nghiên cứu tinh sạch và xác định tiềm năng chống ung thư của piperine từ hồ tiêu đen (piper nigrum l )

Hóa trị liệu là phương pháp sử dụng các hóa chất thích hợp truyền vào cơ thể để tiêu diệt một loại tế bào ung thư nào đó.. Hóa trị được sử dụng trong trường hợp phẫu thuật và xạ trị đã k

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Nguyễn Thị Thu Hương

NGHI£N CøU TINH S¹CH Vµ X¸C §ÞNH TIÒM N¡NG

CHèNG UNG TH¦ CñA PIPERINE Tõ Hå TI£U §EN

(PIPER NIGRUM L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2013

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Nguyễn Thị Thu Hương

NGHI£N CøU TINH S¹CH Vµ X¸C §ÞNH TIÒM N¡NG

CHèNG UNG TH¦ CñA PIPERINE Tõ Hå TI£U §EN

(PIPER NIGRUM L.)

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số : 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THỊ HỒNG VÂN

Hà Nội - 2013

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS

Nguyễn Thị Hồng Vân, người thầy đã tận tình hướng dẫn và khích lệ tinh thần

giúp tôi hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Phạm Thị Lương Hằng và

TS Hoàng Thị Mỹ Nhung, những nhà khoa học đã tạo điều kiện tốt nhất,giúp

tôi giải đáp những thắc mắc trong thời gian tiến hành luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS Trần Thị Thùy Anh, ThS Ngô Thị

Trang và ThS Bùi Thị Vân Khánh, những cán bộ nghiên cứu đã giành nhiều

thời gian và tâm huyết trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình tiến hành thí nghiệm

Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong bộ môn Di truyền, khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã luôn quan tâm, giúp đỡ tôi hoàn thành nghiên cứu

Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các anh chị, các bạn, các

em trong các phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Di truyền học, Bộ môn Sinh lý thực vật - Hóa sinh và Bộ môn Sinh học tế bào đã nhiệt tình chỉ bảo, chia sẻ kinh nghiệm, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và làm việc

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến những người thân trong gia đình cùng những người bạn đã hết lòng ủng hộ, cổ vũ và giúp đỡ tôi trong học tập cũng như cuộc sống, giúp tôi yên tâm hoàn thành công việc

Hà Nội, ngày 24 tháng 12 năm 2013

Nguyễn Thị Thu Hương

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ATCC American Type Culture Collection

CDK Cyclin dependent kinase

CTHH Công thức hóa học

CTPT Công thức phân tử

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

FBS Fetal bovine serum – Huyết thanh thai bò

HPLC High performance liquid chromatography - Sắc ký lỏng cao áp IGF - 1 Insulin like Grow Factor-1 - Yếu tố tăng trưởng 1 giống Insuline IPA Isopropyl alcohol

LCMS Liquid chromatography mass spectrometry – Sắc ký lỏng khối phổ N-hex N-hexane

MCf – 7 Michigan Cancer Foundation - 7

MTT (3–(4,5-dimethylthiazol–2–yl) –5– (3 – carbocymethoxyphenyl) –

2– (4 -sulfophenyl) –2H– tetrazolium) PBS Phosphate buffered saline

Ppm Parts per million

Rf Retardation factor - Hệ số di động

RPMI Roswell park memorial institute medium

TLC Thin layer chromatography - Sắc ký bản mỏng

UV Ultraviolet - Tia cực tím

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Quá trình phát sinh và di căn ung thư [31] 4

Hình 2 Các giai đoạn cơ bản của quá trình phát sinh ung thư [2, 20] 7

Hình 3 Henrietta Lacks và dòng tế bào Hela [4] 11

Hình 4 Dòng tế bào ung thư vú MCF-7 [38] 12

Hình 5 Cây và quả Hồ tiêu 13

Hình 6 Cấu trúc hóa học của Piperine [31] 15

Hình 7 Quá trình sinh tổng hợp Piperine [39] 16

Hình 8 Minh họa các bước sắc ký bản mỏng [23] 21

Hình 9 Minh họa quá trình sắc ký cột [23] 22

Hình 10 Hệ thống HPLC [28] 24

Hình 11 Phản ứng xảy ra trong phương pháp MTT [14] 27

Hình 12 Sơ đồ thu dịch chiết tổng số trong methanol 32

Hình 13 Bố trí thí nghiệm thử độc tính của dịch chiết Hồ tiêu và Piperine trên tế bào ung thư MCF - 7 bằng phương pháp MTT 39

Hình 14 Bố trí thí nghiệm thử độc tính của dịch chiết Hồ tiêu và Piperine trên tế bào ung thư Hela bằng phương pháp MTT 40

Hình 15 Hàm lượng cao khô thu được từ hai quy trình tách chiết 42

Hình 16 Sắc ký đồ các mẫu Hồ tiêu trong ethanol : n-hexane : ethyl acetate (trái )và n - hexane : ethyl acetate (phải) (UV 254 nm) 43

Hình 17 Sắc ký đồ các mẫu Hồ tiêu trong n - hexane : ethyl acetate (trái) hexane : chloroform : nitroethane : ethyl acetate : acetone : methanol : acetonitrile : nước (phải) [46] 44

Hình 18 Sắc ký đồ mẫu Hồ tiêu 1 (T1) trong hệ dung môi n-hexane : ethyl acetate với tỷ lệ a) 9 : 1 b) 8 : 2 c) 7 : 3 (UV 254 nm) 45

Hình 19 Sắc ký đồ các phân đoạn của mẫu Hồ tiêu 5 (T5) (UV 365 nm) 46

Hình 20 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Piperine dùng để phân tích các mẫu dịch chiết tổng số Hồ tiêu 48

Hình 21 Đồ thị diện tích peak phụ thuộc vào nồng độ Piperine dựa vào sắc ký đồ dung dịch chuẩn dùng để nghiên cứu các mẫu dịch chiết tổng số Hồ tiêu 49

Hình 22 Sắc ký đồ mẫu Hồ tiêu 2 (T2) 50

Hình 24 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Piperine dùng để phân tích các mẫu Piperine tinh sạch 53

Hình 25 Đồ thị diện tích peak phụ thuộc vào nồng độ Piperine dựa vào sắc ký đồ dung dịch chuẩn dùng để nghiên cứu các mẫu Piperine tinh sạch 54

Hình 26 Sắc ký đồ mẫu Piperine 2 (P2) 55

Hình 27 Các dòng tế bào ung thư Hela (trái) và MCF – 7 (phải) 57

sau 48h nuôi cấy 57

Hình 28 Tế bào MCF - 7 trong môi trường bổ sung DMSO 0.5% 58

Hình 29 Tế bào ung thư MCF – 7 sau 24h ủ mẫu Tiêu 2 (T2) ở các nồng độ a)100 µg/ml b) 10 µg/ml c) 1 µg/ml 59

Hình 30 Tế bào ung thư MCF – 7 sau 24h ủ mẫu Tiêu 4 (T4) ở các nồng độ a) 100 µg/ml; b) 10 µg/ml; c) 1 µg/ml 59

Hình 31 Tế bào ung thư MCF – 7 sau 24h ủ mẫu Piperine 2 (P2) ở các nồng độ a) 100 µg/ml b) 10 µg/ml c) 1 µg/ml 60

Hình 32 Tế bào MCF - 7 sau 24h ủ với Taxol ở nồng độ 0.1 µg/ml (trái) và 10 µg/ml (phải) 60

Hình 33 Đồ thị mô tả sự phụ thuộc A% vào nồng độ thuốc thử của các mẫu T2, T4, P2 trên dòng tế bào MCF - 7 61

Hình 34 Tế bào Hela trong môi trường bổ sung DMSO 0.5% 64

Hình 35 Tế bào Hela sau 24h ủ mẫu Hồ tiêu 2 (T2) ở nồng độ 10 µg/ml (trái) và 100 µg/ml (phải) 65

Hình 36 Tế bào Hela sau 24h ủ chất Hồ tiêu 4 (T4) ở nồng độ 10 µg/ml (trái) và 100 µg/ml (phải) 65

Hình 37 Tế bào Hela sau 24h ủ chất Piperine 2 (P2) ở nồng độ 10 µg/ml (trái) và 100 µg/ml (phải) 66

Hình 38 Đồ thị mô tả sự phụ thuộc A% vào nồng độ thuốc thử của các mẫu T2, T4, P2 trên dòng tế bào Hela 67

