Cơ chế phản ứng của thực vật với điều kiện hạn Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn phân lập và thiết kế vector tăng cường biểu hiện 3 gen: GmMYB, GmCHS7 và GmGLP1.GmMYB XM_00354949
Trang 1PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG BIẾN ĐỔI GEN CÓ KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU
VỚI ĐIỀU KIỆN BẤT THUẬN
Nguyễn Anh Vũ, Lương Thanh Quang, Nguyễn Hữu Kiên, Bùi Thúy Hiền, Dương Tuấn Bảo, Nguyễn Minh Ngọc, Nguyễn Trung Anh, Đỗ Như Quỳnh, Trần Quốc Bảo,
Vũ Hoàng Nam, Trần Thu Cúc, Phạm Thị Lý Thu,
Lê Huy Hàm, Nguyễn Văn Đồng
Viện Di truyền Nông nghiệp
SUMMARY Gene isolation and construction of expression vector as material
for creating stress-tolerant transgenic crop plants
Among abiotic stress factors, drought causes most damage to crop yield world wide In the wake
of increasing frequency and scale of drought due to global warming, creating drought tolerant crop plants is not only in the interest of Vietnam but also the world In our research, we isolated from
soybean (Glycine max) 3 genes potentially involved in drought tolerance including: GmMYB, GmGLP and GmCHS7 These genes were placed under 35S promoter’s control in the binary vector pZY101-Asc carrying ammonium glufosinate resistant bar gene as the selection marker Agrobacteium tumefaciens
strains transformed with these vectors were used to create transgenic soybean lines resulting in some promising initial results
Keywords: Agrobacterium tumefaciens, drought tolerant, glufosinate, GmGLP1, GmMyb, GmCHS7,
soybean, transgenic
I ĐẶT VẤN ĐỀ *
Hạn hán - tình trạng lượng nước tự nhiên
thấp hơn mức trung bình trong một thời gian dài
trên diện rộng và mang tính khu vực, là một
trong các yếu tố phi sinh học có ảnh hưởng lớn
nhất đến năng suất cây trồng trên toàn thế giới
[1] Một số mô hình dự đoán biến đổi khí hậu
cho thấy hạn hán sẽ xảy ra thường xuyên hơn
trong tương lai do những tác động dài hạn của
hiện tượng ấm lên toàn cầu [2, 3] Kết quả là
diện tích đất canh tác ngày càng bị thu hẹp
Trước những thách thức nêu trên, việc nghiên
cứu phát triển những giống cây trồng mới có
khả năng thích ứng, chống chịu các điều kiện
bất thuận đang là một trong những mục tiêu
hàng đầu của các nhà khoa học
Tình trạng thiếu nước dẫn đến một loạt các
thay đổi về hình thái, sinh lý, hóa sinh cũng như
ở cấp phân tử gây ảnh hưởng xấu tới sự phát
triển và năng suất cây trồng [4] Tương tự như
stress mặn, stress hạn phá vỡ sự cân bằng nội
Người phản biện: GS.TSKH Trần Duy Quý
môi và phân bố ion trong tế bào [5, 6] Cây trồng phản ứng với các stress hạn và mặn thông qua các con đường truyền tin và phản ứng tế bào như sản xuất protein stress, tăng cường các chất chống oxi hóa và tích lũy các chất tan tương thích [7, 8, 9] Cơ chế phản ứng của tế bào thực vật với điều kiện hạn được thể hiện trong hình 1 Các gen phản ứng với stress hạn có thể chia thành 2 nhóm chính Nhóm 1 mã hóa cho các protein chức năng tham gia các phản ứng cuối trong chuỗi đáp ứng stress bao gồm gen điều hòa áp suất thẩm thấu [10], các protein chống oxi hóa [11], aquaporin [12], protein phổ biến trong thời kì hình thành phôi muộn (LEA) [13], các protein vận chuyển [14] Nhóm 2 mã hóa các protein điều khiển bao gồm các yếu tố phiên
