để phát hiện 2 mất đoạn phổ biến trong α+

-thalassemia là –α3.7, –α4.2 và 5 mất đoạn phổ biến trong αo-thalassemia gồm: –α20,5

, SEA, MedI, T HAI, FIL [6, 42, 58]

Nếu kết quả xét nghiệm gen âm tính với các mất đoạn phổ biến nhưng lại không phù hợp với các đặc điểm lâm sàng bệnh thì cần phải sàng lọc tiếp với các mất đoạn lớn ít phổ biến bằng kỹ thuật MLPA MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) là kỹ thuật mới dựa trên việc khuếch đại đồng thời nhiều đầu dò thay vì khuếch đại trực tiếp từ khuôn ADN Quy trình kỹ thuật bao gồm các bước cơ bản như sau: (1) thiết kế nhiều cặp oligo đầu dò bắt cặp với vùng ADN quan tâm và một mồi để khuếch đại mỗi cặp đầu dò; (3) tiến hành lai đầu dò với vùng ADN quan tâm; (4) tiếp theo nối 2 đầu dò trong cùng 1 cặp lại với nhau; (5) khuếch đại các đầu dò sau nối với 1 cặp mồi; (6) điện di sản phẩm trên

Như đã đề cập, hầu hết đột biến trong bệnh α-thalassemia là các mất đoạn trên

gen α-globin Những đột biến này có thể được phát hiện bằng phương pháp P CR

sử dụng hai mồi thiết kế dựa vào trình tự ở hai vùng biên đoạn đứt gãy Với những đột biến mất đoạn lớn, mồi thiết kế ở hai vùng biên ch khuếch đại được alen mất đoạn mà không thể khuếch đại alen bình thường bởi vì khoảng cách giữa hai mồi quá lớn Kỹ thuật này được gọi là PCR khoảng cách hay "gap PCR"

Theo các nghiên cứu công bố, cho đến nay đã xác định được hơn 35 đột biến

mất đoạn phổ biến trên vùng gen α-globin trong đó có hơn 20 mất đoạn lớn (mất

đoạn 2 gen), 15 đột biến mất đoạn nhỏ (mất đoạn 1 gen) [34, 44] Kỹ thuật gap PCR đơn mồi ch xác định từng mất đoạn đơn lẻ, nên không phù hợp với xét nghiệm thường quy phục vụ cho chẩn đoán bệnh Bởi vì số lượng quy trình xét nghiệm nhiều đồng nghĩa với tăng nhân lực và tăng nguy cơ sai sót do phải thao tác nhiều; bên cạnh đó là việc tăng giá thành xét nghiệm do tiêu hao nhiều vật tư, sinh phẩm Cho nên, cần thiết phải xây dựng quy trình có thể xác định đồng thời nhiều đột biến

PCR đa mồi (multiplex PCR) là giải pháp ưu việt cho việc phát hiện đồng thời nhiều đột biến mất đoạn trong bệnh α-thalassemia Đây là dạng cải tiến của gap PCR khi kết hợp nhiều cặp mồi riêng biệt trong cùng một phản ứng Từ năm

2000 nhóm nghiên cứu của Chong đã công bố kết quả tối ưu thành công quy trình phát hiện đồng thời 5 đột biến mất đoạn phổ biến trong khu vực Đông Nam Á [5] Các nghiên cứu tiếp theo không những phát hiện được đồng thời nhiều mất đoạn hơn mà còn xác định được cả tình trạng lặp gen (αααanti 3.7

và αααanti 4.2) trong cùng một phản ứng PCR [43] Trong khi đó, ở Việt Nam hiện tại ch có 4 t nh thành

(Hà Nội, HCM, TT Huế, Bến Tre) thực hiện xét nghiệm gen phục vụ chẩn đoán bệnh thalassemia [1] Vì vậy xây dựng quy trình xác định đồng thời nhiều đột biến

gen thalassemia được chúng tôi quan tâm nghiên cứu trong đề tài “Xác định đột

biến gen alpha globin gây bệnh Thalassemia bằng kỹ thuật gap PCR đa mồi”

với mục đích (1) thiết kế thành công các cặp mồi phát hiện đột biến; (2) tối ưu hóa được điều kiện PCR cho từng cặp mồi; (3) tối ưu hóa được điều kiện PCR đa mồi; (4) sử dụng điều kiện tối ưu phân tích trên mẫu bệnh phẩm; (5) bước đầu đánh giá

tỷ lệ các đột biến mất đoạn trên nhóm bệnh nhân nghiên cứu

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- 100 mẫu máu ngoại vi được cung c ấp bởi Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2012

- Mẫu nghiên cứu được lựa chọn dựa trên xét nghiệm phân tích tế bào máu có dấu hiệu nghi ngờ bị thalassemia với một trong trong các ch số như: lượng tế bào hồng cầu giảm, thể tích trung bình hồng cầu giảm (MCV < 80 fl), lượng huyết sắc tố

trung bình trong một tế bào hồng cầu giảm (MCH < 27 pg)