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Danh sách mẫu dược liệu và địa điểm thu mẫu 29 Bảng 2 Hàm lượng cao khô thu được từ hai quy trình tách chiết 41 Bảng 3 Hàm lượng Piperine trong các mẫu Hồ tiêu thông qua định lượng bằng sắc ký cột 47 Bảng 4 Hàm lượng Piperine có trong các mẫu Hồ tiêu thông qua định lượng bằng HPLC 51 Bảng 5 Hiệu suất tinh sạch Piperine bằng sắc ký cột 52 Bảng 6 Hàm lượng Piperine có trong mẫu tinh sạch 56 Bảng 7 Kết quả đo OD và chỉ số tăng sinh A% của các mẫu T2; T4; P2 và Taxol đối với dòng tế bào MCF – 7 62 Bảng 8 Chỉ số IC50 của các mẫu T2, T4, P2 trên dòng tế bào MCF – 7 62 Bảng 9 Kết quả đo OD và chỉ số tăng sinh A% của các mẫu T2; T4; P2 và Taxol đối với dòng tế bào ung thư Hela 67 Bảng 10 Chỉ số IC50 của các chất T2, T4, P2 trên dòng tế bào Hela 68

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Khái quát về ung thư 3

1.1.1 Khái niệm và hiện trạng 3

1.1.2 Cơ chế di truyền gây bệnh ung thư 4

1.1.3 Các phương pháp điều trị 8

1.1.4 Một số dòng tế bào ung thư dùng trong nghiên cứu 11

1.1.4.1 Dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela 11

1.1.4.2 Dòng tế bào ung thư vú MCF-7 12

1.2 Hồ tiêu (Piper nigrum L.) và Piperine 12

1.2.1 Hồ tiêu (Piper nigrum L.) 12

1.2.1.1 Đặc điểm sinh học 12

1.2.1.2 Thành phần hóa học 14

1.2.1.3 Ứng dụng 14

1.2.2 Piperine 15

1.2.2.1 Nguồn gốc, cấu trúc và tính chất hóa học 15

1.2.2.2 Một số phương pháp tinh sạch Piperine từ Hồ tiêu 17

1.2.2.3 Nghiên cứu về Piperine trong lĩnh vực điều trị ung thư 18

1.3 Kỹ thuật tinh sạch hợp chất và thử độc tính trên tế bào 20

1.3.1 Kỹ thuật tinh sạch hợp chất 20

1.3.1.1 Sắc ký bản mỏng (TLC – Thin Layer Chromatography) 20

1.3.1.2 Sắc ký cột 22

1.3.1.3 Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 22

1.3.2 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 25

1.3.2.1 Khái niệm 25

1.3.2.2 Điều kiện nuôi cấy 25

1.3.2.3 Các kỹ thuật nuôi cấy cơ bản 26

1.3.3 Kỹ thuật nghiên cứu tác động của chất lên tế bào 27

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Đối tượng nghiên cứu 29

2.2 Hóa chất, thiết bị và sinh phẩm 29

2.2.1 Hóa chất 29

2.2.2 Thiết bị 30

2.2.3 Sinh phẩm 30

2.3 Phương pháp nghiên cứu 30

2.3.1 Thu dịch chiết tổng số 30

2.3.2 Định tính Piperine bằng sắc kí bản mỏng (TLC) 32

2.3.3 Phân đoạn dịch chiết tổng số, tinh sạch Piperine bằng sắc ký cột 33

2.3.4 Định lượng dịch chiết tổng số và xác định độ tinh sạch của Piperine bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 34

2.3.4.1 Định lượng dịch chiết tổng số 34

2.3.4.2 Xác định độ tinh sạch của Piperine 36

2.3.5 Nuôi cấy tế bào ung thư 37

2.3.5.1 Hoạt hóa và nuôi cấy tế bào 37

2.3.5.2 Cấy chuyển tế bào 38

2.3.6 Nghiên cứu tác động của Piperine trên dòng tế bào ung thư Hela và MCF – 7 38

2.3.6.1 Phương pháp thử độc tính MTT trên dòng tế bào MCF – 7 39

2.3.6.2 Phương pháp thử độc tính MTT trên dòng tế bào Hela 40

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Kết quả tinh sạch Piperine từ Hồ tiêu đen 41

3.1.1 Hiệu suất thu cao khô từ 5 mẫu Hồ tiêu đen 41

3.1.2 Kết quả định tính Piperine bằng sắc ký bản mỏng(TLC) 42

3.1.3 Kết quả tinh sạch Piperine bằng sắc ký cột 45

3.1.4 Kết quả định lượng và đánh giá độ tinh sạch của Piperine bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 47

3.1.4.1 Kết quả định lượng Piperine trong dịch chiết tổng số Hồ tiêu đen 47

3.1.4.2 Kết quả HPLC mẫu Piperine tinh sạch qua sắc ký cột 52

3.2 Kết quả nghiên cứu mức độ tác động của Piperine trên một số dòng tế bào ung thƣ 56

3.2.1 Kết quả nuôi cấy dòng tế bào ung thư Hela và MCF – 7 56 3.2.2 Kết quả thử nghiệm mức độ tác động của Piperine đối với dòng tế bào

MCF – 7 57

3.2.3 Kết quả thử nghiệm mức độ tác động của Piperine đối với dòng tế bào Hela

64

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71

MỞ ĐẦU

Trong số các bệnh nan y, ung thư luôn được coi là một căn bệnh nguy hiểm hàng đầu Hàng năm số ca mắc bệnh và tử vong vì ung thư trên thế giới ngày càng tăng cao Thực tế trên đặt ra áp lực cho ngành y tế và khoa học cần cấp thiết tìm ra các biện pháp hữu hiệu để phòng tránh và điều trị căn bệnh ung thư

Những biện pháp điều trị ung thư phổ biến hiện nay là phẫu thuật, xạ trị và hóa chất; tuy có khả năng chữa được bệnh nhưng hiệu quả không cao và còn gây đau đớn cũng như những di chứng nặng nề cho bệnh nhân Do đó vấn đề đặt ra là tìm được biệt dược và phương pháp chữa trị hiệu quả để hạn chế thấp nhất những ảnh hưởng nguy hiểm trên Một trong hướng đi mới mà các nhà khoa học trên thế giới đang nghiên cứu đó là sử dụng các hợp chất tự nhiên có sẵn trong các loài thực vật nhằm kìm chế cũng như tiêu diệt tế bào ung thư [8, 21]

Ngay từ thời cổ đại, con người đã biết sử dụng các loại cây cỏ tự nhiên để chữa một số bệnh thông thường như bệnh ngoài da, cầm máu, ho, sốt… Nền y học

cổ truyền phát triển, kèm theo là sự phát hiện rất nhiều các các loại thảo dược cũng như khám phá được hàng loạt công dụng của chúng và sáng tạo ra hàng trăm ngàn các bài thuốc chữa bệnh dựa vào sự phối hợp các loại thảo dược Tuy nhiên, phần lớn các bài thuốc cổ truyền đều được xuất phát từ kinh nghiệm dân gian, chưa dựa trên cơ sở khoa học đầy đủ về tác dụng đặc hiệu của thuốc Bên cạnh

đó, các loài thảo dược hầu hết đều có thành phần phức tạp, bao gồm cả thành phần có hoạt tính sinh học và các chất không có hoạt tính sinh học, thậm chí là chứa thành phần gây độc Do đó, hiệu quả chữa bệnh của thảo dược tự nhiên còn hạn chế Để khắc phục những nhược điểm này, các chương trình sàng lọc thuốc được tiến hành dựa trên việc phân tích thành phần thảo dược, từ đó tìm ra thành phần có hoạt tính, các đích tác dụng cụ thể của nó rồi tinh sạch và biến chúng thành các loại thuốc tân dược khác nhau [3,6]

Mới chỉ có khoảng 1% các loài thực vật nhiệt đới đã được nghiên cứu tiềm

năng dược phẩm, do đó khả năng tìm kiếm được các loại hợp chất từ các loài nhiệt đới để ứng dụng cho việc sàng lọc thuốc mới là rất lớn [32] Điều đó cho thấy tiềm năng khai thác dược phẩm của Việt Nam, một trong những nước nhiệt đới có mức độ đa đạng thực vật cao, là rất khả quan

Hồ tiêu đen (Piper nigrum L.) là một loài thực vật nhiệt đới được trồng rộng

rãi ở Việt Nam với thành phần chính là Piperine Trên thế giới đã có nhiều đề tài nghiên cứu về tác động của Hồ tiêu đen nói chung và Piperine nói riêng đối với các dòng tế bào ung thư khác nhau Dựa trên mục đích và tiềm năng, chúng tôi thực

hiện đề tài: “Nghiên cứu tinh sạch và xác định tiềm năng chống ung thƣ của

Piperine từ Hồ tiêu đen (Piper nigrum L )” Mục tiêu của đề tài là tinh sạch hợp

chất Piperine từ cây Hồ tiêu đen, thử hoạt tính trên một số dòng tế bào ung thư, xác định mức độ tác động của hợp chất lên sự phát triển của tế bào, từ đó bước đầu đánh giá tiềm năng chống ung thư của Piperine