mã và các protein kinase truyền tin Một số yếu
tố phiên mã liên quan đến khả năng chịu mặn và chịu hạn thường gặp bao gồm WRKY [15,16], bZIP [15], MYB [17,18], DREB [19], NCED [20] và AP2/ERF [21] Các protein kinase truyền tin bao gồm: Protein kinase phụ thuộc
Ca2+ [22], MAPK [23], RPK [24], PIK [25] và protein kinase serine/threonine [26]
Trang 2Hình 1 Cơ chế phản ứng của thực vật với điều kiện hạn
Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn
phân lập và thiết kế vector tăng cường biểu hiện
3 gen: GmMYB, GmCHS7 và GmGLP1.GmMYB
(XM_003549497) ban đầu được xếp vào nhóm
MYB, tuy nhiên với trình tự mang vùng WRKY,
gen này được xếp lại vào nhóm các yếu tố phiên
mã WRKY mã hóa cho protein WRKY24
Nghiên cứu gần đây cho thấy WRKY nằm trong
số các yếu tố phiên mã tăng cường biểu hiện trong điều kiện mặn và có nhiều khả năng giúp nâng cao khả năng chịu mặn của đậu tương [27]
GmGLP1 (EU916269) là một trong các gen mã
hóa protein giống germin (germin-like protein) tìm thấy trong hạt nảy mầm Tất cả các protein
Trang 3germin đều mang motif germin tạo thành cấu
trúc lõi thùng beta tham gia vào gắn kết với kim
loại [28] Mặc dù còn nhiều germin chưa được
xác định chức năng, các phân tích chức năng
tương đồng cho thấy germin tham gia vào nhiều
quá trình quan trọng khác nhau như phát triển,
điều hòa áp suất thẩm thấu, dao động quang chu
kỳ và phòng vệ [29] Một báo cáo gần đây cho
thấy tăng cường biểu hiện germin tách từ đậu
tương giúp tăng khả năng chịu mặn của cây
thuốc lá chuyển gen [30] Cuối cùng,
GmCHS7(XM_003517481) là một trong các gen
thuộc nhóm đa gen mã hóa chalcone synthase
tham gia sinh tổng hợp flavonoid/isoflavonoid
Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy chalcone
synthase tham gia vào phản ứng phòng vệ của
thực vật chống lại các tác nhân sinh học gây
bệnh [31] Một số nghiên cứu lại cho thấy
GmCHS7 biểu hiện mạnh ở rễ và có nhiều khả
năng tham gia vào quá trình hình thành nốt sần
rễ cây họ Đậu [32]
II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu
Vật liệu thực vật: Giống đậu tương
DT2008, DT84,Williams 82 và ĐT22 Các hóa
chất, vật tư tiêu hao cơ bản phục vụ tách chiết
và clone gen Các plasmid pGEMT-easy,
pRTL2 và pZY101-Asc
2.1 Phương pháp nghiên cứu
*Tách chiết gen GmMYB, GmGLP1 và
GmCHS7
Ba dòng đậu tương DT2008, DT84 và
Williams 82 đã được cho nảy mầm trong xô
nhựa chứa đất giá thể Mỗi dòng gieo 100 hạt
kích thước lớn, vỏ trơn đều, không rạn nứt hay
bị tổn thương, không có dấu hiệu bị mọt Các thí
nghiệm được tưới nước đầy đủ hàng ngày, mỗi
xô 100 ml nước Sau ba tuần, ngừng tưới nước
trong 3 ngày Sau đó xử lý hạn nhân tạo bằng
cách tưới 200 ml dung dịch sorbitol 7% (w/v)
15 mẫu lá đã thu được từ 3 giống tại 5 thời
điểm: Ngay trước khi xử lý hạn, sau xử lý hạn
1h, 5h, 12h và 24h Với mỗi mẫu lá, chúng tôi
đã thu lá từ 20 cây khác nhau của cùng một điều
kiện (giống và thời điểm) Mẫu được xử lý lạnh
sâu bằng cách ngâm trong ni tơ lỏng (-196oC) để
làm ngưng toàn bộ các phản ứng sinh hóa trong
mẫu, ngăn chăn sự phân hủy ARN thông tin Mẫu lá được nghiền nhỏ thành bột mịn trong nitơ lỏng và được dùng để tách ARN theo quy trình sử dụng bộ kit SV Total RNA isolation (Promega)
