nghiên cứu rối loạn enzyme α–galactosidase a và phân tích trình tự gen GLA trên bệnh nhân phì đại cơ tim

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị, thầy cô trong nhóm thực hiện đề tài hợp tác quốc tế: “Nghiên cứu sàng lọc bệnh lý về tích trữ ở lysosome trên bệnh nhân gan to, lách to và ph

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lê Hiền Giang

NGHIÊN CỨU RỐI LOẠN ENZYME α-GALACTOSIDASE A

VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN GLA TRÊN

BỆNH NHÂN PHÌ ĐẠI CƠ TIM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lê Hiền Giang

NGHIÊN CỨU RỐI LOẠN ENZYME α-GALACTOSIDASE A

VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN GLA TRÊN

BỆNH NHÂN PHÌ ĐẠI CƠ TIM

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân

TS Nguyễn Thị Quỳnh Thơ

Hà Nội – 2014

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng sâu sắc, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn TS Nguyễn Thị Quỳnh Thơ, người đã tận tình hướng dẫn, ủng hộ và hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân, chủ nhiệm bộ môn Sinh học di truyền trường ĐH KHTN Hà Nội, người thầy đã trực tiếp dạy dỗ, hướng dẫn tôi thực hiện đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em labo Y sinh học di truyền, Kỹ thuật

Y học trường Đại học Y Hải Phòng đã nhiệt tình hỗ trợ, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị, thầy cô trong nhóm thực hiện đề

tài hợp tác quốc tế: “Nghiên cứu sàng lọc bệnh lý về tích trữ ở lysosome trên bệnh

nhân gan to, lách to và phì đại cơ tim chưa rõ nguyên nhân ở Việt Nam” của trường

ĐH Y Hải Phòng; Trung tâm nghiên cứu và điều trị bệnh hiếm gặp, Bệnh viện đa khoa Cựu chiến binh Đài Bắc, những người đã tận tình hướng dẫn kỹ thuật, giúp đỡ vật chất và tinh thần cho tôi thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Sinh học di truyền, trường ĐH KHTN Hà Nội, các anh chị và các bạn cao học khoá 2012 – 2014 đã nhiệt tình giúp

đỡ và cổ vũ tinh thần để tôi hoàn thành đề tài của mình

Cuối cùng tôi cũng xin gửi lời cảm ơn từ đáy lòng tới gia đình, bạn bè tôi, những người luôn bên tôi, cổ vũ cho tôi trong suốt thời gian qua

Học viên

Lê Hiền Giang

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về chứng phì đại cơ tim 3

1.1.1 Lịch sử phát hiện và tần số mắc bệnh 3

1.1.2 Nguyên nhân và triệu chứng của bệnh 4

1.2 Bệnh Fabry 7

1.2.1 Lịch sử phát hiện, nguyên nhân và tần số mắc bệnh 7

1.2.2 Triệu chứng của bệnh 8

1.3 Gen GLA và Enzyme α – galactosidase A 11

1.3.1 Gen GLA 11

1.3.2 Enzyme α – galactosidase A 12

1.4 Tổng quan các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về đột biến gen GLA; bệnh Fabry và bệnh phì đại cơ tim 15

1.4.1 Đột biến gen GLA 15

1.4.2 Tổng quan về bệnh Fabry và bệnh phì đại cơ tim 18

1.5 Tổng quan về siêu âm tim 22

1.6 Tổng quan về các phương pháp xác định hoạt độ enzyme α – Gal A và phân tích trình tự gen GLA 24

1.6.1 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme 24

1.6.1.1 Phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC 24

1.6.1.2 Phương pháp khối phổ hai lần (MS/MS) 24

1.6.2 Phương pháp phân tích trình tự gen GLA 26

1.6.2.1 Phương pháp PCR 26

1.6.2.2 Phương pháp điện di 26

1.6.2.3 Phương pháp xác định trình tự gen [3] 26

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân 28

2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu [68] 28

2.3 Nguyên liệu 29

2.3.1 Mẫu máu 29

2.3.2 Các loại hóa chất và trang thiết bị 30

2.4 Phương pháp nghiên cứu 31

2.4.1 Phương pháp xác đinh hoạt độ enzyme α-galactosidase A 31

2.4.1.1 Tiến hành phản ứng enzyme 31

2.4.1.2 Phương pháp sắc ký lỏng kết hợp đo khối phổ 33

2.4.2 Phân tích trình tự gen GLA 34

2.4.2.1 Khuếch đại gen GLA từ mẫu máu toàn phần 34

2.4.2.2 Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 37

2.4.2.3 Tách ADN từ gel Agarose 37

2.4.2.4 Định lượng ADN trong dung dịch bằng phương pháp quang phổ kế 38

2.4.2.5 Giải trình tự gen GLA 39

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Kết quả xác định hoạt độ enzyme α-Gal A 41

3.1.1 Hoạt độ enzyme α-Gal A 41

3.1.2 Số lượng mẫu và hoạt độ enzyme α-Gal A theo nhóm tuổi 45

3.2 Kết quả giải trình tự gen GLA 47

3.2.1 Đặc điểm của 26 mẫu được giải trình tự 47

3.2.2 Kết quả nhân bản các phân đoạn gen GLA 49

3.2.2.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR 49

3.2.2.2 Kết quả đo OD sản phẩm tinh sạch 51

3.2.3 Phát hiện các đột biến trên gen GLA 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ERT Enzyme replacement therapy (Liệu pháp enzyme thay thế)

HPLC High Performance Liquid Chromatography (sắc ký lỏng hiệu năng

cao)

IS Internal standard (nội chuẩn)

IVS Intervening sequence (trình tự intron)

LC - MS Liquid chromatography–mass spectrometry (sắc ký lỏng khối phổ) LVMI Left Ventricular Mass Idex (khối lượng cơ thất trái)

LVPWd Left Ventricular end Diastolic Post Wall (bề dày thành sau thất trái

cuối thì tâm trương)

MS Mass spectrometry (khối phổ)

UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng

siêu cao) UTR Untranslated region (vùng trình tự không mã hoá axit amin)

α-Gal A Enzyme α –galactosidase A

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Những dấu hiệu và triệu chứng có thể có của bệnh Fabry [38] 9

Bảng 1.2 Vị trí và độ dài exon và intron của gen GLA 11

Bảng 1.3 Kích thước của 7 exon trong gen GLA ở người và số lượng các đột biến liên quan [23] 18

Bảng 2.1 Các thành phần có trong dung dịch phản ứng 32

Bảng 2.2 Các thông số trong phương pháp khối phổ 33

Bảng 2.3 Trình tự và nhiệt độ bắt cặp của mồi, kích thước sản phẩm PCR 36

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR 36

Bảng 2.5 Thành phần của phản ứng nhân bản 39

Bảng 2.6 Hàm lượng ADN khuôn cho phản ứng PCR giải trình tự 39

Bảng 2.7 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR giải trình tự 40

Bảng 3.1 Đặc điểm của 26 mẫu được giải trình tự 47

Bảng 3.2 Các chỉ số LVMI, LVPWd của người bình thường và bệnh nhân phì đại cơ tim 48

Bảng 3.3 Kết quả đo OD 260 ; OD 280 và nồng độ ADN sản phẩm PCR của mẫu FB01 51

Bảng 3.4 Kết quả giải trình tự 26 mẫu 52

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh cơ tim bình thường (A) và cơ tim bị phì đại (B) 6

Hình 1.2 Vị trí của gen GLA trên NST X 11

Hình 1.3 Cấu trúc không gian của α-galactosidase A 12

Hình 1.4 Globotriaosylceramide và vị trí cắt của enzyme α – galactosidase A 13

Hình 1.5 Gen GLA hoạt động bình thường sinh ra α-Gal A phân cắt Gb3 14

Hình 1.6 Khiếm khuyết gen GLA gây tích đọng Gb3 trong lysosome 14

Hình 1.7 Hình ảnh siêu âm tim của bệnh nhân FB64 (trên) và FB334(dưới) 23

Hình 1.8 Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết hợp đo khối phổ song song (UPLC – MS/MS) của hãng Aligent 25

Hình 2.1 Mẫu máu trên giấy thấm DBS 30

Hình 2.2 Cơ chất, nội chuẩn và sản phẩm trong phản ứng enzyme 32

Hình 3.1 Hoạt độ enzyme α- Gal A của bệnh nhân phì đại cơ tim 41

Hình 3.2 Hoạt độ enzyme α-Gal A của nhóm đối chứng và bệnh nhân 43

Hình 3.3 Số lượng mẫu theo nhóm tuổi 45

Hình 3.4 Hoạt độ enzyme α-Gal A theo nhóm tuổi 46

Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của mẫu FB01 49

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR 7 exon và intron 4 của mẫu FB26, FB44; FB64; FB69 50