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát về ung thư

1.1.1 Khái niệm và hiện trạng

Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới, hằng năm có khoảng 9 triệu người chết vì căn bệnh ung thư trên tổng số 15 triệu người mới mắc bệnh Hội nghị khoa học quốc tế về phòng chống ung thư tổ chức tại Bệnh viện Bạch Mai ngày 11/04/2013 đã thống kê rằng mỗi năm có khoảng 110 000 ca mắc ung thư mới tại Việt Nam Số tử vong do ung thư hàng năm lên đến 82 000 trường hợp, tỉ lệ tử vong/mắc lên đến 73.5% và vào loại cao hàng đầu thế giới Bên cạnh đó, hội thảo cũng đưa ra 15 loại ung thư thường gặp nhất ở Việt Nam đó là ung thư phổi, vú, đại trực tràng, dạ dày, gan, tiền liệt tuyến, tử cung/cổ tử cung, thực quản, bàng quang, u lympho không Hodgkin, khoang miệng, bệnh bạch cầu, tụy, buồng trứng và thận, trong đó thường gặp nhất ở nam giới là ung thư phổi và nữ giới là ung thư vú Trong nhiều năm gần đây, các phòng thí nghiệm trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về bản chất, cơ chế phát sinh của các bệnh ung thư khác nhau và nhờ đó chúng

ta đã có những hiểu biết cơ bản về căn bệnh này

Ung thư xuất hiện chủ yếu là do các rối loạn di truyền Trong một số trường hợp, các rối loạn này hình thành do ảnh hưởng của yếu tố môi trường (tia cực tím, các hóa chất độc hại…) Các dạng ung thư thường xuất hiện do đột biến xảy ra ở các gen thiết yếu, gây ra sự sai hỏng trong quá trình trao đổi chất làm cơ thể mất khả năng kiểm soát sự phân chia tế bào [26] Lúc này các tế bào ung thư phân chia không ngừng, dần dần hình thành nên khối u gồm nhiều lớp tế bào nằm chồng chất lên nhau Khi các tế bào tách khỏi khối u và xâm lấn sang các mô xung quanh, khối

u chuyển thành dạng u ác tính U ác tính có thể phát tán tới các vùng khác nhau của

cơ thể và hình thành nên các khối u thứ cấp Quá trình này được gọi là sự di căn (Hình 1) [2, 13, 31] Hiện nay đã phát hiện được khoảng 200 loại ung thư khác nhau được mô tả Các dạng ung thư có thể xuất hiện từ nhiều loại mô khác nhau của cơ

thể, một số phát triển rất nhanh, một số phát triển chậm hơn Dạng ung thư phổ biến nhất ở nam giới là ung thư tiền liệt tuyến, ở nữ giới là ung thư vú Dạng ung thư phổ biến nhất ở cả hai giới là ung thư phổi [29]

Hình 1 Quá trình phát sinh và di căn ung thƣ [31]

Dựa vào nguồn gốc phát sinh của ung thư, người ta chia ung thư ra thành 3 loại: Ung thư phát sinh do các đột biến tự phát trong các tế bào soma, ung thư phát sinh từ các đột biến tế bào mầm sinh dục và ung thư phát sinh do virus Trong đó ung thư soma là dạng phổ biến nhất và không có khả năng di truyền Ung thư mầm sinh dục chỉ chiếm từ 0.1% đến 10% [12]

1.1.2 Cơ chế di truyền gây bệnh ung thư

Như đã trình bày ở trên, tế bào ung thư hình thành là do sự sai hỏng trong quá trình nhân đôi tế bào Một chu trình tế bào bình thường gồm 4 pha: G1, S, G2

và M Trong đó các 3 pha đầu tiên đóng vai trò chuẩn bị cho pha M (Mytosis) để từ một tế bào mẹ phân đôi thành 2 tế bào con mang vật chất di truyền giống nhau Thời gian kéo dài của mỗi chu trình và mỗi pha được điều khiển chặt chẽ bởi các

phân tử tín hiệu nội bào và ngoại bào Sự chuyển đổi từ pha này sang pha kia trong chu trình tế bào là do sự phối hợp điều khiển của nhiều phân tử tín hiệu nhất định và biểu hiện bằng những đáp ứng chính xác và đặc trưng của tế bào với từng loại tín hiệu tương ứng Nếu có sai sót trong quá trình truyền tín hiệu, hoặc đáp ứng các tế bào thiếu chính xác, các tế bào có thể phân chia vô hạn và chuyển sang trạng thái ung thư

Bằng các kỹ thuật di truyền, các nhà khoa học đã chứng minh được rằng nguyên nhân gây phá hỏng chu trình tế bào chuyển sang trạng thái ung thư là do sai hỏng của các gen Có hai nhóm gen chính khi bị đột biến có liên quan trực tiếp đến

sự phát sinh ung thư là gen ung thư và gen ức chế khối u

Các gen gây khối u (hay còn được gọi là các gen ung thư oncogen) là một nhóm các gen mà sản phẩm protein của chúng trực tiếp hay gián tiếp tham gia điều khiển sự biểu hiện của các gen có vai trò tăng cường phân bào Các gen gây khối u đầu tiên được phát hiện ở retrovirus có khả năng gây khối u ở vật chủ khi bị lây

nhiễm Một ví dụ về nhóm gen này đó là gen v – sis gây khối u sacom ở khỉ Gen v – sis của virus mã hóa cho một protein giống với yếu tố tăng trưởng PDGF có

nguồn gốc từ tiểu cầu Khi xâm nhập vào cơ thể thì gen này biểu hiện theo cơ chế không được kiểm soát dẫn đến hình thành khối u

Một số gen có trình tự tương đồng với gen gây khối u ở retrovirus được tìm thấy ở các vật chủ Nhóm gen này được gọi là các tiền gen gây khối u ở tế bào vật chủ Bình thường, các tiền gen gây khối u có chức năng điều hòa các hoạt động tăng sinh của tế bào và không có khả năng gây ra khối u Tuy nhiên, khi các gen này bị đột biến sẽ dẫn đến sự mất cân bằng trong quá trình sinh hóa và khiến tế bào chuyển

sang trạng thái ung thư Gen c – ras là một tiền gen gây khối u ở người Các đột

biến ở gen này đều liên quan đến sự thay đổi acid amin tại vị trí 12, 59 và 61; chuyển protein Ras thành dạng phân tử kích thích phân bào, gây nên sự phân chia không kiểm soát của tế bào

Một nhóm gen quan trọng khác cũng liên quan đến quá trình phát sinh ung thư đó là các gen ức chế khối u (tumor suppressor gene) hay gen chống ung thư (anti - oncogene) Sản phẩm protein của các gen ức chế khối u tham gia vào nhiều hoạt động khác nhau của tế bào như điều khiển phân bào, biệt hóa tế bảo, sửa chữa ADN và sự chết theo chương trình của tế bào Khi các gen này bị đột biến sẽ gây rối loạn các hoạt động của tế bào và dẫn đến trạng thái ung thư Một số ví dụ điển hình

về gen ức chế khối u đó là gen pRB và gen TP53.Gen pRB giữ vai trò điều hòa chu

trình tế bào, đột biến ở gen này gây ra khối u ở nhiều mô khác nhau như ung thư

phổi, bàng quan… Gen TP53 mã hóa cho protein ức chế khối u p53 Protein p53

đóng vai trò quan trọng trong việc điều khiển các hoạt động sửa chữa ADN bị sai hỏng đồng thời kích hoạt một hệ thống tiêu diệt các tế bào mang đột biến không thể sửa chữa được Đột biến gen TP53 làm biến đổi cấu trúc protein 53 khiến protein này không thể gắn được vào các gen cần thiết để kích hoạt phiên mã gen, kết quả dẫn đến hội chứng Li - Fraumeni liên quan đến một loạt các dạng ung thư khác nhau Hầu hết các bệnh ung thư có biểu hiện di truyền theo dòng họ thì đều liên quan đến đột biến ở các gen ức chế khối u

Trong thực tế, sự hình thành các khối u và di căn ung thư đa phần phụ thuộc vào sự tích lũy nhiều đột biến khác nhau Các đột biến này có thể liên quan đến các tiền gen gây khối u hoặc gây bất hoạt các gen ức chế khối u, dẫn đến một loạt các sai hỏng trong điều hòa sinh trưởng, phát triển và sửa chữa ADN Các đột biến này

có thể là đột biến tự phát, do ảnh hưởng của môi trường đến tế bào hay do di truyền

Cơ chế phát sinh ung thư hết sức đa dạng tuy nhiên có thể tóm tắt như sau: Đầu tiên các tế bào ung thư nhận được tín hiệu tăng sinh và phân bào từ các phân tử tín hiệu nội và ngoại bào, dẫn đến sự phân chia không giới hạn Các tế bào ung thư này mất khả năng đáp ứng với tín hiệu ức chế phân bào, có khả năng vượt qua các điểm kiểm tra trong chu trình tế bào để tiếp tục nhân lên một cách mất kiểm soát Không những vậy, chúng còn có khả năng vượt qua cơ chế chết theo chương trình được điều khiển bởi protein p53 để tiếp tục sinh trưởng và phát triển Sau đó, các tế

bào ung thư vượt qua giới hạn phân bào bằng việc gắn thêm đầu mút NST nhờ hoạt động mạnh của enzyme telomerase và trở thành tế bào bất tử Thậm chí chúng còn phát triển mạnh hệ thống tự nuôi dưỡng bằng việc hình thành một loạt các mạch máu cung cấp dinh dưỡng cho khối u Được cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng, các

tế bào càng phát triển mạnh hơn đến khi có khả năng xâm lấn các vùng khác và hình thành các khối u mới Trong quá trình di căn này, các tế bào khối u di chuyển theo đường mạch máu và mạch bạch huyết đến nhiều mô khác nhau trong cơ thể, hình thành các khối u thứ cấp ở các vị trí rất xa khối u nguyên phát Đến giai đoạn này, việc điều trị trở lên rất khó khăn và phức tạp (Hình 2) [2, 12, 20]