ARN tổng số từ các mẫu được dùng để tổng hợp thư viện cDNA sử dụng enzyme reverse transcriptase Tổng hợp mạch cDNA đầu tiên bằng cách ủ hỗn hợp ARN tổng số (tối đa 5 g) (4 l), mồi oligo (dT)20 50 M (1 l), dNTP 10
mM (1 l) và nước cất đã qua xử lý DEPC (4 l) trong 5 phút ở 65oC, chuyển sang giữ trên đá trong 2 phút Sau đó trộn với hỗn hợp Tổng hợp cDNA bao gồm: Dịch đệm 10x (2 l), MgCl2 25
mM (4 l), DTT 0,1 M (2 l), RnaseOUT 40 U/l (1 l), superScript III RT 200U/l (1 l) vả
ủ trong 50 phút ở 50oC Sau đó ủ 5 phút ở 80oC
để ngưng phản ứng phiên mã ngược, làm lạnh ống nghiệm trên đá, ly tâm nhanh để thu mẫu, sau đó thêm 1 µl RnaseH và ủ ở 37oC trong 20 phút để phân hủy ARN
Các gen quan tâm được PCR từ thư viện cDNA với các cặp mồi đặc hiệu:
+ GmMYB Forward:
GmMYB Reverse:
+ GmGLP1 Forward:
GmGLP1 Reverse:
+ GmCHS7 Forward:
GmCHS7 Reverse:
Thành phần phản ứng bao gồm: Dung dịch đệm 10X (5 l), dNTP 10 mM (5 l), mồi xuôi (5 l), mồi ngược (5 l), Pfu DNA polymerase (1,25 l), cDNA (1 l), H2O (27,75 l)với chu trình nhiệt: Biến tính ở 95oCtrong 3 phút; 40 chu kỳ 95oC trong 30 giây, 55oC trong 30 giây
và 72oC trong 1 phút; sau đó kéo dài mạch lần cuối ở 72oC trong 7 phút Sản phẩm PCR sau khi đã kiểm tra điện di được tinh sạch bằng bộ
Trang 4kit GenCatch PCR Purification (Epoch Life
Science), tạo đầu dính với Taq polymerase, gắn
vào vector nhân dòng pGEMT-easy và đưa và
E coli DH5 bằng phương pháp sốc nhiệt
Các gen quan tâm tiếp tục được PCR với cặp
mồi đặc hiệu mang trình tự giới hạn để cắt giới
hạn và chuyển vào cassette biểu hiện gen dưới sự
kiểm soát của promoter 35S trong vector pRTL2
Trình tự của các cặp mồi đặc hiệu:
+ GmMyb-KpnI:
GmMyb-BamHI:
GC GGATCC TCAGCAAGGCTTAATTTCAAAACCTA
+ GmGLP1-XmaI:
GmGLP1-BamHI:
GC GGATCC TTATTTCTTAGGAGCAAGCCTAGAC
+ GmCHS7-NcoI:
GmCHS7-XbaI:
AGATCT TCAGATGGCCACAC
Sau khi các gen quan tâm được đưa vào
cassette biểu hiện gen pRTL2, toàn bộ cassette
biểu hiện gen mang promoter, enhancer, gene
quan tâm cùng trình tự poly A được cắt bằng
enzyme cắt giới hạn AscI và gắn vào vector nhị
thể pZY101-Asc mang gen chọn lọc bar kháng
ammonium glufosinate Vector pZY101-Asc mang cassette biểu hiện gen quan tâm được biến
nạp vào một số chủng A tumefaciens bằng phương pháp xung điện Các chủng khuẩn A tumefaciens mang gen được dùng để chuyển nạp
vào hạt đậu tương đang nảy mầm theo phương pháp của Zeng và cộng sự [33] có cải tiến
Cây chuyển gen tái sinh trồng ra đất sau khoảng 20 ngày được phun BASTA (tương đương ammonium glufosinate 60 mg/L) để kiểm tra khả năng kháng thuốc trừ cỏ Các cây sống sót sau khi phun được thu mẫu lá để phân tích
Sự có mặt của gen cần chuyển trong cây chuyển gen được kiểm tra bằng PCR với mồi xuôi nằm trong vùng promoter 35S_F (GTGACAGATAGCTGGGCAATG) và mồi ngược nằm trong gen tương ứng Như vậy mặc
dù mồi ngược có thể gắn vào gen nội sinh, sản phẩm PCR chỉ được hình thành trên cassette biểu hiện gen mang gen cần chuyển nằm ngay sau promoter 35S
III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Từ thư viện cDNA của 3 giống đậu tương DT2008, DT84 và Williams 82, chúng tôi đã tiến
hành PCR và tách chiết được gen GmMYB, GmGLP1 và GmCHS7, chủ yếu từ giống Williams