Hình 3.7 Đoạn trình tự exon 1 đột biến c.[178 C>T] ; [0], p.P60S 54

Hình 3.8 Đoạn trình tự exon 1 có đột biến 5'UTR -12 G>A 56

Hình 3.9 Đoạn trình tự exon 1 có đột biến 5'UTR -10 C>T 56

Hình 3.10 Đoạn trình tự nucleotide có đột biến IVS1+17 A>G 57

MỞ ĐẦU

Bệnh phì đại cơ tim (Hypertrophic cardiomyopathy - HCM) là một căn bệnh

trong đó cơ tim dày bất thường ở tâm thất trái, thất phải, mỏm tim hoặc toàn bộ cơ

tim Phần lớn các trường hợp đều bị phì đại vách liên thất, làm tắc nghẽn đường ra thất trái

Hầu hết bệnh nhân mắc bệnh này đều không có triệu chứng và họ có thể sống một cuộc sống bình thường như những người bình thường Trên thực tế, bệnh chỉ hay gặp ở người trẻ tuổi và vận động viên thể thao Triệu chứng đầu tiên và cũng là cuối cùng của bệnh phì đại cơ tim là đột tử Tuy nhiên, ở một số ít bệnh nhân có thể

có một trong các triệu chứng sau đây: đau ngực, chóng mặt và hoa mắt, nhất là trong lúc vận động mạnh hoặc khi thay đổi tư thế đột ngột, khó thở, thường xuyên mệt mỏi, hay bị ngất xỉu

Trong số các bệnh nhân phì đại cơ tim, có đến 40% chưa tìm ra nguyên nhân

gây bệnh Gần đây, một số các biến thể không điển hình của bệnh do tích đọng các

chất tại lysosome đã được xác định và đã thu hút được sự chú ý của các bác sĩ, đặc biệt là kiểu hình không điển hình của bệnh Fabry, với các biểu hiện phì đại cơ tim

và các triệu chứng tương tự

Bệnh Fabry là một bệnh di truyền liên quan đến gen GLA mã hóa enzyme

lysosome α –galactosidase A (α – Gal A) trên NST X gây tích đọng các chất trong lysosome Bệnh được phát hiện năm 1898 bởi hai nhà da liễu học hoạt động độc lập

là Johannes Fabry người Đức, và William Anderson người Anh do đó bệnh còn được gọi là bệnh Anderson – Fabry

Khi enzyme α –galactosidase A bị thiếu một phần hoặc hoàn toàn dẫn đến việc không chuyển hóa được các glycosphingolipid mà chủ yếu là globotriaosylceramide (Gb3 hoặc GL-3) Gb3 không được chuyển hóa sẽ tích đọng tại các tế bào mạch máu, gây tắc nghẽn quá trình vận chuyển máu Gb3 cũng tích đọng ở các tế bào thần kinh, tế bào tim, và các loại khác nhau của tế bào thận Sự rối loạn chức năng

tế bào hoặc sự chết tế bào dẫn đến những đáp ứng chuyển hóa của các mô như phì đại, viêm, xơ và xơ cứng

Biến thể tim của bệnh Fabry không điển hình có thể chỉ là phì đại thất trái, loạn nhịp tim, hoặc bệnh cơ tim phì đại trong những thập kỷ thứ 5 thứ đến thứ 8 của cuộc sống Những biểu hiện kiểu hình không đầy đủ này được đặc trưng bởi sự khởi phát muộn và tiến triển chậm của bệnh, các biểu hiện suy cơ quan xuất hiện khi bệnh nhân đã lớn tuổi Điều này mở ra một hướng nghiên cứu mới về một trong những nguyên nhân gây bệnh phì đại cơ tim

Ở Việt Nam, hiện chưa có công trình nghiên cứu nào về mối quan hệ giữa

enzyme α –galactosidase A, gen GLA và bệnh phì đại cơ tim Điều này có thể gây

khó khăn trong việc xác định chính xác nguyên nhân gây bệnh phì đại cơ tim và đưa

ra đúng phác đồ điều trị

Do đó chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu rối loạn enzyme α – galactosidase A và phân tích trình tự gen GLA trên bệnh nhân phì đại cơ tim”

Đề tài không chỉ mang ý nghĩa khoa học mà còn có ý nghĩa thực tiễn y học

trong điều trị bệnh phì đại cơ tim

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1 Phân tích rối loạn enzyme α –galactosidase A ở bệnh nhân phì đại cơ tim

2 Phân tích trình tự gen GLA của một số mẫu có hoạt độ enzyme α –

galactosidase A giảm mạnh

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về chứng phì đại cơ tim

1.1.1 Lịch sử phát hiện và tần số mắc bệnh

Trong thập kỉ qua, những tiến bộ quan trọng đã nâng cao hiểu biết của chúng

ta về cơ sơ phân tử của bệnh tim mạch Khi cấu trúc xoắn kép của ADN được mô tả lần đầu vào năm 1953 bởi Watson và Crick trong tạp chí Nature, không ai có thể dự đoán những tác động to lớn mà mà phát hiện này đem lại trong việc thiết lập các nghiên cứu về di truyền người Phát hiện này cũng với lý thuyết về di truyền Mendel là hai mốc quan trọng trong sự phát triển của lĩnh vực di truyền phân tử tim mạch Ngoài ra những tiến bộ công nghệ gần đây đã thúc đẩy mạnh mẽ những nghiên cứu di truyền phân tử tim mạch Ngày nay, di truyền phân tử tim mạch được đặc trưng bởi sự tích hợp của nghiên cứu trong phòng thí nghiệm công nghệ cao và

y học lâm sàng Di truyền học phân tử đã xác định lại nguyên nhân và tiêu chuẩn chẩn đoán của nhiều bệnh, từ đó đem đến những phác đồ điều trị mới cho một số bệnh tim mạch Các rối loạn tim mạch đầu tiên được xác định cơ sở di truyền là bệnh phì đại cơ tim [49]

Bệnh phì đại cơ tim do Lord Brock lần đầu tiên phát hiện ra vào năm 1957 [36, 37]

Năm 1958, Donald Teare đã lần đầu tiên mô tả lâm sàng và bệnh lý của 9 bệnh nhân phì đại cơ tim bị chết đột tử Ngay từ đầu, phì đại cơ tim được gắn với đột tử

do tim (Sudden Cardiac Death – SCD) ở thanh thiếu niên Ngoài ra, người ta nghi nhận sự xuất hiện của các gia đình phì đại cơ tim, khuynh hướng gia đình của đột tử

do tim khi hoạt động gắng sức và ngất báo hiệu [50]

Năm 1964, Braunwald đã mô tả một cách toàn diện về phì đại cơ tim, quá trình tiến triển bệnh, tình trạng phì đại vách ngăn, lộn xộn của sợi cơ

Năm 1979, sự ra đời của siêu âm 2D đã hỗ trợ rất nhiều trong chẩn đoán phì đại cơ tim

Phì đại cơ tim là căn bệnh di truyền về tim khá phổ biến với tỉ lệ 1/500 dân và

có thể xảy ra ở cả nam và nữ, ở mọi lứa tuổi và sắc tộc [12, 13]

Bệnh phì đại cơ tim là bệnh phổ biến thứ hai trong nhóm bệnh về cơ tim, chiếm 35 – 40% bệnh tim mạch ở trẻ em Bệnh phì đại cơ tim ảnh hưởng đến

500000 người ở Mỹ, trong đó trẻ em dưới 12 tuổi chiếm 10% Các khiếm khuyết về gen gây bệnh có thể di truyền, và người ta ước tính rằng 50 – 60 % trẻ em mắc phì đại cơ tim có người thân bị bệnh, mặc dù họ có thể không được chẩn đoán hoặc có không có triệu chứng [77]

Hiện nay đột tử có liên quan đến phì đại cơ tim chiếm 1 – 2% ở trẻ em và thanh thiếu niên, chiếm 0,5 – 1% ở người lớn [8]

Các đột biến gây bệnh, biểu hiện bệnh và tiên lượng bệnh đều rất đa dạng và không đồng nhất Các thống kê cho thấy đây là một trong những nguyên nhân phổ biến gây đột tử ở người trẻ tuổi (đặc biệt là các vận động viên) [7, 12, 13, 36]

1.1.2 Nguyên nhân và triệu chứng của bệnh

Từ năm 1989 hàng loạt các đột biến ở các gen gây phì đại cơ tim đã được tìm thấy Đến năm 2011 người ta đã tìm thấy hơn 11 gen mã hoá protein sarcomer cơ tim với hơn 1400 đột biến liên quan đến phì đại cơ tim Ngoài ra còn nhiều đột biến