Hình 2 Các giai đoạn cơ bản của quá trình phát sinh ung thƣ [2, 20]

Từ những hiểu biết về cơ chế phát sinh ung thư, hiện nay các nhà khoa học khuyến khích việc phát hiện chẩn đoán khối u sớm để đề ra các phương pháp điều trị thích hợp và hiệu quả

Duy trì tín hiệu tăng sinh

Trốn tránh ức chế sinh trưởng

Kích hoạt xâm lấn

và di căn

Chuyển sang dạng bất tử

Hình thành các

mạch máu

Chống cơ chế chết

theo chương trình

1.1.3 Các phương pháp điều trị

Hiện nay tại Việt Nam đã áp dụng một số phương pháp điều trị ung thư, tuy nhiên hiệu quả điều trị chưa cao, nguyên nhân chủ yếu là do các trường hợp mắc bệnh được phát hiện ở giai đoạn muộn khi các tế bào ung thư đã chuyển sang dạng ác tính và di căn Một số phương pháp điều trị chủ yếu là phẫu thuật, xạ trị, hóa trị liệu

Phẫu thuật là phương pháp mổ cắt bỏ khối u ung thư nên chỉ có giá trị triệt

để khi khối u ở giai đoạn đầu, còn khu trú Nếu khối u di căn, phẫu thuật chỉ có hiệu lực tạm thời, thậm chí trong một số trường hợp còn kích thích sự di căn và phát triển của khối u

Bên cạnh phương pháp phẫu thuật, người ta còn sử dụng phương pháp xạ trị nhằm tiêu diệt tế bào ung thư bằng cách làm tổn thương các mạch máu tới nuôi chúng Tuy nhiên, tương tự như phẫu thuật, khi khối u đã di căn thì không thể sử dụng xạ trị Bên cạnh đó, một số ung thư chống chỉ định của xạ trị là ung thư dạ dày, đại trực tràng, tụy… Biến chứng của xạ trị khá trầm trọng, ảnh hưởng lâu dài đến sức khỏe người bệnh, gây tổn thương các mô lành, làm mô bị chai cứng, gây biến chứng tại các tạng rỗng ảnh hưởng đến quá trình tiêu hóa, gây chảy máu tại các chỗ lở loét Ngoài ra xạ trị còn có khả năng gây ra bệnh ung thư khác cho người bệnh Nếu xạ trị liên tục kéo dài có thể làm sức khỏe kiệt quệ, mất sức đề kháng, dễ mắc các bệnh nhiễm trùng, nếu không có hạn chế và bồi dưỡng thích hợp, có thể làm bệnh nhân chết trước khi chết vì ung thư

Hóa trị liệu là phương pháp sử dụng các hóa chất thích hợp truyền vào cơ thể

để tiêu diệt một loại tế bào ung thư nào đó Hiện nay người ta đã có trên 50 loại thuốc khác nhau được đưa vào để điều trị bệnh ung thư Hóa trị được sử dụng trong trường hợp phẫu thuật và xạ trị đã không còn hiệu lực như trường hợp ung thư đã di căn, ung thư máu, ung thư hạch… người ta có thể dùng kết hợp nhiều loại thuốc hoặc kết hợp với các phương pháp điều trị khác nhằm tăng hiệu quả chữa bệnh Tuy nhiên cũng

như xạ trị, hóa trị làm giảm tiểu cầu bạch cầu, dẫn đến suy giảm sức đề kháng của cơ thể Theo nghiên cứu gần đây, cứ 6 người bị ung thư vú được điều trị bằng hóa trị liệu thì có một người phải cấp cứu do các tác dụng phụ như sốt, nhiễm trùng… [8, 25]

Việc sử dụng các phương pháp điều trị ung thư như phẫu thuật, xạ trị và hóa trị liệu sẽ gây ra nhiều đau đớn cho bệnh nhân Do vậy gần đây, các nhà sinh y học trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu và phát triển các phương pháp điều trị ít gây di chứng là sinh trị liệu và đông y

Bệnh nhân được điều trị bằng Sinh trị liệu sẽ được tiêm các sinh chất có khả năng kích thích tính đề kháng tự nhiên của cơ thể chống lại ung thư như nội tiết tố hoặc interferon Nghiên cứu của Rulla và cộng sự (2006) cho thấy, nồng độ các hormone như estrogen và testosterone có ảnh hưởng đến nguy cơ mắc ung thư vú ở phụ nữ [45] Interferon alfa2b đã được sử dụng như một loại thuốc điều trị bệnh ung thư da Melanoma và đạt được kết quả khả quan [30]

Đông y là phương pháp sử dụng các loại thảo dược nhằm kích thích cơ thể sản sinh ra những chất cần thiết để chữa bệnh, khai thông khí huyết, đào thải các độc tố gây bệnh ra ngoài cơ thể Bên cạnh đó, các vị thuốc Đông y được sử dụng để bồi bổ cơ thể, giúp khắc phục và ngăn chặn các biến chứng do hóa trị liệu hoặc xạ trị liệu gây ra Thực tế trong nhiều năm qua các nhà y học cổ truyền đã có nhiều đề tài nghiên cứu dùng thảo dược để chữa ung thư và thu được nhiều kết quả tốt trong điều kiện lâm sàng Một số cây thảo dược có tác dụng điều trị bệnh ung thư đã được nghiên cứu là cỏ lưỡi rắn trắng, nấm lim xanh, hoa mẫu đơn, táo tàu, cam thảo, hoàng cầm và hồ tiêu đen

Trong Đông y, cỏ lưỡi rắn trắng có tên là bạch hoa xà thiệt thảo, còn có tên

là bồi ngòi bò, xà thiệt thảo, xà châm thảo, long thiệt thảo Tên khoa học là Hedyotis diffusa Willd, thuộc họ cà phê Đây là loại cỏ mọc bò, sống hàng năm, có thể cao tới

30 - 40 cm Hợp chất Methylathraquinon được chiết xuất từ cây cỏ lưỡi trắng khi thử độc tính trên dòng tế bào ung thư vú MCF - 7 đã gây ra sự tự hủy tế bào vào pha

S trong chu trình tế bào [53]

Nấm lim xanh hay còn gọi là nấm Linh chi tự nhiên, tên khoa học là

Ganoderma lucidum, thuộc họ Nấm lim Theo nghiên cứu của Hongbo và cộng sự

(2002), một hợp chất rượu được tách chiết từ nấm Linh chi có khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư, ngoài ra còn gây ra sự chết theo chương trình ở dòng tế bào ung thư vú MCF - 7 [28, 49]

Hoa mẫu đơn, táo tàu, cam thảo và hoàng cầm là 4 loại thảo dược phổ biến

trong Y học Trung Quốc Việc kết hợp 4 loại thảo dược được các thầy lang Trung Quốc sử dụng 1 800 năm trước đây và phát hiện ra chất giúp tăng cường hiệu quả của hóa trị ở những bệnh nhân ung thư đại tràng (ruột kết) Các thử nghiệm trên động vật có khối u cho thấy việc kết hợp thảo mộc với các loại thuốc hóa trị giúp phục hồi các tế bào đường ruột nhanh hơn việc chỉ sử dụng hóa trị Các thảo mộc này cũng tăng cường điều trị ung thư đại tràng

Hồ tiêu đen có thành phần chính là Piperine có khả năng gây gián đoạn quá trình tự đổi mới của các tế báo gốc đang ở giai đoạn đầu của ung thư, do đó làm giảm nguy cơ phát triển ung thư Piperine có tác động lên nhiều loại ung thư khác nhau như ức chế di căn ung thư phổi [16], ức chế tăng sinh, gây chết theo chương trình đối với dòng ung thư trực tràng HRT-18 [42]…

Tuy nhiên, việc làm sáng tỏ cơ chế hoạt động của các thảo dược được sử dụng trong điều trị ung thư còn gặp nhiều khó khăn Các loại thảo dược thường có thành phần phức tạp, các thành phần đó có thể có lợi hoặc có hại, thậm chí gây độc không chỉ với tế bào ung thư mà còn với các tế bào bình thường của cơ thể, do đó hiệu quả chữa bệnh không cao Vì vậy việc nghiên cứu, tinh sạch và thử tiềm năng tác động của các thành phần trong cây thảo dược lên các dòng tế bào ung thư khác nhau đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước chú trọng nghiên cứu