82 với các mẫu sau khi xử lý hạn nhân tạo cho thấy nhiều khả năng các gen này phản ứng và biểu hiện trong điều kiện hạn (Hình 2, Hình 3)
Hình 2 A Kết quả PCR GmMYB từ các thư viện cDNA của giống Williams 82 M: Thang ADN chuẩn 1kb plus; 1-5 lần lượt các mẫu cDNA thu ở 0h, 1h, 5h, 12h và 24h sau khi xử lý hạn B: Kết quả PCR
GmCHS7 từ các thư viện cDNA của giống Williams 82 M: Thang ADN chuẩn 1kb plus; 1-4 lần lượt
các mẫu 1h, 5h, 12h và 24h
Trang 5Hình 3 Kết quả PCR GmGLP1từ các thư viện cDNA sau xử lý hạn.M: Thang chuẩn DNA 1kb plus; 1-5 lần lượt các mẫu 0h, 1h, 5h, 12h và 24h giống DT2008; 6-10: lần lượt các mẫu 0h, 1h, 5h, 12h và
24h giống Williams82
Các gen GmMYB, GmGLP1 và GmCHS7 sau
khi được PCR thành công từ thư viện cDNA đã
được đưa vào plasmid pGEMT-easy, nhân dòng
và giải trình tự Kết quả giải trình tự cho thấy các
gen này mang trình tự đúng với trình tự đã công
bố trên cơ sở dữ liệu NCBI Các gen này được chuyển vào cassette biểu hiện gen dưới sự điều khiển của promoter 35S và đưa vào vector nhị thể pZY101-Asc (Hình 4)
Hình 4 Kết quả PCR kiểm tra cassette biểu hiện gen trong pZY101-Asc mang GmMYB (1) 2742 bp,
GmGLP1 (2) 1884 bp và GmCHS7 (3) 2334 bp
Sau khi thiết kế thành công các vector nhị
thể pZY101-Asc mang GmMYB, GmGLP1 và
GmCHS7, chúng tôi đã tiến hành biến nạp vào
các chủng A tumefaciens EHA101, EHA105,
GV3101, LBA4404 và AGL1 Các chủng khuẩn
mang gen này được dùng để chuyển nạp vào
một số giống đậu tương của Việt Nam Hình 5
minh họa quy trình chuyển nạp gen vào đậu
tương bằng phương pháp gây tổn thương nốt lá
mầm thông qua vi khuẩn A tumefaciens Các
nghiên cứu trước đây đã cho thấy tần số chuyển
gen vào đậu tương bằng phương pháp này bị
ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố trong đó có giống
đậu tương sử dụng để tiếp nhận gen Các giống
đậu tương phản ứng rất khác nhau quy trình tái
sinh chồi và chọn lọc Ngay trong giai đoạn nảy mầm, các giống có tốc độ nảy mầm khác nhau, ảnh hưởng đến khả năng gây tổn thương nốt lá mầm và độ mẫn cảm với chuyển nạp Ở giai đoạn tái sinh chồi, với cùng một nồng độ chất kích thích sinh trưởng nhất định, một số giống đáp ứng tạo chồi rất tốt trong khi các giống khác tạo mô xốp thay vì phát sinh chồi Tương
tự, phản ứng của các giống với áp lực chọn lọc thực vật cũng có khác biệt rõ rệt Ở cùng một nồng độ chất chọn lọc ammonium glufosinate, chồi tái sinh ở một số giống chuyển màu nâu và chết đồng loạt trong vòng một tuần Một số giống khác có khả năng chống chịu cao hơn và chồi giữ xanh lâu hơn
Trang 6Hình 5 Quy trình chuyển nạp gen vào đậu tương bằng phương pháp gây tổn thương nốt lá mầm thông qua vi khuẩn A tumefaciens, tái sinh và chọn lọc cây chuyển gen bằng gen chỉ thị bar
1: Nảy mầm hạt trong môi trường GM sau khi khử trùng; 2: Hạt nảy mầm sau 5 ngày được tách đôi và gây tổn