ở các gen không mã hoá protein sarcomer cơ tim cũng có thể gây bệnh [14]

Đột biến ở gen mã hoá protein sarcomer trong cơ tim (chủ yếu là myosin và troponin) chiếm khoảng 60% các trường hợp phì đại cơ tim, 40% còn lại là do các đột biến gen khác hoặc chưa rõ nguyên nhân [8]

Gần 20 năm trước, người ta xác định được đột biến liên quan đến gen MYH7

mã hoá β-myosin chuỗi nặng là cơ sở gây bệnh phì đại cơ tim Từ đó đến nay, hàng trăm đột biến nằm rải rác trong ít nhất 27 gen có liên quan đến bệnh phì đại cơ tim được tìm thấy [36]

Theo những thống kê trong 20 năm qua, bệnh phì đại cơ tim là một bệnh tim mạch có tính chất gia đình phổ biến và có sự đa dạng về mặt di truyền Đại đa số

các đột biến gây bệnh làm thay đổi tính chất vật lý và chức năng của protein là đột biến nhầm nghĩa, trong đó 1 axit amin này được thay thế bằng 1 axit amin khác Ngoài ra, có thể có đột biến gây ảnh hưởng đến nhiều axit amin trong 1 protein (đột biến dịch khung đọc), kết quả là dẫn đến nhiều sản phẩm rất khác nhau và thường gây ra nhiều hậu quả lâm sàng hơn [14]

Ngoài những nguyên nhân do đột biến các gen mã hoá cho protein cơ tim, những nguyên nhân khác cũng đang được nghiên cứu tìm hiểu Ưu điểm của những xét nghiệm di truyền là xác định được nguyên nhân cụ thể ở những bệnh nhân phì đại cơ tim có phải do gen mã hoá protein cơ tim gây nên hay là do những gen khác Những bệnh về tim liên quan đến sự trao đổi chất ở cơ tim thường được chẩn đoán lâm sàng sai Ví dụ một loại rối loạn tích đọng lysosome do gen trội liên kết với NST X, lysosome liên quan đến protein màng (LAMP2- bệnh Danon); bệnh Fabry,

một bệnh do đột biến lặn ở gen GLA nằm trên NST X, gen này mã hoá cho enzyme

α-galactosidase A Sự thiếu hụt enzyme này dẫn đến sự lắng đọng glycosphingolipid trong tế bào [14, 56]

Theo thông kê, đột biến gen GLA ở bệnh nhân Fabry có thể chiếm tới 5% số

bệnh nhân phì đại cơ tim [8]

Chẩn đoán phân biệt giữa phì đại cơ tim do đột biến protein cơ tim với các dạng đột biến khác là rất quan trọng trong điều trị Ví dụ chẩn đoán đúng bệnh Fabry sẽ đưa ra được liệu pháp điều trị hiệu quả như bổ sung enzyme tái tổ hợp α-galactosidase A, điều này có thể làm giảm bớt hiện tượng phì đại cơ tim và cải thiện chức năng tim cũng như khả năng gắng sức của bệnh nhân [14]

Phì đại cơ tim do sự phát triển, sắp xếp của các sợi cơ diễn ra không bình thường dẫn đến thành tim dày lên (hình 1.1) Sự dày lên thường diễn ra ở tâm thất trái (khoang chính của tim thực hiện chức năng bơm máu), đặc biệt là vách ngăn giữa tâm thất trái và tâm thất phải Sự dày lên làm kích thước của khoang bơm máu giảm xuống Nó cũng làm tim ngăn cản việc tim nghỉ giữa các lần đập và bơm máu,

từ đó có thể làm hạn chế việc bơm máu [37, 76]

Hình 1.1 Hình ảnh cơ tim bình thường (A) và cơ tim bị phì đại (B)

Tuổi khởi phát, sự phát triển bệnh, biểu hiện lâm sàng rất khác nhau Hầu hết những người phì đại cơ tim có thể không có triệu chứng, nhưng nó có thể biểu hiện bất ngờ vào bất kỳ lứa tuổi nào [8]

Về triệu chứng của bệnh, rất nhiều bệnh nhân không có triệu chứng Họ cũng

có thể thấy khó thở và tức ngực Những dấu hiệu khác thường là choáng váng khi

có những hoạt động vật lý, tim đập nhanh chóng và có cảm giác như có gì đó đè nặng ở ngực, cảm thấy mệt mỏi, đặc biệt là với các hoạt động nặng

Trong một số trường hợp, triệu chứng đầu tiên và cũng là cuối cùng của bệnh phì đại cơ tim là đột tử gây ra do tim đập hỗn loạn Khoang chứa tim hẹp nên khi tim đập hỗn loạn và nhanh làm cho máu không được bơm đi Thay vì phải đập, tim chỉ rung lên Theo sự tiến triển của bệnh, bệnh nhân cũng có thể bị suy tim kèm theo nhiều triệu chứng khác [37]

Trẻ em dưới 1 tuổi có thể có triệu chứng suy tim sung huyết trong khi trẻ lớn hơn có thể không có triệu chứng Các triệu chứng khởi phát xuất hiện theo sự phát triển của cơ thể, các biểu hiện bệnh thường biểu hiện ở cuối thời thơ ấu và đầu thời

kỳ thiếu niên Tập thể dục và lao động nặng có thể làm các triệu chứng biểu hiện rõ hơn

Mức độ nghiêm trọng của bệnh phụ thuộc vào vị trí cơ tim phì đại, và liệu nó

có ảnh hưởng đến việc bơm máu hay không Các triệu chứng ở trẻ em thường gặp là khó thở (thở rất nhanh khi tập thể dục), đau thắt ngực, choáng váng hoặc chóng mặt, ngất, đánh trống ngực, loạn nhịp tim Các triệu chứng ở trẻ sơ sinh có thể khó khăn hơn để phát hiện bao gồm khó thở, phát triển kém, ra mồ hôi nhiều, hay khóc và kích động khi ăn được cho là do đau ngực [77]

Do những biểu hiện lâm sàng phức tạp, nguyên nhân gây bệnh đa dạng nên đã gây nhiều khó khăn cho các bác sĩ trong việc tiên lượng và chẩn đoán bệnh [12]

1.2 Bệnh Fabry

1.2.1 Lịch sử phát hiện, nguyên nhân và tần số mắc bệnh

Một trong những căn bệnh tích đọng các chất trong lysosome phổ biến nhất là

bệnh Fabry Bệnh gây nên do đột biến gen lặn ở gen GLA khiến cho enzyme α-Gal

A không được tổng hợp, tổng hợp thiếu hoặc sai hỏng về chức năng

Bệnh Fabry hay còn gọi là bệnh Andeson-Fabry, được mô tả đầu tiên vào năm

1898 bởi hai nhà khoa học hoạt động độc lập là Johannes Fabry người Đức và William Anderson người Anh Năm 1947 nguyên nhân gây bệnh được xác định là

do chất béo lắng đọng trong các mạch máu của cơ thể Năm 1963, chất béo lắng đọng được xác định là globotriaosylceramide (Gb3) và đến năm 1967 người ta xác định được enzyme α-Gal A chính là tác nhân gây tích đọng Gb3 Năm 1986, gen

GLA mã hoá cho enzyme α-Gal A được xác định [75]

Từ đó đến nay người ta đã xác định được hàng trăm đột biến trên gen GLA gây

nên bệnh Fabry, kèm theo đó là các kiểu hình khác nhau của bệnh Phần lớn các

bệnh nhân bị bệnh Fabry có một đột biến điểm duy nhất trong gen GLA của họ

Tỉ lệ ước chừng của bệnh Fabry là 1/40000 nam giới và căn bệnh này được tìm thấy ở tất cả các sắc tộc [27]

1.2.2 Triệu chứng của bệnh

Kiểu hình lâm sàng của bệnh Fabry có thể rất khác nhau, ở cả nam và nữ, giữa những người trong cùng một gia đình, hay giữa các bệnh nhân không cùng một gia đình nhưng mang những đột biến giống nhau [23]

Thiếu một phần hoặc hoàn toàn enzyme α-Gal A dẫn đến việc không chuyển hóa được glycosphingolipids Việc tăng tích lũy Gb3 xảy ra trong các tế bào nội mô mạch máu, tế bào thần kinh, tế bào tim, và các loại khác nhau của tế bào thận Rối loạn chức năng và/ hoặc chết tế bào dẫn đến sự đáp ứng chuyển hóa của các mô như phì đại, viêm, xơ và xơ cứng Sự tăng lên âm thầm của bệnh giai đoạn đầu dẫn đến những triệu chứng ban đầu trong thời thơ ấu, hoặc thanh thiếu niên và sau này nghiêm trọng ở tim, thận hay biến chứng mạch máu não Nếu người đồng hợp tử (hoặc bệnh nhân nam) không được điều trị tuổi thọ sẽ bị rút ngắn đáng kể, chỉ sống được 40 – 50 tuổi Mặc dù bản chất liên quan đến NST X, nhưng do sự bất hoạt của