1.1.4 Một số dòng tế bào ung thư dùng trong nghiên cứu

1.1.4.1 Dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela

Ung thư cổ tử cung là bệnh hay gặp chiếm tỷ lệ cao trong tổng số các bệnh ung thư (11% trong tổng số ung thư cả hai giới và 22.35% trong ung thư sinh dục nữ) Tuổi thường gặp là 30 - 59, đỉnh cao là 45 - 50, tuy nhiên vẫn có trường hợp mắc ở tuổi 20 90 – 95% là ung thư thượng bì gai, 5 - 10% còn lại là ung thư thượng

bì tuyến Nguyên nhân gây bệnh chủ yếu là do nhiễm khuẩn sinh dục, đặc biệt là virus Hepes type II (HVII) và Papiloma virus 16 - 18 và 3 - 33 Bệnh lây qua đường tình dục ở lứa tuổi 18 - 30, đặc biệt là lúc có thai [4]

Hình 3 Henrietta Lacks và dòng tế bào Hela [4]

Dòng tế bào Hela là dòng tế bào được nuôi cấy từ các tế bào khối u cổ tử cung của bệnh nhân Henrietta Lacks vào năm 1950 (Hình 3) Đây là lần đầu tiên trong lịch sử y học thế giới, các bác sỹ tiến hành một ca tách lấy các tế bào ung thư

từ cơ thể của người bệnh và nuôi sống bên ngoài cơ thể Các nhà khoa học đã tiến hành nuôi cấy các tế bào này và sử dụng chúng để điều chế vaccine polio chống lại bệnh ung thư cổ tử cung gây ra bởi virus HPV Kể từ sau sự kiện này, rất nhiều tế bào đã được nuôi cấy thành công từ những tế bào ban đầu lấy từ cơ thể Henrietta kể

từ lúc bà qua đời Cho tới nay với những mẫu tế bào ung thư đó, các nhà khoa học

đã tiến hành nhiều nghiên cứu khoa học liên quan đến bệnh ung thư, với hơn 60 000 tài liệu khoa học liên quan.

Tế bào Hela có các dấu chuẩn đặc hiệu và sống bám dính trong môi trường nuôi cấy invitro 98% tế bào Hela có chứa một nhiễm sắc thể tâm giữa nhỏ và 100%

là thể dị bội Thời gian nhân đôi là 24h trong môi trường nuôi cấy có bổ sung huyết thanh [14]

1.1.4.2 Dòng tế bào ung thư vú MCF-7

Ung thư vú là bệnh lý ác tính phổ biến nhất ở nữ giới, chủ yếu gồm 2 dạng: ung thư nang tuyến vú và ung thư núm vú Các trường hợp có nguy cơ mắc ung thư

vú cao là tuổi cao, nồng độ IGF – 1 (Insulinlike Grow Factor-1) trong giai đoạn mãn kinh cao, tiền sử gia đình có người mắc bệnh… [4]

Dòng MCF – 7 là dòng tế bào được tách từ khối u của bệnh nhân ung thư vú Hiện nay dòng MCF – 7 là một trong những dòng tế bào được sử dụng phổ biến trong việc thử độc tính của các hoạt chất sinh học lên tế bào ung thư [28, 53] Thời gian nhân đôi của dòng MCF – 7 là 24.5 giờ (Hình 4)

Hình 4 Dòng tế bào ung thƣ vú MCF-7 [38]

1.2 Hồ tiêu (Piper nigrum L.) và Piperine

1.2.1 Hồ tiêu (Piper nigrum L.)

1.2.1.1 Đặc điểm sinh học

Hồ tiêu còn gọi là cổ nguyệt, hắc cổ nguyệt, bạch cổ nguyệt, tên khoa học là

Piper nigrum L., là một loài cây leo có hoa thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae), trồng

chủ yếu để lấy quả và hạt (Hình 5)

Hồ tiêu có thân dạng dây leo, nhẵn, không mang lông, bám vào các cây khác bằng rễ Thân mọc cuốn, mang lá mọc cách Lá như lá trầu không, nhưng dài và thuôn hơn Có hai loại nhánh: một loại nhánh mang quả, và một loại nhánh dinh dưỡng, cả hai loại nhánh đều xuất phát từ kẽ lá Đối chiếu với lá là một cụm hoa Hình đuôi sóc Khi chín, rụng cả chùm Quả Hồ tiêu hình cầu , đường kính 3.5 - 5

mm Mặt ngoài màu nâu đen, có nhiều vết nhăn hình mạng lưới nổi lên Đầu quả có vết của vòi nhụy nhỏ hơi nổi lên , gốc quả có vết sẹo của cuống quả Chất cứng, phần thịt quả có thể bóc ra được Vỏ quả trong màu tr ắng tro hoặc màu vàng nhạt ,

mă ̣t cắt ngang màu vàng nhạt Quả có chất bột , trong có lỗ hổng nhỏ là vị trí củ a nội nhũ, mùi thơm, vị cay [3, 21]

Vỏ quả ngoài cấu tạo bởi một lớp tế bào xếp không đều và hơi uốn lượn Vòng mô cứng xếp sát vỏ quả ngoài Tế bào mô cứng hình nhiều ca ̣nh , thành dày, khoang he ̣p, có ống trao đổi rõ , xếp thành đám sát nhau thàn h nhiều vòng liên tu ̣c

Vỏ quả giữa : vùng ngoài cấu tạo bởi tế bào nhỏ , thành mỏng, nhăn nheo, bị bẹp, kéo dài theo hướng tiếp tuyến , có nhiều tế bào chứa tinh dầu Vỏ quả trong gồm tế bào mô cứng thành dày phía trong v à hai bên thành hình chữ U Mô ̣t lớp tế bào vỏ hạt xếp đều đặn, thành mỏng Vùng ngoại nhũ rất rộng, phía ngoài gồm 2 - 3 lớp tế bào nhỏ thành mỏng, ở sát vỏ hạt; phía trong gồm tế bào lớn hơn, thành mỏng chứa nhiều tinh bô ̣t và tế bào tiết tinh dầu Đối diện với cuống quả có một vùng nội nhũ rất nhỏ, cây mầm nằm trong nô ̣i nhũ

Hình 5 Cây và quả Hồ tiêu

Khi xay quả Hồ tiêu ta thu được bột có màu tro thẫm , tế bào đá ở vỏ ngoài hình gần vuông, chữ nhâ ̣t hoă ̣c không đều , đường kính 19 - 66 µm, thành tương đối dày Tế bào đá vỏ quả trong hình đa giác, đường kính 20 - 30 µm, nhìn mặt bên có hình vuông, thành tế bào có một mặt mỏng Tế bào vỏ hạt hình đa giác , màu nâu, thành dày mỏng không đều và có hình chuỗi hạt Giọt dầu tương đối ít, hình tròn, đường kính 51 - 75 µm Hạt tinh bột rất nhỏ, thường tập trung lại thành khối

Hồ tiêu được thu hoạch mỗi năm hai lần Muốn có Hồ tiêu đen, người ta

hái quả vào lúc xuất hiện một số quả đỏ hay vàng trên chùm, nghĩa là lúc quả còn xanh; những quả còn non quá chưa có sọ rất giòn, khi phơi dễ vỡ vụn, các

quả khác khi phơi vỏ quả sẽ săn lại, ngả màu đen Muốn có Hồ tiêu trắng (hay Hồ tiêu sọ), người ta hái quả lúc chúng đã thật chín, sau đó bỏ vỏ

Loại này có màu trắng ngà hay xám, ít nhăn nheo và ít thơm hơn (vì lớp vỏ chứa tinh dầu đã mất) nhưng cay hơn (vì quả đã chín) Bên cạnh hai sản phẩm nói

trên, tuy hiếm hơn, còn có Hồ tiêu đỏ, là loại Hồ tiêu chín cây hoặc được thu hái

khi rất già, ủ chín sau đó được chế biến theo cách thức đặc biệt để giữ màu đỏ của vỏ Hồ tiêu đỏ có màu đỏ thẫm hơi ngả đen [1, 3]

1.2.1.2 Thành phần hóa học

Sau khi chiết xuất dịch Hồ tiêu bằng dung môi methylene chloride, người ta

đã thu được nhiều hợp chất trong đó có 83.80% hợp chất trung tính (khoảng 40 loại

hợp chất), 1.72% axit yếu, 0.55% axit mạnh và 0.22% bazơ [15] Một số hợp chất

chủ yếu đã được phát hiện trong Piper nigrum L là piperine, sesquisabinene,

piperylin, cubebin, pipertine, piperoleins A và B [48]