 Phenol: Chloroform: Isoamyl (25:24:1)

 Kit tách chiết ADN tổng số ReliaprepT M

Blood gDNA MiniPrep System (Promega)

 Kit nhân dòng gen InsTAcloneT M

PCR Cloning Kit (Fermentas)

 Agarose (Takara)

 Dòng tế bào khả biến Escherichia coli JM109 cung cấp bởi Phòng thí nghiệm

Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

 Các hóa chất thông dụng khác đều đạt độ tinh khiết dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử

2.1.3 Các cặp mồi

Dựa vào các nghiên cứu đã công bố, phân tích các vùng trên cụm gen

α-globin phù hợp với thiết kế mồi, chúng tôi thiết kế 5 mồi xuôi và 6 mồi ngược theo

sơ đồ mô tả trên Hình 6 cho phép phát hiện đồng thời 5 mất đoạn phổ biến nhất

Mồi xuôi α2/3.7-F là mồi chung khuếch đ ại đoạn đột biến 3.7 và đoạn α2 để kiểm tra tính đồng hợp, dị hợp tử đột biến Năm cặp mồi phát hiện 5 mất đoạn phổ biến là: T HAI, FIL, SEA, -α3.7 và -α4.2 Ngoài ra chúng tôi còn thiết kế thêm

cặp mồi nội kiểm nhân đoạn LIS nằm trên nhiễm sắc thể 17

Hình 6 Sơ đồ thiết kế mồi phát hiện 5 mất đoạn phổ biến trong bệnh

alpha thalassemia [5, 6, 57]

Trình tự, chiều dài mồi và kích thước sản phẩm PCR với mỗi cặp mồi được

diễn giải chi tiết trong Bảng 1 Trong đó, cặp mồi α2/3.7-F và α2-R nhân đoạn α2

để kiểm tra tính đồng hợp, dị hợp của đột biến Các cặp mồi SEA-F/R, THAI-F/R,

FIL-F/R, α2/3.7-F/3.7-R, 4.2-F/R dùng trong phản ứng PCR để phát hiện các

đột biến tương ứng trên gen α-globin Cặp mồi M13-F/R để sàng lọc khuẩn lạc

trong giai đoạn tách dòng các đoạn đột biến Các mồi dùng trong nghiên cứu này

được cung cấp bởi hãng IDT (Mỹ)

(1144 bp)

(546 bp) FIL-R ATAACCTTTATCTGCCACATGTAGC

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Với mục đích xác định đồng thời nhiều đột biến mất đoạn trên gen α-globin,

chúng tôi bố trí sơ đồ thí nghiệm như Hình 7 gồm các bước: (1) thu nhận mẫu bệnh phẩm (200 µl máu ngoại vi), (2) tách chiết ADN tổng số bằng kit thương mại (3) kiểm tra chất lượng ADN bằng phương pháp điện di, xác định nồ ng độ và

độ tinh sạch bằng phương pháp đo mật độ quang học; (4) tối ưu hóa điều kiện PCR với cặp mồi nội kiểm LIS và α2 và khuôn là ADN đạt chất lượng (5) tách dòng và giải trình tự vùng đột biến của mẫu ADN cho kết quả dương tính (6) tối ưu hóa điều kiện cho phản ứng PCR đa mồi Tham khảo các tài liệu về tối ưu hóa phản ứng PCR đa mồi nói chung và những nghiên cứu PCR đa mồi trong mất đoạn alpha thalassemia, c húng tôi tập trung vào 3 vấn đề trọng tâm: thứ nhất là tối ưu hóa theo dải nhiệt độ gắn mồi; thứ hai là tối ưu hóa theo t ỷ lệ nồng độ các mồi; thứ ba là

sử dụng thêm một số chất tăng cường phản ứng để hỗ trợ cho việc khuếch đại nhiều trình tự đích (7) Áp dụng điều kiện tối ưu cho PCR đa mồi để xác định đột biến cho các mẫu bệnh phẩm (8) thống kê phân tích số liệu nghiên cứu

Hình 7 Sơ đồ nghiên cứu (1) thu thập mẫu bệnh phẩm; (2) tách chiết ADN;

(3) kiểm tra chất lượng và nồng độ ADN; (4) tối ưu hóa PCR cho cặp mồi đơn; (5) tách dòng đoạn mang đột biến; (6) tối ưu hóa PCR đa mồi; (7) sàng lọc trên mẫu bệnh phẩm; (8) phân tích số liệu nghiên cứu

2.2.2 Phương pháp xác định nồng độ ADN bằng đo quang phổ

Để kiểm tra chất lượng và xác định nồng độ ADN, trong nghiên cứu này chúng tôi kết hợp phương pháp điện di và đo quang phổ Phương pháp điện di nhằm kiểm tra mức độ đứt gãy ADN, còn phương pháp đo quang phổ để xác định nồng độ

và độ sạch của ADN (1,8 < A260/A280 < 2) Phương pháp này dựa trên nguyên lý hấp phụ ánh sáng cực đại của ADN tại bước sóng 260 nm Nồng độ ADN được tính theo công thức sau:

[ADN] = Α260 x n x 50 (µg/ml) Trong đó: Α260 là độ hấp thụ của ADN ở bước sóng 260 nm

n là số lần pha loãng mẫu

50 là nồng độ ADN ứng với Α260 = 1

A260/A280 thể hiện độ sạch ADN

2.2.3 Kỹ thuật PCR đa mồi

Trong nghiên c ứu này, phản ứng PCR được sử dụng để khuếch đ ại các đoạn nội kiểm, đoạn mang đột biến và kiểm tra vector mang đoạn chèn sau khi tách dòng Phản ứng PCR đa mồi khuếch đại được đồng thời 5 đoạn có kích thước khác nhau:

1 đoạn nội kiểm LIS, 1 đoạn xác định đồng hợp/dị hợp tự gen α2-globin, 3 mất đoạn

phổ biến nhất gồm SEA, -α3.7 và -α4.2 Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại các cặp mồi đơn được trình bày trên Bảng 2 Trong đó, nhiệt độ gắn mồi cho các đoạn LIS, a2, SEA, THAI, FIL, α3.7, α4.2 lần lượt là 62, 63, 64, 60, 60, 65 và 64o

C Thời gian gắn mồi cho các cặp mồi khuếch đại các đoạn này lần lượt là 1 phút,

1 phút, 1 phút 30 giây, 30 giây, 30 giây, 2 phút 30 giây và 2 phút 30 giây

Biến tính : 940

C trong 30"

Gắn mồi : 600

C - 650C trong 30” - 2' 30" (tùy thuộc vào từng cặp mồi)

2.2.5 Phương pháp tách dòng

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng High Pure PCR Product Purification Kit

(Roche) sau đó đưa vào vector pTZ57R/T theo quy trình của InsTAcloneT M

PCR Cloning Kit (Fermentas)

2.2.5.1 Biến nạp bằng sốc nhiệt

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp sốc nhiệt để biến nạp

các vector tái tổ hợp vào tế bào E coli JM109 Các tế bào vi khuẩn được xử lý

với CaCl2 có màng trở nên xốp, tạo điều kiện cho ADN plasmid đi qua các lỗ trên màng khi nhiệt độ thay đổi đột ngột Quy trình thực hiện gồm các bước

cơ bản sau:

 Lấy tế bào khả biến E coli JM 109 từ -80oC, để trên đá 5 phút

 Bổ sung 5 µl hỗn hợp của phản ứng nối, búng nhẹ, ủ trên đá 30 phút

 Sốc nhiệt hỗn hợp ở 42oC trong 45 giây, để lại trên đá 3 phút

 Bổ sung 1 ml môi trường LB, ủ 37oC trong 15 phút, lắc 200 vòng/phút ở

2.2.5.2 Sàng lọc khuẩn lạc và nuôi tế bào bão hòa

Mỗi khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch LB bổ sung ampicillin được sàng lọc nhanh bằng kĩ thuật PCR Khuẩn lạc cho băng ADN có kích thước phù hợp sẽ được sàng lọc tiếp bằng cách nuôi bão hòa qua đêm trong môi trường LB bổ sung ampicillin (50 µg/ml) lắc 200 vòng/phút ở 370C qua đêm, tách plasmid và cắt kiểm tra với enzyme giới hạn

2.2.5.3 Tách plasmid

ADN plasmid được tách chiết theo quy trình trong Molecular Cloning – A

Laboratory Manual gồm các bước như sau

 Ly tâm thu cặn tế bào, 6,000 vòng/phút ở 40C trong 5 phút

 Hòa tan cặn tế bào trong 100 µl dung dịch I (Tris-HCl 25 mM pH 8, glucose 50 mM, EDTA 10 mM pH 8) có bổ sung RNase 20 µg/ml, ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng

 Thêm 200 µl dung dịch II (NaOH 0,2 N, SDS 1%), trộn nhẹ, ủ trên đá trong 3 phút

 Thêm 150 µl dung dịch III (CH3COOK 3M pH 5,2), trộn nhẹ, ủ trên đá trong 5 phút

 Ly tâm 13,000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút để thu dịch trong

 Bổ sung 1 thể tích Phenol : Chloroform : Isoamyl (25 : 24 : 1), trộn nhẹ

 Ly tâm 13,0 00 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, thu dịch pha trên

 Bổ sung 0,6 thể tích isopropanol, ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút

 Ly tâm 13,000 vòng/phút ở 40C trong 20 phút, thu tủa

 Rửa tủa bằng 500 µl ethanol 70%, ly tâm 13,000 vòng/phút ở 40C trong 5 phút, thu tủa và làm khô tủa

 Hòa tủa trong 30µl H2O, bảo quản ở -200

C