thương ở nốt lá mầm tạo điều kiện cho A tumefaciens chuyển nạp; 3: Đồng nuôi cấy nửa hạt và A tumefaciens trên môi trường CCM không chứa kháng sinh chọn lọc; 4: Kích thích tạo chồi trên môi trường SI chứa kháng sinh diệt khuẩn; 5: Chồi bên tái sinh từ các vị trí tổn thương trên nốt lá mầm trên môi trường SI; 6: Chuyển lá mầm kèm cụm chồi sang môi trường SI với chất chọn lọc thực vật-thuốc diệt cỏ ammonium glufosinate; 7: Phần lớn chồi chết dưới áp lực chọn lọc; 8: Loại bỏ lá mầm, tiếp tục nuôi cấy cụm chồi trên môi trường chọn lọc; 9: Chồi chuyển gen kháng ammonium glufosinate tái sinh từ cụm chồi; 10: Kích thích kéo dài các chồi chuyển gen trong môi trường SE không có áp lực chọn lọc; 11: Kích thích chồi tạo rễ trong môi trường RM; 12: Đưa cây chuyển gen trồng ra đất, phun BASTA kiểm tra và thu mẫu để phân tích sinh học phân tử
Sau khi thử nghiệm biến nạp trên một số
giống đậu tương khác nhau của Việt Nam chúng
tôi nhận thấy, giống ĐT22 cho kết quả tái sinh
tốt nhất và tập trung tiến hành chuyển gen vào
giống này Các kết quả chuyển gen ban đầu cho
một số cây tái sinh và sống sót qua môi trường
chọn lọc chứa ammonium glufosinate Các cây
này sau khi được trồng ra đất tiếp tục được chọn
lọc bằng phun thuốc diệt cỏ BASTA Các cây
sống sót sau khi phun BASTA tiếp tục được
phân tích PCR Kết quả cho thấy không phải tất
cả các cây sống sót sau qua chọn lọc trong nuôi
cấy mô và phun BASTA đều mang gen cần
chuyển Chỉ có bốn trong số chín cây phân tích
PCR cho thấy có mang gen GmMYB (Hình 6) Đối với GmGLP1, trong số 8 cây phân tích, 5
cây cho kết quả dương tính (Hình 7) Với gen
GmCHS7, tỉ lệ cây phân tích dương tính là thấp
nhất: Chỉ có 1/5 cây (Hình 8).Về lý thuyết, do gen cần chuyển và gen bar nằm sát nhau trên cùng một T-DNA nên rất ít khả năng cây
chuyển gen chỉ mang bar mà không mang gen
cần chuyển Nhiều khả năng, áp lực chọn lọc bằng thuốc diệt cỏ chưa đủ cao trong cả quá trình nuôi cấy mô và khi trồng ra đất Kết quả là một số cây sống sót qua chọn lọc do khả năng kháng thuốc diệt cỏ bẩm sinh cao hơn những cây khác mặc dù không được chuyển gen
Trang 7Hình 6 Kết quả điện di kiểm tra cây chuyển gen GmMYB M: Thang ADN chuẩn 1 kb plus
(-) H 2 O; (+) plasmid; 1 - 8: Các cây chuyển gen giả định Kích thước sản phẩm mong đợi: 1779 bp
Hình 7 Kết quả điện di kiểm tra cây chuyển gen GmGLP1 M: Thang ADN chuẩn 1 kb plus
(-) H 2 O; (+) plasmid; 1 - 9: Các cây chuyển gen giả định Kích thước sản phẩm mong đợi: 992 bp
Hình 8 Kết quả điện di kiểm tra cây chuyển gen GmCHS7 M: Thang ADN chuẩn 1 kb plus (-) H 2 O; (+) plasmid; 1 - 5: các cây chuyển gen giả định Kích thước sản phẩm mong đợi: 1368 bp
Tuy nhiên chúng tôi cho rằng việc nâng cao
nồng độ chọn lọc trong quá trình nuôi cấy mô và
phun BASTA là không cần thiết Trên thực tế,
với áp lực chọn lọc hiện tại, số lượng cây sống
sót nhưng không mang gen không quá nhiều
Ngược lại, một số giống đậu tương thử nghiệm
đã không sống sót được với áp lực chọn lọc này
Nâng áp lực chọn lọc có thể giảm số cây dương
tính giả nhưng có thể loại bỏ một số cây chuyển
gen không sống sót được với áp lực chọn lọc cao
IV KẾT LUẬN
Chúng tôi đã tách chiết được 3 gen GmMYB,
GmGLP1 và GmCHS7 và đưa thành công vào
vector biểu hiện gen pZY101-Asc và chuyển vào
các chủng vi khuẩn A tumefaciens Kết quả
chuyển nạp gen vào đậu tương cho thấy bước đầu
đã thu được một số cây chuyển gen mang các gen
trên Mặc dù với áp lực chọn lọc hiện tại, một số
cây sống sót không mang gen cần chuyển, chúng
tôi kết luận không cần nâng cao áp lực chọn lọc