Trong đông y, Hồ tiêu là một vị thuốc hữu hiệu chữa trị các bệnh như nôn mửa do lạnh, tiêu chảy, khó tiêu, chán ăn Tinh dầu Hồ tiêu đen có tác dụng khử trùng, chống viêm nhiễm, giảm đau, chống nôn, long đờm, hạ sốt, giảm xung huyết da, lưu thông máu, giữ ấm cho cơ thể, trấn tĩnh, giảm cảm giác sợ hãi, bồn chồn, lo lắng… Những nghiên cứu mới đây còn chỉ ra rằng Hồ tiêu đen có tác

dụng trong việc phòng chống ung thư và các bệnh về tim mạch [1, 3, 40]

1.2.2 Piperine

1.2.2.1 Nguồn gốc, cấu trúc và tính chất hóa học

Hans Christian Orsted là người đầu tiên phát hiện và tinh sạch Piperine từ

quả Hồ tiêu Piper nigrum L vào năm 1819 Piperine là một loại alkaloid có trong quả của Piper longum L.; Piper retrofractum Vahl.; Piper clusii C.D.C và từ vỏ rễ của cây Piper geniculatum Sw thuộc họ Piperaceae (Hình 6)

Hình 6 Cấu trúc hóa học của Piperine [31]

CTPT: C17H19 NO3 Tên IUPAC: 1–[5–(1,3-Benzodioxol-5- yl)-1-oxo-2,4-pentadienyl] piperidine Piperine thu được dưới dạng tinh thể lăng trụ, lúc đầu không vị, sau có vị cháy khét Piperine tan tốt trong dung môi hữu cơ (ethanol, chloroform…) nhưng ít tan trong nước (40 mg/l ở 180C) Khi thử với thuốc thử Wagner cho màu xanh ánh kim, với H2SO4 cho màu đỏ đặc trưng [23, 40]

Quá trình sinh tổng hợp Piperine được thể hiện trong Hình 7 Đầu tiên, sự có

mặt của enzyme pyridoxal lysine phosphatase ( PLP ) thúc đẩy quá trình khử L – lysine thành dạng cadaverine Dưới tác dụng của enzyme dianmine oxidase, cadaverine được oxi hóa thành một dạng amino aldehyde Dạng vòng của amino aldehyde này sẽ chuyển thành Piperidine Piperidine kết hợp với Piperoyl – CoA sẽ tạo thành Piperine Các Piperoyl – CoA có nguồn gốc từ các Cinnamoyl – CoA được tạo thành thông qua con đường acetate/shikimic acid [43, 48]

Hình 7 Quá trình sinh tổng hợp Piperine [39]

Piperine được tìm thấy gây ức chế P - glycoprotein và CYP3A4 của người, các enzyme quan trọng trong việc trao đổi chất và vận chuyển các xenobitic

và các chất chuyển hóa Trong các nghiên cứu tiến hành trên động vật, Piperine cũng ức chế các enzyme quan trọng khác trong sự chuyển hóa sinh học của nhiều thuốc Bằng cách ức chế các quá trình chuyển hóa thuốc, Piperine có thể làm tăng hoạt tính sinh học của các hợp chất khác nhau và thay đổi hiệu quả của một

số thuốc Điển hình là Piperine có thể làm tăng hoạt tính sinh học của Curcumin trên tế bào ung thư vú MCF -7 ở người [35] Các nghiên cứu gần đây còn chỉ ra hiệu quả ngăn ngừa ung thư phổi của Piperine trên mô hình chuột [22]

Ngoài Piperine còn một nhóm các alkaloid có tính chất tương tự Piperine thu được từ những loài Hồ tiêu khác nhau được gọi là các alkaloid dạng Piperine Ngoài Piperine, các hợp chất phổ biến thuộc nhóm này là chavicine, piperettine, piperiline, piperlonguminine, pellitorine, pipercide, guineensine, sylvatine, (E)-1-[3’,4’-(methylenedioxy)cinnamoyl] piperidine, wisanine, 4,5-dihydropiperine và 4,5- dihydropiperlongumine Các hợp chất này khác nhau chủ yếu ở cấu trúc chuỗi cacbon, các nhân tố đầu cuối của chuỗi và các yếu tố gắn vào nhân thơm [48]

1.2.2.2 Một số phương pháp tinh sạch Piperine từ Hồ tiêu

Piperine và các hợp chất thuộc nhóm alkaloid dạng Piperine đã được phân

lập từ nhiều loài Piper thông qua các phương pháp khác nhau, tùy thuộc vào quy

mô, mục đích và nguyên liệu có sẵn

Soxhlet (hệ thống bình ngưng trào ngược) là phương pháp được các nhà khoa học sử dụng phổ biến để tách chiết Piperine từ Hồ tiêu Addison Ault đã tinh sạch thành công Piperine với hàm lượng khoảng 3.4% bằng dung môi IPA (isopropyl alcohol) có bổ sung thêm bột calcium carbonate (CaCO3) [10] Với dung môi ethanol 95%, Raphael Ikan (1991) đã phân lập được Piperine dưới dạng tinh thể màu vàng [32] Một giải pháp khác được thực hiện bởi William W Epstein, David F Netz và Jimmy L Seidel (2003) là sử dụng dung môi dichloromethane (CH2Cl2) cho hệ thống bình ngưng trào ngược trong 20 phút sau đó làm mát 5 phút rồi lọc, cô quay chân không để thu tinh thể rồi phân tích TLC trong hệ dung môi acetone : hexane (3 : 2) [52]

Ngoài phương pháp soxhlet, một số phương pháp khác cũng được sử dụng nhằm tách chiết Piperine với độ tinh sạch cao Patrick D Bailey và cộng sự đãsử dụng phương pháp sắc ký cột để phân lập Piperidine từ dịch chiết tổng số Hồ tiêu với hệ dung môi hexane: diethyl ether (1 : 2) Các phân đoạn Piperidine được tinh sạch bằng phương pháp tái kết tinh [41] Girija Raman và Vilas G Gaikar (2002)

đã sử dụng kỹ thuật MAE (microwave-assisted technique) để tách chiết Piperine

trong các dung môi không phân cực Hiệu suất thu Piperine lên tới 94% với độ tinh khiết đạt 85% [20] Phương pháp HPLC và LCMS được Ian M Scott và cộng

sự (2005) sử dụng trong nghiên cứu của có khả năng phân lập Piperine với hiệu

suất > 95% [47]

1.2.2.3 Nghiên cứu về Piperine trong lĩnh vực điều trị ung thư

Hiện nay hướng nghiên cứu sử dụng các hợp chất có trong các loài thực vật để điều trị các bệnh ung thư đang được rất nhiều nhà khoa học quan tâm Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu tách chiết và thử độc tính của Piperine với các dòng tế bào ung thư khác nhau và thu được nhiều kết quả khả quan Phương pháp thử độc tính được sử dụng rộng rãi nhất đó là sử dụng chất thử 3 – (4,

5 - dimethylthiazol – 2 – yl) – 2, 5 dyphenyl – tetrazolium bromide (MTT)

Daniel và cộng sự (2005) đã sử dụng phương pháp MTT khi nghiên cứu về độc tính của Piperine trên dòng tế bào ung thư phổi B16F – 10 và 2 dòng tế bào ung thư bạch cầu CEM và HL – 60 Các dòng tế bào trên được nuôi cấy trong môi trường RPMI có bổ sung 10% PBS, 2 mM glutamine, 100 μg/ml streptomycin,

100 U/ml penicillin và ủ ở 37o

C, 5% CO2 Chia tế bào vào đĩa 96 giếng sao cho đạt mật độ 50000 tế bào/giếng Sau 24 giờ, Piperine được bổ sung vào các giếng thử và ủ trong 72 giờ Lấy 200 μl dịch tế bào có bổ sung MTT kiểm tra tỷ lệ sống chết của tế bào Doxorubixin được sử dụng làm đối chứng dương Kết quả cho thấy, chỉ số IC50 của Piperine đối với dòng tế bào CEM và HL – 60 là 25 μg/ml và B16F – 10 là 19.9 μg/ml [19]

Một nghiên cứu khác của Paul B Yaffe và cộng sự (2012) về tác động của Piperine đến sự sinh trưởng và phát triển của dòng tế bào ung thư đại trực tràng HRT – 18 bằng phương pháp thử độc tính MTT và đếm dòng tế bào Kết quả cho thấy, Piperine gây rối loạn quá trình trao đổi chất của các tế bào HRT - 18 Cụ thể là hoạt tính của enzyme succinate dehydrogenase có mặt trong ty thể giảm đi một cách đáng kể khi môi trường nuôi cấy có bổ sung Piperine Để nghiên cứu ảnh hưởng của

Piperine đến chu trình tế bào, ông nuôi tế bào HRT – 18 trong 2 loại môi trường có

và không bổ sung Piperine Sau 72h, tiến hành nhuộm tế bào với PI, sử dụng phương pháp đếm dòng tế bào để tìm ra tỷ lệ tế bào thuộc các pha khác nhau của chu trình tế bào và so sánh Kết quả cho thấy, ở đĩa nuôi cấy có bổ sung Piperine, tỷ

lệ tế bào bị giữ lại ở pha G0 /G cao hơn hẳn so với các pha khác và so với đĩa không

bổ sung Piperine Điều này chứng tỏ, Piperine là nguyên nhân gây ra hiện tượng bắt giữ chu trình tế bào [42]