1 NST X trong quá trình phát triển phôi, phần lớn những phụ nữ dị hợp tử cũng bị bệnh tật đáng kể và có thể tử vong sớm Phụ nữ cũng có thể bị ảnh hưởng nghiêm trọng như nam giới, tuy nhiên họ cũng có thể không có triệu chứng của các mô học liên quan

Biểu hiện triệu chứng và diễn biến lâm sàng của bệnh Fabry thay đổi theo tuổi Các triệu chứng khởi phát thường xuất hiện ở nam sớm hơn ở nữ Bệnh thể điển hình (cổ điển) thường xuất hiện từ khi còn là đứa trẻ dẫn tới sự tiến triển bệnh ra vùng ngoại vi và tự điều khiển hệ thống thần kinh Các dấu hiệu hoặc triệu chứng ban đầu khác bao gồm angiokeratomas, mờ mắt, mệt mỏi, lười vận động Sự lắng đọng thêm chất nền ở những cơ quan cụ thể dẫn đến những tiến triển của bệnh, cuối cùng dẫn đến biến chứng đe dọa tính mạng ở tuổi trưởng thành, đặc biệt liên quan đến thận, tim và hệ thống thần kinh trung ương Thận rối loạn chức năng do xơ hóa cầu thận, teo ống thận, xơ hóa mô kẽ trở nên rõ ràng ở tuổi từ 30 – 40 (ở phụ nữ biểu hiện muộn hơn) và bệnh nhân có thể bị thận ở giai đoạn cuối của bệnh Biến chứng tim mạch gồm loạn nhịp tim, phì đại thất trái, suy tim, thiếu máu cục bộ cơ

tim, hoặc nhồi máu cơ tim Cơn thiếu máu và đột quỵ là những biểu hiện muộn và cũng là nguyên nhân gây tử vong sớm ở những bệnh nhân Fabry [38]

Bảng 1.1 Những dấu hiệu và triệu chứng có thể có của bệnh Fabry [38]

Tổng quan Giảm chất lượng cuộc sống do một nhóm các triệu chứng và

tiên lượng

Hệ thống thần kinh Acroparesthesias (hội chứng liên quan đến các dị cảm như

ngứa ran, tê và tê cứng ở tay, chân)

Các cơn đau, đột quỵ Thiếu máu não thoáng qua Nghẽn mạch

khoảng 1 -3mm, có thể phẳng hoặc nổi cục nhỏ, gây nên do

sự tổn thương hoặc giãn nở vĩnh viễn của các mao mạch)

Tăng tiết mồ hôi/ ít hoặc không tiết mồ hôi

Tiêu chảy Đầy bụng sau ăn và đau

Ăn mau no Khó tăng cân

vào nước tiểu)

Giảm khả năng điều khiển Tăng bài tiết Gb – 3 qua nước tiểu

Giảm GFR (mức lọc máu cầu thận), giai đoạn cuối bệnh

thận

Phì đại cơ tim đặc biệt là phì đại thất trái Suy mạch

Nhồi máu cơ tim Điện tâm đồ bất thường Bệnh van tim (suy van hai lá) Tai – Mũi – Họng Mất thính giác, điếc đột ngột

Ù tai Chóng mặt

Khó thở, thở khò khè Không chịu được tập thể dục

Ngoài những bệnh nhân thể điển hình, một số lượng đáng kể những bệnh nhân

có kiểu hình được mô tả ở dạng không điển hình, hay còn được gọi là thể tim hoặc thể thận Những biểu hiện kiểu hình không đầy đủ này được đặc trưng bởi sự khởi đầu muộn và tiến triển chậm của bệnh, các biểu hiện suy cơ quan xuất hiện khi bệnh nhân đã lớn tuổi (sống được thời gian dài) [23] Một trong những triệu chứng thường thấy nhất ở những bệnh nhân Fabry thể không điển hình là chứng phì đại cơ tim

Ở những bệnh nhân Fabry có những biểu hiện phì đại cơ thất trái giống như biểu hiện phì đại cơ tim Bệnh cơ tim của bệnh nhân Fabry được báo cáo là đến 6% nam giới và 12 % nữ giới có hiện tượng phì đại cơ tim khởi phát muộn Đặc biệt, tim có thể là cơ quan duy nhất có liên quan ở bệnh nhân nam giới (hoặc đồng hợp tử gen bệnh) hay ở nữ giới mang gen bệnh, trong khi các hoạt động enzyme gần như bình thường và thiếu các biểu hiện lâm sàng khác Điều này gây khó khăn trong việc chẩn đoán bệnh Do đó cần có thêm các nghiên cứu sinh hoá và phân tích di truyền để đưa đến kết luận chính xác [48]

1.3 Gen GLA và Enzyme α – galactosidase A

1.3.1 Gen GLA

Gen GLA là gen mã hoá cho enzyme α – galactosidase A nằm trên cánh dài của NST X, ở vùng Xq22.1 (hình 1.2) Chính xác hơn, gen GLA nằm từ cặp base

101 408 012 đến cặp base 101 397 790 trên NST X Nó bao gồm 7 exon với độ dài

mỗi exon khoảng 92 đến 219 bp (bảng 1.2) Vùng mang mã gồm 1290 bp và mã hóa cho 1 chuỗi polypeptid có 429 amino acid, với 31 axit amin đầu tiên là một chuỗi tín hiệu

Hình 1.2 Vị trí của gen GLA trên NST X

(Nguồn: Genetics Home Reference)

Bảng 1.2 Vị trí và độ dài exon và intron của gen GLA

Exon / Intron Vị trí bắt đầu Vị trí kết thúc Độ dài (bp)

1.3.2 Enzyme α – galactosidase A

Enzyme α – galactosidase A (hay còn được gọi là α – Gal A; GLA và α –

GAL) được mã hóa bởi gen GLA Enzyme α- Gal A là một glycoprotein homodimer

bao gồm hai tiểu đơn vị khoảng 50-kDa Mỗi monomer có hai miền, một miền chứa

vị trí hoạt động và một miền đầu C chứa 8 sợi β đối song (hình 1.3) [61]

Các phân tích cấu trúc cho thấy, một phần đầu N của glycoprotein liên kết với cacbohydrate, chiếm khoảng 5-15% khối lượng của α-Gal A, có tới hơn 70 glycoform với 23 cấu trúc lõi carbohydrate khác nhau Các thành phần carbohydrate của glycoprotein là cần thiết để phân tử được đưa vào lysosome thông qua con đường thụ thể mannose-6-phosphate [65]

Hình 1.3 Cấu trúc không gian của α-galactosidase A

Cấu trúc không gian của α-galactosidase A được mô tả bởi các sợi ribbon có màu sắc khác nhau Từ sợi màu xanh đến mầu đỏ tương ứng từ đầu N đến đầu C Vị trí hoạt động được xác định bằng sự xúc tác cho ra sản phẩm galactose Mỗi đơn phân trong cấu trúc phức hợp gồm 2 vùng, một vùng (β/ α) 8 có vị trí hoạt động (từ màu xanh đến màu vàng) cộng thêm một đầu C đối song với vùng β (từ vàng đến đỏ)[65]

Enzyme α – galactosidase A có chức năng loại bỏ các nhóm α-galactose đầu cuối từ các chất nền như các sphingolipid, glycoprotein và glycolipid trong đó chủ yếu là globotriaosylceramide (Gb3 hoặc GL-3), một phân tử bao gồm 3 đường liên kết với một chất béo (hình 1.4) Phân tử Gb3 được giải phóng trong quá trình tái chế (recycling) các tế bào hồng cầu già và các tế bào khác [23, 61, 65]

Hình 1.4 Globotriaosylceramide và vị trí cắt của enzyme α – galactosidase A

(nguồn: http://flipper.diff.org/app/items/info/2968)

Sự phân cắt các đại phân tử, bao gồm cả glycopeptide và glycolipid xảy ra trong lysosome dưới tác dụng của các enzyme dị hoá Ví dụ các glycosidase tách những oligosaccharide từ glycoprotein và glycolipid thành các phần nhỏ hơn cho tế bào sử dụng Ở người, các sai hỏng ở các enzyme trong lysosome gây bệnh tích đọng các chất trong lysosome (lysosomal storage diseases - LSDs) Ở nhóm bệnh này, sự khiếm khuyết của gen dẫn đến sự thiếu hụt hoặc mất chức năng của các enzyme dẫn đến tích tụ các chất trong mô Các triệu chứng bệnh cụ thể phụ thuộc vào số lượng, hoạt động của các enzyme [65]