vì có thể tăng tỉ lệ cây dương tính thật nhưng làm
giảm tổng số cây chuyển gen thu được Các cây
chuyển gen đã được xác nhận bằng PCR là nguồn vật liệu để nghiên cứu sâu hơn nữa chức năng
của GmMYB, GmGLP1 và GmCHS7, đồng thời
cũng là nguồn vật liệu tiềm năng để nghiên cứu chọn tạo các giống đậu tương mới có khả năng chống chịu với các điều kiện bất thuận
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Boyer JS (1982) Plant productivity and
environment Science 218, 443-448
2 Cook ER, Seager R, Cane MA, Stahle DW (2007) .North American Drought: Reconstructions, Causes,
and Consequences.Earth Sci Rev 81:93-134
3 Salinger MJ, Sivakumar MVK, Motha R (2005) Reducing vulnerability of agriculture and forestry to climate variability and change: workshop summary
and recommendations Climatic Change 70:341-362
4 Wang WX, Vinocur B, Shoseyov O, Altman A (2001) Biotechnologyof plant osmotic stress tolerance: physiological andmolecular
considerations Acta Hort 560:285-292
5 Serrano R, Mulet JM, Rios G, Marquez JA, de Larrinoa IF, LeubeMP, Mendizabal I, Pascual-Ahuir
A, Proft M, Ros R,Montesinos C (1999) A glimpse
Trang 8of the mechanisms of ionhomeostasis during salt
stress J Exp Bot 50:1023-1036
6 Zhu JK (2001) Plant salt tolerance Trends Plant Sci
6:66-71
7 Vierling E, Kimpel JA (1992) Plant responses to
environmentalstress Curr Opin Biotech 3:164-170
8 Zhu JK, Hasegawa PM, Bressan RA (1997)
Molecular aspects ofosmotic stress in plants Crit
Rev Plant Sci 16:253-277
9 Cushman JC, Bohnert HJ (2000) Genomic
approaches to plantstress tolerance Curr Opin Plant
Biol 3:117-124
10 Tomy S, Chang Y-M, Chen Y-H, Cao J-C, Wang
T-P, et al (2009) Salinity effects on the expression of
osmoregulatory genes in the euryhaline black porgy
Acanthopagrus schlegeli.General and Comparative
Endocrinology 161: 123-132
11 Manaa A, Ben Ahmed H, Valot B, Bouchet JP,
Aschi-Smiti S, et al (2011) Salt and genotype
impact on plant physiology and root proteome
variations in tomato Journal of Experimental
Botany 62: 2797-2813
12 Gao Z, He X, Zhao B, Zhou C, Liang Y, et al
(2010) Overexpressing a putative aquaporin gene
from wheat, TaNIP, enhances salt tolerance in
transgenic Arabidopsis Plant and Cell Physiology
51: 767-775
13 Wang Y, Jiang J, Zhao X, Liu G, Yang C, et al
(2006) A novel LEA gene from Tamarix
androssowii confers drought tolerance in transgenic
tobacco Plant Science 171: 655-662
14 Morino M, Natsui S, Ono T, Swartz TH, Krulwich
TA, et al (2010) Single site mutations in the
hetero-oligomeric MRP antiporter from alkaliphilic
Bacillus pseudofirmus OF4 that affect Na+/H+
antiport activity, sodium exclusion, individual MRP
protein levels, or MRP complex formation Journal
of Biological Chemistry 285: 30942-30950
15 Gong P, Zhang J, Li H, Yang C, Zhang C, et al
(2010) Transcriptional profiles of
drought-responsive genes in modulating transcription signal
transduction, andbiochemical pathways in tomato
Journal of Experimental Botany 61: 3563-3575
16 Zhou Q-Y, Tian A-G, Zou H-F, Xie Z-M, Lei G, et
al (2008) Soybean WRKYtype transcription factor
genes, GmWRKY13, GmWRKY21, and
GmWRKY54, confer differential tolerance to abiotic