Khi thử nghiệm trên chuột mang dòng tế bào ung thư phổi ác tính B16F -10, C.R Pradeep và G Kuttan (2002) đã phát hiện ra rằng Piperine có khả năng làm giảm đáng kể các hợp chất sinh ra do cảm ứng khối u (92.5%) như acid uronic, hexosamine… Thậm chí, Piperine còn tăng thời gian sống của chuột mắc bệnh lên đến 90 ngày sau thử nghiệm Kết quả đã khẳng định khả năng ngăn cản quá trình di căn ung thư của Piperine [16]

Ngoài ra còn một số phương pháp khác đã được các nhà khoa học sử dụng để nghiên cứu sự ảnh hưởng của Piperine lên sự phát triển của khối u Bezerra và cộng

sự (2006) đã sử dụng phương pháp quan sát mô bệnh học để đánh giá mức độ tác động của Piperine lên khối u Sarcoma 18 Ông tiến hành cấy các tế bào khối u Sarcoma-18 10 ngày tuổi vào 60 chuột cái Thụy Sỹ vào vùng da dưới bụng Piperine được tiêm vào các con chuột thí nghiệm với nồng độ 50 mg/kg Sau 7 ngày, khi chuột chết, khối u, gan, lá lách và thận được cắt bỏ, cân nặng và cố định bằng formaldehyde 10% Các bộ phận này được với hematocylin và eosin rồi quan sát dưới kính hiển vi để đánh giá mức độ tổn thương của khối u và các mô dưới tác động của thuốc [18]

Ở Việt Nam, mặc dù đã có một số nghiên cứu về hoạt tính của một số loại hợp chất tự nhiên, nhưng chưa có nghiên cứa về tác động của trên các dòng tế bào ung thư

1.3 Kỹ thuật tinh sạch hợp chất và thử độc tính trên tế bào

Dựa vào cấu tạo của các pha hay kiểu thiết kế hệ thống sắc ký mà người ta chia thành các phương pháp: sắc ký bản mỏng, sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực, sắc ký lỏng cao áp… Cũng có thể phân chia sắc ký thành 2 loại là sắc

ký phân tách và sắc ký hấp thụ dựa vào sự tương tác giữa chất cần phân tách với pha cố định Trong khi sắc ký phân tách sử dụng pha cố định là giấy, bản mỏng silicagel… không gây ra sự phân bố hay tương tác với chất phân tách thì sắc ký hấp thụ lại sử dụng pha cố định có sự hấp thụ hay tương tác với chất phân tách [7, 27]

1.3.1.1 Sắc ký bản mỏng (TLC – Thin Layer Chromatography)

Sắc ký bản mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại Pha động

là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần dựa theo từng trường hợp Trong quá

trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều

cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động (Hình 8)

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf của các chất trong hỗn hợp được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng cách dịch chuyển của dung môi Thông thường giá trị Rf không lặp lại chính xác giữa các phòng thí nghiệm hoặc thậm chí là giữa các lần thí nghiệm khác nhau trong cùng một phòng thí nghiệm Lý do là vì Rf phụ thuộc vào kích thước loại buồng, kích thước bản mỏng, thành phần pha động, độ ẩm không khí…Vì vậy Rf chỉ có giá trị tương đối [7, 27]

Hình 8 Minh họa các bước sắc ký bản mỏng [23]

1.3.1.2 Sắc ký cột

Nguyên lí tách của sắc ký lọc gel (sắc ký cột)là một mẫu thử được nạp lên một cột chứa chất hấp phụ (thường là silica gel, nhôm oxit) Cột chứa chất hấp phụ này đóng vai trò là một pha tĩnh Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo cột sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử, do các cấu tử này có độ phân cực khác nhau nên ái lực của chúng với pha tĩnh cũng khác nhau, vì vậy chúng bị dung môi giải hấp và bị đẩy đi với vận tốc khác nhau tạo các dải riêng biệt có vị trí khác nhau ra khỏi cột tại các thời điểm khác nhau, làm cơ sở cho việc phân tích định tính và định lượng (Hình 9) [7, 27]

Hình 9 Minh họa quá trình sắc ký cột [23]

1.3.1.3 Sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

Sắc ký lỏng cao áp (HPLC – high pressure liquid chromatography) hay còn được gọi là sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) là một bước phát triển cao của sắc ký và đôi lúc được gọi là sắc ký hiện đại để so sánh với sắc ký truyền thống Ưu điểm của HPLC so với các loại sắc ký khác là khả năng phân tách các chất tốt, tốc độ phân tích n hanh, các cột HPLC có thể sử dụng nhiều lần mà không cần nhồi hay xử lí lại, quá trình vận hành thiết bị và phân tích

dữ liệu được tự động hóa và có thể dễ dàng nâng cấp lên quy mô lớn và các quy trình thu nhận chế phẩm [7]

Về nguyên tắc hoạt động, HPLC dựa trên áp lực của bơm cơ học lên một dung môi lỏng để tải một hỗn hợp chất vào cột hóa học, qua đó quá trình phân tách xảy ra Một cột phân tách HPLC được nhồi bởi các chất tương tự như các loại sắc

ký khác (như silica, các polymer hay chất hấp phụ) Sự phân tách HPLC bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như áp suất và nhiệt độ, tương tác hóa học giữa hỗn hợp mẫu

và dung môi lỏng (như tính không ưa nước, quá trình proton hóa, v.v) , tương tác hóa học giữa hỗn hợp mẫu và nguyên tử đặc rắn bên trong cột phân tích (như ái lực ligan, trao đổi ion,…)[34]

HPLC được phân biệt với các phương pháp sắc ký thông thường vì áp lực của HPLC tương đối cao (~150 bar) trong khi sắc ký thông thường phần lớn dựa vào áp lực của trọng lực Do điều kiện phân tách dưới áp lực cao nên cột của HPLC

có đường kính trong tương đối nhỏ (ví dụ 4.6 mm), ngắn (250 mm) và đặc hơn, giúp phân tách hỗn hợp mẫu tốt hơn so với sắc ký thông thường Điều này cho thấy HPLC ưu thế việc phân tách các hợp chất

HPLC gần như được áp dụng đối với mọi loại sắc ký truyền thống: hấp thụ, phân tách, lọc gel, ái lực,… mà về mặt lý thuyết đều gần như không có gì khác biệt Nói cách khác, HPLC là kiểu sắc ký lỏng được tự động hóa Và ngày nay, nó được

áp dụng rất phổ biến cho các thí nghiệm phân tách các hợp chất sinh học khác nhau như amino acid, carbohydrate, vitamin, protein,… [7, 23]

Một hệ thống HPLC cơ bản bao gồm: Hệ thống bình chứa dung môi, hệ thống các bơm cao áp, một bộ phận tiêm mẫu tự động, cột sắc ký, một detector và một hệ thống máy tính và phần mềm phân tích dữ liệu (Hình 10)

Hình 10 Hệ thống HPLC [28]

Hiện tại các máy HPLC có 4 đường dung môi vào bơm cao áp Tuy nhiên thường chỉ sử dụng 2 - 3 đường để dung môi được hòa trộn đồng đều hơn Tất cả các dung môi sử dụng cho HPLC phải là dung môi hoàn toàn tinh khiết nhằm tránh làm hỏng cột phân tích và tạo các peak tạp trong quá trình phân tích Khi bơm dung môi vào hệ thống, nếu bọt khí xuất hiện quá nhiều sẽ khiến bơm cao áp không bơm được dung môi và hệ thống ngừng hoạt động Vì vậy hệ thống được bổ sung them

bộ khử khí để loại bọt trước khi bơm cao áp bơm dung môi vào cột sắc ký Áp suất cần thiết là 250 – 500 at (1 at – 0.98 bar) Bơm phải tạo dòng liên tục với lưu lượng 0.1 – 9.999 ml/phút Hiện nay sử dụng bơm 2 pitton để liên tục đẩy dòng dung môi

Các mẫu nghiên cứu được pha với nồng độ xác định được bộ phận tiêm mẫu vào cột sắc ký theo nguyên tắc dòng chảy liên tục, một lần tiêm từ 5 – 100 µl Cột sắc ký được làm bằng thép không gỉ, chiều dài 10 – 30 cm, đường kính 1-10 mm, hạt nhồi có đường kính 5 – 10 µm Tùy vào đặc điểm của chất cần phân tích mà có thể sử dụng cột có kích thước nhỏ hơn tương ứng với hạt nhồi kích thước nhỏ để tăng hiệu suất phân tách Hạt nhồi cột thường là silicagel hoặc nhôm oxit Với

Tiêm mẫu

tự động

Bộ phận khử khí và bơm cao

áp

Cột sắc ký

Hệ thông máy tính và phần mềm phân tích

Bình chứa dung

môi pha động

những thí nghiệm yêu cầu thực hiện ở nhiệt độ khác với nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt

Các chất ra khỏi cột được detector phát hiện và ghi kết quả trên sắc ký đồ để định tính và định lượng Tùy thuộc vào chất cần phân tích mà ta sử dụng loại detector phù hợp Một số loại detector thường sử dụng là detector quang phổ tử ngoại UV (200 – 380 nm), detector quang phổ tử ngoại UV - VIS (190 – 900 nm), detector huỳnh quang… Các dữ liệu sẽ được xử lý thông qua phần mềm để đưa ra các thông số về chiều cao, diện tích các peak và nồng độ chất… [33, 34]

1.3.2 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào

Khi nuôi cấy, người ta chia thành 2 nhóm tế bào: tế bào dịch huyền phù và tế bào dính bám Các tế bào như tế bào máu có thể sinh trưởng trong môi trường dinh dưỡng lỏng mà không cần giá thể Tuy nhiên hầu hết các tế bào động vật thuộc loại thứ 2, tức là cần một bề mặt để tế bào bám Các tế bào này thường được nuôi cấy trong đĩa petri hoặc chai nuôi cấy [13, 38]

1.3.2.2 Điều kiện nuôi cấy

Nhu cầu dinh dưỡng của tế bào động vật cao hơn so với vi sinh vật do không

có trao đổi chất nitơ vô cơ, vì vậy cần bổ sung nhiều thành phần vào môi trường

nuôi cấy như axit amin, vitamin, muối vô cơ, nguồn carbon (glucose) và huyết thanh hoặc các hormone thay thế huyết thanh

Huyết thanh đóng vai trò vô cùng quan trọng trong nuôi cấy tế bào động vật Đây là nguồn cung cấp các nhân tố tăng trưởng, bám dính, các hormon, lipid, khoáng chất… cho tế bào khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy cơ bản Không những vậy nó còn có vai trò trong điều khiển tính thấm của màng tế bào và hoạt động như chất mang lipid, enzym, vi chất dinh duỡng và một ít nguyên tố cho tế bào Tuy nhiên, huyết thanh có giá thành cao, nếu sử dụng huyết thanh được cung cấp từ các nguồn không đáng tin cậy thì đây có khả năng trở thành nguồn nhiễm khuẩn cho tế bào nuôi cấy Ngoài ra một số thành phần protein trong huyết thanh có thể gây ảnh hưởng kìm hãm sự sinh trưởng của một vài dòng tế bào

Ngoài thành phần dinh dưỡng, các yếu tố như pH và nhiệt độ cũng ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của tế bào Hầu hết các tế bào động vật đều sinh trưởng tốt trong môi trường có pH 7.4 Một số tế bào chuyển dạng sinh trưởng trong môi trường axit nhẹ (7 - 7.4), nguyên bào sợi sinh trưởng trong môi trường kiềm nhẹ (7.4 - 7.7) pH của môi trường được điều khiển nhờ dung dịch đệm được bổ sung vào môi trường như HEPES hoặc bicarbonate Ngoài ra còn cần sử dụng nguồn CO2 bên ngoài với nồng độ CO2 duy trì trong tủ cấy là 5 - 7% Mỗi loại môi trường sẽ thích hợp với nồng độ CO2 và bicarbonate riêng để đạt đuợc độ pH chuẩn

Nhiệt độ nuôi cấy phụ thuộc vào nhiệt độ cơ thể tách tế bào Thường nuôi cấy ở

nhiệt độ thấp hơn một chút so với nhiệt độ chuẩn [13, 38]

1.3.2.3 Các kỹ thuật nuôi cấy cơ bản

Từ các dòng tế bào gốc được cung cấp, để thu được một lượng lớn các tế bào phục vụ mục đích nghiên cứu, cần tiến hành nuôi cấy tế bào trong môi trường phù hợp Sau một thời gian, kiểm tra số lượng và mật độ tế bào bằng buồng đếm Nếu tế bào đã phát triển > 90% diện tích bề mặt nuôi cấy thì cần tiến hành cấy chuyển tế

bào sang chai (đĩa) nuôi cấy mới để tạo điều kiện cho tế bào nhân lên

Các tế bào chưa sử dụng được bảo quản trong điều kiện lạnh phù hợp để sử dụng cho những lần thí nghiệm sau Cần đảm bảo 90% tế bào sống sót trước khi cất lạnh Sử dụng các ống riêng biệt được cất trong nito lỏng và đảm bảo môi trường vô trùng hoàn toàn.hộp cất lạnh với tốc độ 10C cho tới khi đạt nhiệt độ dưới -700

C, tế bào sẽ bị phá hủy nếu nhiệt độ tăng hơn -500C Môi trường cất lạnh có thể là môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh có 10 – 15% DMSO hoặc môi trường thương phẩm

Khi cần sử dụng, các tế bào sẽ được rã đông nhanh bằng bể ổn nhiệt

1.3.3 Kỹ thuật nghiên cứu tác động của chất lên tế bào

Một cách đơn giản để xác định mức độ tăng trưởng của tế bào là đếm tế bào sau khi tế bào được nhuộm với những chất có màu đặc trưng ví dụ như Trybal blue Tuy nhiên phương pháp này có độ nhạy không cao Do đó , chúng tôi sử dụng phương pháp MTT để xác định tỷ lệ sống chết của tế bào trong môi trường chứa Piperine

Hình 11 Phản ứng xảy ra trong phương pháp MTT [14]

Phương pháp định lượng MTT (3 – (4, 5 - dimethylthiazol – 2 – yl) – 2, 5 dyphenyl – tetrazolium bromide) dựa trên hoạt độ của enzyme dehydrogenase của

ty thể (bằng cách tạo nên sự cân bằng giữa NADH và NADPH) Enzyme này có tác dụng chuyển hóa MTT thành formazan màu nâu đỏ hấp thụ ánh sáng tối đa ở bước sóng 490 – 500 nm Lượng formazan tạo ra sẽ được định lượng bằng lượng ánh

enzyme dehydrogenase

sáng ở bước sóng 490 nm bị hấp thụ Chỉ có những tế bào sống mới có khả năng chuyển hóa, do đó, bằng việc so sánh lượng formazan tạo thành ở các tế bào được thử thuốc và các tế bào bình thường, ta có thể đánh giá được mức độ tăng sinh của

tế bào [15, 39]

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu dược liệu Hồ tiêu đen (Piper nigrum L.) được phân loại và cung cấp

bởi Viện Dược liệu, Bộ Y tế Danh sách, ký hiệu và địa điểm thu thập mẫu được trình bày tại Bảng 1

Bảng 1 Danh sách mẫu dược liệu và địa điểm thu mẫu

2.2 Hóa chất, thiết bị và sinh phẩm

2.2.1 Hóa chất

Nghiên cứu sử dụng các hóa chất dùng trong tách chiết, chạy sắc ký, nuôi cấy tế bào và thử độc tính được cung cấp bởi các hãng có uy tín như các loại dung môi hữu cơ methanol, ethanol, n – hexane, ethyl acetate (Merck ® - Đức), silicagel, Piperine (Sigma - Đức), môi trường nuôi cấy, các loại kháng sinh penicillin, streptomicin, PBS (Invitrogen® - Hoa Kỳ)

2.2.2 Thiết bị

Nghiên cứu sử dụng các dụng cụ và thiết bị trực thuộc phòng Thí nghiệm trọng điểm Enzyme Protein và các phòng Thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, Bộ môn Sinh lý thực vật – Hóa sinh, Bộ môn Sinh học Tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Các thiết bị và dụng cụ sử dụng được cung cấp bởi các hãng có uy tín và đảm bảo chất lượng như máy siêu

âm, tủ hood (Corning - Hoa Kỳ), máy cô quay chân không (Bio Lab - Hoa Kỳ), máy

ly tâm cỡ lớn (Sigma - Đức), các loại bình tam giác, bình cầu, ống nghiệm, cột sắc ký… (Steroglass - Italy)

2.2.3 Sinh phẩm

Các dòng tế bào ung thư chúng tôi sử dụng là dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela và dòng tế bào ung thư vú MCF – 7 Các dòng có nguồn gốc từ ATCC (American Type Culture Collection), được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu Ung thư thực nghiệm – Bộ môn Sinh học Tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Các mẫu dược liệu đã sấy khô cung cấp bởi Viện Dược liệu được nghiền nhỏ, cho qua rây có kích thước nhỏ (0.1 mm), thu dạng bột mịn Bột được bảo quản trong các bình thủy tinh tối màu, dán nhãn, có thêm gói chống ẩm và đặt ở những nơi khô ráo, thoáng khí

2.3.1 Thu dịch chiết tổng số

Chúng tôi sử dụng 2 quy trình tách chiết khác nhau để thu dịch chiết tổng số

từ các mẫu Hồ tiêu Việc tách chiết được tiến hành lặp lại 3 lần trên mỗi mẫu, mỗi lần tách chiết 5g bột mẫu khô (Hình 12)

Dịch chiết tổng số sau khi thu được sẽ được loại dung môi bằng máy cô