Enzyme α – galactosidase A cũng là một lysosome enzyme Hoạt động bình

thường của gen GLA và enzyme α – Gal A trong tế bào được nêu trong hình 1.5

Hình 1.5 Gen GLA hoạt động bình thường sinh ra α-Gal A phân cắt Gb3 [76]

Sự thay đổi trong gen GLA tạo ra những enzyme α – galactosidase A bất

thường hoặc hàm lượng enzyme suy giảm Điều này dẫn đến sự phân cắt Gb3

không hiệu quả Kết quả là, chất này tích tụ trong các tế bào của cơ thể, đặc biệt là các tế bào mạch máu ở da và các tế bào trong thận, tim và hệ thần kinh (Hình 1.6)

Tùy theo mức độ tích tụ và cơ quan nơi Gb3 tích tụ sẽ có những triệu chứng khác

nhau Một trong những biểu hiện thường thấy nhất là chứng phì đại cơ tim [76]

Hình 1.6 Khiếm khuyết gen GLA gây tích đọng Gb3 trong lysosome [76]

1.4 Tổng quan các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về đột biến gen

GLA; bệnh Fabry và bệnh phì đại cơ tim

1.4.1 Đột biến gen GLA

Sau khi xác định gen GLA mã hoá cho enzyme α – Gal A vào năm 1986, hàng loạt các đột biến gen GLA gây nên bệnh Fabry đã được các nhà khoa học tìm ra

Năm 1989, Bernstein và cộng sự đã xác định một đột biến thay thế Tryp356Arg, đây là kết quả của đột biến điểm C thành T tại nucleotide 1066 [15] Năm 1990, nhóm nghiên cứu của Sakuraba đã xác định một đột biến thay thế G

thành A ở exon 6 (codon 301) của gen GLA ở một bệnh nhân Fabry thể không điển

hình với biểu hiện bệnh tim khởi phát muộn Năm 1996 người ta cũng phát hiện một đột biến tương tự ở một người đàn ông 45 tuổi, nhưng người này chỉ có triệu chứng của bệnh thận là biểu hiện duy nhất [64]

Năm 1991 Yokoi và cộng sự đã xác định một đột biến G thành A tại vị trí cắt nối acceptor ở intron 3 Đột biến này dẫn đến việc xoá exon 4 và làm dịch khung đọc do xuất hiện bộ ba kết thúc tại exon 5 [71]

Năm 1992, Nhóm nghiên cứu của Ishii đã xác định một đột biến thay thế

835C-G trong exon 6 của gen 835C-GLA dẫn đến sự thay thế 835C-Gln279835C-Glu ở một bệnh nhân Nhật

Bản 60 tuổi và cháu trai 39 tuổi Hai người có các biểu hiện phì đại thành tâm thất trái và vách gian tâm thất, hoạt độ enzyme α – Gal A rất thấp, không có dấu hiệu đặc trưng khác của bệnh Fabry Người ông qua đời vì suy tim ở tuổi 64 [35]

Năm 1994, Eng và Desnick xem xét và lập bảng 15 đột biến sắp xếp lại gen

GLA, 3 sai sót trong tổng hợp GLA mRNA, và 31 đột biến điểm GLA gây bệnh

Fabry [26]

Năm 1996, Blanch và cộng sự đã khuếch đại các exon 7 của gen GLA và ranh

giới với các intron từ mỗi thành viên trong 9 gia tộc và phân tích thay đổi trình tự của gen bằng phương pháp SSCP (Single- Strand Conformation Polymorphism)

Bằng phương pháp này họ đã phát hiện ra các đột biến trên 9 bệnh nhân bị Fabry thể điển hình Các đột biến đều đã được công bố trước đó [16]

Cũng trong năm 1996, Germain và cộng sự sử dụng phương pháp FAMA

(Fluorescence-assisted mismatch analysis) để sàng lọc nhanh các gen GLA ở những

bệnh nhân Fabry Đột biến đã được tìm thấy ở các thành viên trong 9 gia tộc khác nhau Trong đó có 7 thay đổi trình tự chưa được mô tả trước đó, 3 đột biến làm chấm dứt sớm chuỗi polypeptide, 1 đột biến vị trí cắt nối và 3 đột biến nhầm nghĩa [28]

Năm 1997, Christine M Eng và cộng sự đã phát hiện 35 đột biến gen GLA ở

các bệnh nhân Fabry thể tim và thể điển hình Các loại đột biến gồm đột biến vô nghĩa, nhầm nghĩa, vị trí cắt nối, đột biến chèn hoặc mất một vài nucleotide, trong

đó các đột biến xuất hiện ở exon 7 nhiều nhất [19]

Năm 2000, Kase và cộng sự mô tả đột biến Q279E gây ra các biến thể tim của bệnh Fabry Khi so các tế bào hoạt động bình thường với các nguyên bào sợi của bệnh nhân bị đột biến, họ nhận thấy tế bào đột biến Q279E chỉ tạo ra một lượng nhỏ enzyme α – Gal A Các tác giả nhận định rằng, protein đột biến có lẽ giảm ở lưới nội chất của tế bào [40]

Năm 2003, nhóm nghiên cứu của Yasuda đã xác định được 2 đột biến lệch khung mới là 1277delAA và 1284delACTT xảy ra ở đoạn cuối trình tự mã hoá đầu 3’ và làm mất các tín hiệu kết thúc Việc xoá 2 cặp nu cũng làm thay đổi trình tự poly A Cả hai đột biến tạo ra các sản phẩm phiên mã có độ dài đoạn trình tự đầu 3’ khác nhau, một số bị kéo dài thêm khoảng 1 kb [70]

Cũng trong năm 2003, Lai và cộng sự đã chỉ ra rằng hầu hết các đột biến ở gen

GLA đã được xác định ở những bệnh nhân bệnh Fabry chỉ bằng giải trình tự gen, và

do đó một số các đột biến cắt nối được phân loại sai là đột biến nhầm nghĩa Để xác định được các sai sót cắt nối gây ra bởi đột biến Nhóm tác giả đã tiến hành tìm kiếm các đột biến đã được công bố có vị trí gần vị trí cắt nối, bao gồm cả đột biến

điểm ở exon, và thực hiện phân tích splice-site score (SSS) Họ đã tìm ra 13 đột biến vị trí donor và 6 đột biến ở vị trí acceptor, 1 đột biến tạo exon mới Tất cả các đột biến đều ở vị trí cắt nối, trừ 1 đột biến tạo exon mới Đối với kiểu gen S65T, họ thực hiện phân tích RT – PCR sử dụng ARN được phân lập từ máu toàn phần Họ tìm thấy một vị trí ở 14 nucleotide dowstream đã được hoạt hoá và kết quả là việc chèn thêm 14 cặp nucleotide và dịch chuyển bộ ba kết thúc đến vị trí bộ ba 106 Sự thay đổi này được coi là phù hợp hơn với các biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân Fabry cổ điển so với đột biến thay thế axit amin S65T [41]

Nhóm nghiên cứu của Adriana cũng đã tìm ra 15 đột biến gen GLA mới và 1

phụ nữ đồng hợp tử với kiểu hình Fabry điển hình biểu hiện từ khi 8 tuổi [5]

Năm 2005, nhóm nghiên cứu của Junaid Shabbeer đã xác định được 67 đột biến

gen GLA ở 66 gia đình Fabry không có quan hệ họ hàng Trong số 67 đột biến có

tới 50 đột biến mới chưa từng được công bố [39]

Ellen Schafer và cộng sự cũng đã phát hiện 34 đột biến gen GLA mới trên 121

bệnh nhân Fabry [25]

Năm 2007, Masaaki Shimotori và cộng sự đã phát hiện 24 đột biến gen GLA

trên bệnh nhân Fabry ở Nhật Bản, trong đó có 11 đột biến mới [52]

Theo những tài liệu nghiên cứu tính đến năm 2010, có tổng số khoảng 599

thay đổi trong trình tự gen GLA, trong đó có 435 thay đổi gây ra bởi đột biến điểm

(nhầm nghĩa, vô nghĩa, splice site) và 150 thay đổi gây ra bởi sự sắp xếp lại các trình tự ngắn (chủ yếu là mất và lặp các đoạn nhỏ hơn 65 nucleotid) cũng như 14 đa hình ADN đã được tìm ra [23]