stresses in transgenic Arabidopsis plants Plant
Biotechnology Journal 6: 486-503
17 Liao Y, Zou H-F, Wang H-W, Zhang W-K, Ma B, et
al (2008) Soybean GmMYB76, GmMYB92, and
GmMYB177 genes confer stress tolerance in
transgenic Arabidopsis plants Cell Research 18:
1047-1060
18 Mao X, Jia D, Li A, Zhang H, Tian S, et al (2011)
Transgenic expression of TaMYB2A confers
enhanced tolerance to multiple abiotic stresses in
Arabidopsis Functional & Integrative
Genomics11(3):445-65
19 Chen M, Wang Q-Y, Cheng X-G, Xu Z-S, Li L-C, et
al (2007) GmDREB2, a soybean DRE-binding
transcription factor, conferred drought and high-salt
tolerance in transgenic plants Biochemical and Biophysical Research Communications 353: 299-305
20 Qin X, Zeevaart JAD (1999) The 9-cis-epoxycarotenoid cleavage reaction is thekey regulatory step of abscisic acid biosynthesis in
water-stressed bean.Proceeding Natural Academy of Sciences 96: 15354-15361
21 Zhang G, Chen M, Li L, Xu Z, Chen X, et al
(2009) Overexpression of thesoybean GmERF3 gene, an AP2/ERF type transcription factor for increasedtolerances to salt, drought, and diseases in
transgenic tobacco Journal ofExperimental Botany
60: 3781-3796
22 Kim JH (2002) Ca2+-dependent Inhibition of Na+/H+exchanger 3 (NHE3)requires an NHE3-E3KARP-alpha -actinin-4 complex for oligomerization andendocytosis Journal of Biological Chemistry 277: 23714-23724
23 Moris PC (2010) Integrating lipid signalling, mitogen-activated protein kinasecascades and salt
tolerance New Phytologist 188: 640-643
24 Chinchilla D, Shan L, He P, de Vries S, Kemmerling
B (2009) One for all: thereceptor-associated kinase
BAK1 Trends in Plant Science 14: 535-541
25 Whitman M, Downes CP, Keeler M, Keller T, Cantley L (1988) Type Iphosphatidylinositol kinase makes a novel inositol phospholipid,
phosphatidylinositol-3-phosphate Nature 332:
644-646
26 Mao X, Zhang H, Tian S, Chang X, Jing R (2009) TaSnRK2.4, an SNF1-typeserine/threonine protein
kinase of wheat (Triticum aestivum L.), confers
enhancedmultistress tolerance in Arabidopsis
Journal of Experimental Botany 61: 683-696
27 Ali Z, Zhang da Y, Xu ZL, Xu L, Yi JX, He
XL, Huang YH, Liu XQ, Khan AA, Trethowan
RM, Ma HX (2012) Uncovering the salt response of soybean by unraveling its wild and cultivated
functional genomes using tag sequencing PLoS One 7(11):e48819
28 Requena L, Bornemann S (1999) Barley (Hordeum vulgare) oxalate oxidase is a manganese-containing
enzyme Biochemical Journal343:185-190
29 Mahmut Ç (2000) Germin, an oxalate oxidase, has a
function in many aspects of plant Life Turkish Journal of Biology 24:717-724
30 Lu M, Han YP, Gao JG, Wang XJ, Li WB (2010) Identification and analysis of the
germin-like gene family in soybean BMC Genomics11:620
31 Dao TT, Linthorst HJ, Verpoorte R (2011) Chlacone synthase and its functions in plant
resistance Phytochem Rev 10(3):397-412
32 Yi J, Derynck MR, Chen L, Dhaubhadel S (2010) Differential expression of CHS7 and CHS8 genes
in soybean Planta 231(3):741-53
33 Zeng P, Vadnais DA, Zhang Z, Polacco JC (2004)
Refined glufosinate selection in Agrobacterium-mediated transformation of soybean [Glycine max (L.) Merrill] Plant Cell Reports, 22(7), 478-482