Trong khi không phát hiện được các đột biến điểm ở những vị trí nhất định (hot spots), thì có khoảng 30% sự sắp xếp lại trình tự diễn ra ở exon 7, nơi chỉ chiếm 22,6 % vùng mã hóa (bảng 1.3)

Bảng 1.3 Kích thước của 7 exon trong gen GLA ở người và số lượng các đột biến liên quan [23]

biến điểm duy nhất trong gen GLA của họ

1.4.2 Tổng quan về bệnh Fabry và bệnh phì đại cơ tim

Sự liên quan giữa bệnh phì đại cơ tim và bệnh Fabry chỉ được các nhà khoa học thực sự quan tâm đến trong những năm gần đây

Năm 1995, Nakao và cộng sự đã phát hiện 7 bệnh nhân Fabry thể không điển hình trong số 230 người đàn ông bị phì đại cơ thất trái Những người đàn ông này không có quan hệ họ hàng, ở độ tuổi từ 55 – 72, không có các triệu chứng của bệnh Fabry điển hình Hai bệnh nhân có đột biến mới ở exon 1 và exon 6 Còn lại 5 bệnh

nhân không có đột biến ở vùng mã hoá của gen GLA tuy nhiên hoạt độ α – Gal A

thấp, và GLA mARN thấp hơn đáng kể so với bình thường [55]

Theo nghiên cứu của Linhart và cộng sự năm 2001, biến thể tim có thể là biểu hiện duy nhất ở một số bệnh nhân Fabry Những bất thường của cơ tim được đặc trưng chủ yếu ở tâm thất trái với mô hình cấu trúc hay gặp nhất là phì đại cơ thất trái, ở một số bệnh nhân có bệnh cơ tim bắt chước phì đại tắc nghẽn điển hình Đại diện lâm sàng cho bệnh nhân nữ Fabry là vô cùng đa dạng, do tính chât dị hợp tử và biểu hiện gen biến các khiếm khuyết ở bệnh nhân nữ có thể có triệu chứng hoặc biểu hiện không đầy đủ của bệnh Trong một số nghiên cứu cho thấy, 56% bệnh nhân nữ dị hợp tử dưới 38 tuổi và 86% trên 38 tuổi có biểu hiện của bệnh về tim Ngoài ra, bệnh Fabry có thể chiếm tới 12% bệnh phì đại cơ tim khởi phát muộn ở phụ nữ [46]

Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Christoph Kampmann đã kiểm tra siêu âm tim hai chiều trên 55 nữ bệnh nhân Fabry dị hợp tử (tuổi trung bình 39,6) Trong số này 23,6% có tâm thất trái bình thường về hình thái và khối lượng, 52,7% bệnh nhân phì đại đồng tâm thất trái, và 10,9% bệnh nhân phì đại lệch tâm thất trái, tất cả các bệnh nhân trên 45 tuổi có phì đại tâm thất trái Các đặc điểm bất thường của van tim, phì đại cơ tim trở nên xấu hơn theo tuổi tác ở những nữ bệnh nhân Fabry dị hợp

tử, do đó họ cần được xem xét điều trị bằng liệu pháp enzyme thay thế [21]

Andreas Perrot và cộng sự nhận định rằng mặc dù bệnh Fabry có thể đưa đến nhiều triệu chứng lâm sàng phức tạp, nhưng có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng những biểu hiện có thể chỉ hạn chế ở những biến thể tim Các biến thể tim là phổ biến hơn các suy nghĩ trước đây, khoảng 3 – 6% số bệnh nhân nam bị phì đại cơ thất trái dường như là bị biến thể của bệnh Fabry [9]

Cũng trong năm 2002, B Sachdev và cộng sự nhận định rằng, bệnh Fabry nên được xem xét ở tất cả các trường hợp phì đại cơ tim không giải thích được Sự xem xét này rất quan trọng cho việc sử dụng liệu pháp thay thế enzyme (enzyme replacement therapy – ERT) trong điều trị bệnh [11]

Năm 2003, Senechal và Germain nghiên cứu đánh giá lâm sàng, xét nghiệm, điện tim và siêu âm tim 20 bệnh nhân nam Fabry tuổi trung bình 39 (từ 12 – 65 tuổi) Bệnh nhân phì đại cơ thất trái và/ hoặc tái định dạng cơ tim được tìm thấy ở

12 bệnh nhân (60%) Những thay đổi về cấu trúc van hai lá và van động mạch chủ được tìm thấy ở 25% và 10% các trường hợp tương ứng Các nhà tim mạch học cần nhận thức chẩn đoán bệnh Fabry từ những bệnh nhân có biểu hiện phì đại cơ thất trái, tái định dạng cơ tim hay van động mạch chủ, van hai lá dày lên trên siêu âm tim [66]

Năm 2007, Lorenzo Monserrat và cộng sự đã nghiên cứu trên 508 bệnh nhân phì đại cơ tim không có quan hệ họ hàng (328 nam, 180 nữ, tuổi từ 58 ± 16 Ba nam

giới có đột biến gen GLA (0,9%) trong đó có 1 đột biến mới và 2 đột biến đã được

mô tả hai phụ nữ có đột biến đã được mô tả (1,1%) [54]

Nhóm nghiên cứu của Christoph Kampmann nhận định rằng, các triệu chứng bệnh liên quan đến tim có thể xuất hiện thường xuyên và tiến triển ngay cả ở độ tuổi trẻ em và thanh thiếu niên ở bệnh nhân Fabry [20]

Cũng trong năm 2007, Linhart và cộng sự đã sàng lọc dữ liệu lâm sàng của

714 bệnh nhân đên từ 11 quốc gia có tuổi trung bình 35 ± 17, 369 phụ nữ, 336 đã điều trị bằng liệu pháp enzyme thay thế Nghiên cứu cho thấy ở những bệnh nhân Fabry có tỷ lệ cao mắc bệnh tim mạch Những bệnh nhân nữ được điều trị bằng ERT cho hiệu quả tốt hơn những bệnh nhân nam Dấu hiệu phì đại cơ thất trái là phổ biến hơn các dấu hiệu tim mạch khác, đồng thời nó cũng độc lập với giới tính, tuổi tác [20]

Năm 2010, Ole Havndrup đã sàng lọc bệnh Fabry trên đối tượng bệnh nhân, gia đình phì đại cơ tim đã được xác định không có đột biến gen sarcomere Kết quả

cho thấy đột biến gen GLA đã được tìm thấy ở 3/90 gia đình, 2/20 phụ nữ Tất cả

các bệnh nhân đều không có biểu hiện khác của bệnh Fabry [57]

Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Manesh R Patel đã xác định tỷ lệ mắc các bệnh tim mạch, các sự kiện và biến chứng tim mạch ở những bệnh nhân Fabry trong

giai đoạn lịch sử tự nhiên (trước khi bệnh nhân được điều trị bằng ERT, hoặc ở những bệnh nhân không bao giờ được điều trị) Các sự kiện và biến cố tim mạch xảy ra vào khoảng 5% bệnh nhân Fabry Tất cả những bệnh nhân Fabry cần được theo dõi các yêu tố nguy cơ tim mạch, đặc biệt là tăng huyết áp và phì đại cơ thất trái [58]

Perry Elliott và cộng sự ở 13 trung tâm nghiên cứu ở châu âu đã phối hợp sàng lọc bệnh Fabry trên đối tượng bệnh nhân phì đại cơ thất trái không rõ nguyên nhân

Kết quả cho thấy 0,5% bệnh nhân có đột biến gen GLA Thất trái ở những bệnh

nhân này có độ dày từ 15 – 22 mm [60]

Năm 2012, Markus A Engelen và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của ERT đối với cấu trúc và chức năng tim ở bệnh nhân Fabry trưởng thành Điều trị sớm bằng ERT được khuyến cáo để ngăn chặn sự suy thoái về tim mạch Các tác động tích cực của ERT thường thể hiện rõ vào thời gian bắt đầu điều trị, trong quá trình tiếp tục điều trị ERT, lợi ích lớn ban đầu dường như bị mất và cải thiện chậm [51] Năm 2013, Hsiang-Yu Lin và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của ERT trên đối tượng bệnh nhân Fabry thể tim khởi phát muộn mang đột biến IVS4 +919G>A Kết quả cho thấy liệu pháp enzyme thay thế mang lại nhiều lợi ích và an toàn cho bệnh nhân Fabry thể tim cũng như các bệnh nhân Fabry thể điển hình [31]

Hiện nay, ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào về gen GLA và bệnh

Fabry được công bố

Các nghiên cứu trên cho thấy, mặc dù bệnh Fabry có nhiều biểu hiện lâm sàng khác nhau nhưng tỷ lệ mắc bệnh tim mạch, trong đó có phì đại cơ tim là khá cao Tỷ

lệ các bệnh nhân Fabry được sàng lọc từ các đối tượng bị bệnh về tim cũng không nhỏ Tiến bộ trong sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền đã kích hoạt sự phát triển của liệu pháp thay thế enzyme trong điều trị bệnh Fabry và cho thấy liệu pháp điều trị này thực sự mang lại hiệu quả Liệu pháp này có thể là một trong những ví dụ đầu tiên để điều trị nguyên nhân của phì đại cơ thất trái Do đó chẩn đoán sớm các bệnh nhân phì đại với các biến thể tim của bệnh Fabry là rất quan trọng

1.5 Tổng quan về siêu âm tim

Siêu âm chẩn đoán là một phần quan trọng trong hình ảnh y học, nó là phương pháp thăm khám không chảy máu, không gây nguy hiểm cho bệnh nhân và thầy thuốc, là phương pháp thăm khám rất kinh tế nên được ứng dụng rộng rãi tại các cơ

sở y tế từ trung ương đến địa phương

Lịch sử siêu âm bắt đầu khi Hartridge (1920) đưa ra giả thiết dơi phóng ra sóng siêu âm để tìm mồi Đến năm 1949, Ludwig và Struthers dùng sóng siêu âm phát hiện vật lạ và sỏi mật trong cơ thể chó Năm 1952, Wild và Reid đầu tiên dùng siêu

âm phát hiện khối u ở vú Từ những năm 1970, siêu âm đã được ứng dụng tại Việt Nam, ban đầu là siêu âm loại A, siêu âm TM, rồi đến siêu âm 2D [2]

Siêu âm được ứng dụng trong tim mạch lần đầu tiên vào năm 1950 khi W.D Keidel người Đức thực hiện thăm dò siêu âm tim đầu tiên với toan tính đo cung lượng tim Kinh nghiệm sử dụng sóng hồi âm để khám tim nêu ra đầu tiên bởi Elder

và H Hertz, họ đã ghi nhận hình ảnh siêu âm M – mode đầu tiên vào năm 1953 [4] Siêu âm tim sử dụng sóng âm thanh tần số cao để tái lập hình ảnh của cấu trúc tim hoặc dòng máu trong buồng tim Siêu âm tần số cao có thể xuyên thấu cấu trúc đặc và phản hồi bề mặt ngăn cách giữa hai cấu trúc khác nhau có kháng trở âm thanh không như nhau Cơ tim và van tim có kháng trở khác nhau do đó có thể hình ảnh phản hồi khác nhau [2]

Có 3 kiểu siêu âm tim cơ bản gồm siêu âm tim kiểu M, B, siêu âm tim hai chiều

và siêu âm tim Doppler Siêu âm tim màu là một ứng dụng từ siêu âm Doppler và siêu âm ba chiều là một ứng dụng từ siêu âm hai chiều [2]

Bệnh cơ tim phì đại đặc trưng bởi trạng thái phì đại các thất, thông thường phì đại cơ tim không đối xứng và trội tại vách liên thất Đường kính buồng thất trái bình thường hoặc giảm, có thể nghẽn đường ra thất trái Do đó dùng siêu âm để chẩn đoán phì đại cơ tim người ta thương quan tâm đến các thông số của thất trái

Siêu âm hai chiều đánh giá mức độ phì đại của thành tim Thường có sự phì đại không đồng tâm của thành thất trái, với ưu thế vượt trội của vách liên thất so với thành sau thất trái Thất trái thường không giãn và không có các bệnh lý khác có thể dẫn đến tăng độ dày của thành tim Siêu âm Doppler cho phép đánh giá mức độ chênh áp ở đường ra thất trái, dòng hở van hai lá, ba lá và áp lực động mạch phổi, từ

đó đánh giá mức độ tiến triển của bệnh

Siêu âm tim có thể cung cấp các thông tin quan trọng cho chần đoán và đánh giá sinh lý bệnh của bệnh nhân phì đại cơ tim Tuy nhiên một mình siêu âm tim không thể phân biệt được các hình thức khác nhau của phì đại cơ tim không rõ nguyên nhân, ví dụ như trong chẩn đoán Fabry Nhưng siêu âm tim có thể là bước đầu để sàng lọc các bệnh này [48]

Hình 1.7 Hình ảnh siêu âm tim của bệnh nhân FB64 (trên) và FB334(dưới)

1.6 Tổng quan về các phương pháp xác định hoạt độ enzyme α – Gal A và

phân tích trình tự gen GLA

1.6.1 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme

1.6.1.1 Phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC

Hoạt độ enzyme α – Gal A được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng siêu cao (UPLC) kết hợp với đo khối phổ song song (MS/MS) sử dụng cơ chất

và nội chuẩn

Sắc ký lỏng là quá trình tách một hỗn hợp chất trong cột sắc ký ở trạng thái lỏng, vì thế các chất phân tích mẫu cần được hoà tan trong một chất lỏng phù hợp, thường là pha động chạy sắc ký [1]

Sắc ký lỏng hiệu năng siêu cao (UPLC) là phương pháp phát triển cao, tích hợp bộ khử khí chân không, áp suất làm việc có thể lên tới 15000 psi UPLC còn cải thiện rất cao về kích thước hạt gel, tốc độ rửa chiết do đó tốc độ phân tích nhanh hơn (thời gian cho một mẫu có thể chỉ cần từ 5 – 10 phút trong khi sắc ký hiệu năng cao - HPLC cần > 30 phút), tiêu tốn ít dung môi hơn, kết quả phân tích đáng tin cậy hơn do độ nhạy và độ phân giải cao hơn [74]

1.6.1.2 Phương pháp khối phổ hai lần (MS/MS)

Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên

sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc

từ trường nhất định Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó Như vậy, trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải được chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hoá bằng các phương pháp thích hợp Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét ion dương (+) hoặc âm (-)

Hình 1.8 Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết hợp đo khối phổ song song (UPLC –

MS/MS) của hãng Aligent

Hệ thống sắc ký lỏng đầu dò 3 tứ cực gồm hệ thông sắc lỏng hiệu năng siêu cao UPLC và hệ thống đo khối phổ Sau khi được tách trong hệ thống sắc ký lỏng, mẫu cần phân tích sẽ đi qua một ống dẫn đến đầu dò MS Tại đây diễn ra quá trình ion, ion sinh ra được tập trung và gia tốc bằng hệ quang học ion để đưa vào bộ phân tích khối Tại bộ phân tích khối, tứ cực thứ nhất sẽ chọn ion mẹ có m/z xác định, các phân mảnh của ion này được tạo ra tại buồng va chạm (collision cell) nhờ tương tác với khí trơ và được phân tích nhờ tứ cực thứ ba, tạo ra tín hiệu đặc trưng tại bộ phận phát hiện ion Đầu dò tứ cực có độ nhạy cao được sử dụng trong phân tích định lượng một chất đã biết, tạo được nhiều phân mảnh trong chế độ MS/MS, thích hợp cho phân tích vi lượng các chất đã biết trước cấu trúc [74]

Những năm gần đây, phương pháp LC – MS đã được ứng dụng ngày càng nhiều trong việc sàng lọc các bệnh tích đọng các chất trong lysosome trong đó có bệnh Fabry Phương pháp này cho kết quả chính xác cao và có nhiều ưu việt hơn các phương pháp truyền thống [42, 53, 67, 72]

1.6.2 Phương pháp phân tích trình tự gen GLA

nhân bản, ADN mồi xuôi và mồi ngược Thêm vào đó các thành phần khác: Taq

ADN polymerase, dNTPs (ATP, TTP, CTP và GTP), dung dịch muối MgCl2 Dựa vào khả năng biến tính của ADN ở nhiệt độ cao (khoảng 95oC), khi đó ADN mạch kép sẽ tách thành hai mạch đơn Khi nhiệt độ hạ xuống thấp (45 –

50oC), mồi sẽ bắt cặp vào vị trí phù hợp trên sợi ADN sợi đơn Tiếp đó, nhiệt độ tăng lên khoảng 72oC, enzyme sẽ xúc tác phản ứng tổng hợp kéo dài sợi ADN mới

từ đoạn mồi Chu kỳ được lặp lại liên tục tạo ra số lượng lớn ADN mới Nhờ có kĩ thuật PCR mà từ một lượng nhỏ ADN ban đầu ra thu được một lượng đủ ADN cần thiết cho các thí nghiệm về ADN [3]

1.6.2.2 Phương pháp điện di

Điện di là phương pháp thực hiện dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phần tử mẫu tích điện trong điện trường Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn điện và tạo điện trường đều Một bản gel đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử, và các chất chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, xanh coomassie, bạc) để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di [1]

1.6.2.3 Phương pháp xác định trình tự gen [3]

Kỹ thuật giải trình tự gen chính là phương pháp xác định sự sắp xếp của các loại nucleotide trên phân tử ADN Có hai phương pháp xác định trình tự chính là phương pháp hoá học của Maxam – Gillbert (1977) và phương pháp enzyme học của Sanger

Nguyên tắc của phương pháp Maxam – Gillbert dựa trên phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu phân tử ADN cần xác định Phân tử ADN được đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 ở một đầu tạo những đoạn đánh dấu có thể phát hiện bằng hình phóng

xạ Xử lí hóa học đặc hiệu phân hủy đặc trưng một loại nucleotide của mạch ADN

đã đánh dấu phóng xạ, tạo các đoạn oligonucleotide có chiều dài hơn kém nhau 1 nucleotide được phát hiện bằng điện di Kết qủa các phản ứng hóa học xử lí mạch ADN được phát hiện bằng điện di trên gel polyacriamid có thể xác định được trình

tự mạch đơn

Phương pháp Sanger dựa vào sự tổng hợp enzyme ADN polymerase Đặc trưng của phương pháp là ngoài 4 loại nucletide thông thường còn sử dụng thêm 4 loại ddNTP (dideoxynucleotide triphosphate gồm 4 loại ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) có nhóm 3’OH được thay thế bằng H Các ddNTP sẽ làm ngừng quá trình tổng hợp vì liên kết photphodieste không được hình thành Nhờ vậy trong ống phản ứng có các mạch đơn ADN có các chiều dài khác nhau tương ứng với các vị trí trình tự các nucleotide trên đoạn ADN gốc Để giải trình tự, người ta dùng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính Với phương pháp đánh dấu mồi hay các dNTP bằng đồng vị phóng xạ P32 hay S35 thì sau khi điện di người ta phát hiện các vạch điện di bằng kỹ thuật phóng xạ ký tự ghi, và từ các vạch này giải được trình tự của đoạn ADN

Ngày nay, phương pháp xác định trình tự gen chủ yếu được thực hiện bằng máy giải trình tự tự động Nguyên tắc ban đầu của hai phương pháp hoá học và enzyme được cải tiến và đưa vào các thiết bị tự động hoá, nhanh và chính xác hơn Phương pháp này kết hợp với kỹ thuật PCR để tổng hợp các oligonucleotide Trong

kỹ thuật này, các ddNTP được đánh dấu bằng các chất huỳnh quang, có thể dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện được chỉ trong một ống nghiệm Hỗn hợp được phân tích bằng kỹ thuật điện di mao quản và hệ thống phân tích bằng phần mềm máy tính hiện đại, chính xác

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Lựa chọn nhóm nghiên cứu dựa trên những bệnh nhân có biểu hiện bệnh phì đại

cơ tim không xác định được nguyên nhân rõ ràng, tình nguyện tham gia nghiên cứu sau khi được giải thích đầy đủ các thông tin có liên quan

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân

Trên cơ sở các biểu hiện không điển hình của bệnh Fabry gặp với tỷ lệ khá lớn

ở các bệnh nhân có phì đại thất trái, chúng tôi xây dựng tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân trong nghiên cứu như sau:

* Tiêu chuẩn chẩn đoán phì đại (cơ) tim:

Bệnh nhân siêu âm tim tại phòng Siêu âm có một trong các tiêu chuẩn sau:

- Bề dầy thành sau thất trái thì tâm trương (LVPWd) > 12mm

- Khối lượng cơ thất trái (LVMI): Nam >134g/m2, Nữ >110g/m2

* Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân không có các tiêu chuẩn trên

- Bệnh nhân không tình nguyện tham gia nghiên cứu

* Nhóm đối chứng

- Người bình thường không có các tiêu chuẩn trên, không mắc các bệnh liên quan đến tim và không có các đặc điểm của bệnh Fabry

- Tình nguyện tham gia nghiên cứu

2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu [68]

Cỡ mẫu nghiên cứu được tính theo công thức

384 )

2 , 0 2 , 0 (

8 , 0 2 , 0 96 , 1

2

2 2

2 2 /

 là mức ý nghĩa thống kê, lấy giá trị = 0,05

Z là giá trị giới hạn của phân bố chuẩn với mức ý nghĩa 2 phía của sai lầm 

ấn định = 1,96

p=0,2 (p là con số kinh nghiệm dựa vào kết quả nghiên cứu trước đây của Bệnh viện đa khoa cựu chiến binh Đài Bắc về bệnh Fabry)

q = 1 – p

: Sai số được tính bằng 20% của p

Thay vào ta được n ≥ 384

2.3 Nguyên liệu

2.3.1 Mẫu máu

Mẫu phân tích là mẫu máu được lấy theo quy trình thu thập giọt máu khô gồm các bước như sau:

1 Làm hồ sơ bệnh án, photo siêu âm, xét nghiệm

2 Giải thích bệnh nhân: giới thiệu về nghiên cứu

3 Phỏng vấn bệnh nhân theo phiếu phỏng vấn ngay sau khi được bệnh nhân đồng ý tham gia

4 Ghi họ tên, ngày tháng năm sinh của bệnh nhân; ngày lấy máu lên trên giấy thấm DBS (Dry Blood Spot)

5 Lấy 3ml máu tĩnh mạch (chú ý tránh vỡ hồng cầu, không đâm kim lần 2, thay

xilanh mới nếu cần chọc kim lại)

6 Xả bớt 1 giọt máu đầu, tháo đầu kim

7 Nhỏ máu lên giấy DBS, để giọt máu tự lan đều xung quanh vòng tròn

8 Gác lên giá, để khô ở nhiệt độ phòng trong 60-90phút, tối đa 3h (không để giấy trực tiếp trên mặt bàn)

9 Cắm đầu kim 20, cho phần máu còn lại vào ống nghiệm chống đông EDTA Bảo quản ống máu trong thùng đá khô

10 Đóng gói các tờ DBS trong túi nilon gắn mép Cho thêm vào mỗi túi nilon:

5 - 10 gói chống ẩm, 1 giấy ẩm kế Trải túi nilon trên mặt bàn phẳng, vuốt mạnh để đuổi khí ra khỏi túi, miết cẩn thận mép túi để gắn hoàn toàn miệng túi

11 Dán nhãn, ghi ngày lấy mẫu Bảo quản lạnh 40C (ngăn mát tủ lạnh hoặc trong thùng đá khô)

Hình 2.1 Mẫu máu trên giấy thấm DBS

2.3.2 Các loại hóa chất và trang thiết bị

- Máy đo phổ khối song song với cụm 3 khối thiết bị tứ cực Triple Quad

LC/MS 6460 (Aligent)

- Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC Agilent 1290

- Kít giải trình tự chu kỳ BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems)

- Máy giải trình tự ABI Prism 3730

- Bộ điện di ngang

- Các hoá chất, dụng cụ cần thiết

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp xác đinh hoạt độ enzyme α-galactosidase A

2.4.1.1 Tiến hành phản ứng enzyme

 Chuẩn bị đệm phản ứng

Cân 2,45g sodium acetate trihydrate hoà tan vào nước cất

Bổ sung thêm 1,46 ml glacial acetic acid

Điều chỉnh PH về 4,6 bằng acetic acid hoặc sodium hydroxide

Bổ sung thêm nước cất đề đưa thể tích dung dịch lên 250 ml

Cuối cùng, trong 250ml đệm phản ứng có 0,174 mol/l acetate, PH 4.6

 Chuẩn bị dung dịch phản ứng

- Cơ chất (substrate – S): hydroxymethyl-tetrahydro-pyran-2-yloxy)-phenylcarbamoyl]-ethyl}-carbamic acid

(6-Benzoylamino-hexyl)-{2-[4-(3,4,5-trihydroxy-6-tert-butyl ester (C33H47N3O10)

- Nội chuẩn (internal standard – IS):

(6-d5-benzoylamino-hexyl)-[2-(4-hydroxy-phenylcarbamoyl)-ethyl]-carbamic acid tert-butyl ester (C27H32N5O5D5) (Cơ chất và nội chuẩn do Genzyme cung cấp)

- Hoà cơ chất và nội chuẩn (S/IS) theo tỉ lệ 500:1 Bổ sung 0,45ml dung dịch sodium taurocholate 120g/l vào S/IS và votex nhẹ

- Thêm vào 14,67ml đệm, 2,88ml N-Acetylgalactosamine (GALNAc] 1mol/l

và votex nhẹ ta được dung dịch phản ứng